Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕТОДАМИ ПОЛЯРОГРАФИИ И ЭПР ©-ДИФЕНОЛОКСИДАЗЫ КЛУБНЕЙ КАРТОФЕЛЯ, ЗДОРОВОГО И ПОРАЖЕННОГО ВИРУСАМИ

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "ИССЛЕДОВАНИЕ МЕТОДАМИ ПОЛЯРОГРАФИИ И ЭПР ©-ДИФЕНОЛОКСИДАЗЫ КЛУБНЕЙ КАРТОФЕЛЯ, ЗДОРОВОГО И ПОРАЖЕННОГО ВИРУСАМИ"

ВСЕСОЮЗНАЯ ордена ЛЕНИНА академия СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК имени В. И. ЛЕНИНА

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИИ

На правах рукописи

ЧЕРНИКОВ Сергей Львович

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕТОДАМИ ПОЛЯРОГРАФИИ И ЭПР ©-ДИФЕН0Л0КСИДАЗЫ КЛУБНЕЙ КАРТОФЕЛЯ, ЗДОРОВОГО И ПОРАЖЕННОГО ВИРУСАМИ

(06.01.11 — Фитопатология и защита растений)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ленинград 1973

ВСЕСОЮЗНАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА АКАД&ШШ СЕДЬСКОХОЗЯЙСТаШШХ НАУК

имена В.И,ЛЕНИНА

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-HDCДЕДОВАТЕЛЬСККЙ ИНСТИТУТ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ

На правах рукописи

ЧЕРНИКОВ Сергей Львович

ИССЛЕДОВАНИЕ ШТОДАНИ ПОЛЯРОГРАИЛ И ЭГ1Р О-ДИИНОЛОКСИДАЗЫ КЛУБНКЙ КАРТОЗЖЛЯ, ЗДОРОВОГО И ПОРАЖЁННОГО ВИРУСАМИ

(06,01.11 - фиюгатология и ващита растений)

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

f -'ím .;......

Ленинград 1973

Работа выполнена в лаборатория бвофаеикн Всесоюаного научно-исследовательского института ващиты растений.

Научные руководители:

кандида* биологических наук С.В♦Андреевк кандидат биологических наук Д.Н.Логинова.

Социальные оппоненты:

доктор биологических наук профессор В.В.Полевой, кандидат (^явжко-математических наук А.Й.Иэчалкив.

Зедуцов учреждение - Агрофизический научно-неследовательский институт.

Автореферат разослан *•/<? " 1973 г.

Защита диссертации состоетел 1973 г.

в У часов на заседании Учёного Совета ВНЗР, Ленинград, ул.Герцена,42.

О диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Отеивн просим направддаь по адресу: Ленинград 190000, ул.Герцена,42, ВНЗР.

УчЗняЙ секретарь Совета

Х.И.Попова

Внедрение вирусов в клетки растения выбывает раеличные изменения в обиене веществ хозяина, в значительной степени связанные с перестройкой окислительных систем и цепей транспорта электронов.-Так как у вирусов кет окислительно-восстановительных ферментов, их репликация зависит от уровня к направленности. энергетических процессов поражённое клетки. Поэтому изучение этих процессов имеет большое вначение для выяснения механизма устойчивости растений. Решение указанной проблемы облегчит селекцию высокоустойчивых к ваболеваниям сортов сельскохозяйственных растений. Важной задачей исследований в этом плане является разработка методов диагностики и отбора устойчивых к заболеваниям форм растений на основе прямых я косвенных показателей.

Многие исследователи отмечают активирование фермента о-дифенолоксидавы (о-ДФО; полишенолоксидаза, тирозиназа; Кф 1.10.3.1) при различных поражениях растений, рассматривая этот факт как защитную реакцию растений на внедрение патогена (Купревич,1947; Рубин и яр.,1947,1971; Хан-добина и 0зерецковская,1959; го1упюзу еъ а1.,1959; и.,1964; тои^уата а. зъаьшапп, 1964; и т.д.).

о-ДФО катализирует две различные по механизму реакции: (1) окисление о-днфенолов в о-хиноны (ди$енолоксж-дазная активность) и (2) гидроксилирование некоторых мо-нофвнолов в о-ди<|енолн (монофенолоксидавкая активность)-какдая ив которых проявляет свои особенности.

ОН

0

(1)

ОН

ОН

СН8

сна

Функционирование этого фермента связано с содержавшийся в клетках растений фенольными соединениями, участвующими в биологическом окислении» фотосинтезе и т.д. (Залродатов,1964,1968,1970; Колесников,1966) и иммунитете растений (Рубин и Арциховская,1966; Мэтлицкий,1968). Однако многие вопросы, касающиеся функций о-ДФО в метаболизме и защитных реакциях растений, а также даханивма её действия, до сих пор не ясны.

