Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование механизма сопряжения синтеза АТФ и протонного транспорта АТФ-синтазой из пурпурной бактерии Rhodobacter capsulatus

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фенюк, Борис Александрович, Москва

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи

ФЕНЮК Борис Александрович

изучение механизма сопряжения синтёза атф и протонного транспорта атф-синтазой

из пурпурной бактерии шововастея сарвиьатиз

. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук А.Д. Каулен

Москва — 1998.

Содержание

1 Список сокращений..........................................3

2 Введение ......................................................4

3 Обзор литературы............................................6

3.1 Разнообразие Н+-АТФаз ............................6

3.2 Структура фермента................................9

3.3 Каталитический механизм работы Н+-АТФазы . 30

3.4 Транс локация протонов и механизм сопряжения . 44

4 Материалы и методы........................................62

4.1 Культивирование ШюйоЬаЫег сарвиШив..........62

4.2 Получение хроматофоров............................63

4.3 Измерение концентрации бактериохлорофилла . . 63

4.4 Измерение АТФазной активности и синтеза АТФ 64

4.5 Получение Рх КЬ. сарвиШив........................65

4.6 Оборудование для импульсной спектрофотометрии 65

4.7 Регистрация изменений Аф ........................67

4.8 Определение концентрации Н+-АТФазы..........68

4.9 Регистрация изменений внутреннего и наружнего

рН хроматофоров ....................................70

4.10 Измерение концентрации реакционных центров . 71

5 Результаты....................................................73

5.1 Генерация и спад Аф................................73

5.2 Перенос протонов через ГоГ^ в отсутствие ну-клеотидов (слип)......................................78

5.3 Транспорт протонов через Го........................80

5.4 Транспорт протонов через ГоГх в условиях синтеза АТФ . . . .........................................83

5.5 Эффект ингибиторов Гх на протонный транспорт 90

5.6 Синтез АТФ и расчет отношения Н+/АТФ .... 91

5.7 Эластичная модель Н+-АТФазы....................99

6 Обсуждение....................................................104

7 Выводы........................................................107

1 Список сокращений

Д/2Н+ - трансмембранная разность электрохимических потенци-

алов ионов водорода

Аф - трансмембранная разность электрических потенциалов

дМФ - 1,1'-диметилферроцен

дцкд - Г^К'-дициклогексилкарбодиимид

АТФ - аденозин-5'-трифосфат

АДФ - аденозин-5'-дифосфат

АМФ - аденозин-5'-монофосфат

БСА - бычий сывороточный альбумин

ДТТ - дитиотреитол

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

РЦ - реакционный центр

Трицин - Ы-трис(гидроксиметил)метилглицин

АМР-Р№ - - аденозин-5'-(/3,7-имидо)-трифосфат

НЕРЕЭ - К-2-гидроксиэт1шпиперазин-^т'-2-этансульфоновая

кислота

МОРБ - 3-(1Ч-морфолино)пропансульфоновая кислота

Т№АТР - - 2',3'-0-(2,4,6-тринитрофенил)аденозин 5'-трифосфат

ТГО - 3-(трифторметил)-3-(л«-йодофенил)диазирин

- 4-хлоро-7-нитробензо-2-окса-1,3-диазол

ДМСО - диметилсульфоксид

2 Введение

Основным источником энергии для большинства организмов является окислительное и фотосинтетическое фосфорилирование. Согласно хе-миосмотической теории Митчела [1], энергия, высвобождающаяся при этих процессах, переводится клеткой в форму так называемых универсальных энергетических валют: энергии фосфатных связей нуклеотид-трифосфатов и энергии трансмембранного электрохимического ионного потенциала.

Мембранный фермент, ответственный за взаимопревращение этих двух форм энергии, Н+-АТФ-синтаза, называемая также Н+-АТФазой или Го Г1-комплексом (КФ 3.6.1.34), играет ключевую роль в энергообмене клетки, осуществляя сопряжение реакции синтеза/гидролиза АТФ с трансмембранным переносом протонов. Н+-АТФаза обнаружена во внутренней мембране митохондрий, в тилакоидной мембране хло-ропластов и в цитоплазматической мембране бактерий; ферменты из столь различных объектов удивительно близки по строению и каталитическим свойствам.

Н+-АТФаза состоит из интегрированной в мембрану части Го, участвующей в транслокации ионов, и каталитической части Г^ называемой Гх-АТФазой из-за ее АТФазной активности. Многие данные указывают на то, что Н+-АТФаза — фермент, работающий по принципу молекулярной машины: ток ионов через мембранную часть

Н+-АТФазы приводит к механическому движению субъединиц Го, которое в свою очередь приводит во вращение субъединицы 7 и е внутри Гь последние механически изменяют конформацию Гх, высвобождая синтезированный АТФ.

