Исследование генов РуБисКО и АТФ-зависимой цитратлиазы у фото- и хемоавтотрофных бактерий, и анализ их разнообразия в осадках солёных и содовых озёр

Ковалева, Ольга Леонидовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование генов РуБисКО и АТФ-зависимой цитратлиазы у фото- и хемоавтотрофных бактерий, и анализ их разнообразия в осадках солёных и содовых озёр
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование генов РуБисКО и АТФ-зависимой цитратлиазы у фото- и хемоавтотрофных бактерий, и анализ их разнообразия в осадках солёных и содовых озёр"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

нмени М.В. Ломоносова _Биологический факультет _

на правах рукописи №

Ковалева Ольга Леонидовна

ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНОВ РУБИСКО И АТФ-ЗАВИСИМОЙ ЦИТРАТЛИАЗЫ У ФОТО- И ХЕМОАВТОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ, И АНАЛИЗ ИХ РАЗНООБРАЗИЯ В ОСАДКАХ СОЛЁНЫХ И СОДОВЫХ ОЗЁР

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

~ - ЛЕН 2919

Москва, 2010 г.

004615697

Работа выполнена в Институте микробиологии имени С.Н. Виноградского РАН (Лаборатория экологии и геохимической деятельности микроорганизмов)

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Ивановский Руслан Николаевич

доктор биологических наук

Туровя Татьяна Павловна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Игнатов Александр Николаевич кандидат биологических наук Черных Николай Алексеевич

Ведущая организация Институт биохимии и

физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г.Пущино

Защита состоится 14 декабря 2010 года в 15 ч. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д.501.001.21 по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, дом 1, МГУ, корп.12, Биологический факультет, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан ■/З ноября 2010 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, к.б.н

Пискункова Н.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Солёные озёра являются уникальными природными экосистемами, характеризующимися высоким содержанием минеральных солей. Специфическим типом солёных водоёмов являются содовые озёра. Для них характерно наличие фракции щелочных карбонатов Иа и К, которые и обусловливают стабильно высокий уровень рН в данных водоёмах. Несмотря на определённое сходство по своим физико-химическим условиям с морскими экосистемами, солёные озёра значительно менее исследованы. Изучение содовых озёр на территории России впервые было проведено группой под руководством Б.Л. Исаченко в 1930 году (Исаченко, 1951). Интерес к изучению галоалкалофильных микробных сообществ снова возник лишь спустя несколько десятилетий, и был обусловлен прикладными задачами поиска щелочеустойчивых экзогидролаз, используемых в качестве добавок к моющим средствам.

Высокая концентрация солей в рассолах создаёт неблагоприятные условия для развития в них эукариотного сообщества и, тем самым, способствует сохранению в них реликтового микробного сообщества (Заварзин, 1993).

Благодаря активным исследованиям последних лет было показано, что в гиперсолёных содовых озёрах присутствуют все основные группы представителей фото- и хемолитотрофов, обеспечивающих полный цикл превращения вещества в системе.

Одним из наиболее значимых биогенных элементов, определяющих возможность существования и развития биосферы, является углерод. Важнейшей стадией в цикле углерода является процесс ассимиляции СО2 автотрофными организмами, в состав которых в содовых озёрах входят как алкалофильные фототрофные (оксигенные и аноксигенные) бактерии, так и хемотрофные бактерии, среди которых значительная роль принадлежит сероокисляющим (СОБ). Среди идентифицированных традиционными микробиологическими методами видов имеются представители алкалофильных фотоавтотрофов ЕсШЫогЪо<1о8р\га, На1огкойо5р'1га, ЕсШЫогИас1оз1та, а также представители галоалкалофильных сероокисляющих бактерий ТЫоа1ка1тЬпо НаШИюЬасШш, Пюка1о5р1га, тоИа1огЬаЬс1из и др.

В экстремальных условиях нередко обнаруживаются уникальные автохтонные микроорганизмы, не встречающиеся в других экосистемах, что свидетельствует об актуальности изучения биоразнообразия гиперсолёных мест обитания. Одним из перспективных направлений в изучении биоразнообразия гиперсолёных озёр является исследование состава микробной популяции с помощью методов молекулярной биологии. Чаще всего для этих целей

используется анализ генов 168 рРНК, однако в последнее время новым подходом становится анализ генов, кодирующих определённую функцию. Примерами таких генов-маркёров могут быть сЬЬЪ/М и ас/В гены, кодирующие ключевые ферменты наиболее распространённых циклов ассимиляции СО2 - цикла Кальвина и восстановительного цикла трикарбоновых кислот (вЦТК), соответственно. Первичная структура этих ферментов достаточно консервативна и может быть использована в филогенетике.

Ключевым ферментом цикла Кальвина является рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилаза/оксигеназа (РуБисКО). По структурным и функциональным особенностям у бактерий в настоящее время выделяют 2 формы фермента. Наиболее распространённой является форма I, большая субъединица которой кодируется сЬЬЬ генами. Внутри формы I существует разделение на 2 варианта: «зелёный», обнаруживаемый у протеобактерий, зелёных растений и водорослей, и «красный», преимущественно обнаруживаемый у а-, р-протеобактерий, а также красных водорослей. Форма II фермента, кодируется сЬЪМ генами, встречается значительно реже.

Гены, кодирующие р-субъединицу АТФ-зависимой цитратлиазы (ас/В), имеют две структурные формы, присущие соответственно хемоавтотрофным представителям е-протеобактерий и филы Адшйсае и фотоавтотрофам филы СЫогоЫ.

Анализ сЬЬЬ/М и ас/В генов в природных образцах позволяет получить достоверную информацию о составе С02-ассимилирующей части микробной популяции, не прибегая к традиционных методам выделения микроорганизмов в чистую культуру. Это особенно актуально в случае исследования гиперсолёных озёр, так как культивирование некоторых групп экстремально галоалкалофильных автотрофных микроорганизмов часто затруднительно в связи с особенностями метаболизма последних.

Для реализации данного подхода с успехом применяются методы ПЦР и клонирования, с последующим созданием клоновых библиотек. Дальнейший анализ библиотек клонов в дополнение к классическим методам микробиологии даёт возможность получить более полную информацию о составе автотрофной части микробной популяции солёных и содовых водоёмов, и позволяет выявить представителей пока ещё некультивируемых групп автотрофов.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы являлось проведение сравнительного анализа генов ключевых ферментов фиксации С02 у фото- и хемоавтотрофных бактерий и использование этих генов в качестве молекулярных маркёров для оценки разнообразия автотрофных бактерий в осадках содовых озёр и гиперсолёных озёр с нейтральным рН.

Для выполнения цели были поставлены следующие задачи:

■ провести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей больших субъединиц генов РуБисКО, доступных в международной базе данных GenBank, для выявления участков со степенью консервативности 60% и более;

■ на основании проведённого анализа усовершенствовать известные праймерные системы, а также сконструировать новые праймеры, пригодные для амплификации генов РуБисКО у бактерий, принадлежащих к разным таксономическим группам;

■ провести тестирование разработанных праймеров и оптимизировать условия ПЦР с использованием препаратов ДНК чистых культур фото- и хемоавтотрофных микроорганизмов, а также подобрать наиболее эффективные праймерные системы для амплификации этих генов в природных образцах;

■ определить первичную структуру генов РуБисКО в геномах представителей различных таксономических групп фото- и хемоавтотрофных микроорганизмов (в том числе, выделенных из солёных озёр) и провести филогенетический анализ полученных de novo последовательностей;

1 исследовать разнообразие генов РуБисКО и АТФ-зависимой цитратлиазы в осадках солёных и содовых озёр с использованием наиболее универсальных праймерных систем.

Научная новизна и практическая значимость работы. Разработаны новые праймерные системы, позволяющие эффективно амплифицировать гены РуБисКО формы I и формы II, пригодные для использования в экспериментальных филогенетических исследованиях;

Определена последовательность 101 фрагмента генов РуБисКО, принадлежащих представителям 9 родов галоалкалофильных хемоавтотрофных бактерий и 12 родов фотоавтотофов, а также 4 последовательности acIB фотоавтотрофных бактерий рода Chlorobaculum. При этом впервые было проведено исследование генов РуБисКО для нескольких штаммов, принадлежащих к одному виду, и выявлены различия в наборе ebb генов на внутривидовом уровне. Кроме того, полученные данные были использованы для описания двух новых видов фототрофных бактерий родов Ectothiorhodospira и Thiocapsa. Все полученные последовательности депонированы в базу данных GenBank.

С помощью анализа ebb и aclВ генов впервые проведено исследование состава автотрофной части микробной популяции на поверхности и в толще осадков гиперсолёных озёр с нейтральным значением pH и гиперсолёных содовых

озёр Кулундинской степи (Алтайский край, Россия) и озёрной системы Вади Натрун (Египет).

Полученные в этой работе данные существенно расширяют наши знания о составе микробной популяции содовых озёр, что позволяет лучше понять структурные и функциональные взаимоотношения внутри микробного сообщества и оценить потенциал содовых озёр как уникальных с точки зрения экологии природных объектов.

Публикации и апробация работы. По результатам работы опубликовано 4 статьи, 2 статьи приняты в печать. Основные положения и результаты работы были представлены на следующих конференциях: 1) 3rd Congress of European Microbiologists: «Microbes and Man - interdependence and future challenges», June 28 - July 2, 2009, Gothenburg, Sweden; 2) Всероссийский симпозиум с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов», 24 -27 декабря 2009, Москва, Россия; 3) 9th International conference on halophilic microorganisms "Halophiles 2010", June 29 -July 3,2010, Beijing, China.

Структура и объём работы: Материалы диссертации изложены на 146 страницах машинописного текста и включают 29 рисунков и 4 таблицы. Диссертация состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Экспериментальная часть», «Результаты и обсуждение», «Выводы» и «Список литературы», который содержит 30 отечественных и 132 иностранных наименований.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В работе были исследованы чистые культуры фотоавтотрофных бактерий из коллекции кафедры микробиологии Биологического факультета МГУ (9 штаммов), а также коллекция штаммов фото-и хемоавтотрофных бактерий (43 штамма), предоставленная лабораторией экологии и геохимической деятельности микроорганизмов Института микробиологии им. С.Н.Виноградского РАН (ИНМИ).

В работе также были исследованы образцы осадков различных солёных/содовых озёр (табл. 1), основная часть которых расположена на территории Кулундинской степи, что находится на юге Алтайского края, вдоль границы с Казахстаном. Образцы осадков 6 солёных/содовых озёр Кулундинской степи и 1 образец из оз. Вади Натрун предоставлены д.б.н. Сорокиным Д.Ю. (лаб. экологии и геохимической деятельности микроорганизмов, ИНМИ). Образцы осадков из 4 солёных/содовых озёр Кулундинской степи были собраны во время экспедиции в Алтайский край в 2009 году. Некоторые физико-химические

характеристики исследованных озёр приведены в таблице 1. Они могут значительно отличаться в зависимости от локальных климатических условий, и также в зависимости от сезона, когда были отобраны пробы. Образцы осадков были отобраны в разные годы в летний период. Глубина озёр в этот период была небольшой и составляла в среднем 10-50 см. Некоторые озёра оказались почти высохшими. До проведения исследования образцы осадков хранили при 4° С.

Таблица 1. Физико-химические характеристики исследованных озёр.