Субстраты о-ДФО и продукты катализируемых ею реакций - о-хиноны - могут переходить в семихинонные свободные радикалы (СР). Последние играют важную роль в ферментативных реакциях, транспорте электронов, миграции энергии и т.д., а потому и в устойчивости растений к болезням. С другой стороны, ингибиторы радикальных процессов (ИРП), использованные для подавления некоторых еаболеваний животных (Эмануэль и Дипчина,1958; Эмануэль и др.,1959; Семенова и др.,1965; Эмануэль,1958; и т.д.) и растений (Дип-сиц а др.,1962; Симионеску,1962; Долягин и др.,1970)» относятся к фенольным соединениям. При этом ИРП сами могут находиться в СР-состоянии (Калмансон и др.,1961; Сапежин-ский и др.,1963;-Реунов и Шчалкия, 1970).

Эффективность использования ИРП будет зависеть от понимания молекулярных механизмов патологии, устойчивости растений и действия этих препаратов. Следовательно, изучение природы и роли СР в нормальных и патологических процессах имеет важное научное и практическое значение. Кроме того, до недавнего врешни предполагалось, что в реакциях (1) и (2), катализируемых о-ДФО, семихинонные СР образуются как промежуточный продукт.

Перечисленное вше указывает на необходимость дальнейшего исследования системы о-ДФО. Выяснению некоторых сторон функционирования и механизма действия этого фермента клубыей картофеля и посвящена представляемая работа, цель шторой заключалась в следующей:

1) исследование влияния поражения клубней картофеля вирусами на дифенолоксидазнук и монофенолоксидаэную активности о-ДФО, иашненпе отношения этих активностей.

а также на кинетику СР-процессов, сопровождающих соответствующие реакции фермента;

2) исследование ряда особенностей о-ДФО (кинетика ди-фенолоксидааной и монофвнолоксадагноЙ реакций, отношение двух активностей, влияние металловязывающих ингибиторов на активности фермента);

3} установление причин возникновения СР при протекании реакций о-ДФО здоровых и поражённых вирусами клубней картофеля *

ОБЫКТЫ И МЕГГ0ДЕ1

Объектом исследования служили клубни картофеля сорта Берлихинген в период покоя, здорового и поражённого вирусами Х+5+Ы(К). Эти вирусы вызывают, как правило, системную реакцию у картофеля, т.е. поражение всего растения. Под здоровыми клубнями картофеля подразумеваем клубни, свободные от вирусной инфекции.

Серия опытов проведена с очищенной о-ДФО клубней вдо-рового картофеля, полученной в лаборатории биофизики ВИЗР.

Полярографический метод исследования о-ДйО использован рэдои авторов { ЗлегэЬаш , 1956; Вепйа11 а. йгедогу, 1963,1966; Тата^исЫ ей а1., 1969; Бузуя и др,,1970). Эти исследователи, работавшие с очищенными препаратами фермента, приводят данные для дифенолоксвдавной активности, поскольку моно$енолоксидавная утрачивается при очистке легче и быстрее первой. о-ДФО клубней картофеля обладает очень высокой монофенолоксидааноГ. активностью. Поэтому представлялось важный исследовать обе активности фермента одним прямым методом - полярографический.

Нами собрана пол*фографическая установка со стационарны« платиновым электродом мембранного типа и ячейкой по Х.Ф.Шольцу и Д.Н.Островскому (1965) в модификации О.А.Димитрова (1966), Регистрации кривых поглощения кислорода -автоматическая, на электродном потенциометре ЭПП-09ЫЗ.

Определение скорости погловэния кислорода при протекании моно- и дифенолоксидовной реакций о-Д$0 проводили следующим образом. К 9 г мякоти клубня картофеля добавляли

б ил 1/15 If фосфатного буфера в гомогенизировали при еРС а течение 5 мин. в ыикроизиельчителе тканей РТ-2. Гоиоге-нат фильтровали черев бумажный фильтр при 5°С. В ячейку вносили: 3,7 ил 1/15 M фосфатного буфера с соответствуй^ щей величиной рн (при работе о ингибиторами - 3,6 ыл ), 0,1 ил раствора субстрата - пирокатехина или п-кревола (конечныэ концентрации 1,2-10~3М), 0,1 ил раствора ингибитора, 0,2 ил фильтрата или разбавленного в 10 pas препарата очищенного фермента* о-ДФО является медьсодержащий ферментом. Поэтому испольаованы след у ища в шталлсвявывасо-щие ингибиторы: азид натрия (5-10""1!*, 1*10"311; рН 4,8),. цианид калия (5-10~4М; рН 7,4) и тиоиочевина (5*10"3М; рН 7,4), Активность о-ДФО выражали в относительных единицах как тангенс угла наклона касательной к 1фивой поглощения кислорода.

