Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование молекулярно-генетического полиморфизма генома ячменя (РORDEUM VULGARE L.) методом полимеразной цепной реакции

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Исследование молекулярно-генетического полиморфизма генома ячменя (РORDEUM VULGARE L.) методом полимеразной цепной реакции"

pîs ort

/ с / (fr 5Qn£

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ

на правах рукописи УДК 575,11Л13:633Л6

КАЛЕНДАРЬ РУСЛАН НИКОЛАЕВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО

ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОМА ЯЧМЕНЯ [HORDEL'M VULGARE L.) МЕТОДОМ ПОЛИМЕРА ЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

03.00.26 - молекулярная гснешка

AB ГОРЕ ФЕРАТ Диссертация на соискание ученой степени кандидата биол<>1 кческих наук

КИЕВ 1996

Работа выполнена в отделе reiraoü mcsraepmi Селекцию« генетического института Укранской Академия Аграрных наук.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, член-корр. УААН, Cimojmi fO.M.

Официальные оппонент: доктор биологических наук,

профессор, С.СЛМашота

кандидат биологических наук,. А.Н.Живолув

Ведущая организация: Институт Генетики и Цитологии АН Белорусы

Защита диссертации состоится 22 октябре 1996 г.

в_часов на заседании Специального совета

института Молекулярной биологии, и генетики HAU Украины по адресу: 252143, г.Киев, ул. Заболотаого,24. Диссертацию можно получить в библиотеке института молекулярной биологик и генетики HAH Украины

Автореферат разослан 22 сентября 1996 г.

Ученый секретарь Специального совета, кандидат биологичных наук

Л.Л.Лукаш

Актуальность проблемы. В исследовании молекуллрно-гического полиморфизма растений за последнее премя отмечаегся оделенный прогресс, основой которого послужило использование С-маркеров, в частности, выявляемых па основе полимеразной юй реакций (ПЦР). Быстрота получения результатов и дешевизна 1меразпой цепной реакции - обеспечили преимущество этого метода д иными подходами при изучении генетического полиморфизма.

Наибольшее распространение в исследовании молекулярно-гического полиморфизма получил вариант полимеразной цепной ции с единичным коротким произвольным праймсром (RAPD -dorn Amplified Polymorphie DNA). Первые работы по использова-RAPD были проведены на сое и микроорганизмах, где данный )д показал себя как наиболее эффективный способ дифференциации ишзмов и их идентификации. Сегодня уже сложно найти область в жулярной генетике, где не использовался бы данный метод. Это [ядно показало его использованием в проектах, которые преследуют .ю применение ДНК-маркеров для легального исследования цепных родном хозяйстве организмов.

Цель н задачи работы. Целью диссертационной работы явился гиз мопекулярно-генетического полиморфизма генома ячменя ■drum vulgare L.) с помощью полимеразной цепной реакции с про-

>льными праймерами, картирование продуктов полимеразной иеп-реакшш и определение их сцепления с л оку сами количественных шакоп.

Непосредственными задачами работы были: 1. Оптимизация условий полимеразной цепной реакции с произ->ными праймерами: оптимизация реакционного раствора для по-

я

вышения выхода и воспроизводимости продуктов амплификации; по бор температурного режима полимеразной .цепной, реакции; подб< условий воспроизводимости спектров злсктрофорстического раздел ¿шя продукта» амплификации , ; .

2. Исследование межвидового лолиморфизма родаHordeum L.

3. Исследование внутривидового полиморфизма вида Hördii vulgare L. ;

4. Картирование генома ячменя с помощью продуетеu RÄPD картирование локусов количественных показателей.

Научная ноашиа н нракгкческое зиачечме работы. Научная новц на диссертации состоит в использовании разработанной математ ческой модели полимеразной цепной реакции и предложенной форму! для вычисления температуры плавления прайыера и оптимизации уел вий проведения отжига. Существенным моментом являегся разработ компьютерных программ для вычисления оптимальной температур отжига для конкретной последовательности прайыера. Разработа! компьютерные программы для анализа филогенетических взаимоота шений и проведения картирования генома ячмейя. ;

Практическое значаще состоит в создании оптимальных услов; полимеразной цепной реакции с произвольными праймерами, учит вающих последовательность используемого праймера. Разработ состав реакционного раствора для полимеразной цепной реакции произвольными праймерами.

Уточнено происхождения некоторых видов рода Hordeum L. проведен анализ взаимоотношений ряда сортов вида Hordeum vulgare.

..Частично картирован геном ячменя, найден маркер гена, коди-утощего нзофермент ß-амилазу, и проведена идентификация локусов, пзечающих за'количественные признаки.

