Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование механизмов диссипации протондвижущей силы митохондрий

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование механизмов диссипации протондвижущей силы митохондрий"

г . Л л " /

* «ч^

На правах рукописи

Балакирев Максим Юрьевич

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ ДИССИПАЦИИ ПРОТОНДВИЖУЩЕЙ СИЛЫ МИТОХОНДРИЙ

03.00.04 -биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Новосибирск - 1997

Работа выполнена в Институте химической кинетики и горения СО РАН г.Новосибирск

Научные руководители: д. х. н, Храмцов В. В.

Институт химической кинетики и горения СО РАН

Официальные оппоненты: д. х. н. профессор Г. А. Невинский

Новосибирский институт биоорганической химии СО РАН

к. б. н. Л. Ф. Гуляева

Институт молекулярной патологии и экологической биохимии СО РАМН

Ведущая организация Институт цитологии и генетики СО РАН

Зашита состоится {1997 г в У^'ч на заседании диссертационного совета

/

К 003.52.01 в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН в конференц-зале института по адресу: 630090, Новосибирск, прос. акад. Лаврентьева, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биоорганической химии СО РАН

Автореферат разослан ЧР" £—• 1997г.

//

Учёный секретарь диссертационного совета к. х. н.

° с федорова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Согласно хемиосмотической теории Митчелла трансмембранный электрохимический градиент протона, протондвижущая сила (Ар), является основным источником э/герги.ч синтеза. АТФ в митохондриях. В создании Ар принимают участие ряд митохондриальных дегидрогеназ, преобразующих энергию окисления субстратов в электрохимический градиент Н', тогда как утилизация Ар происходит в протонном канале АТФ-синтазного комплекса. Помимо целенаправленного использования для синтеза АТФ, Ар может рассеиваться переходя в тепло (иначе говоря- диссипатировать) в трансмембранных потоках различных ионов присутствующих в среде. В некоторых случаях диссииативные потоки через внутреннюю мембрану митохондрий (ВММ) могут достигать значительной величины, приводя к коллапсу Ар и ингибированию синтеза АТФ. Считается, что определяющим фактором увеличения трансмембранных ионных потоков является рост проницаемости ВММ, который, в свою очередь, может осуществляться по различным механизмам. Несмотря на растущее количество данных свидетельствующих о важной роли процессов диссипации йр в системе митохондриального транспорта, регуляции термогенеза и образования кислородных интермедиатов, равно как и в различных патофизиологических процессах и клеточном апоптозе, механизмы данного явления по прежнему неясны

Цель настоящей работы заключалась в исследовании механизмов увеличения проницаемости ВММ, приводящих к диссипации протондвижущей силы митохондрий. В задачи исследования входило:

1. Оценить ионную проницаемость липидной части ВММ в модельной системе фосфолипидных липосом.

2. Исследовать влияние нарушений митохондриального метаболизма на проницаемость внутренней мембраны изолированных митохондрий.

3. Исследовать механизм развития неселективной проницаемости ВММ, "макропроницаемости", на примере тиурам-дисульфид- индуцированной пермиабилизации митохондрий.

4. Изучить возможную роль N0, одного из важнейших биохимических посредников, в регуляции "макропроницаемосги" митохондрий.

Научная новизна представленной работы состоит в следующем:

1. Впервые был применен метод рН-чувствительного спинового зонда для исследования трансмембранного транспорта различных ионов. С его помощью были оценены коэффициенты проницаемости Н\ СГ, К' и ТГ для фосфолипидного бислоя.

2. Было показано что повреждение ВММ приводит к последовательной активации различных транспортных механизмов приводящих к диссипации Лр. Предложена общая схема увеличения проницаемости ВММ.

3. На примере тиурам-дисульфид- индуцированной пермиабилизации митохондрий было показано существование по крайней мере двух различных механизмов возникновения "макропроницаемости" митохондрий.

4. Была выявлена потенциальная роль NO как физиологического регулятора "макропроницаемости" ВММ.

Публикации и апробация работы По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ. Результаты исследований были доложены на "XV International Conference on Magnetic Resonance in Biological System" (Jerusalem 1992) и "IX European Bioenergetic Conference" (Belgium 1996).