Белок определяли по методу Яоуря и яр, (Lowry et al, , 1951),Препарат очищенной о-Щ) содержал 71,3 мг белка/ил. Скорость поглощения кислорода (цкЫ О^/мин.-ыг белка; среда - 0,1 U фосфатный буфер, t = 21°С) в дифенолоксидавной реакции, катализируемой очишрнной о-ДФО, составляла 0,59 (рН 4,6) н 0,63 (рН 7,4),.а в ионофенолоксидавной реакции 0,06 (pfl 4,8) и 0,17 (рН 7,4).

Возникновение CP при протекании реакций о-ДФО исследовали методом электронного парамагнитного резонанса {ЭПРХ 0,3 г иякоти клубня картофеля растирали в ступке с 0,7 ил (контроль) 1/15 U фосфатного буфера. При работе с иетаял-свявывающими ингибиторами ткань клубня сначала растирали с 0,5 ил буфера,затем вносили 0,2 ил раствора ингибитора -аеида натрия (2*10~3М и б*10~3М; рН 4,8) или тиоыочевинн (5 * 10~3ц* рй 7,4). Гоиогенат переносили в специальные колбочки и прибавляли (нулевое время) 0,2 ил раствора субстрата - пирокатехина или п-кревола ( 8*10~^li). Проводили также реакции с очищенной о-ДФО: к 0,4 ил буфера с рН 7,4 (0,3 ил в опытах с тиоиочевиной - 0,1 ил, 5'10~3М) добавляли 0,2 мл препарата фермента и 0,2 мл раствора соответствующего субстрата (в'Ю*3!!). Черев 0,5, 1, 5 и 10 мин.

б

для д ифэ н олокс ид о sho Я активности а 1, 3, 7 и 15 мин. для ыонофэнолоксидааной активности реакционную сиесь фиксировали жидкий азотом, заливая его в колбочки. При исследования кинетики накопления CP при протекании реакций, катализируемых очищеяноЗ о-Д<Е0, «а 5 сек. до заливания азота в голйочки вносили по 30 иг ыолселекта Г-25 в качестве наполнителя.

Ли0$или80ванние образцы (30 мг) помещали в полиэтиленовые ампулы. Спектры ЭПР регистрировали на радиоспэстро-метре 3-х си диапазона РЭ-1301. Стандартами служили ДФПГ и ионы Мп2+ в кристаллической решетке %0. CP-сигналы обраа-цов гатасывали одновреиенно со спектром стандарта Mn^/^JgO.

Опыты проводили при кошаткой температуре не менее, чем в 5-ти ратной повторности. Статистически обработанные экспериментальные данные представлены как х i s^. Считали ревность существенной при 5%-ном уровне энчч;;дасти (ро<0,05).

ИССЛЕДОЗАНИВ о-ДЗО МЕТОДОМ ПОЛЯРОГРАСИК

На ptic.l приведены кривые поглощения кислорода в "лоно-и ди<£енолоксидазной реаквдях о-Д40. Отчётливо вкяно р&гл»-чие этих кривых, отраиающее разницу в протекании соотзет-ствуюпфх реакций во бремени при непрерывном снижении концентрации кислорода в реакционной среде.

Лифенолоксидазная реакция характеризуется постоянством скорости поглощения кислорода при его высоких концентрациях с постепенным снияданиеи скорости из-за падения ган-центрации кислорода и инактивации фермента продуктом реакции - о-бензохиноном (Опарин и Курсанов,1929; Graub&rd . а. Nelson , 1935; Aslmov a. Dawson, 1950; Загрометов, 1970) , Константа Цихаэлиса этой реакции для кислорода , определённая методом двойных обратных ВвЛИЧИН (iiiilfcweaver BurÜ* 1334), равна 4-t0~4lt 0¿.

Цоно<?енолоксявазная реакция проявляет исключительные особенности: в начале её наблюдается индукционный период

N

мкЫ .

250 а

Рис.1. Поглощение кисло да в дифенолоксидазной и шнофвнолоксвдавной реакциях о-Д40. Стрелкой отмечен момент внесения

фермента в ячейку

0

Л-1-1-1--

О 4 е 12 16 мин

(рис.1, кривая 2, участок аб), еа которым следует постоянство скорости поглощения кислорода (участок бв). Полярографический ыетод регистрации поглощения кислорода позволяет следить за реакцией сразу после внесения в реакционную смесь фермента, благодаря чеку мы установили зависимость длительности индукционного периода от величины ионо- активности о-ДФО и от концентрации добавленного о-дифенола. Дополнительное внесение о-дифенола (пирокатехин) в ячейку, в которой протекает монофенолоксидаэная реакция, сокращало индукционный период, но скорость поглощения кислорода оставалась постоянной и не зависела от количества о-дифенола.