Ап|>»бированне работы. Основные результаты работы были ^обданы 'на ■ международной' конференции ' "Молекулярно-генетичестсие аркйры и'сслекцня растений" ..(Киев, 10-13 мая 1994г.), на международ-ш симпозиуме "Биотехнология и генетическая инженерия растений" Сиев, 3-6 октября 1994г.), на конференции "Насгпдки наукових по-угав молодих вчених-аграрниюв в умовах реформування АПК" [абани, 199б).: V

Личный вклад диссертанта в разработку научных релул.латоа. исСертантом была разработана математическая модель полимеразной :пной реакции с произвольными праймерами, предложена эмпириче-:ая формула для вычисления температуры плавления олигонуклео-дного праимера, на основе которой разработана компьютерная про-амма, оптимизированы условия проведения RAPD; модифицирован тод Выделения высоКомолекулярной растительной ДНК; синтезиро-ны 68 олигонуклеотпдов; исследован межвидовой полиморфизм рода ordeum L. и. внутривидовой полиморфизм вида Hardeum vulgare L.; зработана компьютерная программа для построения филогенетнче-ия схем происхождения организмов; проведено моделирование по-едоватеяьности произвольного ирайыера. для выявления внутри- или зквидового' полиморфизма; картирован геном ячменя с помощью 21 VPP-марксра и идентифищфованы лскусы количественных /тризна-в; разработана компьютерная программа дай картирования.

Структура и состав работы. Диссертация состоит из обзора л ратуры, материалов, и методов, экспериментальной части, результат их обсуждения, заключения и выводов.

Работа напечатана на 161 страницах машинописного текста, держит 25 рисунков и 12 таблиц. Список используемой литерат составил 216 источников, из них 170 на иностранных языках.

На защиту выноса гея;

1. Результаты оптимизации условий проведения полимера: цепной реакции: моделирования полимергзнай цепной реакции, вы ления оптимальной температуры-отжига, подбор оптимального р ционного раствора.

2. Результаты исследования молекулярно-генетическо^о поли: физыа между видами семейства Hordeum L. и внутривидового и морфизма вида Hordeum vulgare L.

3. Данные ijo картированию генома ячменя, при помощи с опыляющейся популяции F-^s, Одесский 115/Гольф и проведения керного анализа для идентификации сцепления молекулярных марк и покусов количественных признаков.

материалы и методы исследования

В качеств материала для исследования были использованы i торие виды рода Hordeum L.: II. agriocriiJion A'berg., II. sporn а C.Koch., H. laguneuliforme Bacht:, II. vulgare L., II. chilense Roe Shult., II. bulbosum L., а также Triticum durum L.: ('линия 350-72), Tri aesthum L. (Одесская полукарликовая), Seeale .cereate L. (Харько] 60).

В исследовании внутривидовой изменчивости использовали 21 рт ярового ячменя: Джау Кабутак, Одесский 31, Одесский 70, Одес-ий 100, Донецкий 8, Донецкий 9, Исток, Циклон, Черноморец, Винер, so 56, Riso 1508, Нутаис 106, Корал, Пашшдум 32, Паллидум 331/13, :tzes, Bomi, Bonus, Athos, Calsberg II.

Для картирования локусов количественных признаков аыализиро-ны 150 линий самоопыляющейся популяции №106 (Ft я F«, Одесский 5/Гольф), популяцию сорта Productiv, линии пшеницы Chinese spring етолненные хромосомами (кроме пятой) ячменя сорта Betzes, полу-нных из отделов: генетических основ селекции, селекции ячменя и дела генетики СГИ УААН г.Одесса.

»щеленне вькокомолекулярной растительной ДНК осуществляли из полированных проростков, которые растирали стеклянным пестиком эппендорфе с 0.5 мл лизирующего раствора (20 mM NajED'lA, 100 М трис-HCl, pH 8.0 (25° С), 1.4 М NaCl, 2 % СТАВ) и выдерживали в чение 1 часа при 60°С. Добавляли равный объем смеси хлороформа и опентанола (24:1) и тщательно перемешивали. ДНК осаждали равным ъемом изопропанола после 5 минутного центрифугирования в на зльиой центрифуге Eppendorf 5415 при максимальных оборогах. здок ДНК растворяли в 500 мкл раствора ТЕ (10 мМ трис-HCl, pH ) и i мМ NasEDTA) в присутствии ! мкг/мл РТПСазы А. Концентрата ДНК определяли с помощью флюориыетра 'ГКО 100 (Hoefer ientific Instruments, San Francisco).