Объем и структура работы Диссертация изложена на 164 страницах машинописного текста, содержит 42 рисунка, 2 таблицы и состоит из введения, трех глав, выводов и списка литературы из 205 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение Целью настоящей работы было изучение механизмов увеличения проницаемости ВММ приводящих к диссипации Ар и разобщению окислительного фосфорилирования. На Рис.1 схематично показано три возможных канала диссипации Др в митохондриях, а именно: А- диффузия ионов по электрохимическому градиенту через липидный бислой, Б- электро-форетический транспорт ионов через белковые каналы и В- свободный

транспорт веществ размером < 1.5 kDa через постулированные недавно макропоры ВММ (МП, Pfeiffer D R., 1990).

Свободная энергия

Рис.1 I - АТФ-синтазный комплекс, II - протонные помпы Сдегидрогеназы), А - диффузия через липидный бислой, Б - электрофоретический транспорт ионо» через белковые каналы, В - макропоры внутренней мембраны митохондрий ((1- 3 пш).

Несмотря на тесную взаимосвязь, объединенные на Рис.1 механизмы А, Б, В существенно различаются и служат, по-видимому, для выполнения разных функций в клеточном гомеостазе. Так, например, потенциально обратимые механизмы А и Б, как было показано, участвуют в регуляции клеточного термогенеза, синтеза АТФ и митохондриального объема. С другой стороны

активация механизма В может приводить к необратимым нарушениям митохондриалъных функций и, как следствие, участвует в процессах клеточной гибели- некрозе и апоптозе. В связи с этим, в настоящей работе изучение данных механизмов проводилось раздельно, с использованием разных модельных систем.

Г U-L-Ы

о

U

ocnxn о

о о

Л J* q"N-x-N о

* Уйг >ьДг

q.

4 6 С-95%

О- О-

5 * « (СHjlj 4|

ftWH, ICH Oj Э г ОМГ 5«С 5« г г l-tth

(Механизм А) Ионная лронниаемость липидного бислоя Одним из основных исходных постулатов хемиосмотической теории формирования Ар и синтеза АТФ (Mitchell Р., 1961) являлось непроницаемость липидной мембраны

митохондрий для различных ионов , включая Н* (НзО*). Последующие работы показали, однако, что ионная

проницаемость липидной

мембраны может варьировать в широких пределах и вносить существенный вклад в диссипацию Ар. В связи с этим в начале настоящей работы мы исследовали проницаемость

фосфолипидного бислоя для ««^j^ различных ионов в модельной о- системе больших униламеллярных липосом. Впервые для исследования процессов

трансмембранного транспорта ионов был использован разработанный Храмцовым с

i «OHtCMCi, .... ■ er DMF

- - Ю*С

0 °

BO'il-N''X~N О h v-n

f

о-

кон

еюн/чго

Г

1КОН

EtCH/H,o г е., 3-е *

НИ н

о

Рис.2 Схема синтеза рН-чувсгвительимх зондов

н н doulran—O^^N^

Т 'СНг)<

о

ъ

л

>—so

N

I

о' ams

Рис.3 Парамагнитные зонды для изучения трансмембранного транспорта_

соавт. метод рН-чувствительного спинового зонда. Для этого согласно Рис.2 нами был синтезирован ряд новых рН-чувствительных имидазолиновых

радикалов со значениями рК, 4.7-6.6 [¡]. Два радикала (Рис.3), непроницаемых

для фосфолипидной мембраны: спинмеченый декстран (ЭК, рК, 6.2) и амидиносульфоновая кислота (АМБ, рК, 5.2) были использованы для исследования

трансмембранного транспорта [2]. ЭПР спектры этих радикалов представляют собой суперпозицию а спектров протонированной и депротонированной форм, а зависимость константы СТВ (ак)

Рнс.4 Зависимость от рН константы СТВ (;ц)

спектра ЭПР радикалов АМ8 (О) и РИ (И)

от рН имеет вид кривой титрования и позволяет определять рН в диапазонах 4.2- 6.3 для АМБ и 5.1- 7.3 для 1Ж (Рис.4) Парамагнитный зонд заключался во внутренний объем больших фосфатидилхолиновых липосом и за изменением внутреннего рН следили после создания трансмембранного градиента Н". Рис.5 показывает, что наблюдаемые кинетики изменения рН имеют бифазный

характер, где быстрая часть кинетики отражает электрогенный транспорт протона внутрь липосом с созданием трансмембранного

электрического потенциала (&<//), в то время как последующая (медленная) часть кинетики определяется трансмембранным зо транспортом ионов присутствующих

в растворе по Д (/.