№ образца Название озера и время сбора материала pH Сол£ность, г/л Способ отбора проб

Гиперсолёные озёра с высоким значением pH

05-2 Смесь осадков из 5 озёр (2005 год) 9.5 - 9.95 110-400 Интегральные пробы (смесь осадков 0-10 см)

05-3 Смесь осадков из 4 небольших озёр (2005 год) 10.0-10.4 50 - 130

Т5-07 Танатар-5 (2007 год) 10.35 70

S-06 Смесь осадков из 15 небольших озер (2006 год) 9.45 - 10.6 30 - 206

05-1 Танатар-1 (2005 год) 9.7911.05 320 - 520

WN-X Вади Натрун (Египет) (2001 год) 9.75 - 10.3 200 - 360

4KL Горчина-1 (2009 год) 10.16 300 Поверхностный слой осадков (0-1 см)

6KL Танатар-5 (2009 год) 10.1 180

Гнперсолёные озёра с нейтральным значением pH

14KL Бурлинское (2002 год) 7.45 360 Интегральная проба (0-10 см)

2KL Петухово (солёное) (2009 год) 7.45 300 Поверхностный слой осадков (0-1 см)

8KL Ломовое (2009 год) 7.8 325

Выделение ДНК. ДНК из чистых культур выделяли методом Бирнбойма-Доли (Birnboira and Doly, 1979) с использованием набора для Wizard-технологии «Promega» (США). ДНК из осадков содовых озёр получали с помощью набора для выделения тотальной ДНК из почв MoBio (MoBio Power Soil DNA Isolation kit; MoBio Laboratories). Для осаждения песка и крупных иловых частиц Юг осадка отмывали в IM NaCl и затем трёхкратно центрифугировали, перенося каждый раз надосадочный слой в новую пробирку. Полученную таким образом коллоидную фракцию использовали затем для выделения ДНК.

Выбор праймеров для амплификации генов РуБисКО форм I и П. Для выявления консервативных участков в гене, кодирующем большую субъединицу РуБисКО, был проведён сравнительный анализ более чем 100 нуклеотидных последовательностей по каждой форме РуБисКО, доступных в базе GenBank. В

результате проведённого анализа в последовательности гена были выявлены участки со степенью консервативности более 60%, для которых были сконструированы праймеры длиной 20-25 нуклеотидов.

ПЦР и клонирование. Амплификацию генов 16S рРНК проводили с универсальными праймерами 11F, 519R, 1492R согласно протоколу Lane (1991). Для амплификации генов РуБисКО использовали как разработанные нами праймерные системы, так и праймеры, опубликованные в литературе ранее, но модифицированные нами с учётом появившихся в последнее время в базе данных последовательностей РуБисКО (табл. 2).

Таблица 2. Праймерные системы для амплификации генов РуБисКО, использованные в работе.

Праймер Форма РуБисКО Последовательность праймера 5'-3' Ссылка

cbbLGlf Форма I «зелёный» вариант GGCAACGTGTTCGGSTTCAA Беке! е! а1„ 2005

cbbLl106R CRTGRATVCCRCCIGAIGCIACVG Разработан в данной работе

RublgF GAYTTCACCAARGAYGAYGA Спиридонова и др., 2004

RublgR TCRAACTTGATYTCYTTCCA Спиридонова и др., 2004

Krl84f GGNACNTGGACCACNGTNTGGAC АИгмбег« а1„ 2003

gr781r GTARTCGWGCATGAYGATSGG АКкМегыаЫООЗ (с изменениями)

RublrF Форма I «красный» вариант GCVACCTGGACSGTSGTVTGG Спиридонова и др., 2004

RublrR TCGCCYTCSAGCTTGCCSAC

RubII331f Форма II AACAACCARGGYATGGGYGA Разработан в данной работе

RuIIR2 TGRCCIGCICGRTGRTARTGCA Спиридонова и др., 2004

Rublll 113r SGCGTTCATGCCSSAGATGATCGGSGT Ека1и1йа1., 2007 {с изменениями)

При обозначении вырожденных позиций для всех используемых праймеров приняты следующие сокращения: У=Т,С; И=А,С; М=А,С; К=Т,С; \У=А,Т; 8=0,С; В=Т,С,С;\-А,0,С; П=АД,С, Н=А,Т,С; Х=&,А,Т,С

Фрагменты ас/В генов амплифицировали с использованием праймеров 892F - 1204R для хемоавтотрофных бактерий (Campbell et al., 2003) и 48F-1063R для фототорофных зелёных серных бактерий (Ивановский Р.Н., неопубликованные данные). Очистку ПЦР-продуктов выполняли с помощью набора QIAquick gel extraction kit (Qiagen) согласно рекомендациям производителя. Очищенные ПЦР-фрагменты секвенировали или клонировали с использованием компетентных клеток Escherichia coli ТОРЮ и набора реактивов CloneJet PCR Cloning kit (Fermentas) с плазмидой pJET1.2/blunt согласно рекомендациям производителя.

Выделение и очистку плазмидной ДНК проводили с помощью набора "Wizard MiniPrep" (Promega, США).

Анализ нуклеотидных последовательностей. Сравнительный анализ полученных последовательностей с последовательностями базы данных GenBank проводили с помощью программы NCBI Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). Проверку и редактирование последовательностей проводили с помощью редактора BioEdit (http://jwbrown.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html). Выбранные последовательности выравнивали между собой с помощью программы CLUSTAL W v 1.75 (Thompson et al., 1994). Построение филогенетических деревьев проводили с использованием алгоритмов: neighbor-joining (Saitou and Nei, 1987), реализованного в пакете программ TREECON W (Van de Peer and De Wachter, 1994), и алгоритма maximum-likelihood в пакете программ PhyML (Guindon & Gascuel, 2003).

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Разработка ирай,мерных систем для амплификации генов РуБпсКО формы I и формы II. К моменту выполнения данной работы в литературе были описаны несколько праймерных систем для амплификации этих генов (Elsaied et al., 2001; Alfreider et al., 2003; Спиридонова и соавт., 2004; Selesi et al., 2005). Однако в большинстве случаев они были сконструированы на основании сравнения нуклеотидных последовательностей ebb генов ограниченного числа видов микроорганизмов и были пригодны для амплификации искомых генов у бактерий, относящихся к определённым таксономическим группам. Значительное расширение базы данных нуклеотидных последовательностей различных генов, в том числе генов РуБисКО, позволило провести анализ распределения консервативных участков в последовательности генов РуБисКО и разработать новые праймерные системы для их амплификации.

Для определения положения консервативных участков в гене, кодирующем форму I РуБисКО, были проанализированы более 150 нуклеотидных последовательностей, принадлежащих различным группам бактерий. Для конструирования праймеров формы П РуБисКО было проанализировано около 100 последовательностей. Для каждой формы РуБисКО была построена консенсусная последовательность, в которой с помощью специально разработанной программы (Марусина А.И., неопубликованные данные) были определены консервативные участки. Для подбора праймеров были выбраны участки со степенью консервативности 60% и более.

По результатам анализа были выбраны следующие системы праймеров: для амплификации РуБисКО формы I «зелёного» варианта - система cbbLGlF /cbbLr.

ограничивающая участок ci>6L гена длиной около 850 пар нуклеотидов; для амплификации гена формы II - система RuII331F /RuIIl 113R. ограничивающая участок cbbM гена длиной около 800 нуклеотидов. Последовательности разработанных праймеров указаны в табл. 2 разделе «Объекты и методы исследования».

2. Тестирование разработанных праймеров. Проверка эффективности работы разработанных праймеров проводилась на культурах автотрофов с известной нуклеотидной последовательностью генов РуБисКО. Среди них Acidithiobacillus fenooxidans TFY (гены cbbL и cbbM), Thioalkalimicrobium sibiricum ALI (ген cbbL) и Rhodospirillum rubrum. 1R (ген cbbM). Условия ПЦР были оптимизированы посредством проведения ПЦР с градиентом температуры отжига праймеров в диапазоне от 56 до 66°С. Оптимальная температура отжига для пары cbbLGIF - cbbLr составила 60°С, для пары RuII331F - II1113R - 62°С. Условия и протоколы ПЦР приведены в главе диссертации «Материалы и методы».

В результате ПЦР у всех контрольных штаммов были получены амплификаты соответствующей длины. Все фрагменты были секвенированы с использованием специфических прямого и обратного праймеров. Анализ полученных нуклеотидных последовательностей показал высокую степень гомологии с депонированными в GenBank последовательностями данных генов.

Это позволяет использовать данные системы праймеров для детекции cbbL и cbbM генов как у фото-, так и у хемоавтотрофных бактерий.

3. Детекция генов РуБисКО формы I и формы II у фото- и хемоавтотрофных бактерий. Разработанные системы праймеров были использованы для выявления cbbLfM генов в геномах фото- и хемоавтотрофных бактерий, большинство из которых были выделены из различных солёных и содовых озёр. Всего в работе было проанализировано 18 штаммов фотоавтотрофов и 32 штамма хемоавтотрофов. Список исследованных культур приведён в разделе диссертации «Материалы и методы».

3.1 Выявление и филогенетический анализ cbbUM генов у различных фотоавтотрофных бактерий. Первичная последовательность генов РуБисКО была определена у представителей 14 родов фотоавтотрофных бактерий, многие из них были выделены из солёных и содовых озёр. Все исследованные культуры фиксируют С02 в цикле Кальвина.

Для проведения исследования использовалась система специфических олигонуклеотидных праймеров, включающая праймеры амплификации генов «зелёного» и «красного» вариантов формы I, а также генов формы II РуБисКО. Фрагменты генов РуБисКО разных форм были выявлены у всех исследуемых

культур. Все полученные de novo последовательности выявили высокую степень гомологии (более 80%) с последовательностями РуБисКО других фотоавтотрофов, доступными в электронной базе GenBank.

Большинство из исследованных нами фототрофных бактерий относились к подразделению у-протеобактерий, внутри которого входили в состав семейств Ectothiorhodospiraceae и Chromatiaceae. Наборы и структура генов РуБисКО у представителей этих семейств значительно отличаются. Филогения РуБисКО у представителей Ectothiorhodospiraceae была исследована ранее (Tourova et al., 2007). Все они содержали в геноме по одному гену «зелёного» варианта формы I РуБисКО и образовывали на cbbL-дереве единый монофилетический кластер. В геноме исследованного в данной работе нового штамма Mg3, идентифицированного как представитель вида Halorhodospira halophila, также был обнаружен единственный ген «зелёного» типа формы I, последовательность которого была идентична таковой типового штамма этого вида (100% для нуклеотидов и аминокислот).

Однако, исследованные нами два штамма В7-7 и М-10, описанные как новый вид Ect. magna, образовывали на С66Ь-дереве ветвь в кластере с членами семейства Chromatiaceae, а не с другими членами рода Ectothiorhodospira.

Было также подтверждено необычное положение на дереве бактерий рода Thiorhodospira: новый штамм Ts. sibirica В8-1 вместе с типовым штаммом этого вида на дереве РуБисКО группировался не с у-протеобактериями, а с а-протеобактериями. Поскольку, нуклеотидный состав и частота использования кодонов у типового штамма оказались одинаковыми для гена РуБисКО и для тотального генома в целом, но при этом заметно отличались от таковых у а-протеобактерий, то этот феномен был, предположительно, объяснён увеличением скорости несинонимичных замен, а не горизонтальным переносом генов (Tourova et al., 2007).