Влияние т>Н (рис.2) на активности определено на-

ши при рН 6,4-7,8. В указанных пределах рН обе активности о-ДЗО изменяются незначительно, однако эта область рН представ л дат интерес, так как в ней перекрыв акт с я оптиму-кы дифенолоксидазной (рН 4,5-6,2) и моно<;енолоксидагноК СрН 6-8,5) активности фермента ив рааличных организмов. При поражении клубней картофеля вирусами возрастают обе активности о-ДФО (рю<0,05). Равличия хода кривых дифе-

14 гЦ 1

¿12 ш

•

° 8 ь

8«

¡4 » •I-

и

0

6,4

л

]—-;■■

Рис.2. Влияние рН аа ди-

фено локс ид а вн ую (1,2-)

и мо но фзш локс пда 8 яую

1 —____т (3,4--) активности о-ДСО

__3-1-----вдоровых (*—*) и пораженных вирус аш (*—*) клуб-Л-1------{__, ней картофеля.

6,8 7,2 7,6 РН

нолоксидаеноЯ активности о-ДЮ вдоровых (кривая 2) и пораженных вирусами (кривая 1) клубней, так ке как и ыонофе-нолоксидазной активности (кривые 4 л 3).малозначимы. Следовательно, общий характер зависимости от рН двух активностей о-ДФО.поражённых вирусами клубней сохраняется.

Исследование влияния ингибиторов (таблица) показало, что испояьвованные наш в работе металлсвявывающие ингибиторы оказывают одинаковое действие (различие малозначимо) на О-Д50 здоровых и поражённых вирусами клубней. Наибольшее ингибирование активностей вызывал цианид, а надменьшее - т ко мочевина. Монофенолоксидазная активность о-ДАО обладает резистентность» к ыеталлсвязывающим ингибиторам, что выражается в более слабом снижении этой активности тиомочевиной по сравнению с дифенолоксидазной.Кроме того, азид в концентрациях 5*10"% и 1 • Ю М подавляет дифенол-оксидазную активность о-ДФО здоровых и поражённых вирусами клубней на 62,9-63,8 % и 67,9-68,5 %t но повышает ионо-фенолонсидавную на 37,2-39,7 % или уменьшает её лишь на 15,0-17,4 % соответственно. Дополнительное исследование влияния ингибиторов на обе активности очищенной о-ДФО к

Влияние шталлсвязываювщх ингибиторов на дифенолоксидавную и монофенолоксидавную активности о-ДФО клубней картофеля

0-ДЗЮ Активность Ингибя-тор*/ Контроль Опыт % инги-бироввния Ро <

Нлубян вдорового картофеля Ди- ты 5,28 2,69 51,2 0,002

кот 1,32 75,1 0,001

1 Нал, 5II 4,17 1,55 62,9 0,002

1,31 68,5 0,001

ыоно- ты 2,27 1,54 32,2 0,05

кем 0,59 74,0 0,001

I НаН, 3 И 0,92 1,28 АКТИВИр. 39,7 0,01

0,76 17,4 0,05

Клубни картофеля, порешенного вирусами ДИ- ТЫ И, 67 5,76 50,3 0,002

ксн 2,9В 74,6 0,001

I Пая, 5 И 8,74 3,17 63,8 0,002

2,81 67,9 0,001

коко- ТЫ 5,64 3,74 33,7 0,05

кем 1,57 72» X 0.001

I НаЯ, ?и г, ов 2,85 Активар. 37.2 0,01

1,76 15,0 0,05

х/ Конечные концентрации иаглбиторов (II): твоиочевина (ТМ; рН 7,4) - 5*Ю~3; КОТ (рН 7,4) - 5-10*4! НаН? (рН»4,8) - (I) 5-Ю-4. (П) 1-Ю'3.

фермента этиолированных ростков клубней картофеля такие показало отмеченную выше peaseтентность ионофенолокевдаа-ноЙ активности к ингибиторам. Это подчёркивает различие двух активностей и сложность механизма действия о-ДФО.

Установленные данные можно объяснить различием функциональных групп активного центра о-ДФО, участвующих в связывании субстратов в каталитическом акте при протекании реакций (l) е (2). Иначе говоря, полученные в работе ревультаты подтверждают гипотезу ферментативного окисления монофенолов в о-дифенолы и указывают на существование двух каталитических участков в активном центре о-ДФО,каждый ив которых, как можно предполагать, комплементарен своим субстратам - о-дифенолам или нонофенолам. Последнее, так же как разница в механизме двух реакций, и находят своё выражение в разном отношнии соответствующих активностей о-ДФО к рН и ыеталлсвязывамщи ингибиторам.

Показанное нами возрастание активности о-ДФО клубней картофеля при поражении их вирусами может происходить по ряду причин: синтез фермента de novo, активация его латентной формы, изменение изоферментного состава и т.д. Ив реаультатов работы (отсутствие закономерных различив во влиянии рН и ингибиторов на о-ДФО здоровых и поражённых вирусами клубней) следует, что независимо .от причин активирования 0-Д5Ю характеристики, определяющие функциональные особенности этого фермента, не изменяются при поражении клубней вирусами.

