Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование клеточной регуляции влияния митохондрий на фотохимическую активность хлоропластов

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Исследование клеточной регуляции влияния митохондрий на фотохимическую активность хлоропластов"

АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БОТАНИКИ им. В. Ф. КУПРЕВИЧА

КАРСОНОВА Наталия Александровна

ИССЛЕДОВАНИЕ КЛЕТОЧНОЙ РЕГУЛЯЦИИ влияния МИТОХОНДРИЙ и НА ФОТОХИМИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ' ХЛОРОПЛАСТОВ

03.00.12 — физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск — 1992

Работа выполнена в лаборатории фотосинтеза ордена Трудового Красного Знамени Института экспериментальной ботаники им.В.Ф.Купревича Академии наук Беларуси

Научный руководитель: доктор биологических наук ИВАНЧЕМ) В.М.

: Белорусский государственный университет

: доктор биологических наук СЕРОВА З.Я;

кандидат биологических наук САВЧЕНКО Г.Е.

Защита состоится 5-& 1992 г. в У4 ^

часов на заседании специализированного совета но защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук ' при ордена Трудового Красного Знамени Институте экспериыенталь-" ной ботаники иы.В.Ф.Кущ>евича АН Беларуси (220072 Минск, ул.Ф.Скорины,27).

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке ш.Я.Коласа АН Беларуси.

Автореферат разослан . £_1922 г.

Ведущее учреждение

Официальные оппоненты

Ученый секретарь специализированного совеха к.б.н.

К.В.Рогульчвнжо

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

: Ш2*Ш22Хк-2£Ш

В з аи:.ю от нош 'ен ия фотосинтеза и дыхания представляют собой важный элемент продукционного процесса. Интерес к этой проблеме значительно возроо в связи с созданием математических моделей последнего. Исследование взаимосвязи двух биоэнергетических функций имеет огромное значение и в общебиологическом плане для расширения наших представлений о механизме внутриклеточной интеграции.

К настоящему времени исследованы, главным образом, метаболические связи между дыханием и фотосинтезом (Заленский,1980,1981, 1985; Семихатова,1980,1982,1938; Ыамушша, 1980,1991; Филиппова, 1982,1986,1989; Aícon-Biet<r ,1983,1988; Camal Д983; Chapman , Graham ,1974; GardestrBa ,1987,1988; Hampp ' ,1985;

Heber ,1982; Sharkey, Vanderveer ,1989).

Недавно получены данные, позволяющие предполагать существование нового типа взаимодействия данных процессов. Обнаружено, что совместная инкубация хлоропластоэ а митохондрий in vitro приводит к изменений функциональной активности обоих типов органелл. В частности, подавляется электронный транспорт и фотофосфорилиро-вание в хлоропластах, а та:-сте окислительное фосфорилироЕИше в митохондриях (Иванченко, ГЛарпакова, Микульская,1985,1987,1988, 1990). Было установлено, что данный эффект, осуществляется с участием медиаторов белковой природы, содержащихся в органеллах (Иванченко, Маршакова, Микульская,1987). Обнаружено, что в цитоплазме клетка имеется фактор, способный регулировать влияние митохондрий на фотохимическую активность хлоропластов (Иванченко, Микульская, Мараакова,1983). Это позволяет предположить, что в растзтольной клетке существует лсизеостный ранее уровень взаимодействия хлоропластов' и мигохочдрай, и что он, по-видимому, находится под контролем со стороны мотка в ц&аом.

Целью налах исследований явилось дальнейшее изучение выше -описанного феномена, в частности, условий проявления аяглбитор-ного эффекта штохогтрий по отнгапониэ к фотохимической активности хлоропластов, а также поиски в капрг чтении идентификации клеточного фактора, способного устранять подавление митохондриями электронного транспорта в хлоропластах.

Р. .З.ШЧУ. .щодцда:

- пойти условия стабильного проявления ингибиторного влияния ¿итохондрий на фотохимическую активность хлоропластов;

- исследовать действие физико-химических факторов (рН, тедше-ратура) на протекторную активность.цитоплазматического фактора;

- приступить к очистке вышеупомянутого фактора.

