Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование методом низкотемпературной ЭПР-спектроскопии парамагнитных центров сложных железосерных белков

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование методом низкотемпературной ЭПР-спектроскопии парамагнитных центров сложных железосерных белков"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО НАРОДНОМУ ОБРАЗОВАНИЮ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи

МОРОЗ Игорь Анатольевич

УДК 577.3

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕТОДОМ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОЙ ЭПР-СПЕКТРОСКОПИИ ПАРАМАГНИТНЫХ ЦЕНТРОВ СЛОЖНЫХ ЖЕЛЕЗОСЕРНЫХ БЕЛКОВ

Специальность 03.00.02 — биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва 1931

Работа выполнена в Отделе кинетики химических и биологических процессов ордена Ленина Института химической физики АН СССР им. Н. Н. Семенова.

Научный руководитель:

доктор физико-математических наук Д. Ш. БУРБАЕВ

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, профессор Э. К. РУУГЕ, кандидат биологических наук, доценг К- Н. ТИМОФЕЕВ

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии АН СССР.

< - 32-

Защита состоится « <Ь » д с 1991 г. в л& час. на

заседании специализированного совета К-053.05.68 в МГУ им. М. В. Ломоносова по адресу: 119899 ГСП Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет. ^''

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан « ) » 1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук,

доцент Б. А. ГУЛЯЕВ

, с" ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ.

' Актуальность проблемы. Выяснение состава, электронной и ~' |пространстгенной структуры активных центров ферментов, их фи-»цИ^зико-хишчеегсих свойств остается одной из актуальных проблем молекулярной биофизики и физики (ферментативного катализа Знание молекулярной организации активных центров фермента необходимо для понимания физики элементарного акта, физических основ механизма протекания ферментативного процесса. Особенно эта проблема актуальна для сложных, многоцентровых ферментов, в частности, для сдозямх жэлезосерных белков, которые принимают непосредственное участие ь таких вамаых биологических процессах, кап перенос электрона в дыхательной цепи ш-' тохшдрий мгеотных, в реакциях фотосинтеза, в процессе фиксации азота, в реакциях окисления метана метачокйслиюцих баотериД. Согласно принятой классификации слоляыми лоелеэосер-ныш белками являются ферменты, содержащие помимо железосерно-го центра (ЯПЦ) другие активные центра.

Диссертация посвящена исследованию двух слошых язэлезосерных белков - двух ИАВД-дегидрогеназ: ИАОН-Ш-оксидоредуитазы ыемб-раносвязанной метанмонооксигеназы из бактерий №Ы1у1ососсиг сарзи1аЬиз (штамм Ю и комплекса I (1ШН-убихинон-оксидоредук-тазы) дыхательной цепи митохондрий животных. Необходимо отметить, что низкотемпературная ЗИР-спектроскопия является наиболее эффективным методом исследования быстроре-лаксируюшях парамагнитных центров, в том числе и ЖСЦ, поэтому он был выбран основным методом исследования. 1ШН-Ю-оксидоредуктаза является компонентой сложного многокомпонентного ферментативного комплекса - метанмонооксигеназы, кататаоирущей ключевую стадию превращения углерода в метано-

кисляющих бактериях, реакцию окисления метана до метанола. Для мембраносвязанкой фэрмы ИАОН-МО-оксидоредуктазы в настоящее вреш известно, что фермент состоит из четырех субъединиц и содержит флавин и (по предварительным данным) железосеркый центр._ Однако, значительное содержание атомов железа (6г8 на молекулу) свидетельствует о возможном присутствии нескольких лилезосерных центров. Поэтому исследование ШМ-Ш-оксидоре-дуктазы методом низкотемпературной ЭПР-спектроеконии додано выявить наличие келеаосерных центров б ферменте и охарактеризовать их фиамко-химические свойства.

'МАШ-убихшоя-оксидоредуктаза (комплекс I) кроме значительного Числа келезоеерных центров содержит <$лавин и связанный с комп--лексом убихкнон. Однако, к настоящему времени отсутствует детальное исследование связанного с комплексом I убиышона. В .зависимости от условий электронного транспорта в дыхательной Цепи митохондрий возможно наблюдать сигнал ЭПР убисемихинона. За счвт магнитного дилоль-дипольного взаимодействия быстроре-лаксирувдкх парамагнитных центров (ЖСЦ) с убисемихшоном происходит увеличение скорости спш-реаеточной релаксации последнего, спектр ЭПР убисемихинона должен регистрироваться при более низких температурах, чем сигнал свободного, несвязанного с быстрорелакемрующими центрами убисемихинона. ГЬэтому исследование методом низкотемпературной ЭПР-спегароскопии комплекса I в различных состояниях субмктохон;др..ахькых частиц в широкой области температур ЮтЮО К должно выявить быстрорелаксирущие • убисемихиноны, связанные с комплексом I, и определить их физико-химические свойства