Отноиение дисГ&нолоксидазноЕ ц моно^нолоксидазиой ак-Ап

тивносте" о-ДФО (~) широко обсуждается в литературе, так »к

как оно связано с механизмом действия фермента, По нат данным, о-ДФО клубнеЯ картофеля при рН 6,<1-7,8 имеет ^ в пределах 2,0-3,4 (рис.З). Зелкчина отношения не остаётся постоянном, но меняется в зависимости от рН в соответствии с изменением активностей фермента. Цишшальное значение наблюдается в области рН 7,0. 3 кислой среде

(рН 4,8) оно увеличивается , ва счёт относительно большего снижения «оно- активности и достигает величины порядка 4,5 (таблица), а при рН 7,0-7,8 меняется очень незначительно .

ч

А« 4-

Рис.З. Влияние рН на отношение дифенолоксидавной активности к монофенолокси-

1 давной (4&) о-Д<Ю клубней I ¿и

адорового (1) и пораЕёиного вирусами (2) картофеля.

(1—1___I_ ' _I___

6,4 6,6 7,2 7,6 рН

Важность рассмотрения отношения двух активностей о-ДФО, а вначиг, и полярогра^чвского метода их определения, хорошо проявляется при сравнении этого отношения фермента здоровых и поражённых вирусами клубней (рис.3).Кривые ва-

ввсииости от рН в обоих случаях близки, однако аначе-Ам

ния отношения несколько выше для о-ДФО здоровых клубней картофеля (различие статистически достоверно) .Как отмочено вше, в поражённых вирусами клубнях повышаются обе активности о-ДФО (рис.2). Следовательно, при атом монофеноя-оксидявная активность увеличивается в большей степени по сравнению с дифеяолоксидазноЗ.

С.Вушиляю с со авт. (воисЫИоиг еЪ а1. ,1963) предположили, что существуют два (или более) типа субъединиц о-ДФО, обладающих характерными активностями по отношению

к о-дифенолаии ыонофенолам* Ис хо д я:: и в_.это го 2_по ложе ни яиг литературных данных.по.механизму;действия о-ДФО,можночза.^; кшочить, что по лу че н н ые - в ;ра бот е I ре а у л ьт ат выв в а нтот ли - ;> чияыи в комбинации субъединиц о-ДФО вдоровых в пораже вирусам клубней. 'Иначе :товорД";т'6олш

фнолоксмдазной^агаивности^-ДФО, вовКимо.^. обусловлено-^ изменением четвврт11^ной!.стру^у^„^р^в^та.^*

Моно£енолотеидааная;реаквдято-Дф.,,,йвд^ .р.иг^

рает важную роль вт-детоксикацин рае личных-ядоа^ вт.органив— ме животных и 'растений.:4. (»11к1лаоп и-- кыеет .значение)

для устойчивости картофеля к фитофторе {Нилова и Гусева , 1972). Погтому установленное нами относительно большее повышение моиофенолоксидазной активности о-ДФО при поражении клубнейзвирусами^ по-видимому^, свявано со степень» устойчивостирастения'картофеля к вирусам. |

ИССЖДОЗАЩ^СИСТЕШ о-ДФО МЕТОДОМ ЭПРХ |

Все зарег'истрированнйе0 СР-сигналы^ЭПР „ представляли^

м Л'' А: '4 С ^ 1 < "" Ч «Ъ, ' 1 , ' 1.'4 .- *

собой слегка асишетричные; синглеты с г-факторов близким-к г-фактору свободного электрона, и* шириной иажду-та^каии

максимального"на кло на^*~8*,5 а,__При_исло.4ьзовании„кипячё-

ного гоиогената ткани клубней* Картофеля или кипячёного препарата очищенной о-ДФО наблюдался незначительный СР-сигнал, величина которого не изменялась во времени. Точно также в отсутствие субстратов фермента количество СР практически н е - эрараста/10^а о т нос иг ел ьв о ^ и с хо д ного уровня. Следовательно,^увеличением количе^твр наших опытах

связано с функционированием о-Д®. "'V !

. -^¿г.уъ-ол Р ? .....~ ^ _

ДиДеполоксидазноя.- активность о-ДФОЛ-Рис*4- и~5£.Наибо-

лее резкое возрастание-концентрации СР в начале"соОтвет-ствукще!! реакции^к на.бл-юдеется для о-Д50 здоровых клубнеГ: (рис.4, кривая 1). По с т е пе нцоТдкорс р тй"у ве личвн5я~конце н-

трации СР падает.Для реакций des нспольвования иеталлсвя-вывавщях ингибиторов (контроль) характерны более высокие скорости накопления s большие предельные значения концентрации СР.