мшмеразваа цемпая реакция с произвольными праймерами ироводи-сь в реакционном растворе в присутствии 3 мМ ионов магния, а при правленной амплификации - 1.5 шМ. Температура отжига при на-авлешгой амлификации была на протяжении всей реакции равной

55°С, тогда как для ПЦР с произвольными праймерами отжиг на пе] пых четырех циклах реакции был ниже оптимальной на 5-10 градусо Реакционная смесь для иолимеразной цепной реакции объемом 20 mi содержала: 50 мМ KCl, 20 мМ трис-HCt, pH 8.4 (25°С), 3 <1.5) мЗ MgCb. 0.01 % Tween-20, 0.15 мМ каждого dNTP, 0.3 мкМ праймера, 5 глицерина, 20 нг ДНК и 1 ед. Taq-полимеразы. В пробирки наслаивал 40 мкл минерального масла. Амплификацию с произвольными прайм рами проводили следующим образом: первая денатурация - 2 мину] при 94°С; первые чегтыре цикла - 94° С, 1 мин., 1.5 минуты при 40-43' и 2 мин. при 72°С; в последующих циклах отжиг осуществлялся при А 55°С в зависимости от праймера. Проводилось 35 циклов реакци Последи'.я элонгация длилась 10 минут. Продукты амллификащ фракционировали электрофорезом в 1.5 - 2 % агарозном геле в IxTJ (50 niM трис-НзВСЬ и 1 mM ЭД'ГА-Naj, pH 8.0) в течении 5-7 часов п; напряжении 50 вольт и визуализировали бромистым этидием".

Синтез и очистка шестьдесят восьми праймероа. Праймеры длиной 10 до 24 нуклеотадов, были синтезированы на автоматическом ДН1 синтезаторе "Applied Biosystems 380 В" цианофосфорамидитным мел дом. Растворы фосфорамидитов в ацетонитриле готовили до конце! рации 50 мг на 1 ул. Использовались колонки для твердофазного сии за ояигонуклеотидов емкостью 0-2 мкМ (Applied Biosystems), с выход до 15 O.E. (33 мкг олигокуклеотида на 1 O.E.). Короткие олигонуют тиды (10-15 нуклеотидов) не требовали очистки, поэтому синтез зак; читался снятием всех защитных (тритильных) групп (trityl-ofl). Син более длинных олигонуклеоткдов требовал очистки на колонках О (Oligonucleotide Purification Cartridges), поэтогу синтез заканчивали I снятая тритила (trityl-on). Очистку trityl-olT олигонуклеотидов мо»

роводить с помощью электрофореза в дснатуирующем нолиакриамид-ом геле с 7М мочевиной и экстракцией водой из геля.

компьютерный анализ полученных результатов осутеашшш с но-ющью программ: "PC'R" - для огшшизации условий отжша НИР, TREE" - дчя построения схем филогенешческих взаимоотношений у [ссдедуемых форм; "MAP_Q'lL " - для картирования.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Оптимизация условии проведения полнмератлон ценной реакции : протволыаыми праймерами.

с Разработана модель полимеразной цепной реакции с црои.шоль чыми прлймерами. В течение первых двух циклов реакции образуклея здухцепочечные молекулы ДНК, содержащие «.nici мегчи (некомгшеыентарные основания) и длинные некомплемешарные концы. При дальнейшей амплификации из таких молекул образуется чайный продукт амплификации, с полностью комплементарной последовательностью. Поэтому первые два цикла реакции необходимо проводить при температуре отжига ниже оптимальной для данного праймера. И дальнейшем отжиг проводят при оптимальнх условиях.

При вычислений оптимальной температуры отжига необходимы два условия: знание нукпеотидной последовательности праймера и продукта амплификации (Rychlik et al., 1990). Использовать работу Rychlik et al., (1990) для определение температуры планления праймера затруднительно (ошибка в формуле или опечатка), поэтому была предложена собственная эмпирическая формула, полученная на основании этой же работы:

Tmr™" = ~kdG

p irn •

где k=2.9136826, 1 - длина праймера (в нуклеотидах), если концентр ция ионов калия в растворе равна 50 мМ, dG - свободная энерп Гиббса (Breslauer et al., 1986).

Вычисление температуры плавления продукта амппификаш проводили при усредненных данных: 50% ГТД-состав и размер от 200 j 2000 пар оснований.

Таким образом, для каждого праймера вычислена оптимальн; температура отжчга. Оказалось, »по для 10-членных праймеров oi составлгл: не 37°С (Williams et al., 1990), а от 45 до 52°С. При провел нии RAPD в таких условиях образовывались от 1 до 30 воспроизвод мых продуктов, в зависимости от последовательности праймера.

При оптимизации реакционной смеси был предложен состав: ! шМ KCl, 20 мМ трис-HCl, pH 8.4 (25»С), 3 мМ MgCh, 0.01 % Twesn-2 5% глицерина и 5% PEG 6000. Концентрация ДНК - 1 нг на I мкл pea ционной смеси, а количество Taq -по лим ер азы - 1 ед. на 20 мкл реаки: онной смеси. Показано, что 4-6% PEG 6000 значительно усилива! эффективность реакции (до 100 раз), то есть эффективность реакш приблизилась к значению 2°-2п.

2. Исследование межвидового ползторфтма рола Hordeumh.