Сведений о структуре РуБисКО у представителей семейства Chromatiaceae относительно немного. До нашего исследования единственным изученным в этом отношении организмом был типовой штамм вида Allochromatium vinosum, в геноме которого были обнаружены 2 различных cbbL-тепа «зелёного» типа формы I. Полученные в нашей работе данные позволили существенно расширить круг представителей Chromatiaceae с известной структурой генов, кодирующих РуБисКО. Нами были исследованы 10 представителей данного семейства. У некоторых штаммов были обнаружены два гена, кодирующих форму I РуБисКО. Среди них типовой штамм вида A. minutissimum (Турова и соавт., 2009) и три штамма Thioalkalicoccus limnaeus. Каждый из cbbL генов A. minutissimum и

I Thioalkalicoccus limnaeus B7-I rfcfeL-2 _P- Thioalkalicoccus limnaeus A31W)/>L-2 J ' Thioalkalicoccus limitants A26T ebbh-2 1-Thioeapsa sp. XR

— Th iorhodococcus nuainitolivh apis I Allochromatium mimitissimum cbbL-2 Allochromariuin vintmim rbcA

— Ectothiorliodosinus mongolicus

_iHalorlwdospira balophila

I 'Halorhodospira halophila Mg3 I r-HaldrhodospimhalocUloris

I— Halorhodaspha abdehtmlekii Eclothiorhodospirashaposhnikovii Ectothiorhodospira mobilis Ecrorhiorodospira variabilis

Ectothiarboiospira ItaloalkaliphUa r-Allochromatium mimitissimum cbblrl л ' Allochromatium rinosum rhcL .Lamprobacter modestohalophilus SbNLb02 '■Lamprobacter modestohalophilus SivashNT

A.rinosum cbhb-2 кластер

Ectoth'wrhodospiraceae >

ft Ect,

Y-PB

Proclibrococcus marinus ¡Ectothiorhodospira mama MIO

' l'' ■ft]! lllrlin,t,ltr*!r

Ectothiorhodospira maena JB7-71 г Thioeapsa roseopersiciiiu DSM 217T ~—' Thincapsa boxorovii' BBS

rti

г-d'

Thincapsa bogoror_

г Thioalkalkoccus limnaeus B7-1 cbbL-1 Пr Thioalkalicoccus limnaeus A261 cbhL-]

Thioalkalicoccus limnaeus Ajl cbbL-l J Rhodovulum sulfidophihmt

Rhodovulum siilfidophilum Rp-6 Rhodobacter blasticm Rhodovulum emyhalinum Rhmlm'ulum adriaticum

Wwdobader aiotoformans cbbL-2 •Rhodobacter capsulants Rhodobacter reldkampii RJiodochta centeuaria cbhL-2 RlroJopseudomoftttspalustris cbbh-2 _I Thiorltodospira sibirica

• Avinosum Г cbbl-l кластер

Green (IA)

a-PB

-1> y-PB

•Thiorhodospira sibirica B8-

Рис. 1. Филогенетическое дерево фотоавтотрофных бактерий, построегоюе на основании сравнительного анализа генов РуБисКО формы I с использованием алгоритма neighbor-joining. Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее 10 заменам на каждые 100 нуклеотидов. Цифрами показана достоверность ветвления 100 альтернативных деревьев с помощью бутсреп-анализа (bootstrap). Последовательности, оперделённые в данном исследовании выделены жирным шрифтом и подчёркнуты.

The. limnaeus группировался вокруг соответствующего гена A. vinosum, расширяя тем самым кластеры «А. vinosum cbbL-1» и «А. vinosum cbbL-2». Другие изученные нами представители семейства, среди которых 3 представителя рода Thioeapsa (типовые штаммы Тс. roseopersicina, Th. bogorovii и штамм Thioeapsa sp.lR), 2 представителя рода Lamprobacter, и типовой штамм вида

ТМогкодососст таптюЩа^из имели по одному сййЬ-гену. При этом

последовательности этих генов имели высокую степень гомологии с известными для каждого рода сббЬ-последовательностями, и на общем дереве формы I группировались вокруг сЬЫ.-1 или сЬ6Ь-2 генов А. vinosllm.

В данной работе впервые было показано наличие у СИготаНасеае одновременно генов, кодирующих форму I и форму II РуБисКО. Такими примерами стали 3 штамма алкалофильного Тка. Итпаеиз и штамм галофильного ЬатргоЬааег тос!е$1о11а1орЬИив З^ах^1 Интересен тот факт, что у другого штамма Ь. тойез1оЬи\орЫ1и!: 8ЬЫЬЬ02 генов формы II РуБисКО не обнаружено, что является примером отличий в наборе генов РуБисКО на внутривидовом уровне.

На основании полученных данных можно предложить гипотетическую схему эволюции генов РуБисКО у фотоавтотрофных представителей порядка СЪготайакз (рис. 2).

Рис. 2. Гипотетическая схема эволюции генов РуБисКО у фотоавтотрофных представителей порядка СЬгопШеаЬз.

Вероятно, общий предок С11готайа1ез имел в геноме единственную копию гена, кодирующего фермент формы I и ген формы II. Представители ЕсШМог1юс1озри-асеае унаследовали предковую форму гена сЬЬЪ, потеряв при этом ген сЬЬМ. В процессе эволюции другой ветви - семейства СЪготайасеае -произошла дупликация гена сЬЬЪ, результатом которой мог стать тройной набор генов РуБисКО (сЬЬЬ-1, сЬЬЪ-2 и сЬЬМ), обнаруженный нами у представителей

АиосЪготы'шт

¡.стргаЬаси'Г 5р.

ТЫоЫкаНсоссиз

Thioalkalicoccus. Далее в процессе эволюции других .видов Chromatiaceae происходили потери как генов cbbM, так и избирательно одного из двух cbbL генов предковой формы. Кроме того, представитель вида Е magna, по-видимому, приобрел ген cbblA в результате горизонтального переноса генов.

В отличие от большинства пурпурных серных у-протеобактериями, пурпурные несерные а-протеобактерии оказались более разнообразными по составу генов РуБисКО. Штаммы Rhodoblastus acidophilus 5-6 и Rhodomicrobium vanniellii К-1, принадлежащие к порядку Rhizobiales, содержали в геноме «красный» вариант формы I, также как и единственный исследованный в данной работе представитель подразделения (3-протеобактерий Rubrivivax gelatinosus . При этом штаммы Rbl. acidophilus 5-6 и Rv. gelatinosus образовывали новые ветви внутри кластера «красного» типа РуБисКО, a Rhm. vannillei К-1 был близок к типовому штамму этого вида (97.3% сходства аминокислот). Ещё два представителя а-протеобактерий: коллекционный штамм Rp-б вида Rhodovulum sulfidophilum, как и типовой штамм этого вида содержал в геноме двойной набор генов РуБисКО: «зелёного» типа формы I и формы П; и штамм 5К вида Phaeospirillum fulvum - единственный ген формы II (см. рис. 1).

В целом, анализ генов РуБисКО у фотоавтотрофных бактерий показал, что, несмотря на общие несоответствия филогений РуБисКО и 16S рРНК, корреляция данных на уровне вида остаётся довольно чёткой. Уровень видового сходства cbbUM. последовательностей составляет не менее 87.7% для нуклеотидов и не менее 97.0% для аминокислот. Таким образом, ebb-гены можно использовать в качестве молекулярного маркёра в таксономических и экологических исследованиях в дополнение к традиционному методу анализа генов 16S рРНК.

3.3 Выявление и филогенетический анализ cbbhfM генов в группе хемоавтотрофных галофильных СОБ. В работе были исследованы несколько групп умеренно и экстремально галофильных облигатно хемолитоавтогрофных СОБ, выделенных из различных гиперсолёных водоёмов. Большинство штаммов принадлежали к новым таксонам родового ранга в подразделении у-протеобактерий (Sorokin et al., 2006; 2007а, b; 2008b). Для оценки уровня внутривидовой вариабельности генов РуБисКО нами было проведено исследование нескольких штаммов одного вида.

Фрагменты генов «зелёного» типа формы I РуБисКО были выявлены у всех штаммов, тогда как амплификация с использованием специфичных праймеров «красного» типа не дала положительных результатов ни для одной из исследуемых культур галофилов.

Топологии 16S рРНК и cbbL деревьев для исследуемых микроорганизмов в некоторой степени совпадали: каждая группа штаммов образовывала отдельные

1бБ рРНК

-е- >

{а-протеооакггерт! \

Т1иоа1каИ\1Ьгк> кластер 1

Тк'ш1каи\чЬгю [к ¿о суапоЛеп ¿^¡/¡аи 1$ ТЫаИшГтЬг'ю ((е/ит/шии Т1ш11ка1тЬпо т&апге(1исепх Т1ш1{к(11тЬгго рагш1охих — ТЫрЬц\о$р'1Г(1 /¡¡карркИа-AI.gr <>хпт .ЛпокаШргга 1ш1ор1ши 111^1 ТкюИаЬьтга ¡1а1ор1и1а НЬ4_

сьы

—Г" 1.'

-низ ни НЬП НЬкгЗ нио

1ЪюЬа1охр\га Ьа1оуЫ1а (основной кластер'

ПЫиМчаег ^авпапЛик НИЦ''' Т1йдка1опШ1аи пМгчНгЫисст НКЬР '

11125 НО НШ

ньгг2

нио

111.012 Н1Л)5 НП>4 НШЗ

ТЫоЬаЬтюпт (¡епИгШашч

,111.1)121 |ЦП)Ы-"1 111.04 4

1ни>Я.

.Хагососсии тоЫИх

¡1аЬгкш1о.\р1га

_ Л 1аН\1ососсш capuilittu.it

ЕаогЬ¡огко(1о$шму топцоИсит

\Icth\Loioccns сирхиШмн .

-с

Есшкшгко^охргга

ЛаЛЦииЬисШих /еггоохиЬтх сЬЬ1^2

— Нвк^г'юЬасИЬи Щ'ароШапт

- Шоа&аШа^ег Ьа\орЫЫ$ А1-С01 -НЬ27

Ьнио

г Ж и^орЬипч ИТТ.2

1ни

лШ-П

Я 11у[!го!1п'П!!а1г*.

НаЬФ'юЬасШи.ч.

ни, ни*,

111,271 1112»! ШД1 I

Н- ЫШЬегтащ V Ьн/прЫм'

'ТЬют!сго:,р1Ги " кластер

ТЫисата Ъ»х°г(пй ВВЯ АПоспгоншйшп пшшГмятшт

ТЫописгтр^а'' сЬЫ.-2

Айоскгошшшш гиюм/фг

.4. УШОХШП сЬЫ-1 кластер

ТкюкашьртгакаЬрЫЫ Н1.4—— ТЫока1тртг каЬркИа ЛПасйготайит гтошт гЬсЬ — РгосЫогососсиь тип них __ Яунескососси;: ер. —' ТЫоЬаЬхрЬа а1каЦр}и1а АЬаг 6$рт— ТШсаръа Ьо^огоуН ВВ£» -ТМописгохряа ка!орЫ1а ИЬ5. сЬЫ>-2 —^ Тк ¡<ш!ка ИЬасит Ь а1орЫ1и$ АЬГО! -

'Пшйкш'тЬгю рагаАохих

ТЫиЦсаГмАгю п'игапгеНасепх ^ Хагососсш моЬШх

Ве^шоа яц. ТЫоЬасШих (¡пороги*

"ТкюнпсгоярЬа" сЬЪЬ-1 кластер —-

Л. \>шо\ит сЬЫ-2 кластер

-НИН О г НЬ28 гНШ18 1 Н1Л9

ТЫока1огкаЬ(1т ¿етТг'фсапх}.

" РгоЫйогососап тапгшх ОР2 ХупесЛососсих »р.

"ШЛИО Ш28 101)18 НЫ9

СляшИкиЧта

Рис.3. Положение галоалкалофильных СОБ на дереве транслированных аминокислотных последовательностей сЬЬЪ генов в сравнении с 168 рРНК-деревом. Дендрограммы построении с использованием алгоритма neighbor-joining. Совпадающие позиции выделены серым. Масштаб указывает на количество замен на каждые 100 нуклеотидов. Точки ветвлениях уровнем бутстреп ниже 70% колдапсированы на общую ось ветвления. Исследованные в данной работе штаммы подчеркнуты. Серым цветом выделены кластеры, положение которых совпадает на обоих типах деревьев.

глубокие ветви как на «рибосомном» дереве, так и на дереве генов формы I РуБиеКО. Уровень внутривидового сходства последовательностей РуБисКО был достаточно высок,, составляя в среднем 97.5 - 100%. Однако взаимное расположение некоторых кластеров относительно других у-протсобактерий на cbbL-дереве отличалось о такового на «рибосомном» дереве (рис. 3). Основные несоответствия касались группы штаммов Thiohalospira halophila. Большинство штаммов этого вида на дереве cbbL генов группировались в единый кластер, однако, два штамма Th. halophila (HL4 и HL21) и 77г. alkaliphila образовывали ветви в кластере фото- и хемотрофных у-протсобактерий, сформированном вокруг одного из cbbL генов Allochromatium vinosum («А. vinosum-cbbL-1» кластер).