Исходя из экспериментальных кинетик с помощью

полуэмпирических уравнений трансмембранной диффузии были сделаны оценки коэффициентов проницаемости фосфолипидной мембраны для

Рис.5 Кинетики изменения рН внутри липосом после соадания трансмембранного градиента ДрН=1.13, (Ж)- стандартный буфер, (о)- буфер + 0.] М КС1, (О)- буфер+ 0.1 М КС1 и 30 мкМ валиномицина. Кривая отражает нелинейное приближение по уравнению Нернста-Планка

Н" ((5± 1.5)xlО"4 см/сек), К* (~10"п см/сек), СГ ((1± 0.3)х10"10 см/сек) и ТГ (~10 ! см/сек). Полученные оценки подтверждают существующие данные (Nichols J.W.,1980), что коэффициент проницаемости Н* более чем на б порядков превосходит коэффициенты проницаемости других одновалентных катионов. Это предполагает, что диссипация Ар в митохондриях по механизму А (Рис.1) определяется главным образом Н*- проницаемостью липидной части ВММ. Присутствие других легко-диффундирующих ионов таких как комплекс валиномицин-К* или ТГ также может существенным образом влиять на распределение компонент До (Д у и ДрН). Последнее заключение согласуется с полученными ранее данными (Saris N.E., 1981) о разобщающем действии этих ионов на изолированные митохондрии.

(Механизм Б-нВ) Активация электрофоретического транспорта ионов вызываемая повреждениями ВММ Известно, что окислительное повреждение митохондрий может приводить к снижению hp и разобщению окислительного фосфорилирования за счет увеличения проницаемости ВММ. Бернарди с сотр. (Bernardi Р., 1996) предложили схему, согласно которой окисление митохондриального НАД(Ф)Н и/или глутатиона приводит к окислению находящихся в редокс- равновесии мембранных тиолов и активации специфических транспортных систем. Однако, большинство экспериментов

_ подтверждающих данную схему

Соедишние Степень окисления а 'А _цдщр)ц_ GSH было выполнено в присутствии

Контроль О О ионов Са • что зачастУю не

Дуромнон 100 10 позволяло провести различие

Фениларсин оксид 10 23

трет-Бутилгидропероксид 76 80 между пермиабилизацией ВММ

Диаиид 81 85 ..

Тетраиетилтиурам дисулфид 90 . 57 по механизму Б (Рис. 1, активация

1етраэтишиурам дисульфид 82_100 белковых каналов) и

пермиабилизацией по механизму Таб.1 Окисление митохондриальиых НАД(Ф)Н

В (открытие макропор). Не было ясно также, активация транспорта каких ионов

и СБН химическими соединениями Степень окисления определялась фл>оромегрически у интактных митохондрий спустя 3 мин. после добавления соединения

приводит к диссипации Ар и разобщению окислительного фосфорилирования. В связи с этим в настоящей работе действие различных веществ способных

вызывать окислительное повреждение митохондрий (Таб.1) на проницаемость ВММ было изучено в отсутствии ионов Са2*.