Необходимо отметить, что комплекс I, помимо переноса электрона, приникает ¿дотке в процессе трансформации анергии

электронного транспорта. Поэтому выявление и изучение убисеми-хинонов, связанных с данным комплексом, их взаимодействия с другими переносчиками электронов актуально не тольно для понимания процесса электронного переноса в дыхательной цепи митохондрий, но и для понимания процесса трансформации энергии з первом пун'гге сопряжения.

Тема диссертационной работы полностью соответствует направлению основных исследовагай, проводимых в 5Ш АН СССР, и выполнена в рамках комплексной темы РАН номер 10103-987 от 19.03.87, номер проблемы 07. 4.05.

Цель раооты заключачась в ойнаруюэнии, идентификации и ис-■ сле^вании иэлеэосерных' центров ь ИАШ-Шоксидоредукгазо мемб-раиосвязанной меганмоноокоигенавы и стабильного убисрмйхинона, связанного с ЫАОН-убигинон-оксидоредуктазой дыхательной цепи митохондрий. Для достижения цьли решались следующие основные задачи:

1. Исследование низкотемпературных спектров ЭРР ЮТН-МЭ-оксидо-редуктаэы мзмбраяоовяаанной метанмонооксигеназы в различных окислительно-восстановительных состояниях ¿ермента и при разных условиях регистрации спектров ЭПР.

2. Оценка величины обменного вваимодейсчвия ь-еяду атомами железа в железосерных кластерах 2Ге КСЦ САОН-Ш-эгссидсредук-газы.

3. Исследование механизма возможной перестройки структуры КОД в ИАОН-МЗ-бксидоредуктазе мембраносвязанной метанмонооксигеназы.

4. Исследование низкотемпературных спектров ЭПР КАВН-убихинон-оксидоредуктазн в различных состояниях субмитохондриальных частиц и при различных условиях регистрации спектра ЭП?.

5. Разработка методики разделения сигналов ЭПР парамагнитных центров, существенно различающихся релаксационными характеристиками, ко с одинаковым значением д-фактора и примерно одинаковой шириной линии.

6. Исследование магнитного взаимодействия' убисемихинона о же-леаосернымл центрами МАШ-убихинон-оксидоредуктааы.

Научная новизна. В диссертационной работе впервые обнаружены, иде1!ткфидироваш и исследованы келезосерные центры в МАОН-МО-океидоредуктазном компоненте мэкбраносЕяаашгай меган-мокооксигеназы.

Проведена оценка константы обменного взаимодействия между ато-ыаш! железа в 2Ре ЖСЦ ¡МОН-Ш-окскдоредуктазы мембранооаязан-ной мзтанмонооксигенаэы.

Впервые исследован процесс перехода ЗРе ЕСД в 4Ре ЗСЦ в ЛАОН-Ш-редуктазе меыбраноевязанной метанмонооксигеназы. Пред- ' лакана качественная схема такого перехода. Б работе впервые получены экспериментальные данные о наличии и функционировании двух типов убисеиихинонов, связанных с комплексом I цепи электронного транспорта митохондрий и различающемся скоростью спин-решеточной релаксации. Различие в скорости релаксации обусловлено тем, что быстрорелаксируюший убисеыихинон магнитно взаимодействует с ВД N-2, а ыедленноре-даксирующий убисе'михинон - с быстрорелакекрувдим. Предложна качественная схема первого пункта сопряжения дыхательной цепи митохондрий, учитывающая наличие двук различных по физико-химическим' свойствам убисекагаияонов.

РаэраСотана методика разделения сигналов ЭПР парамагнитных центров с одинаковым значением е-ёактора и примерно одинаковой ч:риной линии, основанная на существенном различии их релакса-