Другим примером различий в топологиях деревьев является положение факультативно галоалкалофильного вида Thioalkalibacter halophilus ALCOl, который, согласно анализу генов 16S рРНК был наиболее близок к Halothiobacillus. Обнаруженный у него ген формы I РуБисКО оказался близким по структуре к одному из cbbL генов галофильной СОБ Thiomicrospira halophila, выделенной из гиперсолёных озёр ранее. Вместе оба штамма группировались вокруг rbcL гена А. vinosum, расширяя тем самым «А. vinosum-cbbL-1» кластер.

Праймерная система Rubi 1331 f/Rubll 1113г, специфичная для амплификации формы II РуБисКО позволила получить фрагменты соответствующих генов у всех штаммов pop.a\hiohalomonas, большинства штаммов Thiohalorhabdus, и лишь у отдельных штаммов Halothibacillus и Thiohalospira. Противоречия в топологиях 16S рРНК и CbbM-деревьев наблюдались в положении групп штаммов Thiohalospira и Halothiobacillus (рис. 4). На сббМ-дереве кластер штаммов HL1, HL2 и HL27 не связан с единственным видом Halothiobacillus neapolitanus, и образует отдельную ветвь в кластере автотрофных СОБ Acidithiobacillus, Thiobacillus и Thiomonas. Однако наиболее заметным несоответствием филогений стало близкое сходство последовательностей сЪЪМ генов между представителями Thiohalospira и Thiohalorhabdus, которые оказались достаточно удалены друг от друга согласно данным анализа 16S рРНК и cbbL генов.

16S pPHK

o.i

0.1

Rhodoferaxferrireducens Polaromonasiiaphthalenirorans Lcptothrix cholodnii Thiomonas intermedia Decliloromonas aromatiea ThiobaciUusthioparus ThiobaciUusdenitrificans AcidithiobaciUus ferrooxidans

Halothiobaciilm ncapolitanux

(HL2 r HalothiobacHlas-. / ^шл HL1 У I I1L2

"Thiomicruspira' кластер

'Mariprofundus fcrrooxy dans'

CbbM

а-протеобактерпп |

г4

HL21] HL4 \

Thiohalospiruhalophila

г Thinhtilomonas nitratircducens HRhD 3s nT—

t|HLDI2 (HLD5 1HLD4 >"HLD3 . , , , . ... HLD5 ■" TluohalomomisdemtrificansH\Ai\2~

f 1ILD4- HLD3

Thiohalosyira halophila

HL4i HL21f

mpJ

HLD10] Г HL28 HL28 f- Thiohalorhubihis dciutrificam H HL19 HL19 J __IHLDIC

Рис. 4. Положение галоалкалофильных СОБ на дереве транслированных аминокислотных последовательностей сАШ генов в сравнении с 16S рРНК-деревом. Дендрограммы построении с использованием алгоритма neighbor-joining. Совпадающие позиции выделены серым. Масштаб указывает на количество замен на каждые 100 нуклеотидов. Точки ветвления с уровнем бутстреп ниже 70% коллапсированы на общую ось ветвления. Исследованные в данной работе штаммы подчёркнуты.

Подобные противоречия вероятнее всего объясняются процессами горизонтального переноса генов РуБисКО от одной группы бактерий к другой. С учётом того, что ферменты формы I и формы II имеют разные кинетические характеристики и отличаются по степени сродства к СОг, процессы приобретения / потери генов разных форм РуБисКО могут быть обусловлены необходимостью наиболее полной адаптации к условиям занимаемой

экологической ниши. Горизонтальный перенос, вероятнее всего может являться причиной различий в наборе генов РуБисКО у штаммов, принадлежащих к одному виду. До настоящего времени в литературе не было данных о подобных внутривидовых различиях структуры генома. До сих пор можно было сравнить состав и структуру генов РуБисКО только для двух различных штаммов вида Ас./еггоохМапз (типового штамма АТСС 23270 и штамма АТСС 53993), у которых эти гены оказались идентичными по составу и близкими по структуре.

Разный состав генов РуБисКО внутри вида также был продемонстрирован в нашем исследовании фотоавтотрофных бактерий (см. раздел 3.1), что может говорить о необходимости выполнения в дальнейшем исследований нескольких штаммов одного вида для оценки вариабельности их геномов.

4. Детекция генов РуБисКО в образцах осадков солёных и содовых озёр. Анализ генов, кодирующих большую субъединицу РуБисКО был использован для оценки разнообразия автотрофов, фиксирующих СОг в цикле Кальвина. Автотрофное звено в трофической структуре гало(алкало)филыюго сообщества представлено оксигенными и аноксигенными фотоавтотрофами, а также хемолитоавтотрофами, среди которых сероокисляющие бактерии (СОБ) имеют наиболее эффективный метаболизм в экстремальных условиях высокой солёности и рН.

К автотрофам относят также метаногенов и сульфатредукторов, однако они фиксируют СО2 с использованием нециклических путей и не являются предметом данного исследования.

Главным образом, в работе были исследованы образцы осадков из различных озёр Кулундинской степи, отличающихся по уровню солёности и рН. Дополнительно была исследована смесь осадков из системы содовых озёр Вади Натрун (Египет). Образцы условно были разделены на две группы: 1) образцы из умеренно-солёных и гиперсолёных содовых озёр; 2) образцы из гиперсолёных озёр с нейтральным рН. Также образцы отличались по способу отбора проб (интегральные пробы и поверхностный слой осадков). Список и основные характеристики озёр приведены в таблице 2 в разделе «Объекты и методы исследования».

4.1 Детекция генов, кодирующих форму I и форму II РуБисКО в умеренно-солёных и гиперсолёных содовых озёрах с высоким рН. Для

выявления генов формы I РуБисКО первоначально применяли разработанные в данной работе праймеры. С их помощью были получены 4 библиотеки клонов для образцов смешанных осадков умеренно-солёных озёр 05-2, 05-3, 8-06 и образца Т5-07 из оз.Танатар-5. Каждая библиотека содержала в среднем по 50 клонов. По результатам сравнительного анализа клонов, нуклеотидные последовательности с

уровнем гомологии 99% и выше были объединены в один филотип (OTU -operational taxonomic unit), таким образом, в каждой библиотеке было выделено от 2 до 4 филотипов. Состав 4-х библиотек оказался схожим (рис. 5).

05-2

(смешанный образец)

Т5-07 (оз.Танатар )

«Симбионт Eclothiorhodasinus Solemya velum»

Альф,- Альфа-

«А-vinosum

S-06 (смешанный образец)

cbbL-1» кластер

«Симбионт Solemya velum» кластер

«A.vinosum cfabL-1» кластер

Рис. 5. Распределение сЬбЬ-филотипов в библиотеках из умеренно-солёных содовых

озёр.

Доминирующей в каждой библиотеке была группа неидентифицированых филотипов у-протеобактерий. На CbbL-дереве они объединялись с «A.vinosum cbbL-1» кластером, который, как было показано ранее, включает как фото-, так и хемоавтотрофных бактерий. В качестве минорных были обнаружены также общий для всех библиотек филотип, родственный последовательности cbbL гена эндосимбионта глубоководного моллюска Solemya velum и филотип фототрофного Ectothiorhodosinus.

Кроме того, в образцах из умеренно-солёных озер Т5-07 (оз. Танатар-5) и смеси осадков S-06 присутствовали филотипы «красного» варианта формы I, принадлежащие неизвестным в настоящее время представителям а-протеобактерий.

Неожиданным стало отсутствие в исследованных библиотеках филотипа, филогенетически близкого бактериям рода Thioalkalivibrio, представители которого являются наиболее распространённой группой в содовых озёрах среди культивируемых сероокисляющих бактерий.

В связи с этим, для образца 05-3 была сконструирована дополнительная клоновая библиотека с использованием менее вырожденной пары праймеров

ЯиЬ^Б/ЯиЬ^Я, ранее показавшей свою эффективность для детекции генов «зелёного» варианта формы 1 РуБисКО у представителей семейства ЕсшИюгкос1озр1гасеае. В результате первичного сравнительного анализа в дополнительной библиотеке 05-3(2) было выделено 10 ОТО (вместо 2 ОТО в библиотеке 05-3(1)) (рис. 6).

«Симбионт $о1инуа ус1ит» кластер \

«АЛ'ШОЯЦП

сЬЫЛ» кластер

Альфа-

протеобактещш

Юнк/ощ/иш Цпанобакте|

Га.чма-протеобактепн

Библиотека 05-3 - (1) (смешанный образец)

«Симбионт ЭЫешуа уе1иш» / кластер

Библиотека 05-3 - (2) (смешанный образец)

НаШЫоЬасш

ЕсЫЫог1ю(1охтш I

ТЫоа1каИгН>по

Рис.6. Распределение еМЬ-филотипов в библиотеке 05-3-(1) и в дополнительно сконструированной библиотеке 05-3-(2).

Общим для библиотек 05-3(1) и 05-3(2) оказался только один филотип, родственный сЬЬЬ гену бактерии-симбионта 5о1етуа уе/ми, который в библиотеке 05-3(2) оказался преобладающим. Кроме того, в библиотеке 05-3(2) были обнаружены филотипы хемоавтотрофных На1о1ЫоЬасй\т и Шоа1ка!тЬгю, и фототрофных Югос1от1ит, ЕсШЫогЬо(1о8\пи$ и цианобактерий.

В дальнейших исследованиях для анализа интегральных проб 05-1 и и поверхностных проб 4КЬ и 6КХ использовали пару праймеров ЯиЬ^Б/КиЬ^Я.

Состав смешанных образцов 05-1 и \VN-S из гиперсолёных содовых озёр Танатар-1 и Вади Натрун, соответственно, оказался схожим и был представлен двумя компонентами: доминирующим ТМоа1ка1ЫЬпо и минорным На1огИос{о8р1га, и таким образом, заметно отличался от состава образцов из умеренно-солёных озёр.

Библиотеки поверхностных слоёв оказались практически монотиповыми. Основная часть клонов в библиотеке 4КЬ распределилась между 3 филотипами, группировавшимися на дереве с сЪЪЬ-последовательностями На1огкойо8р\га. Минорные филотипы представлены хемоавтотрофными ТЫоа1ка1МЪгю и фототрофными цианобактериями. В библиотеке 6КЬ (оз. Танатар-5) доминировали цианобактерии, составляя 87% от общего разнообразия. В качестве минорных членов сообщества были обнаружены фотоавтотрофные Есш1гюгИос1озтиз, а также неизвестная группа а-протеобактерий, несущих в

геноме «красный» вариант формы I РуБисКО, сходная с обнаруженными ранее в интегральных пробах.

Некоторые фнлотипы фото- и хемоавтотрофных бактерий, присутствующие в Кулундинских озёрах, были ранее найдены в умеренно-солёном содовом озере Моно Лейк (Калифорния, США) (Giri et al, 2004). Среди них ctóL-филотипы, относящиеся к Thioalkalivibrio, Ectothiorhodosinus и цианобактериям. Однако в Моно Лейк не были обнаружены филотипы бактерий, содержащих в геноме форму II РуБисКО, тогда как в нашем исследовании они присутствовали в большинстве интегральных проб осадков (умеренно-солёных содовых 05-3, Т5-07, S-06 и гиперсолёного содового WN-S).

Генетическое разнообразие cWM-библиотек оказалось значительно ниже в сравнении с библиотеками формы I РуБисКО. Библиотеки клонов формы II РуБисКО были сконструированы только для 4-х образцов интегральных проб осадков. В каждой библиотеке было выделено от 2 до 6 филотипов, каждый из которых объединял последовательности со степенью гомологии более 99%.