Несмотря на большое количество работ по каталитическому механизму, субъединичному составу, и структуре Н+-АТФазы, механизм сопряжения ионного транспорта с синтезом/гидролизом АТФ до сих пор неизвестен. Целью настоящей работы являлось прояснение механизма сопряжения, стехиометрии Н+/АТФ и создание модели функционирования Н+-АТФазы. Для экспериментов была выбрана Н+-АТФаза фотосинтетической бактерии ШюйоЪа^ег сарБиШиэ, имеющая минимальный субъединичный состав, близкая эволюционно к Н+-АТФазе митохондрий и функционально к хлоропластному ферменту.

Хроматофоры ЯЬ. сарвиШив представляют собой идеальную систему для изучения Н+-АТФазы. Наличие реакционных центров и ^-комплекса позволяет генерировать Аф и запускать фермент вспышкой возбуждающего света. Кроме того, каротиноидные пигменты светособирающего комплекса этой бактерии являются природным индикатором Аф, что позволяет оптическими методами регистрировать трансмембранный перенос протонов в микросекундной шкале.

3 Обзор литературы 3.1 Разнообразие Н+-АТФаз

Существует множество ион-транслоцирующих АТФаз — ферментов, осуществляющих транспорт ионов за счет энергии АТФ. Среди Н+-транс-лоцирующих ферментов различают АТФазы Р-типа, У-типа, А-типа и Р-типа. АТФазы Р-типа (называемые также Е1Е2-АТФазами) обнаружены во внешней клеточной мембране растений и грибов и по механизму катализа напоминают Ка+/К+-АТФазу плазматической мембраны эукариотической клетки. АТФазы У-типа обнаружены в тонопласте растительной клетки, а также в ряде других мембранных компартментов как животной, так и растительной клетки. Их роль заключается в регуляции рН соответствующих органе лл. По структуре и механизму действия они имеют много общего с Р-АТФазами. Н+-АТФазы А-типа встречаются у архебактерий; их функция, видимо, та же, что и у Р-АТФаз, хотя по строению они ближе к АТФазам У-типа.

К Н+-АТФазам Р-типа относятся АТФ-синтазы (Р0Р1-Н+-АТФазы) митохондрий, хлоропластов и бактерий. Их основной ролью является синтез АТФ за счет Д/¿н+, а в отдельных случаях — поддержание этого потенциала за счет гидролиза АТФ. У некоторых бактерий обнаружены транслоцирующие АТФазы Р-типа, использующие Д/%а+ для синтеза АТФ. Филогенетический анализ первичных струк-

тур гомологичных субъединиц ион-транслоцирующего сектора V, А и Б-АТФаз из различных организмов показал, что ферменты всех трех групп эволюционируют от общего предка; дивергенция произошла около двух миллионов лет назад [2]

Настоящая работа, а также оставшаяся часть литературного обзора посвящается изучению Н+-АТФаз Е-типа.

Несмотря на некоторые отличия в субъединичном составе и каталитических характеристиках, ЕоЕ1-Н+-АТФазы из различных объектов обладают удивительно сходным строением и очень высокой гомологией первичной аминокислотной последовательности консервативных субъединиц. Большое количество экспериментальных данных указывает на одинаковый механизм катализа всех АТФаз Е-типа. Поэтому допустимо предполагать единый принцип строения и механизм работы всех Г-АТФаз. Это позволяет комбинировать данные, полученные на разнообразных объектах, для выделения и исследования принципиальных черт структуры и функции фермента.

Структурно АТФазы Е-типа состоят из интегрированного в мембрану Ео-сектора, осуществляющего ионный транспорт, и каталитической Егчасти. Наиболее простое строение имеет бактериальная Н+-АТФаза. Фермент состоит из девяти типов субъединиц. Пять из них, составляющие Ех, названы греческими буквами в порядке убывания молекулярной массы и присутствуют в стехиометрии а3/З3716161. Мембранный Ео-сектор составляют три оставшиеся субъединицы в

стехиометрии <2162^12 [3, 4]. В Fo хлоропластной Н+-АТФазы присутствует два типа 6-субъедиииц: b и Ь'; обе они гомологичны субъединице b Е. cok. В митохондриях фермент состоит из более чем пятнадцати типов субъединиц.