При выявлении полифорфизма среди сортов ячменя Hordeu vulgare показали полифорфизм, только 50% праймеров (34 из 6£ Ираймеры, не выявляющие внутривидовой полиморфизм, могут дете: тировать такоЕой между видами семейства Hordeum (H.agriocritho H.sponianeum, H.laguneuliforme, H.vulgare, H.chUense, H.bulbosum),

эке другими злаками Triticum durum, Triticum aestivum. Seeale cereate, i mays и у сои Glycine max.

Это иллюстрирует положение о специфичности произвольных номеров в выявлении полиморфизма. Внутрившюспецифичные рто специфичные) праймеры выявляют полиморфизм среди сортов юго вида, видоспецифичные праймеры детектируют полиморфизм аду видами и показывают очень слабый полиморфизм среда, сортов того вида.

Проверка специфичности праймеров осуществлялась на 21 сортах различных эколого-географичсских зон выращивания, например хстсий 100 (Украина), Сувенир (Белоруссия), Триумф (Германия), шидум 18 (Россия). Праймеры, не выявившие полиморфизм среди ных сортов и детектирующие межвидовой полиморфизм, считались оспецифичными. Четкой границы между видо- и пнутривидоспещ?-1ными праймерами провести трудно, 7ак как специфичность прайме-определяегся отношением консервативных амшгаконон к общему ичеству продуктов ампляфикацип. Поэтому, видоспенифичный ймер ограничивает большее количество консервативных внутри а локусов, чем внутривидоспецифнчный праймер. Консервативные гри вида последовательности, ограничиваемые видоспспифичнчм ймером, между видами оказываются полиморфгй-ши. Количество пиконов зависит от последовательности нраимфа и структуры ша. Например, сортоспецифический праймер Р56 при ампяифика-с ДНК ячменя образовывал 4 амплнкона, два из коюрнх оказались шорфными (P56#84Ö и Р56#760), тогда как лраймер Р79 при ам-{шкации образовывал 10 полиморфных из 25 амгошяонов. Спешность праймера определяется на основании анализа ампниюто» у >ра генотипов: , ^

где 1& - индекс специфичности праймера, Р - количество полиморфны полос, К-всего полос.

Значение Ь равное 0 соответсвуег отсутствию полиморфных поле и максимальное значение равное 2 принимает при наличии всех пота морфных полос.

Интересная закономерность специфичности произвольных нра! ыеров показана среди вышеуказанных видов. Если представить он дующий ряд расположения этих видов с увеличением уровня внутрив! дового полиморфизма: соя => ячмепь => пшешща => кукуруза, то пра* меры выявляющие сортоспецифический полиморфизм у сои или ячмеи будуг выявлять таковой и у пшеницы и кукурузы, праймеры не выя! ляющие сортоспецифический полиморфизм у пшеницы или ячменя, и выявят его и у сои. Поэтому сортоспецифичные праймеры у ячмен пригодны при исследовании сортового полиморфизма у сои, у пшениш и кукурузы, видоспецифичнЫЬ праймеры для ячменя не пригодны пр исследовании сортового полиморфизма у сои и у пшеницы, но на кук) рузе возможено выявить полиморфизм среди удаленных в генетическо отношении генотипов. Таким образом, праймер, выявляющий внутри сортовой полиморфизм у ячменя со значением индекса специфичност больше 5, вероятнее всего покажет таколой и у сои, и у пшеницы, и кукурузы.

Все праймеры, выявляющие сортоспецифический полиморфизм доменя, показывали полиморфизм на сое, а праймеры, демонстрирую щие слабый полиморфизм среди сортов ячменя, не выявляли полимор фиэм среди сортов сои. Тах были исследованы сортоспецифичны праймеры у ячменя: Р!, Р2, РЗ, Р6, Р8, Р22, Р39, Р43, Р44, Р52, Р63, Г6«

73 и пара нраймеров Р92УР93 для направленной амплификации. Все ни выявили полиморфизм среди сортов сон.

При исследовании филогенетической схемы происхождения Ридов ода Hordewn L, полученной по 6 праймерам, прослеживалась одна ¡ндепцня: анализируемые виды распределены п два больших кластера iirc.l). В одном расположены виды Hordeum (без H.chilense), в другом -.aestivum, T.durum, S.cereale и H.chilense. H.vulgare был представлен вумя сортами: Донецким 4 и Джау Кабутак, характеризующимися >вольно сильными морфологическими и геиешческими различиями "иволап и Календарь, 1995). Джау Кабутак - местный сорт высокогор-лх районов Таджикистана, выведенный в 1913 году, шесгир"дный, шозернйй; Донецкий 4 - ддурядный, пленчатый.

Анализ кластера, содержащего виды Hordewn, показал, что наи-:ньшне генетические дистанции отмечены между H.agriocrithon и tagunculiforme, с которыми рядом располагается сорт Джау Кабутак ¡.vulgare). H.spontaneitm ближе к данному субкласгеру, чем сорт До-цкмй 4 {H.vulgare). H.bulbosum располагается крайне обособленно от их видов.