Озёра с умеренной солёностью Thiohalospira

Филотип А

S-06 (смешанный образец)

оз. Танатар-5 (Т5-07)

Озеро с высокой солёностью

05-3 (смешанный образец)

Филотип С

Филотип В

Вади Натрун (ТО1)

Рис. 7. СЬЬМ-филотипы, обнаруженные в интегральных пробах осадков умеренно-солёных и гиперсолёных содовых озёр.

Большинство филотипов остались неидентифицированными, и образовывали на СЬЬМ-дереве отдельные группы, не связанные близким родством с известными бактериями. В настоящее время оценить их филогенетический статус невозможно. Однако стоит отметить, что доминирующие филотипы, обнаруженные в 3-х умеренно-солёных образцах оказались практически идентичными и не присутствовали в гиперсолёном озере Вади Натрун, где доминировали несколько близкородственных филотипов неизвестных бактерий (рис. 7). При этом доминанты из Вади Натрун

присутствовали и в умеренно-солёных образцах, но только в качестве минорных членов сообщества. Некоторые минорные филотипы в умеренно-солёных образцах всё же удалось идентифицировать: в образце Т5-07 (оз. Танатар-5) и смешанном образце 05-3 присутствовали филотипы, родственные экстремально галофильной СОБ ТМока1о5р1га 1ха1орШа НЬ21, филогения генов РуБисКО которой была рассмотрена в разделе 3.3.

В поверхностных слоях осадков содовых озёр филотипов формы II РуБисКО не обнаружено.

4.2 Детекция генов, кодирующих большую субъединицу РуБисКО формы I и формы II, в осадках гиперсолёных озёр с нейтральным рН.

Для исследования были выбраны 3 наиболее типичные гиперсолёные озёра Кулундинской степи, с рН 7.45 - 7.8 и уровнем общей минерализации 300 - 360 г/л, в которых ранее культуральными методами были обнаружены основные группы галофильных СОБ, включающие НаЫМоЬасШия, ТЫоИаЬзрка, ПюИЫогкаЬсЬлз, ТЫоЪа1отопа$ и ТЫоЬ.аорЫ]1ш. Список озёр приведён с табл. 2 в разделе «Объекты и методы исследования».

Гены РуБисКО формы I и формы II были обнаружены во всех образцах.

Каждая из библиотек формы I содержала в среднем от 5 до 13 филотипов (рис 8).

Самой разнообразной оказалась библиотека из озера Ломовое (8КЬ). Примерно треть клонов от общего числа в библиотеке распределилась между 3 филотипами, принадлежащими цианобактериям. Следующими по числу клонов (около 25% от общего числа) оказались галофильные СОБ Шоа1ка1тЪпо. НаЬШоЬасШия, ЕсюМогкоЛозтих, ТЫоЬа1орЫ1и.<;, ТЫоЬсйогЪаЪс}^. Один из минорных филотипов отдалённо был связан с группой родов А1каШрт11ит-А1ка1Шттсо1а.

Заметно меньшее разнообразие сббЬ-последовательностей было выявлено в поверхностных слоях осадков гиперсолёного озера Петухово (образец 2КЬ): по степени распределения сббЬ-последовательностей между филотипами данная библиотека оказалась практически монотиповой. Большинство последовательностей имели уровень сходства более 97% и были объединены в один филотип, относящийся к роду На1оМоЬасШиз. Минорные филотипы, представленные в среднем 1-3 последовательностями, оказались принадлежащими к ТЫоа1ка1ЫЬпо и цианобактериям, наиболее близким к СуапоЛесе ер.

И, наконец, в гиперсолёном озере Бурлинское (14КЬ) присутствовали 7 сйЬЬ-филотипов, большинство из которых были отдалённо связаны с

экстремально галофильной СОБ ТЫока1огЪаЪс1и$ с!етмАсапз, которая образует глубокую ветвь как на сЬЬЪ дереве, так и на дереве генов 16Б рРНЬС.

ТЫо1ш1(К1р1Га

Нп1о(ЫоЬасИ1из

ТЫоя1каНу1Ьгю

ТЫоЪа1огЬаЬди* ТЫоЬа1орЫ1и* / А/Ы/!р/гШит \adllus \_

^Ц^анооактерии

Поверхностные слон осадков

Рис. 8. Филотипы формы I РуБисКО, обнаруженные в интегральных пробах и поверхностных слоях осадков гиперсолёных нейтральных озёр.

Один из минорных филотипов оказался практически идентичным последовательности сЪЪЬ гена НаЫЫоЬасШт каЬрЫЫз, тогда как другой был близок к двум штаммам Т1иока1ояр1га Иа1орЫ1а НЬ4 и НЬ21, отличающихся необычным положением на дереве сЬЬЪ последовательностей (см. раздел 3.3).

В библиотеках формы II РуБисКО не было выявлено значительного разнообразия. В осадках оз. Ломовое (8КЬ) большая часть сббМ-филотипов осталась неидентифицированной. Лишь 25% от общего числа последовательностей удалось идентифицировать: они принадлежали умеренно-галофильному тиоденитрификатору Ткюкактопах ¿епНгфссж, несколько штаммов которого были выделены ранее, в том числе из кулундинских озёр.

Доминирующие филотипы формы II в осадках оз. Бурлинское как и для формы I были родственны группе штаммов ТЫака1ог}\аЪАт с1епИпАсап$, выделенных из гиперсолёных мест обитания ранее микробиологическими методами (Зогокш е1 а!., 2008Ь). В качестве минорного компонента в сообществе присутствовали сбШ-филотипы, близкие НаЫЫоЪаЫИш.

Единственный сбйМ-филотип, обнаруженный в поверхностном слое озера Петухово-солёное (2КЬ) идентифицировать не удалось.

В целом, результаты ¿¿¿-анализа не выявили значительного разнообразия автотрофов ни в содовых, ни в солёных озёрах. Многие филотипы остались неидентифицированными, что свидетельствует об уникальности микроорганизмов в гало(флкало)фильных сообществах.

Качественный состав сообществ автотрофов различался как в группе содовых озёр (умеренно-солёные и гиперсолёные), так и между гиперсолёными нейтральными и щелочными озёрами.

Форма I РуБнеКО

Интегральные пробы осадков

Поверхностный слой осадков

100%

05-2 05-3 в-Об Т5-07 05-1 \ra-S 14К1. 4----

Содовые НейтР-

Форма II РуБисКО

2К1- 8К1- 4К|_ 6К1. Нейтральные Содовые

Интегральные пробы осадков

Поверхностный слой осадков

05-2 05-3 5-06 Т5-07 05-1 «N-5 14К1. Ч- _--У Чг-'

Содовые Фотоавтотрофы

Нентр.

2К1. 8К1. 4К1- 6К|_ Нейтральные Содовые

Хемоавтотрофы | 1 Неидонтифнцированные

Рис. 9. Вклад филотипов РуБисКО, принадлежащих фото- и хемоавтотрофам, в общее разнообразие автотрофов в осадках содовых и гиперсолёных озёр с нейтральным рН.

При этом анализ распределения фото- и хемотрофных филотипов в кленовых библиотеках выявил различия между образцами интегральных и поверхностных проб (рис. 9). Так, в образцах поверхностных слоев осадков содовых озёр фототрофные филотипы были доминирующими. В поверхностных слоях гиперсолёных нейтральных озёр фототрофы составляли от 2 до 48% от общего числа клонов. В сравнении с поверхностью, в интегральных пробах преобладали филотипы хемоавтотрофных бактерий.

Несмотря на значительную часть неизвестных филотипов, уже сейчас можно сказать, что большинство последовательностей в обоих типах проб принадлежат микроорганизмам подразделения у-протеобактерий (рис. 10).

Форма I РуБисКО

Интегральные пробы осадков

Поверхностный слой осадков

, ЕЙ* ЕЯЯ

05-2 05-3 5-06 Т5-07 05-1 УУМ-Б 14К1_

2К1_ 8KL 4К1- 6КЬ

Содовые Нейтр. Нейтральные Содовые

Форма II РуБисКО

Интегральные пробы осадков

Поверхностный слой осадков юо% .

05-2 05-3 5-ое Т5-07 05-1 «т-вИК!. ---- 1

Соловые о-протеобактерии

Нейтр.

у-протеобактерпн [ I Неилентифицированные

^ 8К[- 4КЬ 6К1.

Нейтральные Содовые

Цнанобак-герпп

Рис. 10. Вклад филотипов РуБисКО, принадлежащих протеобактериям и цаинобактериям, в общее разнообразие автотрофов в осадках содовых и гиперсолёных озёр с нейтпатткным пН.

В данной работе также был проведён анализ генов АТФ-зависимой

цитратлиазы (ас/В) в осадках содовых озёр. Праймеры, специфичные для зелёных

серных бактерий филы СЫогоЫ, не выявили соответствующих генов ни в одном

из образцов, что соответствует данным микробиологических исследований,

которые не обнаружили культивируемых представителей зеленых серных

бактерий в содовых озерах. Однако с помощью праймеров, специфичных для

хемоавтотрофных бактерий, в интегральных пробах из умеренно-солёных озёр

(Т5-07 и Б-Об) были обнаружены близкие уникальные филотипы, принадлежащие

неизвестным эпсилон-протеобактериям. До настоящего времени в литературе не

было сведений о присутствии автотрофных эпсилон-протеобактерий в содовых

озёрах, поэтому полученные данные свидетельствуют о необходимости

проведения дальнейших микробиологических исследований по вьивлению этих уникальных микроорганизмов.

ВЫВОДЫ

1. Усовершенствованы известные праймерные системы и разработаны новые праймеры для амплификации генов РуБисКО форм I и II у различных бактерий.

2. Определены и включены в международную базу данных GenBank последовательности 101 фрагмента генов, кодирующих РуБисКО формы I и формы II, а также АТФ-цитратлиазы, принадлежащих различным хемо- и фотоавтотрофным бактериям;

3. Проведён филогенетический анализ полученных de novo последовательностей, который позволил:

• выявить особенности эволюции фотоавтотрофных бактерий и предложить схему эволюции генов, кодирующих РуБисКО формы I у фотоавтотрофных бактерий порядка Chromatiales;

• выявить внутривидовую вариабельность структуры и набора генов РуБисКО у галофильных ссроокисляющих бактерий;

4. Показана эффективность использования белок-кодирующих генов для анализа минорных членов микробных сообществ, присутствие которых не всегда обнаруживается анализом генов 16S рРНК (в частности, представителей новых родов хемолитоавтотрофных галофильных СОБ родов Thiohalorhabdus, Thiohalospira, Thiohalomonas, Thiohalophilus)',

5. Анализ генов РуБисКО в исследованных природных гало(алкало)фильных сообществах выявил доминирование хемотрофных (pp. Thioalkalivibrio, Thiohalorabdus, Halothiobacillus) и фототрофных (p. Halorhodospira) гамма-протеобактерий; показаны изменения в распределении филотипов фото- и хемотрофов в направлении от поверхностных слоёв осадков, где преимущественно обнаруживаются фототрофы, до глубинных слоёв, в которых преобладают хемоавтотрофы.

6. Анализ генов РуБисКО и АТФ-зависимой цитратлиазы выявил присутствие в солёных озёрах неизвестных представителей хемоавтотрофных бактерий, в том числе, впервые обнаруженных в некоторых содовых озёрах филотипов е-протеобактерий, что свидетельствует о необходимости дальнейшего изучения биоразнообразия гало(алкало)фильных экосистем традиционными микробиологическими методами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в научных журналах:

1. Турова Т.П., Кеппен О.И., Ковалева О.Л., Слободова Н.В., Берг И.А., Ивановский Р.Н. (2009). Филогенетическое положение пурпурной серной

бактерии thiocapsa sp. штамм BBS на основании анализа генов 16s рРНК, cbbL и niffl и описание его в качестве нового вида Thiocapsa bogorovii sp.nov. Микробиология т.78(2): 1-12.