- а -

препаратов NADH-МЭ-сксидоредуктазы в различных окислительно- восстановительных состояниях показало, что данный фермент содержит четыре типа парамагнитных центров, характеризующихся различными спектрами ЭПР: центр 1 имеет сигнал ЭПР с трехосной анизотропией g-фактора (ge-2. 00, g -1.938, g„-l. 013) в восстановленном состоянии, при окислении фермента сигнал центра 1 исчезает, компоненты сигнала центра 1 начинают уширяться при температуре регистрации вше 120 К; центр 2 характеризуется сигналом _ ЭПР с аксиальной анизотропией g-фактора (е,,-2.012, -1.931) в восстановленном состоянии, при окислении фермента сигнал центра 2 не наблюдается, компоненты сигнала центра 3 начинают ушряться при температуре регистрации выше 85 ?• центр 3 имеет сигнал ЭПР при g-2.02, л Н-2.5 мТл в окисленном состоянии, при восстановлении фермента сигнал центра 3 исчезает, сигнал центра 3 начинает ушряться при температуре регистрации выше 25 К; центр 4 характеризуется сигналом ЭПР с трехосной анизотропией g-фактора (ег-2.050, g -1.933, gx

с

-1.900) в восстановленном состоянии, при окислении фермента сигнал центра 1 не наблюдается, компоненты сигнала центра 4 начинают уширяться при температуре регистрации выше 35 К (ри~' сунок 2). Принимая во внимание форму сигналов ЭПР, окислительно-восстановительное состояние фермента, й котором наблюдаются сигналы всех 4-ех центров, значения g-факторов, значения среднего g-фактора (gí/0 -1.95 для центра 1, 1.S57 для центра 2 и 1.96 для центра 4), релаксационные характеристики ( температура начала уширения компонент спектра ЭПР)-, а также, тот факт, что при рыращиваиии бактерий Methylococcus capsulatus на среде, обогащенной изотопом FeJÍ , происходит уширение линий суммарного спектра ЭПР центров 1 и 2, можно заключить, что центры 1 и 2

- 10 -

Рисунок 2. Спектры ЗПР препарата НАВД-Ш-оксидоредуктазы мембраносвяаанкой меташоно-оксигеназы (40 мг/ьш) восстановленного А к Б) МАОН (1 мМ), 3) дигиояитом натрия (10 иМ, в присутствии мэтидвиоло-гена в атмосфере аргона) и Г) окисленного феррициашдом (2 Ш).

Условия регистрации: V свч-9300 МГц; \)вч-100 кГц; ' БсЕЧ-бО мВт; V -1 с; амплитуда модуляции А и В) 0.5 мТл. В и ГЗ 1.0 ыТд; температура регистрации указана на рисунке.

ЗПР-спектрометр "КасИорап" (Польша).

являются двухъядерными ждеаосерньада центрами с серусодержащи-ш. лигандами типа [Ре^^Б!?)^ ], центр 3 является трехъядерньш желевосерныы центром, а центр 4 - четырехтядерныы желебосерным центром о серусодёржащями лигандами типа [Рв,5,(5В)ч], структуры которых приведены на рисунке 1. Выло установлено относительное содержание числа парамагнитных центров различных типов - КОД ЫАВН-"Ш-оксидоредуктааы центр 1: центр 2: центр 3: центр ' 4 соотносятся как 1:1:0.2-0. 3 : 0. е-0.9. ;

и Исподьауя методику определения зависимости скорости спин-решеточной релакса!+ли от температуры регистрации в области-

г.05 г.со ид

|_а

I ч.«т -У |_J

температур, когда наблюдается упмрение спэкгра ЭПР центров 1 и 2, а также ее модификации, предложенную автором, было установлено, что спин-реиеточкая релаксация двухьядериых желевосерних центров ИАОН-Ю-оксьдоредугаазы происходит по характерному для КЩ процессу - двухфононному процессу Орбахе. Были расчитаны константы обменного взаимодействия (Л) между атомами железа в железосерных кластерах центров 1 и—210±40 си"1) и 2 140± 20 от'*). Основывзяеь на различии этой константы, а также на различной .анизотропии г-фактора, спектров ЭПР исследуемых 2Ре ЖСЦ был сделан качественный выаод о раз-^тсии структуры желеао-серного кластера юнтров 1 и 2 ( центр 1 имеет меньпее растоя-' ние меиду атомами железа в кластере и, ' следовательно, меньшй угол атом железа-атом лабильной серы-атом железа, плоскости атом серы аминокислоты цизтекна-атом яелеза-атом серы аминокислоты цистеша для обоих атомов железа центра 1 повернуты на некоторый угол друг относительно друга по сравнению с центром 2). .

Для исследования окислительно-восстановительных свойств ЕЗЦ ['АОН-Ш-сксидоредуктазы использовали в качестве восстановителей: датштреитол, аскорбат, дитшяит натрия'ч НЯ)Н, в качестве окислителя - феррициалид. Степень восстановленное™ (окисленгости) 5ЮЦ оценивали ло интенсивности соответствующих компонент спектра ЭПР каздого центр?.. Было установлено, что средние ошклительно-восстачовятеланые потенциалы обнаруженных Я£СЦ попарно близки (центр 2 и 4; центр 3 и 1) и существенно отличак/гся между парами (центр 2 и 4 - примерно -300 г-400 мЕ, центр из - примерно -50г~'100 мВ). Анализируя как свои экспериментальные данные, так и литературные, удалось продемонстрировать влияние белкового окрулияия на окчсллтельяо-воооча-

- 12 -

новигельныэ характеристики 2Ге ЕСЦ.