Научная цовизна и практическое значение работы

Поскольку данное исследование касается недавно обнаруженой в потому малоизученной биологической реакции, практически вся основная информация, полученная при этом и сформулированная в выводах, представленных в конце реферата, является абсолютно новой.

Тот факт, что работа посвящена вопросам регуляции и интеграции внутриклеточных процессов, обусловливает ее теоретический фундаментальный характер. Практическую значимость на данном этапе исследований можно только предполагать. Например, можно надеяться, что белки-регуляторы из органелл и цитоплазмы, будучи выделенными в активном состоянии, могут когда-нибудь найти применение в биотехнологических цроцессах или даже в качестве лекарственных препаратов. С другой стороны, более полное понимание взаимодействия фотосинтеза и дыхания может оказаться полезным для управления продукционным процессом.

Ацробацид работу. Материалы исследований докладывались на Втором сьезде Всесоюзного общества физиологов растений (Минск, 1990), а также на международной конференции "Фотосинтез и биотехнология" (Пущино,1991). По теме диссертации опубликовано 3 печатных работы. ~

Структура ц объем работы. Диссертация состоит из введения, 3 глав и выводов. Она изложена на 101 странице машинописного текста, включая 34 рисунка и список литературы из 119 наименований, в т.ч. "75 на иностранном языке.

Методика ц объект исследований.

В качестве объекта исследований служили 7-12-дневние проростки гороха ( Паша ва1;1тгшп 1. ) сорта Вегетативный желтый, выращенные под люминостатом на водопроводной воде без минеральных добавок. Митохондрии выделяли из корней, а хлоропласты и меточный сок (фракция, содержащая цитоплазму) - из листьев данных

растений методом дифференциального центрифугирования (Гаврпленко, Ладыгина, 1975; Иванченко, Микульская, Маршакова.1968). Длп определения концентрации хлорофилла айв в хлоропластнои суспензии использовали метод Арпона ( Агпоп ,1949), Содержание ^тлка в клеточном сока и препаратах митохондрий измеряли по Лоури в модификации Хартри ( НыЧгвв , 1972).

Определение восстановительной активности хлоропластов в присутствии акцепторов электронов проводили путем прямых спектрофото-метрических определений количества образующихся восстановительных соединений (Гавриленко, Ладыгина, Хандобина,1975). Кинетику восстановления хлоропласта™ 2,6-Д(ФИФ и феррицианяда калия регистрировали по изменению экстинкции при длинах волн 590 и 420 нм соответственно на спектрофотометре СФ-26. Об активности циклического фотофосфорялировашш с феназинметасульфатом судили по разности между концентрациями Фн в темновой и световой пробах. Концентрацию определяли по методу Аллена в модификации Чеснокова (Шп.у-лина, 1965).

Дня разделения белков клеточного сока использовали методы осаждения ацетоном, сульфатом аммония (Скоупс, 1985), а таете гель-фильтрацию (0стерман,1965) на колонке с акрилексами Р-30 и Р-100 (Иевпа1 , Венгрия).

РЕЗУЛЬТАТ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Исследование влияния митохондрий на йотохимичеокую активность хлоропластов.

Наши исследования показали, что если подавление митохондриями фотофосфорилирования в хлоропласта* было глубоким и проявлялось стабильно из опыта в опыт, то ингибирование реакции Хилла в отдельных экспериментах отсутствовало или оказывалось относительно слабым (рис.1). Поскольку основной целйо пашей работы являлось изучение устранения ингибируюшего действия митохондрий на фотохимическую активно--гь хлоропластов фактором из клеточного сока,было исключительно важным обеспечить стабильность проявления ингиби-торного эффекта.

В связи с этим был нэчат поиск условий, при которых данный эффект постоянно имеет место. Прежде вето мн исследовали зависимость воздействия митохондрий на фотохимическую активность хлоропластов от условий проведения реакции ?'илла. Однако, изменение

Рис.1. Кинетика восстановления феррицианида хлоропласта',ш,пред-инкубированными I ч в присутствии штохондрий - 2. Контроль - I. I - экстшшция юоветц до начала освещения, С - экстинкция освещаемой кюветы. Эти же обозначения используются и далее.