. H.spontancum рассматривается Как одичавший культурный ячмень [арактерным ему ломкий колосом, опушением по ребрам колосовых еников. Шестирядный с ломким колосом H.agriocrithon был обнару. и на территории Тибета Е. Обергом. По выполненности и форме жовки H.agriocrithon близок к культурному ячменю. По разнообра-ю форм H.agriocrithon делается вывод о вторичном происхождении' иного вида (Трофимовская, 1972).

—H.cJilIcnse .^S.cereale

_T.durum

_T.aestivum

_ H.vulgarc: Дж.Каб. _.H.egriocritiion

LH.Iagunculifofnje __ H.spantaneum ........ H.bulbosum

o Áá uJ/g—¿p—uWr u.(i4b. 4oD

рис.1. Дбндрограмма межвидововых взаимоотношений постросшлх н основании анализа генетических дистанций.

• Результаты ф>июггнстичесхого анализа позволяют подтверди мнение что, Шщютапеигп, H.agriocriihon и H.iagunculi/orme верояп являются одичавшими формами Н.vulgarе, а также, что Н.bulbos значительно отличающийся фенотипически от культурных ячмён отличается и генетически, а 11.chítense ближе к S.cereale и пшенице, ч

к другим ячменям.

ч

в

•IS' ^ ..... ... ... .

3. Исследование внутривидового полиморфизма вида И. vulgare L.

В исследовании внутривидового полиморфизма вида Н vulgare использовали 21 сорг, эти сорта происходили из различных эколого-географйческих зон. Так, местный сорт Таджикистана Джау Кабутак исследовался как при изучении эволюционных взаимоотношений между видами семества Hordeum L., так и для анализа внутривидовых взаимоотношений. Паллидум 32 - местный сорт Крыма; Винер выведен на Фзленской Государственной селекционной станции из местных сортов и районирован более чем в 60 областях бывшегъ СССР (нечерноземная полоса Европейской части, север центрального черноземелья, Дальнего Востока); Нутанс 106 (получен из Одесского-18 и местного copia Черкасской области), Черноморец (ЮжныйЯ1утанс 215) выведены во Всесоюзном Селекционно-генетическом институте и районирован в Одесской области. Корал выведен в Чехословакии, Athos - в Кении; Riso 1508, Borní выведены в Германии, причем, первый явлется мутантом последнего; сорт Riso 56 является мутантом Calsberg II, выведенных также в Германии, Betzes выведен в Канаде. Кроме того, для анализа были использованы сорта - Одесский 31, Одесский 70, Одесский 100, Донецкий 9, Донецкий 8, Исток, Циклон.

Исследование внутривидовой изменчивости вида H.vulgore проводилось на вышеуказанных сортах с помощью ГЩР, используя сорто-специфические произвольные прайм еры (PI, Р2, 1*3, Р4, Р6 и Р8 ). У 21 анализируемого сорта рассмотрено 168 локусов. Количество полос на образец составило от 25 до 30, из них полиморфных - 41 %. Существенный вклад в выявляемый уровень внутривидового полиморфизма внёс сорт Джау Кабутак, показавший большое количество полиморфных

полос. Индекс специфичности праймеров составил 1,05, что ниже для значения Is, полученное на видonHordeum. '

Так праимер Р8, выявивший высокий полиморфизм у видов (ïs=l,76), среда сортов показал данную величину равной - 0,92. Это относится я к праимеру Р6 (значение Is снизилось с 1,627 до 0,80).

Диапазон генетических дистанций, рассчитанных по данным RAPD, между сортами ниже, чем межвидовой. Незначительно различаются генотипы исходных^соргов и полученных из них мутантов. Это показано для Riso 1508 fa Bomi, а также Riso 56 и Calsberg II. Дейдро- ■ 1рамма иллюстрирует значительное удаление Джау Кабутак, который -значительно отличается от сортов европейской селекции и по морфологическим признакам (например, голозерность, шестирдцностъ).

4. Картирование продуктов 1ЩР при помощи самоопыпяющевса популяции F7-&. Одесский 115/Гольф(популяцяя №106).

. » . ' . . - ' - ' ; • : При анализе сцепления продуктов амплификации ДНК и ферментов бьшо установлено, что ген р-амилазы ячменя, локализованный в длинном плече хромосомы 4 (4 M) (NABGMP, 1994), тесно сцеплен с хокусом продукта Р6#900 (название • пр»йгяера#размср продукта в нуклеотидах). Был определен также другой маркер гена р-амилазы -Р9#680. расположенный на расстоянии в 1% рекомбинации (рис.2)

Обнаружено, что 6 геном Est 5, конхролирующим синтез эстеразы 5, сцеплен локус, маркируемый продуктами амплификации Р92/93#594 и Р9#! 150, которые выявлени е помощью пары праймеров Р92 и Р93 и произвольным праймером Р9. Данные генетические факторы Estí, Р92/9.Ш94 и P9#í 150 расположены в коротком плече хромосомы 1.