Для регистрации изменения проницаемости ВММ нами был использован рН-чувствительный флуоресцентный зонд ВСЕСР. Изолированные митохондрии печени крысы прединкубировали с ацетоксиметиловым эфиром данного зонда (ВСЕСР-АМ), что приводило к накоплению свободного ВСЕСР в матриксе I (мин) благодаря гидролизу эфира митохондриальными эстеразами. После соответствующей

калибровки измерение

флуоресценции на 535 нм (к„= 500 нм) позволяло проводить непрерывную регистрацию рН матрикса (рНк). Рис.6 показывает что изолированные митохондрии окисляющие сукцинат в среде содержащей 65 мМ КС1 имеют рН„ около 7.8, что соответствует установлению ДрН~0.5. Как оказалось, не все агенты способные окислять НДД(Ф)Н и/или глутатион (Таб. 1) вызывают нарушение проницаемости ВММ (т.е. вызывают изменение рН„) в присутствии 2.5 мМ ЭГТА (Рис.6). Результат согласуется с данными других авторов (ВегпагсН Р., 1991), что ионы Са2* необходимы для того, чтобы окисление НАД(Ф)Н и глутатиона приводило к окислению функциональных БН-групп ВММ. Тетраалкил-тиурам дисульфиды (ТМ и ТЭ, см. Таб.1) и фениларсин оксид (ФАО) вызывали сложные и однотипные кинетики изменения рН„, свидетельствующие о нарушении проницаемости ВММ. Последнее наблюдение указывало на то, что эти.агенты способны напрямую модифицировать функциональные тиолы ВММ. Анализ кинетик изменения рН„ показал, что наблюдаемое начальное защелачивание матрикса зависит от

Рис.6 Влияние различных соединений на величину рН матрикса. (А)-добавление 5 мМ сукцннатц, (Б)- добавление 25 мкМ соединения, добавление дуроишона, диамида и 1-ВиООП приводио к кривым неотличимым от контроля

присутствия К' в растворе и является результатом активации электрогенных К*-селективных каналов, тогда как последующее закисление объяснятся развитием Непроницаемости ВММ и открытием макропор. Определенное из зависимости

начальных скоростей

защелачивания от концентрации КС1 значение Кц5- 35 мМ для ионов К* (Рис.7) хорошо согласовывалось с полученным ранее значением (ОагПс) К., 1992) Кт= 32 мМ для транспорта К* через митохондриальные Катф-каналы. Следует, однако, отметить, что отсутствие ингибирующего эффекта АТФ и глибенкламида (специфичных ингибиторов КАтФ-каналов) не

Рис.7 Зависимость начальной скорости ощелачивания матрикса от концентрации КС1 в буфере. Скорость измеряли после добавления ТМ (■), ТЭ (•) и ОАО (А)_

позволяет объяснить наблюдаемый транспорт калия активацией КдтФ-каналов. Следующее за повышением рН„ закисление матрикса (Рис.6) ингибировалось циклоспорином А (ЦкА) и АДФ. Так как ранее было показано, что оба ингибитора, способны ингибировать как прооксидант-индуцируемые Н*-каналы, так и макропоры ВММ, открытие макропор дополнительно

|ТМ

А

2 4 в в Ю 12 И в « ((МП)

Б

ЦкА

» 2 « в

I (мин)

Рис.8 Вытекание ВСЕСР из матрикса вызываемое добавлением ТМ (А) и ФАО (Б). Условия эксперимента те же, что и на Рис.6 только (1.1 мг/мл Антир и 1 мкМ ЦкА (где указано) было добавлено в буфер

регистрировали по вытеканию ВСЕСР из матрикса. Для этого нами было впервые использовано тушение флуоресценции ВСЕСР добавленными в буф>ер антителами на флуоресцеин (АнтиР) На Рис.8 показано, что и тиург1М дисульфиды и ФАО вызывают тушение ВСЕСИ внешними АнтиР свидетельствующее об открытии МП и вытекании ВСЕСИ из матрикса. Сравнение кинетик на Рис.6 и Рис.& показывает, что индуцированное закисление матрикса опережает вытекание ВСЕСР из митохондрий. Последнее наблюдение может означать, что активация Н'- каналов предшествует развитию "макропроницаемости" ВММ. Таким образом, на основании полученных данных можно предположить, что повреждение ВММ вызывает следующую последовательность увеличения проницаемости ВММ, приводящую к возрастающей диссипации Л/7 и разобщению окислительного фо сфорилирования:

Нарушение митохондриального-метаболизма

Изменение структуры ВММ

Увеличение Непроницаемости ВММ, Др-1

Увеличение Непроницаемости Б ММ, ДрН-1

' макрогтроницаемость

(Механизм В) Различие механизмов макропроницаемости ВММ Развитие проницаемости ВММ для молекул весом <1.5 Ш приводит не только к коллапсу Ар и разобщению окислительного фосфорилирования но и к вытеканию жизненно важных компонент из матрикса. Поэтому в отличии от механизмов А и Б диссипации энегии (Рис.1) механизм В (макропроницаемость) потенциально необратим и может приводить к гибели митохондриона. В настоящее время считается, что макропроницаемость есть результат открытия специфических макропор (МП, 3 нм) на ВММ,

которые ингибируются ЦкА и АДФ. Существуют, однако, сомнения в универсальности данного механизма. Нами и другими авторами (Боко1оуе Р., 1996) было обнаружено, что чувствительность процесса пермиабилизации митохондрий к ЦкА и АДФ зависит от типа индуктора макропроницаемости (Рис.8) Так, например, пермиабилизация ВММ вызванная тиурам дисульфидами (ТД) слабо ингибировалась ЦкА и АДФ (Рис.8А) и, следовательно, могла протекать по неизвестному ранее механизму. В связи с этим процесс пермиабилизации ВММ тиурам дисульфидами был изучен более детально.

а и

Оказалось, что митохондрии способны метаболизировать ТД, добавленные в концентрации ниже [ТД],,.. Метаболизм ТД осуществлялся НАДФН-зависимой глутатионредуктазой и на приводил к развитию макропроницаемости ВММ.

Концентрации выше [ТД],,, приводили к возникновению нового функционального

состояния митохондрий (Рис.9) характеризующегося окисленными НАД(Р)Н и СБН, низким значением Д у и

ингибированным синтезом

АТФ. После установления этого состояния ВММ становилась "макропроницаемой", что приводило к осмотическому набуханию митохондрий

5 10 15

Концентрация ТД (мкМ)

Рис.9 Изменение функционального статуса митохондрий тиурам дисульфидами: образование GSSC (•), НАД(Ф) (В), падение Д ц/ (А) н дыхання-3 (V, отражает синтез АТФ)

(регистрировалось по светорассеянию на 570 нм). Изучение влияния Са 4 и ЦкА, характеристических эффекторов макропроницаемости, на значение [ТД]кр. выявило, что С а2* значительно снижает критическую концентрацию ТД, тогда

как ЦкА противостоит эффекту Са2* не влияя на значение [ТД]Ч,. в отсутствии этого иона (Рис.10). Результат Рис.10 предполагает наличие двух механизмов повреждения митохондрий ТД: зависимый от Са2*, ЦкА-чувствительный и Са2*-независимый, ЦкА-

нечувствительный В согласии с этим предположением, исследование процесса

пермиабилизации митохондрий

(мкМ)

Рис.10 Эффект Ca1* н ЦкА на величину [ТД]^,

Пустые колонки соответствуют добавлению 1 мкМ ЦкА, правая часть диаграммы показывает значение (ТД],Р определенное как суммарное значение |ТД] приводящее к иеоСратнмому окислению НАД(Ф)Н (Рис.9) при добавлении ТД небольшими порциями (2 мкМ)

в различных условиях так же указывало на существование двух механизмов возникновения макропроницаемости ВММ (Таб.2).

Условия ДТТ ЦкА АДФ ТФП P,(As,) NEM

5 мкМ ТД 100 100 95 75 90 Мех-зм

20 мкМ Са" Ускоряет (3 цМ) I

25 мкМ ТД 100 10 0 100 85 Мех-зм

2.5 мМ ЭГТА Ускоряет (50 цМ) (60 цМ) II

Таб.2 Различие характеристик макропроницаемости ВММ при разных условиях проведения эксперимента. Цифрами показан максимальный ингибирующий эффект используемого агента (в %) на скорость пермиабилизации ВММ (регистрация по светорассеянию митохвндриальиой суспензии на 570 ни). В круглых скобках- значение К, ннгибитораю. ДТТ- дитиотреигол, ТФП- трифлуоперазин, NEM- N-зтилмалемид_