Рис,2, Кинетика восстановления феррицианида хлородласташ в отсутствие - I и в присутствии митохондрий - 2 при интенсивности освещения 260 Вт/ы2; 3 - без штохондрий, 4 - в присутствии митохондрий цри интенсивности освещения 350 Вт/м*\

зтенсивности освещения от 260 до 350 Вт/м^, добавление кофакто-ээ фотофосфорилирования в реакционную смесь показало, что изме-зняе данных условий реакции в этом случае не являотся определяем (рис.2,3).

Общеизвестно, что состояние и функциональная акт::п;псть мно-их белков сильно зависит от рН раствора, в котором они находят-я. Основываясь на том, что ингибитор имеет белковую природу Иванченко, Маршакова, Микульская,1987), мы предположили, что от-утствие подавления им электронного транспорта в хлоропластах моет быть обусловлено несовпадением рН среды выделения и среды со-месткой инкубации оргаяелл с оптимумом рН освобоздеиия эжектора з митохондрий; с рН, при котором исследуемый белок остается ста-илышы продолжительное время; с рН сродства ингибиторного факто-а к хлоропластному рецептору.

В опытах по"изменению рН как среды выделения митохондрий,так среды их совместной инкубации с хлоропластами (в пределах 7,2,0 в обоих случаях) получен отрицательный результат, т.е. ста -ильность нягибяторной активности митохондрий не достигалось рис.4,5}. ■

Следующим наши предположением было допущение возможности естабильного проявления ингибиторного влияния митохондрий на отохимичеокую активность хлоропластов из-за изменчивости от опы-а'к опыту состояния мембран хлоропластов, а значит, и условий ронлкновения з них эффектора из митохондрий. В связи с этим бы-ю решено увеличить время совместной инкубации органелл. Оказа -юсь, что действительно, увеличение продолжительности инкубации >т I часа до 3 часов приводило к достаточно устойчивому проявле-шю ингибиторного эффекта (рлс.6). Проявлении эффекта способст -¡овала также дополнительная гомогенизация хлоропластов. Эти фак-;ы говорят о том, что эффект, по-видимому, определяется как скоростью выхода фактора из митохондрий, так и скоростью поступле,-шя его в хлоропласты. И в том. и в другом случае это, долзкно ¡ыть, сопряжено с состоянием кембрак органолл. Поэтому дальней-ше эксперименты бшш связаны о изучением ингкбиторной активно-зти митохондрий, хранившихся при комнатной тевдературе различные зрокл°их'"выделения. К суспензии хлоропластов добавляли митохондрии, выделенные за 0,5, 2 и 4 часа до начала их совместной инку-5ацпи. Ни в одном из случаев мы не наблздали эффекта ингибирова-

* Рис.3. Кинетика восстановления феррицианвда хлоропластами в о: сутстЕие - I и в присутствии митохондрий - 2 без добавления коф£ -торов фосфоршшрования (АДО, Фн); 3 - без митохондрий, 4 - в щн сутствли митохондрий при'добавления кофакторов фос^орклированкя,

.Рис.4, Кинетика восстановления феррицианида хлоропласташ.пре, кшкубированяшя I ч в присутствии: митохондрий, выделенных при рН 7,2 - 2; митохондрий, выделенных при рН 6,0 - 3; митохондрий ввделенных при рН 7,5 - 4. Контроль - I.

О, M

opi

?ис.5. Кинетика восстановления <}еррЕЦианкдо хдорошпсташ, пред-ткубировашшш I ч в среде наделения срН7,5-1;срН7,2-2; з рН 8,0 - 3 а в присутствии штохондрий в среде инкубации с pli 7,5 - 4; с рН 7,2 - 5; с рН 8,0 - 6. ôext59oCT-C^ ?Л

/

ос

од

Л X. 3

-Рис.6. Кинетика восстановления 2,6 - ДЖ© хлоропластами, пред-шшубпрованнши с митохондриями I ч - 2; 3 ч - 3. Контроль - I.

ния. И только через сутки после выделения митохондрии проявляли ингибиторний эффект.(рис.7). При хранении митохондрий на холоду (0-4°С) эффект ингибирования проявляется гораздо слабее, чем при водернивании этих органелл в течение суток после наделения при комнатной температуре. В следующем опыте суспензия митохондрий была разделена на 2 части, причем одна из них ввдерхивалась в течение суток на холоду, а другая - при комнатной температуре.Г %сле этого обе фракции центрифугировали 40 минут при 16000 об/мии.Оказалось, что во фракции, хранившейся на холоду, ингибиторная актив ность сосредоточена преимущественно в осадке, тогда как во второй фракции эффект ингибирования цроявляли и осадок, и супернатант (рис.8).