2. Sorokin DY, Kovaleva OL, Tourova TP, Muyzer G. (2010). Thiohalobacter thiocyanaticus gen. nov., sp. nov., a moderately halophilic, sulfur-oxidizing gammaproteobacterium from hypersaline lakes, that utilizes thiocyanate. Int J Syst Evol Microbiol 60(Pt 2):444-50.

3. Sorokin DY, Tourova TP, Kovaleva OL, Kuenen JG, Muyzer G. (2010). Aerobic carboxydotrophy under extremely haloalkaline conditions in Alkalispirillwn/AlkaMimnicola strains isolated from soda lakes. Microbiology, 156(Pt3): 819-27.

4. Tourova TP, Kovaleva OL, Sorokin DY. and Muyzer G. (2010). Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase genes as a functional marker for chemolithoautotrophic halophilic sulfur-oxidizing bacteria in hypersaline habitats. Microbiology. 156(Pt7): 2016-25.

5. И.А. Брянцева, Т.П. Турова, О.Л.Ковалева, H.A. Кострикина, B.M. Горленко (2010). Новая крупная алкалофильная пурпурная серобактерия Ectothiorhodospira magna sp. nov. Микробиология, 79(6): 782-792.

6. Kovaleva Olga L., Tatjana P. Tourova, Gerard Muyzer, Tatjana V. Kolganova and Dimitry Y. Sorokin (2010). Diversity of RuBisCO and ATP citrate lyase genes in soda lake sediments. FEMS Microb Ecol (in pressl. DOI: 10.1111/j. 1574-6941.2010.00996.x.

Тезисы конференций:

1.Kovaleva O.L., Sorokin D.Y., Turova T.P., Muyzer G. Investigation of autotrophic prokaryotes biodiversity in extremely soda lakes using RuBisCO genes as phylogenetic markers. 3rd Congress of European Microbiologists: «Microbes and Man -interdependence and future challenges», Gothenburg, Sweden, June 28 - July 2, 2009.

2.Ковалева О.Л., Сорокин Д.Ю., Турова Т.П. Использование генов РуБисКО как филогенетического маркёра для исследования биоразнообразия автотрофных прокариот содовых озёр. Всероссийский симпозиум с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов». Москва, Россия, 24 - 27 декабря, 2009. Материалы симпозиума, с.79.

3.Kovaleva O.L., Sorokin D.Y., Turova Т.Р., Muyzer G. Ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase as phylogenetic marker for autotrophic bacteria in hypersaline habitats. 9th International conference on halophilic microorganisms "Halophiles 2010", Beijing, China, June 29 - July 3, 2010.

Подписано в печать:

12.11.2010

Заказ № 4508 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ковалева, Ольга Леонидовна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Гиперсолёные озёра.

1.1. Биогеохимия содовых рассолов.

1.2. Ареал распространения и примеры исследованных озёр.

Глава 2. Гало(алкало)фильное микробное сообщество.

2.1. Трофическая структура микробного сообщества.i.

2.2. Автотрофное микробное сообщество гиперсолёных озёр.

2.2.1. Фототрофные бактерии - первичные продуценты органического вещества.

2.2.2. Хемолитоавтотрофы содовых озёр.

2.2.2.1 Хемолитоавтотрофные СОБ содовых озёр.

2.2.2.2 Алкалофильные нитрификаторы.

2.2.2.3 Алкалофильные хемоавтотрофные гидрогенотрофы.

2.2.2.4 Карбоксидотрофы содовых озёр.

Глава 3. Основные механизмы автотрофной ассимиляции углерода.

3.1. Восстановительный пентозофосфатный путь (цикл Кальвина).

3.2. Восстановительный цикл трикарбоновых кислот (цикл Арнона).

3.3. 3-гидроксипропионатный цикл.

3.4. З-гидроксипропионатный/4-окисбутиратный путь.

3.5. Дикарбоксилат/ 4-окисбутиратный путь.

3.6. Ацетил-КоА путь фиксации С02 (цикл Вуда).

Глава 4. РуБисКО — ключевой фермент цикла Кальвина.

4.1. Форма I РуБисКО.

4.2. Форма II РуБисКО.

4.3. Форма III и форма IV РуБисКО.

Глава 5. АТФ-зависимая цитратлиаза - ключевой фермент вЦТК.

Глава 6. Изучение разнообразия природных микробных сообществ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Глава 7. Материалы и методы.

7.1. Объекты исследования.

7.2. Выделение ДНК.

7.3. Конструирование праймеров.

7.4. Амплификация фрагментов исследуемых генов.

7.5. Амплификация фрагментов генов, кодирующих РуБисКО формы I и 11.

7.5.1. Амплификация фрагментов генов, кодирующих (3-субъединицу

АТФ-зависимой цитратлиазы.

7.5.2. Амплификация фрагментов генов, кодирующих 16S рРНК.

7.5.3. Анализ и очистка ПЦР-фрагментов.

1.5 А. Клонирование.

7.5.4.1 Приготовление компетентных клеток.

7.5.4.2 Трансформация.

7.6. Секвенирование участков генов РБФК.

7.7. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей.

7.8. Статистический анализ.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 8. Разработка и проверка праймерных систем для амплификации генов РуБисКО формы I и.формы II.

8.1. Разработка праймеров для амплификации генов формы I и формы II РуБисКО.:.

8.2. Тестирование разработанных праймеров.

Глава 9. Детекция и анализ генов РуБисКО и АТФ-зависимой цитратлиазы у представителей различных таксонов бактерий.

9.1. Выявление и филогенетический анализ генов РуБисКО у фотоавтотрофных бактерий.

9.1.1. Использование анализа сЪЪL генов для описания новых видов фототрофных бактерий.

9.1.2. Филогения и эволюция фотоавтотрофных бактерий на основании сравнения cbbL/M генов.

9.2. Выявление и филогенетический анализ генов РуБисКО у хемоавтотрофных бактерий.

9.2.1. Анализ генов РуБисКО у экстремально галоалкалофильных карбоксидотрофных штаммов А1ка1 ирт11ит/А 1каШ 1ттсо1а группы.

9.2.2. Анализ сЪЫ,1ЪА генов у хемоавтотрофных экстремально галофильных СОБ, выделенных из осадков гиперсолёных озёр.

9.3. Выявление и филогенетический анализ генов асГВ у фототрофных зелёных серных бактерий.

Глава 10. Детекция и анализ генов РуБисКО и АТФ-зависимой цитратлиазы в образцах осадков солёных и содовых озёр.

10.1. Анализ сЬЬЬ/М генов в осадках умеренно-солёных и гиперсолёных озёр с высоким значением рН.

10.1.1. Детекция сЬЬЪ генов, кодирующих форму I РуБисКО.

10.1.2. Детекция сЬЬЫ генов, кодирующих форму II РуБисКО.

10.2. Анализ сЬЬЬ/М генов в осадках гиперсолёных озёр с нейтральным рН

10.2.1. Детекция сЬЬЪ генов, кодирующих форму I РуБисКО.

10.2.2. Детекция сЬЬЫ генов, кодирующих форму II РуБисКО.

10.3. Детекция генов АТФ-зависимой цитратлиазы (ас/В) в осадках содовых озер.

10.4. Общие закономерности распределения филотипов автотрофов в осадках солёных и содовых озёр.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование генов РуБисКО и АТФ-зависимой цитратлиазы у фото- и хемоавтотрофных бактерий, и анализ их разнообразия в осадках солёных и содовых озёр"

Солёные озёра являются уникальными природными экосистемами, характеризующимися высоким содержанием минеральных солей. Специфическим типом солёных водоёмов являются содовые озёра. Для; них характерно наличие фракции щелочных карбонатов №. и К, которые и обусловливают стабильно высокий: уровень рН в данных водоёмах. Несмотря на определённое сходство по своим физико-химическим; условиям с морскими экосистемами, солёные озёра. значительно менее исследованы. Изучение содовых озёр на территории России впервые было проведено группой под руководством Б.Л. Исаченко в 1930 году (Исаченко, 1951). Интерес к изучению галоалкалофильных микробных сообществ снова возник лишь спустя несколько десятилетий, и был обусловлен прикладными задачами поиска щелочеустойчивых экзогидролаз, используемых в-качестве добавок к моющим средствам.

Высокая концентрация солей в рассолах создаёт неблагоприятные условия для развития в; них эукариотного сообщества и, тем самым, способствует сохранению в них, реликтового микробного сообщества (Заварзин, 1993).

Благодаря активным исследованиям-последних лет было показано, что в гиперсолёных содовых озёрах присутствуют все основные группы представителей фото- и хемолитотрофов, обеспечивающих полный цикл превращения вещества в системе.

Одним из наиболее значимых биогенных элементов, определяющих возможность существования и развития биосферы, является углерод. Важнейшей стадией в цикле углерода является процесс ассимиляции ССЬ автотрофными организмами, в состав которых в содовых озёрах входят как алкалофильные фототрофные (оксигенные и аноксигенные) бактерии, так и хемотрофные бактерии, среди которых значительная роль принадлежит сероокисляющим (СОБ). Среди идентифицированных традиционными микробиологическими методами видов имеются представители алкалофильных фотоавтотрофов ЕсШЫог1юс1озр&а, На1огкос1о8р1га, ЕсШЫогкас1о8 т ш1, а также представители галоалкалофильных, сероокисляющих бактерий ТИюа1ка1шЪгю,. НаШШдЪасШш, ТМокакщлга, Ткю1ш1огкаЬЫш и др. '.'•.•

В; экстремальных условиях нередко; обнаруживаются* уникальные автохтонные микроорганизмы, не встречающиеся в других экосистемах, что свидетельствует об актуальности изучения- биоразнообразия гиперсолёных мест обитания. Одним из перспективных направлений в изучении биоразнообразия гиперсолёных озёр является исследование состава микробной популяции с помощью методов молекулярной биологии. Чаще всего для этих целей используется анализ генов 16Б рРНК, однако в последнее время новым подходом становится анализ генов, кодирующих определённую функцию. Примерами таких генов-маркёров могут быть сЬЬЫШ и ас1В гены, кодирующие ключевые ферменты наиболее распространённых циклов ассимиляции СОг - цикла Кальвина; и восстановительного цикла трикарбоновых кислот (вЦТК), соответственно:. Первичная структура этих ферментов достаточно консервативна; и может быть использована в филогенетике.

Ключевым ферментом цикла Кальвина является рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилаза/оксигеназа (РуБисКО). По структурным и функциональным особенностям у бактерий в^ настоящее время выделяют 2 формы фермента. Наиболее распространённой является форма I, большая субъединица которой кодируется сЬЫ, генами. Внутри формы I существует разделение на 2 варианта:: «зелёный», обнаруживаемый у протеобактерий, зелёных растений и водорослей, и «красный», преимущественно обнаруживаемый у а-, Р-протеобактерий, а также красных водорослей. Форма II фермента, кодируется;сШУГ генами, встречается значительно реже.

Гены, кодирующие (3-субъединицу АТФ-зависимой цитратлиазы (<яс/В), имеют две структурные формы, присущие соответственно хемоавтотрофным представителям е-протеобактерий и филы Адшйсае и фотоавтотрофам филы СЫогоЫ.

Анализ сЬЬЪ/М и ас1В генов в природных образцах позволяет получить достоверную информацию о составе С02-ассимилирующей части микробной популяции, не прибегая к традиционных методам выделения микроорганизмов в чистую культуру. Это особенно актуально в случае исследования гиперсолёных озёр, так как культивирование некоторых групп экстремально галоалкалофильных автотрофных микроорганизмов часто затруднительно в связи с особенностями метаболизма последних.