Основными различиями этих механизмов являются: разная чувствительность к ингибиторам МП- ЦкА, АДФ и трифлуоперазину, противоположный эффект фосфата (арсената, As,) и вовлечение разных SH-rpynn ВММ (разные значения К, для N-этилмалемида). При высокой концентрации Са2*, низком значении рНм и [ТД] преобладал ЦкА-чувствительный механизм, в то время как повышение концентрации ТД и защелачивание матрикса способствовали ЦкА-нечувсгвительному механизму. Полученные нами данные предполагают существование по крайней мере двух типов макропор ВММ: первый соответствует описанным ранее МП (Halestrap А., 1991), имеющим в качестве регуляторной единицы АТФ/АДФ-гранспортер (ингибирование АДФ и ЦкА, реактивация карбоксиатракгилозидом- не показано), тогда как характеристики второго типа предполагают участие анионного канала ВММ. (Механизм В) Влияние окиси азота на возникновение макропроницаемости ВММ Накапливающиеся в литературе данные свидетельствуют о ключевой роли макропроницаемосги митохондрий (канал В, Рис.1) в механизмах клеточной гибели таких как a-TNTF-oпосредованная цитотоксичность и апоптоз (Kroemer G., 1996, 1997). В связи с этим важным вопросом является: каким образом и какими клеточными посредниками может регулироваться этот процесс in vivo ? Работами Бернарди с сотр. (Bernardi Р., 1994) было показано, что одними из основных факторов определяющих развитие макропроницаемости ВММ у изолированного митохондриона являются

концентрация Ca2* в магриксе и величина Atf. Другими авторами (Brown G., 1994) было обнаружено что N0, универсальный биохимический посредник, способен взаимодействовать с некоторыми митохондриальными ферментами,

приводя к ингибированию

Э2<>

30

3

23

24 22 20 18

\

4 6

Ю{МЩ

Рис.11 Индукция макропроницаемости Са1+-нагружеиных митохондрий окнсыо азота._

3400 3300

№j»tt;«ficU {О

Рис.12 Образование железо -динитрозильных комлексов в митохондриях. (а)- низкотемпературный ЭПР спектр митохондрий, (Ь) ЭПР спектр после добавления N0 донора НАД, (с) ЭПР спектр после добавления НАЦ и фотолиза. Стрелкой указано образование сигнала железо-динитрозильных комплексов с 2.041_

респираторной цепи и снижению А у/. В своей работе мы исследовали влияние NO на возникновение

макропроницаемости у

изолированных митохондрий. Для этого нами был использован ряд доноров окиси азота механизм распада которых был предварительно изучен [3]. Оказалось, что наиболее удобным методом генерации NO в системе изолированных митохондрий является фотолиз (hv= 550 нм) S-нитрозо -N-ацетил- цистеина (НАЦ), в то время как другие доноры приводили к различным артефактам из-за протекания побочных реакций [4].

Исследование влияния NO на Са2+/фосфат -индуцированную пермиабилизацию митохондрий (регистрируемую по изменению светорассеяния на 570 нм) позволило разделить условно действие N0 на индуцирующее и

■

регуляторное [5]. Образующаяся в больших концентрациях (>2 мкМ) окись азота существенно ускоряла пермиабилизацию Са2*-нагр уженных митохондрий, выполняя роль индуктора макропроницаемости В ММ (Рис.11). Данный эффект N0 может объясняться необратимым повреждением железо-серных белков митохондрий с образованием ЭПР-видимых железо-динитрозильных комплексов (Рис.12).