Таким образом, становится очевидным, что проявление ингиби -торного эффекта митохондрий связано, в первую очередь.со скорость высвобождения эффектора из органелл. Последнее не, по-видимому, обусловлено состоянием мембран митохондрий.

Тот факт, что их хранение после ввделения в течение суток при комнатной температуре способствует массовому выходу эффектора говорит о том, что это, по-видимому, связано со старением мембран Замедление выхода эффектора в среду инкубации при хранении митохондрий на холоду однозначно свидетельствует в пользу такого вывода. Проявление ингибиторной активности в случае 3,5-часовой инкубации митохондрий с хлоропластами (рис.6) ыо^ет быть обусловлено двумя причинами. Во-первых, тем,что продолжительная совместная инкубация хлоропластов с митохондриями обеспечивает достаточное накопление фактора в хлоропластах при заведомо низкой его концентрации в окружающей среде. Фактор достаточно прочно связывается с хлоропластами и, следовательно, равновесие в реакции смещено в сторону связывания его^в этих органеллах. С другой стороны, возможно, хлоропласты индуцируют выход эффектора из митохондрий.Этот вопрос, однако, требует дополнительного исследования. То, что митохондриальный фактор прочно связан с мембраной и высвобождается только с приходом ее в определенное состояние, является важной предпосылкой того, что опосредованная регуляция носит активный характер и включается, по-видимому, в зависимости от потребностей клетки.

лехкюСТ-с)

0,5

0.x

ь 6

Р„с.7. К« восстановления —

о1г

хондрий, выделенных за и, д инкуйа

2; митохондрий, выдоленнт за^2^ч - ^ ^ ивд(3ац51а 0

ций - 4; митохондрий, полученных за ади« а

хлороплаотами - 5. 05

о. г

Рис.8.

Кинетика восстановления ферридианида хлоропластами.пред-Ш1КуйирояГГи I Ч в среде ^^ ^

натанта ^т^о^ ^т, холоду - 2; осадка тай « ? Д *

НОЙ фракция, хранившейся в течелле су1. I

4; осадка той зо фра:шяи - 5.

Рис.9. Кинетика этерификации Фд хлоропластаыи, предынкубирован-нш.ш в течение I я о митохондриями - 2; с клеточным соком - 3; о митохондриями и клеточным соком - 4. Контроль - I.

А ^ С I 40 Ь, Ллд.м

Рис.10. Кинетика восстановления ферридианада хлорошшстами.пред-инкубированными в течение I ч в присутствии: среды вцделения без митохондрий - I, с митохондриями - 2; клеточного сока - 3; миго -хондрий с последующим освобождением от них и добавлением в реакционную среду клеточного сока - 4.

Изучение явления устранения ингабитошюго действия мчтохотнлш

ж1У£оттшж дшедош. ;шр.с!'шстаа д ладощна .Фздхш да .ж-шет-

Ранее было показано, что клеточный сок листьев способен устра нять подавление митохондриями электронного транспорта в хлороплас тах в реакция Хилла о 2,6-дихлорфенолиндофенолом в'качестве акцеп тора электронов (Иванченко, Маршакова, Микульская,Т388). Наши опыты с другим акцептором электронов (феррицианидом калия) подтвердили это. Одновременно мы обнаружили, что по отношению к реакции {о--тофосфорилировалия клеточный сок не проявляет протекторных свойот от ингибирувдс.'о воздействия митохондрий (рис.9). Это позволяот предполагать, что, возможно, митохондрии выделяют в среду два равных эффектора, один из которых активен по отношению к электронному транспорту в хлороплас тах, другой - по отношению к реакции фо--тофосфорилирования. Действующее начало, содержащееся в цитоплазма, устраняет влияние.только первого из них. Мы предполахшш, что, возможно, существует несколько путей устранения ингибиторного ьлм-яния митохондрий на электронный транспорт в хлоропластах:

I) протектор, содержащийся в цитоплазме, монет оказывать влия ние на хлоропласты, "снимая" митохондриальный эффектор о хлоро -пластного рецептора; 2) протектор монет сам связываться с рецептором хлорошпта или другим способом уменьшать степень сродства с последним митохондриального эффектора; 3) протектор может взаимодействовать о эффектором еще вне хлоропласта нейтрализуя его ; 4) протекторное действие клеточного сока может быть связано с воздействием его на митохондрии, в результате чего происходит блокирование выхода эффектора из органелл. Полученные экспериментальные данше свидетельствуют в пользу того, что протекторное влияние клеточного сока связано, по-видимому, с непосредственным устранением блока с цепи переноса электронов. Клеточный сок до -бавляли к хлоропластам, предварительно проинкубированными с митохондриями и затем освобожденным от них с помощью дифференциального центрифугирования. Как видно из рис,10, это приводило к вое -становлению их фотохимической активности до контрольного уровня.

Если . к хлоропластам, выделенным после их инкубации с меточным соком, добавить митохондрии, то' в раде случаев эффект ин~ гибирования не только проявляется, но и усиливается до почти полного прекращения транспорта электронов (рис.11). Причины этого

Рис.Ц. Кинетика восстановления феррицианида хлоропластами.иред-ыт;убпрованнш.1и в течение I ч в присутствии: среда ввделе1шя - X; •митохондрий - 2; митохондрий и меточного .сока с последующим пе -ренооом хлоропластов в среду инкубации, содержащую митохондрии- 4.

лгх^аоГГ-с) 4

• .¡•;г-<л}1»грря и клеточного сока - 3; митохондрий и хлоропластного ~ , !;.т-1 - 4. Контроль - 1.

инкубированными в течение I ч в присутствии: митохондрий - 2, митохондрий и клеточного сока, нагретого до 50% в течение 5 мин -3; митохондрий и клеточного сока, нагретого'до 50% в течение 5 мин, а затем выдержанного в течение 12 часов при 0-4°С - 4. Контроль - I.

инкубированными в течение I ч в присутствии: митохондрий - 2; митохондрий и клеточного сока - 3; митохондрий я клеточного сока, прокипяченного в течение 5 мин - 4. Контроль - I.

А

явления'^ еще цредотоит выяснить.

В ряду других аспектов, немаловажна, для понимания механизма действия протектора, был вопрос о месте локализации его в клетке. Опыты с экстрактом из хлоролластов показали, что он не обладает способностью устранять индуцируемое митохондриями подавление фотохимической активности (рис.12). Следовательно, протектор локализован вне хлоропласта.

Влияние некоторых (Упзико-химичеоких у акторов на протекторную активность клеточного сока листьев гороха.

Нами было изучено влияние некоторых услоеий (рН и температуры) на протекторные свойства клеточного сока.

Опыты показали, что нагревание в течение 5 минут при 40°С не приводит к потере протекторной активности клеточного сока. Повышение температуры до 50°0 вызывает обратимую потерю исследуемых свойств, т.е. при выдерживании такого препарата в течение 12 часов на холоду (0-4°С), его протекторная активность восстанавливается (рис.13).- Пятиминутное кипячение-приводит к необратимой потере клеточным соком способности восстанавливать подавление скорости электронного транспорта в хлоропласта*, вызванное митохондриями (рие.14). Полученные данные служат свидетельством в пользу высказанного ранее предположения (Иванченко,*Микульская, Маршако-. ва,1988) о <5елковой природе протектора из клеточного сока.

Результаты экспериментов по изучению влияния рН на протекторную активность клеточного сока представлены на рас,15. Видно, что при крайних значениях выбранного нами интервала рй (5,0-8,0 еди -ниц) она не сохраняется. Самую высокую активность изучаемого препарата наблюдали при рН 7,5.

Таким образом, типичный дая белков характер зависимости ак -тивности от рН (наличие оптимума) дополняют уже имеющиеся факты, свидетельствующие о том, что цитоплазыатический фактор, обладающий протекторными свойствами, имеет белковую природу. Наг-пред -ставляется, что их совокупность практически однозначно говорит о том, что дальнейшие шаги в решении доставленной задачи должны быть направлены на поиски соответствующего активного протеина.

Выделение аактопа, обладающего пт>о?екторшд.1Ц свойствами.