Особое внимание в третьей главе было уделено вопросу о возможном переходе ЗРе ЖЩ (центр 3) б 4Ге ЖЩ (центр 4) и наоборот в процессе восстановления (окисления) препарата ЛАДН-МЗок-сидоредуктаеы шибраносвязанной меганмонооксигеназы. В ходе предварительных экспериментов было установлено, что п-хлорыер-курийбензойная кислота (1ШБ) влияет на желеассерные кластеры исследуемого фермента: во-первых, небольшие концентрации реагента (9-ИО молекул ЛХНВ на молекулу белка) приводят к уменьшению скорости спин-решеточной релаксации ЖСЦ, что проявляется в достоверном смещении зависимости интенсивности сигнала ЗПР от температуры регистрации в сторону больших температур (центр 4); во-вторых, большие концентрации реагента (12-13 молекул ГШ.® на молекулу белка) приводят к разрушению хелеаосерных кластеров к исчезновению сигналов ЭПР центров 1, 2, 3 и 4. Используя избыток дитиотреитола (ДТТ) удалось нейтрализовать, но не полностью, воздействие небольших концентраций ПНЯ) на центр 4 и реконструировать (до 60Х от исходного) один из ранее разрушенных КОД - центр 1. Б работе приведено возможное объяснение воздействия ПХШЗ на железосерные кластеры и нейтрализации этого воздействия ДГТ.

Также бнло установлено, что в процессе восстановления препарата НАОН-Ш-оксидо'редуктазы осужэствдяется практически полный переход Зге кластера (центр 3) в 4Ре ЕСЦ (центр 4) при восстановлении препарата МАШ и нефермэнтативно с помощью аскорбата. Процесс реконструкции железосериого кластера может быть ааин-гибировап ПХМБ, что приводит к рездаку изменению окислительно-Еосстановительни свойств 8Ре КСЦ С аффективный средний окислительно-восстановительный потенциал центра 3 существенно поки-

хается). Ингибирувдее действие ПХМБ на процесс реконструкции яэлззоеерного кластера может быть нейтрализовано с помоиью ДТТ. Анализируя собственные, а тагав литературные данные, была предложена возможная схема перехода ЗРе 3;!СД в 4Ре (и наоборот) в процессе восстановления (окисления) НАОН-Ш-оксидоредуктааи мембраносвязанной штанмоноокиггеназв

ГЕРе( Ш)~£Ре( II)] »1 [ЗРе( III)-1Ре( II)] — ЭР©( III) +РеП1) * е

окисленный 4Ре ГСЦ промежуточное окислен- свсбод-

кестабшьное ний ЗРэ ный ион

состояние КОЦ галеяа

переход меаду 4Ре и ЗРе ЖЦ осуществляется через промежуточное, нестабильное состояние, соответствующее переокисленному -1 Ре ЕСД. Это состояние нестабильно в той смысле, что равновесие между промежуточным состоянием к ЗРе НСЦ сильно сдвинуто з сторону образования ЗРо -Э0Ц. При окислении окисленного ЛЗЦ образуется промежуточное (нестабильное)- состояние, которое распадается с перестройкой 4Ре кластера в окисленный ЗГе ИСЦ с высвобождением иона железа. При восстановлении электрон акцептирует промежуточное, нестабильное состояние, переходя в окисленный 4Ре ЕСЦ, что, в свою очередь, приводит к перестройке ЗРо кластера в промежуточное состояние с присоединением иона келеза ПК® ингибирует перестройку келезосерного кластера (блокируя серный лиганд свободного цистеина), тем самым резко понижая эффективный окислительно-восстановительный потенциал систеш, так !<ак этот потенциал для ЗРе НСЦ существенно ниже, чем для промежуточного состояния. Отметим, что рассматриваемая схема хорошо согласуй.оя с одной из ранее предложенных возможных схем перехода ЗРе в 4Ре ЖЦ и наоборот (см. рис. 1).