Третья группа сцепления состоит из пяти л оку сов: Р69#!050, Р39#2300, Р44#560, Р52Ш2и Р52#1190.

Четвертая группа сцепления: Р63#700, Р66#2320, Р10# S 300 и Р52Я700. Пятая: Р5Ш40, Р69#840, Р82/83Я450 и Р39#П88.

Шестая группа сцепления состоит из двух RAPD локусов: Р2#804 и Р2#1300, амплифицированных с помощью праймера Р2.

Оценка сцепления показала, что локусы Est I и Ату / наследовались независимо от всех приведенных ПЦР продуктов.

Из 68 произвольных праймеров 12 показали полиморфизм между линиями популяции №106. Из 10 пар направленных праймеров полиморфными оказались две. Всего на популяции №106 было нндентифн-цировано 2S полиморфных маркера (4 изофермента и 21 ПЦР маркер), из iiux 21 образовали 6 групп сцепления, покрывающих 237 сМ, то есчь шестую часть генома ячменя (размер генома ячменя составляет около 1300 сМ (Kleinhofs, et al., 1992). Большинство маркеров расположено рядом. Не найдено сцепления локусов продуктов амплификации с геном а-амилазы и эстрразы-I и двумя RAPD-маркерами (Р57#1000, Р10Я1300).

опыляющейся популяции F? Одесский 115/Гольф.

5. Маркерный аналйз количественных признаков.

• Нашей задачей явился анализ сцепления локусов продуктов амплификации с локусами количественных признаков (QTLs). Для этого были проанализированы за два года (1994-1995гг.) 150 пиний популяции №106 по следующим количественным показателям: продуктивность, озернснносп., число зерен на одном растении, масса 1000 зерен и кустистость. Покрываемый маркерами размер генома составил шестую часть (237 сМ). то есть достаточную для лредварительного анализа при

определении сцепления рТЬя с молекулярными маркерами. Для этого проводился статистический анализ средних величин между аллелями маркера, используя ^критерий Оподента и Р-критерий Фншеуа (Лакин,!990).

В результате были получены следующие данные

а) Все количественные показатели, проявившие сцепление с определенными маркеричи » одном году могут не идентифицировался в последующие годы.

б) Достоверные результаты по' ^критерию на высоком уровне шачимости иногда были недостоверны по Р'-крищнпо.

в) Основные достоверные данные получены для 3-й, 4-й групп и 6-I группе сцепления.

Количественный показатель "ррадуктивносгяь" дост^перпо про-!ВШ1Ся в 3-й и 4-й группах сцепления. Данный показатель, локалнзо iar.in.u1 между локусами Р69#И>59 и Р39#2300 л относящийся к 3-й ■рушге сцепления, достоверен только для 1995 гола. В 1994 году данный ¡окс.затель з этой гр}ппе сцепления не проявился. В 4-й группе слепле-шя достоверным оказалось сцепление его с токусом .Р66И2300 (в 1994 •оду). • .

"Озсрпешссть" идентифицируется на 3-й л 4-й группах епепле-1ия. Данный локус локализован между Р39#2300 и 1544#560 3-й группы 11995 году и между Р63#700 и Р66#2320 в чегвертой группе сцепления я 994 году.

"Число зерен па сй'.тш растения" идентифицируется п 3 й группе цепления между локусами Г59#1050, Р39Я2300 и Г44#5Г-0 я 1995 году; в -и группе сцепления ил е} гп! ф и пир уе г.: я с локусом Р66#2300 г> ! 1 оду.

"Масса 1000 зерен" идентифицируется с маркером Р66#2320 чел вертой группы сцепления и с Р2#604 и Р2#1300 шестой группы в 199 году. .

"Кустистость" в 1994 году идентифицируется между локусаы Рбб#2320 и Р63#700 четвертой группы сцепления.

Таким обратом, представляется вероялшм наличие многолс кусного типа наследования таких количественных показателей ка продуктивность, озернешшсть, массы 1000 зерен и число зерен на одно, растении, тогда как для показателя кустистость вероятнее характере одлолокушый тип наследования. Локусы первой группы признаке были отнесены к четвертой группе сцепления с маркером Р66#2320 и третьей группе сцепления - с маркерами Р69#1050, Р39#2300 и Р44#56> Локусы второй группы признаков ассоциируют только с маркеро Р6б#2320, причем проявление этих признаков зависит от влияния окр; жаюхцей среды. Поэтому эти маркеры можно рекомендовать для анал) за селекционно-гейешческого материала.