Рнс.13 Обратимый эффект N0 ла свойства митохондрий. Правый рисунок показывает эффект N0 на фракцию митохондрий претерпевающих пермиабилизацию в ответ на Са!*/Р| н его исчезновение со временем (1„р). Добавление N0 в нулевой момент времени к Са!*-нагружеипым митохондриям указано стрелкой, фосфат добавлялся после N0 спустя время указанное на рисунке, НАЦ, 200мкМ (И), 400 мкМ (А.,в) и кислорода, 100 мкМ (Я,.4) и 200 мкМ (в). Левый рисунок показывает обратимое ингибирование дыханин-3 митохондрий окисью азота (концентрации даны на рисунке в мкМ)

Физиологические концентрации N0 (<1 мкМ) имели сложный эффект на Са^/Р.-индуцируемуго пермиабилизацию В ММ. У части митохондрий N0 ускорял пермиабилизацию ВММ, тогда как у другой части митохондриальной популяции развитие макропроницаемости было ингибировано. Наблюдаемое регуляторное действие N0 было временным (со временем Рис. 13)^ и определялось обратимым ингибированием цитохром с оксидазы (Рис.13), которое приводило к временному падению А)/ и перераспределению Са2 в митохондриальной популяции. Интересно, что при физиологических концентрациях кислорода (< 40 мкМ) длительность обратимого действия N0 ([N0] >600 нМ), 4аР, и была пропорциональна 1/[02]. Полученные результаты

предполагают, что соотношение концентраций внутриклеточного N0 и кислорода может определять развитие макропроницаемости митохондрий т г/т.

ВЫВОДЫ

В настоящей работе были нзучены некоторые механизмы увеличения проницаемости внутренней мембраны митохондрий (Рис.!) приводящие к диссипации протондвижущей силы &/>. Полученные результаты могут быть суммированы следующим образом:

1. С помощью развитого в настоящей работе метода рН- чувствительного спинового зонда получены оценки коэффициентов проницаемости фосфолипидного бислоя для ряда моновалентных ионов. Сделан вывод о преобладающем вкладе протонного транспорта в трансмембранные ионные потоки через липидную часть ВММ

2. Показано, что диссипация Ар вызываемая окислительным повреждением митохондрий происходит за счет последовательного роста проницаемости ВММ, включающего: активацию электрофоретического К- канала, увеличение протонной проницаемости ВММ и заканчивающегося развитием неселективной проницаемости ВММ (макропроницаемости) для веществ весом <1.5 кй.

3 На примере тиурам-дисульфид- индуцированной пермиабилизации митохондрий показано существование по крайней мере двух механизмов возникновения макропроницаемости ВММ, различающихся чувствительностью к ингибиторам пермиабилизации. Первый соответствует описанному ранее механизму с участием АДФ/АТФ- транспортера, тогда как характеристики второго указывают на вовлечение анионного канала ВММ.

4 Исследовано влияние N0 на возникновение макропроницаемости у изолированных митохондрий. Показано, что высокие концентрации N0 могут индуцировать пермиабилизацию ВММ из-за необратимого повреждения митохондриальных белков. При физиологических концентрациях 1 цМ) N0 может изменять чувствительность митохондрий к индукторам макропроницаемости, вызывая перераспределение Са2 и

снижение трансмембранного потенциала. Данный эффект NO объясняется обратимым ингибированием цигохром с оксидазы и зависит от концентрации кислорода

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Balakirev M.Yu., Khramtsov V.V, Berezina Т.A., Martin V.V., Volodarskiy LB. The synthesis of amidine derivatives of imidazoline nitroxides - a new series of pH-sensitive spin probes and labels // Synthesis 1992. Nol2. P. 1223-1225. 2 Balakirev M.Yu., Khramtsov V.V. New pH-sensitive aminoxyles: application to the study of biomembrane transport processes.// ./. Cham. Soc. Parkin Tram. 2. 1993. Nol 1. P.2157-2160 3. Balakirev M.Yu., Khramtsov V.V. ESR. study of free radical decomposition of N,N-bis(arylsulfonyl)hydroxylamines in organic solutions.//./. Org. Chum. 1996. V.61 P.7263-7269. 4 Balakirev M.Yu., Khramtsov V.V., Zimmer G. Alteration of mitochondrial function by nitric oxide.// Biachim. Biophys. Ada EBEC Short report 1996. V 9. P. 120.

5. Balakirev M.Yu., Khramtsov V.V.. Zimmer G. Modulation of mitochondrial permeability transition by nitric oxide.// Eur. J. Biachem. 1997. V.246. P.710-718.

/