Основываясь'"на'предположении о том, что протектор является водорастворимой формой белка, мы применили ряд методов, использу-е. 1ых для фракционирования и очистки белков.

Прежде всего, была сделана попытка осаждения протектора из клеточного сока ацетоном. Это позволило бы заготовлять Бпрок активный обезвоженный порошок, который может долго храниться и представляет собой удобный исходный материал, из которого белок можно экстрагировать водой или буферными растворами. Однако, в нашем случав применение данного метода разделения не'дало положительного результата. Экстракт из ацетоновгго порошка клеточного сока не восстанавливал скорость электронного транспорта в реакции Хилла с феррицианидемя. подавленную митохондриями. По-видимому,исследуемый белок является неустойчивым к действию ацетона и необратимо денатурирует в этих условия".

В связи с вышеизложенным нами был применен другой метод фракционирования - осаядение сульфатом аммония. Выбраны следующие интервалы фракционирования: I) от О до 20% насыщения ; 2 ) 20-40/' насыщения ; 3) 60-80$. После экстрагирования белков из полученных осадков 0,05 М трис-НС1-буфером, рП 7,5, удаления излишков соли с помощью диализа, образцы концентрировали и исследовали на протекторную активность. Как и в случае фракционирования ацетоном, активность не была обнаружена ни в одном из образцов. Поскольку оба используемых метода основаны на понижении гидратации полипептидов (Скоупс,1985), можно предположить, что протектор,по-видимому, является белком, денатурирующим при глубоком обезвоживании.

В.ходе дальней«!* исследований был использован метод гелифиль-трации. При использовании в качестве сорбента акрилекса Р-ЗЭ, активность препарата била обнаружена во фракциях, составляющих свободный объем колонки (рис.16). Поскольку интервал молекулярных масс белков, которые мо.т.но фракционировать с помощью данного сорбента, составляет 10-30 тысяч, то мы предполонили, что молекулярная масса протектора превышает 30 тысяч. Поэтому в дальнейшем мы использовали а1филекс Р-100, рассчитанный для разделения более высокомолекулярных белков. Результаты исследования представлены на рис. 17. Фракции, соответствующие белковый пикам, исследовали на протекторную активность. Полученные данные свидетельствуют о том, что она сосредоточена в первом пике (рис. 18).

Таким обадзом, цитоплазматическип протектор, устраняющий ин-гибирование электронного транспорта в хлороплястах, обусловленное их пребиванием m viЬго совместно с митохондриями, кохроматографируется с белками с молекулярной массой, близкой к 100 ООО.

д-ех^м (Т-С)

X Ч С ' S

Pre 15 Кинетика восстановления ферршдаишда хлоропластами.пред-шшубированпши в течение I ч в присутствии: среды ввделения- I; митохондрий - 2; ипохондрий и клеточного сока при рН 5,0 - 3; митохондрий и клеточного сока щш рН 6,0 - 4; митохондрий И клеточного сока при рН 7.5 - 5; митохондрий и клеточного сока при рН 8,0 - 6., " • .

ixijjo

т ----1 И

lio Л(о

Рчо -16 Фракционирование белков клеточного сока о помощью гель-ф'нльтрации на колонке с акрилексом Р-30. 1,2,3; I, П, П - группы

_._____ калибровочная кривая; У0-свободный объем колонки.

¿,0 4.1

0,8 0,4

до

«о

АОО

МО <10 220 ко

■Рио.17, ФракционировАние белков клеточного сока с помощью гель-фильтрации на колонке с акрилексом Р-ЮО. 1,П,Ш - группы фракций, соответствующие пикам 1,2,3.

—■ — - калибровочная кривая; У0-свободный обьем колонки.

А. 3 г.Лкин

"Рис.18. Кинетика восстановления 2,6-ДШФ хлоропластами, пред-ынкубированными в течение I ч в присутствии: митохондрий - 2; митохондрий и белков пика 1-3; митохондрий и белков пика П -4; митохондрий и белков пика Ш - 5. Контроль - I.

выводы

1. Выявлено, что проявление ингибиторного эффекта митохондрий на реакцию Хилла в хлороплаотах не является стабильным в противоположность подавлении митохондриями фотофосфорилирования, которое проявляется из опыта в опыт.