Может показаться, что митохондриальная Н+-АТФаза имеет принципиально иное строение, нежели сходные между собой хлоропласт-ный и бактериальный фермент. Но непосредственно задействованные в катализе субъединицы су, /3, 7, е, а и с бактериального фермента имеют высокогомологичные им по первичной структуре субъединицы в митохондриальном ферменте. Субъединицы 8 и Ъ бактериальной Н+-АТФазы, гомология которых с митохондриальными аналогами низка, несут структурную роль. Таким образом, Н+-АТФазы из разных объектов, видимо, имеют одинаковый комплекс рабочих каталитических субъединиц, но различаются по структурным субъединицам. Дополнительные субъединицы хлоропластной и митохондриаль-ной Н+-АТФазы могут служить для более эффективной работы фермента в конкретных условиях и для его регуляции. Данные по гомологии субъединиц Н+-АТФаз сведены в таблицу 1.

Краткое описание структуры генов Н+-АТФаз из разных объектов освещено в работе Уокера и соавторов [5].

Таблица 1: Гомология субъединиц Н+-АТФазы из разных объектов.

Митохондрии

Хлоропласты

Бактерии

а

Р

7

ОБСР

6

е

а

Ъ

с

ингибитор

А6Ь &

е / 9

а

Р

7 6

а

Ь и У (или I и II) с (или III)

а

Р

7 6

б

б

3.2 Структура фермента

По топологии Н+-АТФаза напоминает гриб. Г ¡-комплекс составляет сферическую глобулу "шляпки", от нее отходит "ножка", состоящая частично из субъединиц Ео, частично из субъединиц ¥\. а у митохон-дриальной Н+-АТФазы еще из ряда субъединиц. "Ножка" соединяет Ех с интегрированным в мембрану Ео, составлющим толстое "основание" ножки. Ниже дана характеристика субъединиц Н+-АТФазы из различных объектов и описание структуры комплекса в целом.

3.2.1 Краткое описание субъединиц

В настоящее время установлена первичная структура всех субъединиц большого числа Н+-АТФаз бактерий, хлоропластов и митохондрий. Рентгеноструктурным анализом получена картина строения комплекса a^ß^i митохондрий с разрешением 2.8 Ä [6], субъединицы е Е. coli с разрешением 2.3 Ä [7], методом ЯМР установлена значительная часть структуры с-субъединицы Е. coli [8, 9,10] и Р. modestum [11]; с помощью обработки протеазами, специфическими модификаторами, кросс-сшивающими реагентами, а также с помощью моноклональных антител получены данные по укладке в мемране ряда субъединиц Fq.

Субъединицы а и ß

Это самые крупные субъединицы комплекса: их молекулярный вес составляет около 55 и 50 кДа соответственно. Эти субъединицы гомологичны между собой по аминокислотной последовательности. Рент-геноструктурный анализ [6] показал, что субъединицы а и ß имеют очень сходное строение и состоят из трех доменов — N-концевой ß-боч-ки из шести /3-тяжей, центрального домена, на котором расположены сайты связывания нуклеотидов, и С-концевого домена из 7 «-спиралей. N-концевые /3-б очки этих субъединиц образуют единый /3-слой.

На субъединицах а и ß находятся сайты связывания нуклеотидов. Всего в Fi их шесть; три образованы преимущественно аминокислотными остатками а-субъединиц и одним остатком /3-субъединиц; три

Рисунок 1: Каталитический сайт Н+-АТФазы митохондрий сердца быка со связанным в нем М§АМР-РМР (стереопара). Отмечены остатки, играющие ключевую роль в связывании нуклеотида. Нумерация остатков митохондриального фермента. Рисунок сделан с помощью программы

других сайта, наоборот, остатками /3-субъединиц и одним остатком а-субъединиц. На /3-субъединицах расположен каталитический сайт, на а — некаталитический; роль последнего до конца не выяснена. Строение каталитического сайта представлено на Рис. 1.

Отсутствие каталитических свойств сайта на а-субъединице, видимо, объясняется отсутствием остатка глутаминовой кислоты в положении, соответствующем /ЗС1и188 (нумерация остатков Н+-АТФазы митохондрий сердца быка) [6].

Субъединицы а и ¡3 отличаются высокой консервативностью. Так,

сравнительный анализ аминокислотной последовательности выявил 70% идентичных остатков у /3-субъединицы фермента Е. соЫ фермента из митохондрий сердца быка [12]; у близких видов гомология еще выше.

Субъединица 7

Это третья по величине субъединица Е^ Ее молекулярный вес около 31 кДа. Строение значительной части этой субъединицы было установлено рентгеноструктурным анализом [6]. Этот белок образует стержень, состоящий из двух антипараллельно закрученных а-спиралей, который пронизывает гексамер из а и /3-субъединиц. Структура неразрешенной рентгеноструктурным анализом части 7-субъединицы неясна.