- 14 -

Глава 1У. Стабильные убисемихкноны, связанные с МАОН-уби-хинок-оксидоредуктаэой дыхвтельной цепи митохондрий. Исследование мэтодой низкотемпературной ЭПР-спектроскопии сопряданных субмитохондриальньк частиц из сердца быка показало, что в суммарном спектре препарата, восстановленного НАШ и замороченного через 15 сеа после добавления восстановителя, присутствует интенсивный сигнал ЭПР свободного радикала при е-2.00 (центр 1) гауссовой формы с шириной мевду точкам! сакси-малького лакяока 0. 87 мТл (.рисунок 3) и оптимальной температурой регистрации 50 К.

с

210 2.00 1.12 гл<3

I 1 I I I

шге чнстщ из сердца быка (7 мг/мл) восстановленного NADH (S мМ) и ¡замороженного через 15 с. после добавления НАШ. Уыовш; регистрации: см. рис. 2, амплитуда модуляции A, jl¡ и Б.) i. О мТл, Г) 0.5 ыТл.

Форма сигнала свободного радикала, а также его ширина позволяют идентифицировать обнаруженный сигнал как сигнал ЭПР убисе-михинона. Было установлено, что число парамагнитных центров, ответственных »а сигнал ЭПР убисешшмона, так относится к числу парамагнитных центров ВОД N-2 ЯАОН-увихинон-оксидоре-дуктаэы как О. 5 : 1. Исследование препаратов субммтохондриаль-ных .астиц в различных состояниях электронного транспорта показало, что сигнал ЭПР убисемихинона наблвдвется в условиях стационарного прямого и обратного энертоагвисмого электронного транспорта черев комплекс 1 дыхательной цепи митохондрий;- в обоих случаях убигемихинон чувствителен к ротешиу и к раг эб-Езиелям электронного транспорта; сигнал ЭПР центра 1 такав наблюдается при АТФ-вависишм обратном электронном транспорте через НАОН-убихшон-оксидоредуктаау. Ротенончукствительность обнаружимте* убисемихинона позволяет утверждать, 1 что центр 1 свяаан с комплексом I дыхательной цепи митохондрий; больная скорость спин-решетосной иелаквации (оптимальная температура регистрации сигнала ЭПР убисемихинона 60 К) позволяет предположить, что спин-репзточная релаксация центра 1 определяется другим быстрорелаксируюядам парамагнитным центром (например одним из ИОД комплекса I) и, следовательно, имеется магнитное диполь-дипольное взаимодействие между обнаруженным убисемихн-ноном и одним из ЖСЦ МАШ-убихинон-оксидорздуктавы. Чувствительность убисемихинона к разобщителям электронного транспорта, а также наличие сигнала ЭПР центра 1 при АТФ-зависимом обратном транспорте позволяет предположить, что данный центр осуществляет сопряженный с переносом электрона трансмембрадный перенос протона, т.е. что обнаруженный убисемихинон является компонентом системы трансформации энергии электронного траке-

порта в энергию .

Из анализа литературных данных следует, что в зависимости от условий электронного транспорта в митохондриях можно набдю- а дать различные по свойствам свободнорадикальные центры. Наши предварительные эксперименты показали, что на самом деле сигнал свободного радикала при г-2.00 в исследуемых препаратах субмитохондриальных частиц является супперпозидией сигналов ЭПР нескольких парамагнитных центров с одинаковым значением е-фактора, примерно одинаковой шириной сигнала, но различающихся скоростью спин-решеточной релатации. Отсюда встают следующие задачи: во-первых, разделить сигналы ЭПР •нескольких парамагнитных центров, используя различие в скорости их релаксации, и, во-вторых, охарактеризовать скорость спин-решеточной релаксации каждого из парамагнитных центров. Специально под эти задачи была разработана методика низкотемпературной ЭПР-спект-роскопии, суть которой состоит в следующем: используя две физические величины, определяющие скорость спин-решеточной релаксации парамагнитной частицы, такие как мощность СВЧ и температура регистрации спектра ЭП?, можно указать такую область этих величин, в которой сигнал бьетрорелаксирукшего центра начинает насыщаться, а сигналы других медленнорглаксирующих центров существенно насыщены. В этой области температур и мощности СВЧ суммарный сигнал будет определяться, в основном, сигналом ЭПР центра, который начинает насыщаться, что позволяет провести исследование релаксационных характеристик этого центра. В , методике такие изложены критерии определения этой области, критерии применимости методики, основные, методы математического анализа и схема проведения ЭПР-исследования.

Основываясь на разработанной методике было установлено, .