При рН 7,4 рассматриваемая активность О-Д40 выше, чем при рН 4,8* Этим можно объяснить различия соответствующих кривых на рис.4 и 5 (кривые 1, кривые 2 и т.д*- сравниваются данные, полученные для реакций, отличающихся только по рН среда)* Несмотря на то* что при рН 4,8 дифвнолокси-давная активность лишь на 21-25 % ниже, чем при рН 7*4 (таблица), концентрации СР меньше в 2-3 pesa в вависимости

120

Рис.4. Влияние ткомочевины

центрацюо СР* возникающих в результате протекания да-фенодоксидавноЕ реакции о-ДЮ клубней здорового (1,2) и поражённого вирусами (3,4) картофеля.

Штриховые линии - контроль.

О 1

5

10 мин.

.40

M

Рис,S. Влияние авида нат

рия (2*10 il; рН 4.8) на концентрация» СР, возникающих в ревультате протекания дифенолоксндааноН ре-

Эбоаначения - см.рис.4

0 1

5

10 пая.

от врэиенн, прошедшего после нечала реакции, и источника о-ДФО. Следовательно, caita концентрация CP сильно ваввсит от рН. Действительно, покавано (ъ1о1в, 1955;. Но efcLne, 1955; Ingram ,1958,1969; Калиансон, 1953), что пара» в орто-бенво-сеыихиноны более стабильны в щелочной среде.

Иэталлсвявивающие ингибиторы, подавляя дифэнолокси-дазнум активность, вызывают тек сашш снижение концентрации GP.

МонофАнодоксидавная активность о-ДДО (рис.6 я 7).Данные по влиянию 1вталлсвя8ывающих ингибиторов на возникновение CP при протекания ионофенолоксидавноЯ реакции о-Д40 адоровых и пораненных, вирусами клубней кокавывакгг, что

60

40

н

о

-10

*ВГ .о.

0 13

30-

«

®ао *

ж ti о

Рис.6. Влияние тно-иочевины (5*10-3Н ; рН 7,4) па концентрацию CP, возникающих в результате протекл-ния монофонолоксидзв-ной реакции о-ДФО. Обозначения - cu. рис.4.'

15 кии.

Рис.7. Влияние авида натрия (6-10~3И ; рЯ 4,8) на концентрацию CP» возникающих в результате протекания ыонофеяолоксждаэ-воВ реакции о-ДФО. Обозначения - см. рис .4.

0 1

15 кия.

„".■ ■i'1 14 [ V* - ■ 1. *» ► V" П f kj 1-J ' * il ilni»^ fti1 ц*44 « Fi I'" •"•'•' '

зависимость концентрацииСР от" в ре пени;' прошедшего с на-.ча'ла это Й 'реакци и Г ^ с увр ственн о s отли чается 'от'аналогичной 'зависимости' для 1:ди<|вноло ади д аз ной реакции^;В^ ионо- реак-" ции ''максимальное количество СР'^меньше' даже'через 15 иин. по сравнении с "иакси шльный количеством в ' дй^енолоксядаз-ной реакцииг(при ' одинаковых'pH),что рыожно'объяснить большей'-величиной дифен олоксидааной гакти"вн octhV1'

При переходе от слабощелочной среды (рис,6, кривые „1,. 3) к кислой (рис .7, зависимости ^. ЗО.^наблюдается рев-.ко е ^уиеньшение. скорости^накопления !CPi' ¿Это". связано, во-первых, со з на чит ельныы;сниженмеы,ноно-;актяв ности в кис-, лой среде* -Во-вторых» как упоминалось»;.стабильность семи-хинонных СР в кислой среде меньше, чей в щелочной. В результате при pH 4,8 количество СР в течение 15 мин* практически .не, возрастает (ро>0,05) по сравнению с исходный уровн9м:{рйс.7,.¿ависиыости'1, 3).... ■'./.: ^Индукционный период моно^внолоксидазной реакции при регистрации СРненаблюдается из-за присутствия в роакци-"онной сыеси о-дифенолов гомогената. Поэтому-уже с начала 'реакции; ^увеличение ко л иче с т ва- СР'— и д ёт,с постоянной скоростью,1' ад^^жет^'отвечать .^постоянству*скорости' поглощения кислорода ,(рис.1, кривая 2, участок;Св).-Примерно через б мин. (рис,б, хфлвые 1 и 3) ив-за падения скорости поглощения кислорода г^приГ очень" низком"" содержании его (рис.1, кривая 2, участок вг) происходит снижение скорости накопления СР» соответствующее уменьшению моно- актнв-ности о-ДФ)'здоровых и поражённых вирусами клубней. Если же активностьгвгначале реакции незначительна (кривые 2 и -;4-на рис.б:"и 7), >о линейность*возрастания концентрации "СР наблюдается-в-течение всех 15-ыин. ' ; ^.