Целью настоящей работы являлось проведение сравнительного анализа генов ключевых ферментов фиксации. СОг у фото- и хемоавтотрофных бактерий и использование этих генов-в качестве молекулярных маркёров для оценки разнообразия автотрофных бактерий в осадках содовых озёр и гиперсолёных озёр с нейтральным рН.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи: провести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей больших субъединиц генов РуБисКО, доступных в международной базе данных ОепВапк, для выявления участков со степенью консервативности 60% и более; на основании проведённого анализа усовершенствовать известные • праймерные системы, а также сконструировать новые праймеры, пригодные для амплификации генов РуБисКО у бактерий, принадлежащих к разным таксономическим группам; провести тестирование разработанных праймеров и оптимизировать условия ПИР с использованием препаратов ДНК чистых культур фото- и хемоавтотрофных микроорганизмов, а также подобрать наиболее эффективные праймерные системы для амплификации этих генов в природных образцах; определить первичную структуру генов РуБисКО в геномах представителей различных таксономических групп фото- и хемоавтотрофных микроорганизмов (в том числе, выделенных из солёных озёр) и провести филогенетический анализ полученных de novo последовательностей; исследовать разнообразие генов РуБисКО и АТФ-зависимой цитратлиазы в осадках солёных и содовых озёр с использованием наиболее универсальных праймерных систем.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Ковалева, Ольга Леонидовна

выводы

1. Усовершенствованы известные праймерные системы, и разработаны новые праймеры для амплификации генов РуБисКО форм I и II у бактерий, принадлежащих к разным таксономическим- группам, а также, определены оптимальные условия ПЦР-амплификации соответствующих генов;- '

2. Определены и включены в международную базу данных, GenBank последовательности 101 фрагмента генов, кодирующих РуБисКО формы I и формы II, а также АТФ-цитратлиазы, принадлежащих различным хемо- и фотоавтотрофным бактериям;

3. Проведён филогенетический анализ полученных de novo последовательностей, который позволил: а) выявить особенности эволюции фотоавтотрофных бактерий* и предложить схему эволюции генов, кодирующих РуБисКО формы I у фотоавтотрофных бактерий?порядка Chromatiales; б) выявить внутривидовую- вариабельность; структуры^ и набора генов РуБисКО у галофильных сероокисляющих бактерий; '

4. Показана эффективность использования белок-кодирующих генов-для анализа минорных членов микробных сообществ, присутствие которых не всегда обнаруживается анализом генов- 16S рРНК (в частности, представителей новых родов хемолитоавтотрофных галофильных СОБ родов Thiohalorhabdus,Thiohalospira, Thiohalomonas, Thiohalophilus)]

5. Анализ генов РуБисКО в ,. исследованных • природных гало(алкало)фильных сообществах выявил доминирование хемотрофных- (pp. Thioalkalivibrio, Thiohalorabdus, Halothiobacillus) и/ фототрофных (p. Halorhodospira) гамма-протеобактерий; показаны изменения! в распределении филотипов фото- и хемотрофов; в направлении от поверхностных слоев осадков,- где: преимущественно обнаруживаются;' фототрофы^ до глубинных слоев,.в которых преобладают хемоавтотрофы.

6. Анализ генов РуБисКО' и'. АТФ-зависимой цитратлиазы" выявил присутствие в солёных озёрах неизвестных представителей - 126 хемоавтотрофных бактерий, в том числе, впервые обнаруженных в некоторых содовых озерах филотипов е-протеобактерий, что свидетельствует о необходимости дальнейшего изучения биоразнообразия гало(алкало)фильных экосистем традиционными микробиологическими методами.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ковалева, Ольга Леонидовна, Москва

1. Болтянская Ю.В., Деткова E.H., Шумский А.Н. и др. (2005). Осмоадаптация у предстваителей галоалкалофильных бактерий из содовых озёр // Микробиология, 1А\ 738-744.

2. Брянцева И.А., Т.П. Турова, О.Л.Ковалева, H.A. Кострикина, В.М. Горленко (2010). Новая крупная алкалофильная пурпурная серобактерия Ectothiorhodospira magna sp. nov. Микробиология (в печати).

3. Брянцева И.А. (2000). Аноксигенные фототрофные бактерии содовых озер Юго-восточного Забайкалья // Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук. Москва.

4. Власов H.A. и Филипова Г.Р. (1973). Физико-химическая характеристика минеральных озёр юго-восточного Забайкалья // Геохимия и гидрохимия природных вод восточной Сибири. Иркутск. 1973, С. 3-57.

5. Герасименко Л.М. (2007). Алкалофильные оксигенные фотосинтезирующие организмы // Труды Института микробиологии им. С.Н.Виноградского. Вып. XIV. Алкалофильные микробные сообщества. М: Наука, с. 88-158.

6. Горленко В.М. (2007). Аноксигенные фототрофные бактерии содовых озер // Труды Института микробиологии им. С.Н.Виноградского. Вып. XIV. Алкалофильные микробные сообщества. М: Наука, с. 225-257.

7. Горленко В.М., Намсараев Б.Б., Кулырова A.B. и др. (1999). Активность сульфидредуцирующих бактерий в донных осадках содовых озёр юго-восточного Забайкалья // Микробиология, 68: 664-670.

8. Ю.Деткова E.H., Болтянская Ю.В. (2006). Связь между стратегией осмоадаптации, аминокислотным составом общего клеточного белка и свойствами некоторых ферментов галоалкалофильных бактерий // Микробилогия, 75: 312-319.

9. П.Дубинин A.B., Герасименко JI.M., Заварзин Г.А. (1995). Экофизиология и видовое многообразие цианобактерий озера Магади // Микробиология. 64: 845-849.

10. Жилина Т.Н., Гарнова Е.С., Турова Т.П., и др. (2001). Amphibacillus fermentum sp. nov. и Amphibacillus tropicus sp. nov.6 новые алкалофильные и факультативно анаэробные сахаролитические бациллы из озера Магади // Микробиология, 70: 825-837.

11. Заварзин Г.А. (1993). Эпиконтинентальные содовые водоемы как предполагаемые реликтовые биотопы формирования наземной биоты // Микробиология, 62: 789-800.

12. Заварзин Г.А. (2007). Образование содовых условий как глобальный процесс. Труды Института микробиологии им. С.Н.Виноградского. Вып. XIV. Алкалофильные микробные сообщества. М: Наука, с. 8-57.

13. Заварзин Г.А. (2007а). Алкалофильные микробные сообщества // Труды Института микробиологии им. С.Н.Виноградского. Вып. XIV. Алкалофильные микробные сообщества. М: Наука, с. 58-87.

14. Заварзин Г.А., Жилина Т.Н., Кевбрин В.В. (1999). Алкалофильные микробные сообщества и их функциональное разнообразие // Микробиология, 68 (3): 503-521.

15. Исаченко Б.JI. (1951). Хлористые, сульфатные и содовые озера Кулундийской степи и биогенные процессы в них // Б.Л.Исаченко Избранные труды. АН СССР М-Л, С. 143-162.

16. Кевбрин В .В., Лысенко A.M., Жилина Т.Н. (1997). Физиология алкалофильного метаногена Z-7936, нового штамма Methanosalsus zhilinaeae, выделенного из озера Магади //Микробиология, 66: 315-320.

17. Кеппен О.И., Берг И.А., Лебедева A.C., Таисова Т.В., Колганова Т.В., Слободова Н.В., Булыгина Е.С., Турова Т.П. и Ивановский Р.Н. (20086). Новая зелёная бактерия Chlorobaculum macestae sp. nov. Микробиология, 77(1): 79-88.

18. Кеппен О.И., Турова Т.П., Ивановский Р.Н., Лебедева A.C., Баслеров Р.В. и Берг И.А. (2008а). Филогенетическое положение трёх штаммов зелёных серных бактерий. Микробиология 77(2): 282-5.

19. Компанцева Е.И., А. В. Комова, Д. Ю. Сорокин (2010). Сообщества аноксифотобактерий в солёных содовых озёрах Кулундинской степи (Алтайский край) // Микробиология, 79(1): 96-102.

20. Компанцева Е.И., Брянцева И.А., Комова A.B., Намсараев Б.Б.(2007). Структура фототрофных сообществ в содовых озерах Юго-Восточного Забайкалья // Микробиология. 76(2): 243-252.

21. Компанцева Е.И., Сорокин Д.Ю., Горленко В.М., Намсараев Б.Б. (2005). Фототрофное сообщество солёного щелочного озера Хилганта (Юго-Восточное Забайкалье) // Микробиология, 74(3): 410-419.

22. Кондратьева, Е. Н., 1996. Автотрофные прокариоты // М.: Изд-во МГУ.

23. Сорокин Д.Ю. (1998). О возможности нитрификации в экстремально щелочных природных местообитаниях Н Микробиология, 67: 404-408.

24. Сорокин Д.Ю. (2007). Натронофильные аэробные хемолитотрофные бактерии содовых озёр // Труды Института микробиологии им. С.Н.Виноградского. Вып. XIV. Алкалофилъные микробные сообщества. М: Наука, с. 258-275.

25. Стрижова Т.А., Орлик JI.A. (1991). Гидрохимический режим озера. Содовые озера Забайкалья: экология и продуктивность. Новосибирск. Наука, с. 19-80.

26. Alfreider А., С. Vogt, D. Hoffmann, W. Babel. (2003). Diversity of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large-subunit genes from groundwater and aquifer microorganisms // Microb Ecol 45: 317-328.

27. Aoshima M., Ishii M., Igarashi Y. (2004a). A novel enzyme, citryl-CoA synthetase, catalysing the first step of the citrate cleavage reaction in Hydrogenobacter thermophilus TK-6 I I Mol. Microbiol. 52: 751-761.

28. Aoshima M., Ishii M., Igarashi Y. (2004b). A novel enzyme, citryl-CoA lyase, catalysing the second step of the citrate cleavage reaction in Hydrogenobacter thermophilus TK-6 // Mol. Microbiol. 52: 763-770.

29. Ashida H., Saito Y., Kojima C., Kobayashi K., Ogasawara N., Yokota A. (2003). A functional link between RuBisCO-like protein of Bacillus and photosynthetic RuBisCO // Science. (302): 286-290.

30. Baumgarte S (2003) Microbial diversity of soda lake habitats. PhD-thesis Gemeinsamen Naturwissenschaftlichen Fakultät, Technischen Universität Carolo-Wilhelmina zu Braunschweig, Deutschland.

31. Beh, M., G. Strauss, R. Huber, K.-O. Stetter, and G. Fuchs. (1993). Enzymes of the reductive citric acid cycle in, the autotrophic eubacterium Aquifex pyrophilus and in the archaebacterium Thermoproteus neutrophilus II Arch. Microbiol. 160:306-311.

32. Berg Ivan A., Daniel Kockelkora, Wolfgang Buckel, Georg Fuchs (2009). A 3-Hydroxypropionate/4-Hydroxybutyrate autotrophic carbon dioxide assimilation pathway in archaea // Science, 318,1782.

33. Birnboim H.C., Doly J. (1979). A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7(6): 1513-1523.

34. Bowes G., Ogren W. L., Hagerman R. H. (1971). Phosphoglycolate production catalyzed by ribulose diphosphate carboxylase // Biochem. Biophys. Res. Commun. 45(3) 716-722.

35. Bryantseva I., Gorlenko V.M., Kompantseva E.I., Imhoff J.F., Süling J. and Mityushina L. (1999). Thiorhodospira sibirica gen. nov., sp. nov., a new alkaliphilic purple sulfur bacterium from a Siberian soda lake // Int. J. Syst. Bacteriol. 49: 697-703.

36. Bryantseva I.A., Gorlenko V.M., Kompantseva E.I. and Imhoff J.F (2000). Thioalkalicoccus limnaeus gen. nov., sp. nov., a new alkaliphilic purple sulfur bacterium with bacteriochlorophyll b H Int. J. Syst. Bacteriol., 50: 2157-2163.