что сигнал ЭПР свободного радикала при е-2.00 в сопряженных субмитохондриальных частицах определяется супперпозицией трех центров - 1, 2 и 3. Центр 3 характеризуется наименьшей скоростью спин-решеточной релаксации, сигналом ЭПР гауссовой формы и шириной 1.1т1.2 мТл. Центр 3 нечувствителен к ротенону. Центр 2 по релшссационным характеристик« - промежуточный мея-ду центром 1 и 3, имеет сигнал ЗПР гауссовой формы с шириной 0.9 мТл, что позволяет идентифицировать его как сигнал ЭПР убисешхинона. Центр 2 чувствителен к ротенону как в условиях прямого, так и ооратного электронного транспорта, следовательно, центр 2 связан с комплексом I дыхательной цепи митохондрий. Скорость его спин-решеточной релаксации меньше, чем у центра 1, но все же больше, чем у свободного, ни с чем не взаимодействующего убисемихинона. Это позволяет предположить, что релаксация центра 2 определяется процессом релаксации другого бысгрорелаксирующего парамагнитного центра. В условиях прямого электронного транспорта через комплекс I дыхательной цепи митохондрий число парамагнитных центров центра 1 : центра 2 : центра 3 соотносится как 1 : 1 : 1, при обратном энергозависимом транспорте - как 0.5 : 0.5 : 1. В области температур 30 т 50 К и мощности СВЧ 20 г 200 мВт сигналы ЭПР центров 2 и 3 сильно насьирни, сигнал центра 1 начинает насыщаться. Суммарный сигнал ЭПР свободного радикала при 2-2.00, в основном, определяется сигналом центра 1. При температуре регистрации 100 т 110 К сигнал центра 1 полностью уширеч, суммарный сигнал ЗЬР свободного радикала при мощности СВЧ 0.3 ; 200 мВт определяется суммой сигналов центра 2 и 3.

Особое внимание в четвертой главе уделено исследованию релаксационных характеристик центра 1 (низкотемпературный, бьют-

pope лаке крумций убксемихияон) и центра 2 (высокотемпературный, медлекнорелаксирущий убисемихинон). Используя в области температур 30 i- 50 К и мощности СВЧ 20 т 200 мВт, где суммарный сигнал ЭПР свободного радикала при g-2.00 определяется, в основном, центром 1, методику определения зависимости скорости спин-решеточной релаксации от температуры регистрации по насыщению сигнала ЭПР парамагнитной частицы, было обнаружено, что спнн-решеточная релаксация центра 1 определяется характерным процессом релаксации ЮЦ - дву^фононным процессом Орбаха; значения константы обменного взаимодействия между атомами железа желевосерного кластера С магнитное взаимодействие с которым определяет релаксацию убисемихинона), вычисленные по релаксации убисемихинона, с хорошей точностью совпадают с таковыми, непосредственно раочитанными по релаксации ЕСЦ для желевосерного центра N-2 комплекса I дыхательной цепи митохондрий. Это позволяет однозначно утверждать, что центр 1 связан с NADH-убкхшон-сксидоредуктааой,' имеется магнитное диполь-ди-полиное взаимодействие между центром 1 и ЖСЦ N-2 и что расстояние между быстрорелаксирующим убисемихнноном и N-2 равно примерно 10 А.

Для анализа диполь-дипольного взаимодействия центра 2 (медлэннорелаксирумдий убисемихинон) мы более подробно исследовали экспериментально установленный факт, что при повышении температуры регистрации препарата СШ до 240 т 245 К при последующей регистрации спектра ЭПР при 40 и 105 К сигналы ЗПР , центров 1 и 2 не найлюдаются, регистрируется только фоновый сигнал - сигнал центра 3. Этот процесс исчезновения сигналов мы назвали отжигом. •■ Экспериментально установлено, что процесс откига происходит при Т>235 К, при температуре 245 К удается

достоверно отснять дииашку отжига сигналов ЭПР центров 1 п 2, которая представлена на рисунке 4.

Рисунок 4. Зависимость интенсивности сигнала ЭПР свободного радикала от мощности СВЧ 1) в препарате сопряженных субмитс-хондриальних частиц па сердца быка (7 мг/ыл), восстановленном МАЛИ (2 мМ) и замороженном через 15 с. после добавления МАЕ!!, 2) после 10 минут отжига при Т-240 К, 3) после 15 минут отгага при Т-240 К, 4) после 20 минут отжига при Т-240 К. Условия регистрации: см. рис. 2, амплитуда «зодуляции 0.5 мТл, температура регистрации указана на рисунке.