Ыетодо1Г,ЭПР .также установлена резистентность ыонофе-"нолотеида зной ."активности о-Д$0: к металле в яе ывающии ингибиторам,Это ^выражается в относительно меньшем подавлении её тиомочеэиной (5* 10~%) и вактивировонии азидом в концентрации б-10Т?М, '„тогда как дифэнолоксидазная активность ингибируется азидом при использовании его уже

в концентрация 2*10 М.

Кинетика накопления CP, возникающих в результате протекания дифенолоксидавной и моиопенолоксидазно;! реакций очищенной о-ДФО, также различна для этих реакций, а кинетические кривые подобны кривым, установленный для (¡.ерцента гоиогенатов ткани клубней картофеля.

Причины возникновения CP при протекании реакций о-МО рассмотрены на примере дгя^енолоксидазноil реакции (1). При этом неходили из данных по поглощению кислорода(Необходимости восстановления кислорода до воды и влияния рН на накопление СР. Кроме того, даже череа Ю мин. после начала дифенолоксядазной реакции максимальная концентрация CP составляла лигсь порядка 0,25 % от концентрации о-хинона, в которой он может образоваться в соответствии со стехиометрией этой реакции. На основании отпеченных (¡актов сделан ешвод, что семихкнонные CP возникают в основном в результате обратной дисыутации (обратного диспропорциониро-вания) о-хинонов и о-дифенолов. Другими словами, CP образуются при установлении равновесия между окисленной и восстановленной формой субстрата.

Накопление CP обусловлено, по-видкмому, как возрастанием в процессе реакции количества о-хинона (о-лишенол -пирокатехин - взят в избытке), так и сорбцией CP белковыми молекулами реакционно!! смеси с делокализацией неспэ-ренных электронов по ним (Б«смонс5елъд,1958; Калмансон и др.,1961; Калмансон,1953). Кроме того, часть CP может накапливаться в димерноИ диамагнитной игорме (Калмансон, 1&53) или из-за образования меланиноподобных веществ. Последние, как показано (Сотапопвг et al.,1954; Mason et а1.,19»0;Рубан и др.,1958; Бкдзиля и Зезина,1971), дают СР-скгнал ЗПР.

Так как в моно^енолоксидазной реакции (2) моно(;енолы переходят в о-диЛенолы, естественно предположить образование CP при её протекании в результате обратной днекута-ции о-хинонов, возникающих при окислении этих о-дис]енолов. Дифенолоксидавная активность вьгае монооенолоксидазной,

в силу чего количество СР .при проявление второй активности меньше.

Таким образом, регистрируемые нами СР не являются непосредственным продуктом дифенолонсидавной к моно^янолок-сидааной реакций о-ДЗО. Иначе говоря, возникновение семи-хинониых СР.при протекании реакций о-Д$0 носит вторичный характер, а фермент относится к группе оксидоредуктаз, осуществляющих каталитическую функцию по схеме: два двух-электронных донора (дзе молекулы о-дифенола) - четырех-электронный акцептор (молекула кислорода). Это подтверждает положение Х.Ыейсона (Иааоп,1957) о том, что о-Д$0 является четырехэлектронной трансфэравоЙ.

Злияние поражения клубней картофеля вирусами на кинетику ОР-процессов заключается в значительном уменьшении концентрации СР, вовникающих в результате протекания ди-фенолоксидазной (рис.4,5) и монофенолоксидавной (рис.6,7) реакций о-ДФО, по сравнению с реакциями фермента вдоровых клубней. Но при поражении клубней вирусами обе активности о-ДФО возрастают (рис.2), что, казалось бы, должно вызывать более интенсивное накопление СР, Следовательно, в .поражённых клубнях уровень СР-процессов снижается, 3 этом случае, так же как и при действии метадлсвязывающих ингибиторов, характер соответствукщих кинетических кривых сохраняется.

Исходя ив приведённых на стр.4 литературных данных о роди НЕРП в подавлении некоторых патологических процессов животных и растений, допустимо предположить, что активирование системы о-ДЗО клубней картофеля при поражении их вирусами сопровождается накоплением ИРП. Это монет, служить защитной реакцией растения на внедрение вирусов. Так как в поражённом органе часто возрастает количество различных фенольных соединений (в том числе субстратов о-Д$0), некоторые из них, возможно, и выступают как естественные ИРП.

Репликация вирусов зависят от энергетических процес-

сов в клетках растения-хозяина. Поэтому не исключено, что роль ИРП заключается в изменении энергетического метаболизма клетки при её поракении, поскольку фенольные вещества, в том числе их семихинонные формы, участвуют в регулировании потока электронов и протонов (Колесников,196$.