выводы

. Исследование мез£- и внутривидовой изменчивости и картиров ние генома ячменя (Пл и^агг) методом полимеразной цепной реакции произвольными праймерами позволило сделать следующие выводы:

1. Для оптимизации условий проведения полимеразной цепш

реакции с произвольными праймерами на основе разработанной мат

матческой модели ПАР!) необходимо в первых ,-вух циклах реакш

проводить отжиг при температуре ниже оптимальной дня данно

пряйыера. Па основании анализа процесса амплификации предложе; \ . - , эмпирическая формула вычисления температуры плавления олиг

1уклеотндов, которая необходима для определение оптимальной температуры отжига праймсра и матрицы. Для исюиоченил факторов, трепятстпующих воспроизводимости реакции предложен модифицированный метод выделения высокомолекулярной ДНК, реакционны;! :остап для полимеразной цепной реакции, содержащий кроме изустных компонентов (глицерин, Tween-20) полиэтиленпшколь 6000.

2. Предложена гипотеза о специфичности выявления полиморфизма последовательности праймера при RAPD. Праймеры, выявляю-дие сортоспецифичный полиморфизм у слабополиморфных видов [строгие самоопылители) выявят таковой и у средне -: и высокополи-лорфных близкородственных видов (перекрестноопыляющиеся).

3. Исследован межвидовой полиморфизм рода Hordeum L. Под-шерждено положение о том, что дикие виды ячменей (fi.rpoiitaneuni, 4.agriocrithon и HJagtiviculiforme) вероятнее всего произошли от куль-гурного Я.vulgare. Разработана компьютерная программа для исследования филогенетических взаимоотношений, осиовующаяся на клаезер-юм анализе.

4. При исследовании внутрилидового полиморфизма видг. 4.vulgare на 21 сорте показано обособленное положение сорта Джау •Сабутак, который ближе по происхождению к лнкнм ячменям, чем к :овременным сортам.

5. При картировании генома ячменя с помощью RAPD-маркеров, ia 150 линях самоопыляющейся популяции' Г7-?, Одесский! 15/Гольф юкализован 21 RAPD-маркер на шести группах сцепления. Суммарный размер покрываемый молекулярными маркерами равен IM с\Т Идеи-гифицирован молекулярный маркер тесно сцепленып с геном коднру-цим ß-амилазы.

6. В результат количественного анализа 150 линий самоопыляющейся популяции F»* Одесский 115/Гольф за 1994 и 1995 годы идентифицированы локусы количественных признаков в 3, 4 и 6 группах сцепления. '

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО TEMli ДИССЕРТАЦИИ

1. Сиволап Ю.М., Календарь Р-Н,,. Чеботарь C.B. Генетический полиморфизм злаковых растений при помощи ПЦР с произвольными праймерами. II Цитология и Генетика. - 1994. - Т:28. - №6. - С 54-61.

2. Календарь Р.Н., Сиволап Ю.М. Полимеразиая цепная реакция с произвольными праймерами. // Биополимеры и Клетка. - 1995. - T. II.-№3-4. - С.55-65.

3. Сиволап Ю.М., Календарь Р.Н. Генетический полиморфизм ячменя, выявляемый ПЦР с произвольными праймерами. // Генетика. -1995. - Т.31. - №10: - С. 1358-1364:

4. Календарь Р.Н. Компьютерная программа'для построения эволюционных деревьев на основе электрофореграм ДНК и белков. // Мо-лекулярно-генстические маркеры и селекция растений: Тез. докл, конференции 10-13 мая 1994г. - Киев. - Ç.25-26.

5. Чапля А.Е., Календарь Р.Н., Нецвегаев В.П., Сиволап Ю.М. Генетический контроль а-амилаз и продуктов амплификации с единичным произвольным праймером у ячменя. II Молекулярно-генезичесхсие маркеры и селекция растений: Тез. докл. конференции 10-13 мая 1994 г. - Киев. - С.73-74.

6. Сиволап Ю.М., Календарь Р.Н. Генетический полиморфизм злаков, де копируемый полимеразной цепной реакцией со случайными

праймерами. // Молекулярно-генетические маркеры и селекния раог" ний: Тез. докл. конференции 10-13 мая 1094 1. - Киев. - С.59.

7. Чанля А.Е., Капеидар P.M. Картування геному ячменю ia 1д<м-тфкагня дотсуЫв гальюеннх ознак за допомогою ¿зоферменfiU ¿а полшеразно! ланцгогово1 реакцп з дошлышмн нраимерачш. II Иа^ндки наукових пошугав молодих вчених-аграрниюв в умовах реформуиания АПК: Тези докл. гсонференн» i996 р.'- С.21-5.

8. Netsvetaev ViP., Kalendar R.N., Sivolap Yu.M.p-amylaM-polymorphism in barley is detected by PCR with an arbitrary primer. I! Barley Genetics Newsletter. - 1995. - V.-24. - P.80-83.