В процессе отжига происходит исчезновение (окисление или восстановление) центра 1 (что отражает изменение тангенса угла наклона ); центр 2 теряет магнитное диполь-дипольное взаимодействие с быстрорелаксирукшм центром (что отражает изменение тангенса утла наклона Л г ), скорость спинреиеточной релаксации центра 2 уменьшается и становится примерно равной старости спин-решеточной релаксации центра 3; ЕСЦ Н-1Ь - окис-

ляется; состояние других электронных переносчиков комплекса I в процессе отжига не меняется. Динамика окисления 1ЫЬ быстрее (примерно в два раза), чем изменение релаксации центра 2, исчезновение сигнала ЭПР центра 1 происходит синхронно с изменением релаксации центра 2 в процессе отжига (рисунок 2). Эти экспериментальные результаты позволяют сделать вывод, что имеется магнитное диполь-дипольное взаимодействие мезду центром 1 и 2 и релаксация центра 1 (быстрорелаксируюший убисемихинон) определяет релаксацию центра 2 (кедленнорелаксирующий убисемихинон). В работе также приведено возможное объяснение установленных фактов в процессе отжига препаратов 'СЫЧ.

В последнем параграфе главы 4 рассматривается возможность участия обнаруженных убисемихинонов (центр 1 и 2) в процессе не только перекоса электрона по дыхательной цепи митохондрий, но и в процессе трансформации энергии в первом пункте сопряжения. Для этого мы оценили окислительно-восстановительный потенциал предшествующего переносчика электронов - ЕСЦ N-2. Основываясь на этой оценке, а таюке на литературных данных, был сделан вывод, что в процессе переноса двух электронов от N-2 к хинону выделяется энергия, достаточная для переноса трех протонов через внутреннюю мембрану митохондрий против градиента д^ Н+ . Учитывая эту оценку, литературные данные по участию ЗЕСЦ N -2 в процессе трансформации энергии и наш экспериментальные результаты, полученные при исследовании убисемихинонов, связанных с комплексом I, была предложена возможная схема места связывания убисемихинонов с ИМН-убихинон-оксидоредуктазой и первого пункта сопряжения в дыхательной цепи митохондрий. Суть данной схемы заключается в том, что при преносе двух электронов через КОД N-2 энергия электронного транспорта трансформи-

руется в энергию двух протонов, перенесенных черев внутреннюю мембрану митохондрий против градиента л/кН+. При поступлении двух электронов от И-2 на пул убихинонов происходит образование двух стабильных убисемихинонов, энергия рекомбинации кото рых трансформируется в энергию одного протона, перенесенного через мембрану митохондрий против градиента .

Заключение.

В заклячении кратко изложены основные экспериментальные результаты, полученные в диссертационной работе, рассмотрены перспективы даяьнейиего развития работы, основанные на результатах исследования. Еызоди.

1. При исследовании НАОН-Ш-оксидоредуктазиого компонента ыэмбраносвязанной метанмонооксигенаеи из бактерий иэ№у1ососсиз сарзи1аЬшз (штамм Н) методом низкотемпературной ЭПР-спектроснопии установлено, что фермент содерта-г четыре типа йзлезосерных центров с серусодержащ«,а лигандачи: два двухъядерных (центры 1 и 2), один трехъядерный (центр 3) и один четырехъядерный (цэнтр 4). Лани характеристики сигнала ЭПР каадого типа КОЦ и относительная оценка их среднего окислительно-восстановительного потенциала. Оценено относительное содержанке числа парамагнитных центров каждого типа.

2. Проведена экспериментальная оценка константы обменного взаимодействия (Л между ионами зкелеза в жэдезосерпых кластерах 2Ге ЕЦ и—2Ю.±40 см"1 для центра 1 и ,1—140+20 си 1 для

центра 2).

3. Установлено влияние п-хлормеркурийбеноойыой кислоты (.ПХМЕ) на свойства далеооеерных центров. Показано, что на начала.-

ных этапах воздействия ЮТБ на фермент наблюдается обратимое изменение релаксационных свойств 4Ге КОД (центр 4). Показана возможность реконструкции 2Ре ЛЩ (центр 1) после воздействия ПХМБ на структуру железосерного кластера. Показано, что при восстановлении фермента наблюдается переход 3 Ре ЖЩ (центр 3) в 4Ре ЖСЦ (центр 4). Этот переход блокируется ПХМБ.

4. При исследовании субмитохондриаяьных частин из сердца быка методом низкотемпературной ЭПР-спектроскопии установлено наличие стабильного, ротеноячувстзительного и -у -зависимого убисемнхинона (центр 1), связаннссо с МАШ-убихинон-оксидоредуктааой, который характеризуется быстрой сшш-ре-шеточной релаксацией.

5. Установлено наличие стабильного, рогекоччувствительного, связанного с комплексом I убисемихинона (центр 2), с релаксационными характеристиками, промежуточными между центром 1 и свободным убисемихиноном.