Показано, что в процессе гидролиза АТФ 7-субъединица вращается внутри «з/Зз-гексамера [13].

Субъединицы 6 и е.

Субъединицы 8 же бактериального и хлоропластного фермента (гомологичны ОБСР и <5-субъединице митохондриальной Н+-АТФазы соответственно, см. Таблицу 1) — самые маленькие субъединицы Е^ молекулярный вес около 20 кДа и 15 кДа соответственно. Структура <5-сц ы Е. соИ была установлена с помощью метода ЯМР [14, 15]. Оказалось, что Ы-концевой участок этого белка представляет собой домен из шести «-спиралей. Именно этот домен контактирует с ]Ч-концевой

Рисунок 2: Схематичное изображение б-субъединицы Е. coli по данным рентге-ноструктурного анализа.

частью а-субъединицы. С-концевая область 6-субъединицы взаимодействует с 6-субъединицей Fq [15].

Структура субъединицы е Е. coli была получена методами ЯМР и рентгеноструктурного анализа [16, 7]. N-концевой домен этого белка представляет собой "сэндвич" из десяти /3-тяжей. С-концевой домен представляет собой "шпильку" из двух а-спиралей и контактирует с /3-субъединицей (Рис. 2).

Субъединица а (субъединица 6).

Это самый крупный из составляющих Fo-сектор белков, его молекулярная масса составляет около 25 кДа. Субъединица а является гидрофобным интегральным мембранным белком. К настоящему времени количество трансмембранных а-спиралей этого белка точно не установлено. По данным экспериментов с моноклональными антителами, специфичными к внемембранным фрагментам субъединицы а

[17, 18], белок образует б трансмембранных столбов; С и N концы расположены с цитоплазматической части мембраны. Другие исследователи полагают наличие лишь пяти трансмембранных «-спиралей, помещая С-конец белка с цитоплазматической стороны, а N-конец — с периплазматической стороны мембраны [19]. Споры, однако, не затрагивают функционально важной области субъединицы a, a именно, двух последних (С-концевых) трансмембранных спиралей. На предпоследней спирали, приблизительно в середине толщи мембраны, находится высококонсервативный остаток аргинина (Arg210 Е. coli) , необходимый для протонной транслокации; ближе к периплазматической поверхности мембраны расположен консервативный остаток глутамино-вой кислоты (Glu219 Е. coli). На последней, С-концевой трансмембранной спирали расположены функционально важные остатки гистидина (His245 Е. cok) и глутамина (Gln252 Е. coli)

Большое количество данных о роли отдельных аминокислотных остатков субъединицы а в процессе переноса протонов было получено на Е. coli методом сайт-специфического мутагенеза. Ниже приведен краткий обзор данных, полученных этим методом.

На мутантах исследовались: 1) нарушения процесса сборки FoFi; 2) синтетическая активность фермента (по росту колоний на сукцинат-ной среде за счет окислительного фосфорилирования); 3) пассивный протонный транспорт при создании искусственного ДДН+; 4) АТФаз-ная активность и ее чувствительность к ДЦКД как тест на эффектив-

ность сопряжения; 5) активный транспорт протонов за счет гидролиза АТФ (АТФ-зависимая транслокация). Так как аминокислотные остатки, описанные ниже, высококонсервативны и присутствуют в субъединицах а из разнообразных организмов, данные о ферменте Е. coli приложимы к Н+-АТФазе в общем.

Критическую роль в ионном транспорте играет высококонсервативный остаток аргинина, расположенный на предпоследней С-кон-цевой трансмембранной a-спирали (Arg210 Е. coli). Замена Arg210 на Ala, Lys, Ile, Val, Gin или Glu приводила к полной потере протонной проводимости Fq и АТФ-зависимой протонной транслокации FoFi ; наблюдалось отсутствие роста на сукцинатной среде. На процесс сборки FoFi-комплекса мутации по этому остатку не влияли. Эффект мутации Arg210Gln частично обращался при замене на аргинин остатка Gln252, находящегося на последней, С-концевой трансмембранной а-спирали: наблюдался рост на сукцинате [19]

Замена Asn214! на Val, Leu, Gin или Glu снижала АТФ-зависимую протонную транс локацию, но наблюдался рост клеток на сукцинатной среде; замена этого остатка на His подавляла АТФ-зависимую протонную транс локацию на 95%, рост на сукцинате в этом случае не наблюдался. АТФазная активность также уменьшалась во всех вышеперечисленных мутантах; но это наблюдалось при pH ниже 8.8, а

1 Здесь и далее нумерация остатков субъединиц дана для Е. coli, если не указано обратное.

при pH 9.1 активность была на уровне дикого типа. ДЦКД снижал на 60-75% АТФазную