9. Sivolap Yu., Chebotar S.', Kalendar R.N., Kozhukova N. Intu-srxl intraspecies genome changeability oi' some cultivated cereals. // VI international Conference "Frontiers in biochemistry ;md bioiociihir biology. The legacy of Andrey i!eioz<:rsky", Moskow, 18-22 iJecembi.r 1995.

Kulcndnr R.N. Investigation of tlie molecuiar-gcnetics polymorphism gcuoine of bailey (Hordeuirivuigai-e L.) by polymerase chaih reaction.

Dissertation for, scientific degree of candidate' of biological sciences on speciality 03.00.26 - Molecular Genetics. PlantBreeding.& Genetics Institute HAAS. Odessa, 1996. .'. .[ - '; '

Dissertation contains a theoretical and experimental material for using the polymerase chain reaction with aibitrary primers (RAPD) for research the phyiogenetics inerralations between some genera.family Hordeum L., .and study intraspecies polymorphism of H.vulgare L., mapping of "the genome of barley (H.vulgareL.). , ' '

Model of polymerase chain reaction with, arbitrary primers is submitted, formula for calculation the temperature, of njalting' oligonucleotides primes and is offered conditions of realization RAPD,

For mapping of polymorphic products! RAPD used self-poiinated population, F7.S from crossing Odesskyl l5/Golf4 Markers with known localization served genes, coding isozymes: a-amylase I, (j-amylasfc I, esterase I and 5. It is used 66 arbitrary primers and 10 pairs primers for directed amplification. 12 arbitrary primers and 2 pairs directed primers have shown polymorphism. On the basis of 19 RAPD markers and 2 isozymes (p-amylase, esterase 3) is determined 6 groups of linkage, a cpvering the sixth-part of barley genome (237 cM). One of 21 polymorphic product amplification, is inherit as oodominant. It is established (installed), that RAPD-marker P6#900 is closely linked with gene coding 0-amylase ZfrnyJ. ; Theoretical aspects of use of RAPD for genetic analysis are discussed. ;

KEY WORDS; gentfim polymorphism, polymerase chain reaction, molecular-gcr>i*K» markers, mapping, quantitative trait loci, barley.

Календаре Р.Н. ^Исследование молекулярпо-генсжчсекою иадн-юрфизМа генома ичменп (Hordeum vulgare L.) методом полнмсразиой' ешмт реакции*^ ,

Диссертация на соискании ученой степени ¡:анлял;! к» билошчеекмх ауте по специальности (B.(KI.2ó - молекулярная геиоика. ^елехс!В{0!Ш0-генйт«ческин институт УЛАН, Одесса, 1996.

Представляется к защите диссертация, которая содержит теЬрети-гский и экспериментальный uaicpuau tío. испощлобрятпр полимерной цепной реакции с произвольными праймерами (RAPD) для иссле-, звания филогенетических взаимоотношений некоторых видов рода 'ordeum L, и изучению внутривидого полиморфизм H.vulgare L., а так е по картир« ваНию генома ячменя H.vulgare L. и идентификации локу->в количественных признаков.

Представлена модель полимеразной цепной реакции с проичвопь ум и праймерами, предложена формула для вычисления температуры тапления олигонуклсо'шдного прайыера и оптимизированы уело шя эоведения RAPD.

Для картирования локусов полиморфных продук-нш ГЩР и; эльзовалн самоопыляющуюся популяцию F7 s, получе1гную от гибри-1зации Одесский 115 на Гольф! Маркерами С известной локализацией [ужили гены, кодирующие изоферменты: а-амилазу Î, ß-амилазу I, теразы I и 5. Использовали 66 произвольных единичных праймеров и 1-ти пар праймеров для направленной амплификации. Двенадцать юиэвольных и 2-е пары направленных праймеров показали поли-)рфизм. Ыа основе 19-ти ПЦР маркеров и 2-х изофермешчв (ß-шлаза, эстераза 5) определено 6 ipyrtn сцепления, покрывающих естую часть генома ячменя (237 сМ). Найден один из 21 i о лили-1рфного продукта амплификации, наследуемый по кодоминангному

типу. Установлено, что 11ЦР маркер Р6#900 тесно сцеплен с . геном кодирующим р-амилазу Вту1. Обсуждаются теоретические аспекты использования продуктов ПЦР для генетического анализа. , •

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА? генетический полиморфизм, полнмеразнаа цепная решрш, молекуяарно-гтетческне нарксрм, картирование, локусы количествешплх приямков, ячмень.

Пот.» «чпт,1 хП 1 1/!с. '

'• Г >

... 1>5*" ия».я.г.5п.«. »гЛ?/З.Твря* ГСОям 1'сГгг,ич1'"Ч|ия Одесского упраплени* »• печати,ц«13. I .пин* 49.