6. Разработана методика разделения сигналов ЭПР парамагнитных центров, существенно различающихся релаксационными характеристиками, но с одинаковым значением е- фактора и примерно одинаковой шириной линии.

7. & основе разработанной методики и метода непрерывного насыщения сигнала ЭПР установлено наличие магнитного диполь• дипольного взаимодействия мевду центром 1 и ЖСЦ М-2 комплекса I дыхательной цепи митохондрий. Нн основе экспериментов по отжигу показано, что имеется магнитное ди-поль-диполъное взаимодействие между двумя типами убисемихи-шнов (центры 1 и 2).

Основные результаты диссертации изложены в работах:

1. Д.Ш. Бурбаев, А. Д. Виноградов, A. R Котляр, И. А. Мэроз, а Д Следь. Стеб ильный убиеемшзюн, связанный с ЫАШ-де-гидрогеназой дыхательной цепи митохондрий. //В тез. YIII Всесоюзной конференции "Магнитный резонанс в биологии и медицине", Звенигород, 190Q, с. 65.

2. Бурбаев Д. ÜL , Гвоздев Р. И., topos И. А., Коршунова Л. А. Двухъядерные иелезосерные центры мембранно-связанной ме-танмоюоксигеназы из Methylococcus capsulatus. //Биофизика, 1990, Т. 35, N5, сс. 779-782.

3. Бурбаев Д. IIL , Моров И. А. , Котляр А. Б. , Следь R Д., Виног-. радов А. Д. Могнитнсе взаимодействие убисемихинона с хеле-зосерным центром N-2 NADH-дегидрогеназы дыхательной цепи митохондрий. //В тез. YIII Всесоюзной конференции "Магнитный резонанс в биологии и медицине", Звенигород, 1990, с. 64.

4. Мороз И. А., Бурбаев Д. Ш., Гвоздев Р. И. Оценка .константы обменного взаимодействия хелезосерных кластеров мембранно-связанной метанмонооксигеназы из bfethylococcus capsula-cus. //Биофизика, 19S0, т. 35, N4, сс. 614-617.

5. Мороз И. А. , Бурбаев Д. Ш., Гвоздев Р. И., Коршунова Л. А. Шгажествеиность форм жлеаосерных центров NADH-редуктазы мембраносвяэанной ыетанмонооксигейазы иэ бактерий Ktethy-lococcus capsulatus. //В тез. YIII Всесоюзной конференции "Магнитный резонэнс в Оиологии и , медицине"', Звенигород, 1990, с. 63.

е. Мороз Л А., Бурбаев Д. Ш. , Хангулов С. R , Гзоздев Р. IL , Коршунора Л. А. ^лезосерные центры NADH-оксидоредуктайы мембраносвязанной метанмонооксигеказы из Methylococcus capsulatus. //В тез. Ш Всесоюзной конференции "Магнит-

- 24 -

Hbfl pesoiiaEC s Gnojiorai h MSflmciHe", BBeHHropo/i, 1S89, c. 24.

7.' D. Sh. Burbaev, I. A. Moroz, L. A. Korshunova, R. I. Bvozdev. n Investigation of the iron-sulfur centers of the NADH-reductase of the membrane-bound monooxygenase of J.iethylocooous capsulatus. //In abstr. International symposium "Molecular organization of biological structures", Moscow, 1989, D-50.

8. Burbaev D. Sh. , Kforoz I. A., Kotlyar A. B., Sled V.D. , Vinogradov A D. Ubisemiquinone In the NADH-ubiquinone reductase region of the mitochondrial respiratory chain. //FEBS Lett. , 1989, v. 254, pp. 47-51.

9. Kotlyar A. B. , Sled V.D. , Burbaev D.Sh., lioroz I. A. , Vinogradov AD. Coupllns site I and the rotenon-sensitive ubisemiquinone in tightly coupled submitochondrial particles. //FEBS Lett.. 1990.. v. 264, pp. 17-20.

10. V. Sled, A. Kotlyar, D. Burbaov, I. Moroz, A. Vinogradov. Ubisemiquinone in the NADH-ubiquinone reductase region of the tightly coupled submitochondrial particles. //In abstr. "Sixth European Bioenergetics Conference", The Netherlands, 1990, EBEC Reports, 1990, v.6, S. 11-30.

M ty &U0f)0 zu ¿cc/St-CLf cpor^efiirefr, Gaxas gi/iW-he,! in-J] Tapes /00 THnorpa$jM MIIChC, yji. 0pr»ohhkiw39, 8/9