2. Исследованы возможные причины нестабильности проявления ингибиторного эффекта изолированных митохондрий на электронный транспорт в хлоропластах. Показано, что рН среды выделения митохондрий и среды их совместной инкубации с хлоропластами, наличие в реакционной смеси кофакторов фбсфорилирования, интенсивность актиничного света, а также возраст растений, из корней которых эццелялись митохондрии, не являются факторами, влияющими на стабильность проявления ингибиторного действия митохондрий ка реакцию Хилла в хлоропластах,. •■•...--.

3. Показано, что устойчивое проявление ингибирования электронного транспорта в хлоропластах наблюдается о увеличением времена инкубации их с митохондриям^ до 3,5 часов, а также после хранения изолированных митохондрий при комнатной температуре в течение суток. Это позволяет предполагать, что эффект оопрякен о состоянием митохондриальных мембран, определяющих,.по-видимому, выход эффектора в.инкубационную среду. '

4. Показано, что фактор, способный устранять подавление скорости электронного транспорта в хлоропластах, вызванное митохондриями, содержатся в клеточном соке, а не в самих хлоропластах.

5. Установлено, что фактор, содержащийся в клеточном соке, обладает протекторными свойствами только по отношению к транс -гюрту электронов в хлоропластах, подавленному митохондриями и

не способен устранять обусловленное ими ингибирование фотофосфорилирования. Этот факт, а также существенно разная активность митохондрий по отношению к этим двум реакциям в хлоропластах указывав! на то, что, по-видимому, мы шлеем дело с двумя разными . эффекторами из митохондрий. '

6. Показано, что протекторное действие указанного фактора, по-видимому, осуществляется вытеснением белка митохондрий с ч-'ст сорбции в хлоропластах. .

7. При хранении клеточного сока на холоду (0-4°С) в течение 5-6 суток его протекторная активность сохраняется. Кипячение клеточного сока в течение 5 минут приводит к необратимой потере активности. При нагревании его до 40°С в течение 5 минут активность сохраняется. Увеличение температуры до 50°С вызывают потерю способности клеточного сока восстанавливать скорость электронного транспорта в хлоропластах, подавленную млто>,а:щриямл, но последующее его выдерживание при пониженной температуре (0^1°С) в тече -ние 12 ч приводит к восстановлению протекторной активности. Совокупность полученных фактов говорит в пользу предположения о бел -ковой природе указанного протектора.

8. Методы осаждения белков охлажденным ацетоном и фракционирование сульфатом аммония оказались неэффективными для выделения активной фракции из всей суммы белков клеточного сока. При раз -делении белков клеточного сока путем гель-фильтрации на колонке о акрилексом Р-30 активная фракция выходит в свободном объеме колонки, что предполагает молекулярную массу протектора более 30 тысяч. При разделении белков клеточного сока на акрилексе Р-ЮО активная фракция кохроматографируется вместо с белками с молекулярной массой, близкой к 100 ООО.

СПИСОК РАБОТ, ОПУЕШОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Иванченко B.W., ¡Ларшакова U.U., Микульская С.А., Обухов-ская Л.В,, Урбанович Т.А., Карсонова H.A. О регуляторном взаимодействии хлоропластов и митохондрий в растительной клеткэ. // Второй оъезд Всесогоз. об-ва физиологов раст.Тезисы докл. Минск. 1990. с.36.

2. Карсонова H.A., Иванченко В.Ы. Исследование особенностей и условий проявления ингибиторного эффекта митохондрий на фото -химическую активность хлоропластов. // Вег~я Академии наук ВССР. Сер.биол.наук.1991, J5 3. с.86-88.

3. Иванченко B.I.I., Мароакова М.И., Избавателев С.П., Микульская С.А., Карсонова H.A. Митохондриальные факторы - регуляторы фотохимической активности хлоропластов. // Фотосинтез и биотехнология. Тез.докл. и сообщ. ыеждунар.' кодф. 16-23 июня 1991 г.Пущино.19Э1.с.4. ■

Усл.пгч.л. /.i

Подписано к Евчяга 2t.iC.SZi. Фсртт^НЩ, ч-л. 1.1 Ткрата 100 sri Босплагна Заказ 1J51 ШШ БелНШШТП. 220QQ4, Миаас, пц Мазкроз», 21