Рядом авторов (Долягин и др.,1970; Липсиц и др.,1971) показано, что заражение возбудителем рака ростков различающихся по устойчивости сортов картофеля приводило к увеличению концентрации СР в ростках восприимчивого сорта, тогда как в ростках устойчивого сорта концентрация СР снижалась. Поэтому установленное нами в работе подавление СР-процессов, сопровождающих реакции о-ДФО, может ишть значение для степени устойчивости растения картофеля к вирусам.

Чтобы избежать противоречий при исследования концентрации СР и её изменения в ходе развитая патологических процессов, нужно учитывать накопление фенольных веществ, в том числе ИРП, и активирование о-ДЮ как защитные реакции растительного организма, ибо и то и другое связано со свободноради гальныни процессами. Это будет способствовать вменению механизма устойчивости растений и роли СР я ИРП в ней.

Отмеченные в работе различия система о-ДФО здоровых и поражённых вирусами клубней, по-видимому, связаны со степенью устойчивости картофеля к вирусам и могут быть использованы при отборе устойчивых к вирусам исходных форм и образцов растений картофеля.

ВЫВОДЫ

1* В клубнях картофеля, поражённых смешанной инфекцией вирусов Х+Э+Ы, возрастает как дифенолоксидавная, так и монофенолоксядазная активность о-ДФО, причём монофенол-оксидавная активность повышается в больней степени.

2. Характеристики, определяющие функциональные особенности о-Д$0, н® ивыеняются при поражении клубней вирусами. Об этой свидетельствует отсутствие закономерных различий

в зависимости отношения активностей ^ от рН н во влиянии

Ам

рН и металлсвязавакщих ингибиторов (азид, цианид, тиомочевина ) на активности фермента здоровых и поражённых вирусами клубней.

3. Установлено, что при протекании дифенодоксидавной и монофенолоксидазной реакций о-ДФО клубней картофеля образуются семихинонные СР, которые, однако, не являются непосредственным продуктом этих реакций. Они возникают в основном в результате обратной дисмутации продуктов и субстратов реакций, катализируемых ферментом.

■4, Кинетика накопления СР различна для обеих реакций о-ДСО, что связано с особенностями проявления соответствующих активностей фермента, и зависит от условий эксперимента: рН среды, присутствия металлсвязывающих ингибиторов о-Д£0 и поражения клубней вирусами*

5. В поражённых вирусами клубнях происходит снижение интенсивности СР-процессов при протекании дифенолоксидаз-ной и монофенолоксидавной реакций о-ДФО, хотя характер кинетических кривых сохраняется. Предполагается, что активирование системы о-ДФО клубней каргго^еля при поражении их вирусами сопровождается увеличением юличества ИРП.

6. Результаты исследования о-ДЗО кдубней картофеля, здорового и поражённого вирусами, методами полярографии и ЭПР указывают на существенное различие двух активностей и сложность механизма действия фермента и подтверждают гипотезу ферментативного окисления монофенолов. Установлено, что монофенолоксидазная активность о-ДФО проявляет резистентность к металлевязывающим ингибиторам (азид и тиомочевина).

Материалы диссертации отражены в следующих печатных работах:

1. Сравнительное исследование моно- и дифенолоксидазноЙ активностей о-дифенолоксидазы. 1С Всесоюзный Биохимический Съезд, Ташкент, октябрь 1970. Тезисы секционных сообщений. Секция 3; Химия и биохимия ферментов, регуляция, стр.131-132.(Соавт. Л.Н.Логинова,Н.Е.Богданова}

2. К вопросу о соотношении ыоно- я дифенолоксидазной активностей о-дифенолоксидавы. Докл.АН СССР, 192. * 4, 920-922, 1970» (Соавт. Л.Н.Логинова, Н.Е.Богданова)

3. о-Дифенолоксидааа - океидава со смешанными функциями. 3 кн.: Физиология и биохимия здорового и больного растения, стр.92-105. Изд. Московского университета, 1970. (Соавт. Л.Н.Логинова, Н.Е.Богданова)

4. Влияние вирусной инфекции на свободнорадикал ыше процессы в растительных тканях. VI Всесоюзное Совещание по вирусным болезням растения, Киев, май 1971. Тезисы докладов, часть 1, стр.32. (Соавт, Н.Е.Богданова, С.Г.Голов, Э.В.Завьялова, Л.Н.Логинова)

5* о-Дифенолоксидаза (1.10.3.1) и свободнорадикальные состояния поражённых вирусной инфекцией растений. IV Международный Биофизический Конгресс, Москва, август 1972. Тезисы секционных докладов, т.4, стр.223224.

6» Определение активности цитохромоксидавы, аскорбинат-, оксидавы и о-дифенолоксидазы полярографическим методом. Бюллетень ВЛЗР, Í» 25 , 66-71, 1973Í

Ртп тип. 8ИР SSK. » £>(£) тнр.2 00.