37. Campbell B. J., Stein J. L., Cary S. C. (2003). Evidence of chemolithoautotrophy in the bacterial community associated with Alvinellapompejana, a hydrothermal vent polychaete // Appl. Environ. Microbiol. 69(9): 5070-5078.

38. Campbell Barbara J. and S. Craig Cary (2004). Abundance of reverse tricarboxylic acid cycle genes in free-living microorganisms at deep-sea hydrothermal vents II Appl. Env. Microbiol 70(10): 6282-6289.

39. Cannon G.C., Baker S.H., Soyer F., Johnson D.R., Bradburne C.E., Mehlman J.L., Davies P.S., Jiang Q.L., Heinhorst S. and Shively J.M. (2003). Organization of carboxysome genes in the thiobacilli // Curr Microbiol 46 (2): 115-119.

40. Cleland W., Andrews T. John, Gutteridge S., Hartman Fred C. and Corimer G. (1998). Mechanism of RuBisCO: the carbamateas general base // Chem Rev 98: 549-562.

41. Delwiche' C.F., PalmerJ.D. (1996). Rampant horizontal transfer and duplication of Rubisco genes in Eubacteria and plastids // Mol. Biol. Evol. 13: 883-892.

42. Distel D. L., Lane D. J., Olsen G. J., Giovannoni S. J., Pace B., Pace N. R., Stahl D. A., Felbeclc H. (1988). Sulfur-oxidizing bacterial endosymbionts: analysis of phylogeny and specificity by 16S rRNA sequences II J. Bacteriol. 170(6): 2506-2510.

43. Distel D.L., Lee H.K., Cavanaugh C.M. (1995). Intracellular coexistence of methano- and thioautotrophic bacteria in a hydrothermal vent mussel // Proc.

44. Natl Acad. ScL 92(21): 9598-9602.

45. Elsaied HE, Kimura H & Naganuma T (2007). Composition of archaeal, bacterial, and eukaryal RuBisCO genotypes in three Western Pacific arc hydrothermal vent systems. Extremophiles 11: 191 202.

46. English, R. S., Williams, C. A., Lorbach, S. C., Shively, J. M. (1992). Two forms of ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase from Thiobacillus denitrificans IIFEMSMicrobiol.Lett. 94 (1,2): 111-119.

47. Eugster HP (1980). Lake Magadi, Kenya, and its precursors. Published by Elsevier. Ed. A. Nissenbaum. Amsterdam, pp. 95-232.

48. Evans M. C., Buchanan B. B., Arnon D. I. (1966). A new ferredoxin-dependent carbon reduction cycle in a photosynthetic bacterium // Proc. Natl. Acad. Sci. 55(4): 928-934.

49. Ezaki, S., Maeda, N., Kishimoto, T., Atomi, H., Imanaka, T. (1999). Presence of structurally novel type ribulose-bisphosphate carboxylase/oxygenase in the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus kodakaraensis KOD1 // J.Biol.Chem, 274 (8): 5078-5082.

50. Foti M., Sorokin D.Y., Lomans B., Mussman M., Zacharova E.E., Pimenov N.V., Kuenen J.G., Muyzer G. (2007). Diversity, activity and abundance of sulfate reducing bacteria in saline and hypersaline soda lakes // Appl. Environ. Microbiol. 73: 2093-2100.

51. Fuchs G, Stupperich E, Eden G (1980). Autotrophic C02 fixation in Chlorobium limicola. Evidence for the operation of a reductive tricarboxylic acid cycle in growing cells // Arch Microbiol 128: 64-71.

52. Gibson J. L., Falcone D. L., Tabita F. R. (1991). Nucleotide sequence, transcriptional analysis, and expression of genes encoded within form I C02 fixation operon of Rhodobacter sphaeroides // J. Biol. Chem. 266(22): 14646-14653.

53. Gibson J.L., Tabita F.R. (1977a). Different molecular forms of D-ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase from Rhodopsendomonas sphaeroides // J. Biol Chem. 252(3) 943-949.

54. Gibson J.L., Tabita F.R. (1977b). Isolation and preliminary characterization of two forms of ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase from Rhodopseudomonas capsulate // J. Bacteriol 132(3): 818-823.

55. Giovannoni S.J., Britschgi T.B., Moyer C.L., Faild K.J. (1990). Genetic diversity in Sargasso Sea bakterioplankton // Nature, 345: 60-63.

56. Giri BJ, Bano N. and Hollibaugh JT. (2004) Distribution of RuBisCO genotypes along a redox gradient in Mono Lake, California // Appl Environ Microbiol 70(6):3443-8.

57. Grant S, Grant W.D., Jones B.E., Kato C, and Li L. (1999). Novel archeal phylotypes from an East African alkaline saltern // Extremophiles, 3: 139145.

58. Grant S, Sorokin DY, Grant WD et al. (2004). A phylogenetic analysis of Wadi el Natran soda lake cellulose enrichment cultures and identification of cellulase genes from these cultures // Extremophiles 8: 421-429.

59. Guindon S. & Gascuel O. (2003). A simple, fast and accurate algorithm to estimate large phylogenies by maximum likelihood // Systematic Biology 52(5): 696-704.

60. Hanson T. E., Tabita F. R. (2001). A ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (RubisCO)-like protein from Chlorobium tepidum that is involved with sulfur metabolism and response to oxidative stress // Proc. Natl. Acad. Sci. 98(8): 4397-4402.

61. Hoehler, T. M., Bebout, B. M. and Des Marais, D. J. (2001). The role of microbial mats in the production of reduced gases on the early Earth // Nature 412, 324-327.

62. Hollibaugh J.T., Wong P.S., Bano N., Pak S.K., Prager E.M., Orrego C. (2001). Stratification of microbial assemblages in Mono Lake, California, and response to a mixing event //Hydrobiologia (466): 45-60.

63. Holo, H., and Sirevag, R. (1986) Autotrophic growth and C02 fixation of Chloroflexus aurantiacus II Arch Microbiol 145: 173-180

64. Horikoshi K. (1996). Alkaliphiles from industrial point of view // FEMS Microbiol Rev. 18: 259-270.

65. Horikoshi K. (1999). Alkaliphiles: some applications of their products for biotechnology//. Microbiol Mol Biol Rev. 63(4):73 5-50

66. Horikoshi, K. (2004). Alkaliphiles // Proc. Japan Acad., Ser. B., 80: 166-178.

67. Hiigler M, Huber H, Stetter KO, Fuchs G. (2003). Autotrophic C02 fixation pathways in archaea (Crenarchaeota) // Arch Microbiol. 179(3): 160-73.

68. Hugler M, Wirsen CO, Fuchs G, Taylor CD, Sievert SM. (2005). Evidence for autotrophic C02 fixation via the reductive tricarboxylic acid cycle by members of the epsilon subdivision of proteobacteria // J Bacteriol. 187(9): 3020-7.

69. Imhoff J.F. and Truper H.G. (1981). Ectothiorhodospira abdelmalekii sp. nov., a new halophilic and alkaliphilic phototrophic bacterium // Zentralblatt fur Bakteriologie, Mikrobiol. Und Hygiene I. Abteilung Originate. 2: 228234.

70. Imhoff J.F., Hashwa F., Truper H.G. (1978). Isolation of extremely halophilic phototrophic bacteria from the alkaline Wadi Natrun, Egypt // Archiv fur Hydrobiologie, 84: 381-388.

71. Imhoff J.F., Sahl H.G., Soliman G.S.H., Truper H.G. (1979). The Wadi Natrun: chemical composition and microbial mass developments in alkaline brines of eutrophic desert lakes // Geomicrobiol. J., I: 219-234.

72. Ivanovsky, R.N., N.V. Sintsov, and E.N. Kondratieva. (1980). ATP-linked citrate lyase activity in the green sulfur bacterium Chlorobium limicola forma thiosulfatophilum II Arch. Microbiol. 128:239-241.

73. Jellison, R. and J. M. Melack. (1993). Meromixis in hypersaline Mono Lake, California. 1. Stratification and vertical mixing during the onset, persistence, and breakdown of meromixis // Limnol. Oceanogr. 38:1008-1019.

74. Johal S. and R. Chollet (1980). Ribulose-l,5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase: enzymic, physicochemical and nutritional properties // What's New in Plant Physiol. 11: 45-48.

75. Jones B.E., Grant W.D., Duckworth A.W. (1998). Microbial diversity of soda lakes // Extremophiles, 2: 191-200.

76. Jones BE and Deocampo DM (2003). Geochemistry of saline lakes // In: Treatise on Geochemistry, Vol 5 pp 393-424 Published by Elsevier.

77. Jordan D. B., Ogren W. L. (1984). The C02/02 specificity of ribulose 1,5. bisphosphate carboxylase/oxygenase. Dependence on ribulosebisphosphateconcentration, pH and temperature // Planta 161: 308-313.

78. Kanao, T., Fukui, T., Atomi, H., and Imanaka, T. (2001) ATP-citrate lyase from the green sulfur bacterium Chlorobium limicola is a heteromeric enzyme composed of two distinct gene products // Eur JBiochem 268: 16701678.

79. Kellogg E. A. and Juliano N. D. (1997). The structure and function of RuBisCO and their implications for systematic studies // Am.J.Bot, 84 (3): 413-428.

80. Kelly D. P. and A. P. Wood (2000). Reclassification of some species of Thiobacillus to the newly designated genera Acidithiobacillus gen. nov., Halothiobacillus gen. nov. and Thermithiobacillus gen. nov. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50:511-516.

81. Kempe S., Degens E.T. (1985). An early soda ocean? // Chem. Geology, 53: 95-108.

82. Kim W. and F. Robert Tabita (2006). Both subunits of ATP-citrate lyase from Chlorobium tepidum. Contribute to catalytic activity // J. Bacter. pp. 6544-6552.

83. Krulwich TA, Guffanti AA. (1989). Alkalophilic bacteria // Annu Rev Microbiol. 43: 435-63.

84. Kung S. D., R. ChoUet and T. V. Marsho (1980). Crystallization and assay procedures of tobacco ribulose-1,5- bisphosphate carboxylase-oxygenase // Methods Enzymol. 69: 326-336.

85. Lane D. J. (1991). 16S/23S sequencing. In: Nucleic acid techniques in bacterial systematic // Stackebrandt E. a. Goodfellow M. (Eds.). Chichester: John Wiley & Sons, Ltd., pp. 115-175.

86. Martin W. and Schnarrenberger C. (1997). The- evolution of the Calvin cycle from prokaryotic to eukaryotic chromosomes: a case study of functional redundancy in ancient pathways through endosymbiosis // Curr Genet ?>2\ 1-18.

87. Melack JM (1983) Large, deep salt lakes: a comparative limnological analysis // Hydrobiologia 105:223-230

88. Mesbah N., Abou-El-Ela S. and Wiegel J. (2007). Novel and unexpected prokaryotic diversity in water and sediments of the alkaline, hypersaline lakes of the Wadi an Natrun // Micr. Ecol. 54:598-617.

89. Milford A.D., Achenbach L.A., Jung D.O., Madigan M.T. (2000). Rhodobaca bogoriensis gen. nov. and sp. nov., an alkaliphilic purple nonsulfur bacterium from African Rift Valley soda lakes,// Arch Microbiol. 174: 18-27.

90. Naganuma T., Kato C., Hirayama H., Moriyama N., Hashimoto J., Horikoshi K. (1997). Intracellular occurrence of e-proteobacterial 16S rDNA sequences in the vestimentiferan trophosome // Journal of Oceanography 53: 193-197.

91. Nanba K., King G.M., Dunfield K. (2004). Analysis of facultative lithotroph distribution and' diversity on volcanic deposits by use of the large subunit of ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase // Appl. Environ. Microbiol. 70(4): 2245-2253.

92. Oren A. (2002) Halophilic microorganisms and their environments // Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp 575.

93. Portis AR Jr. (2003). Rubisco activase Rubisco's catalytic chaperone // Photosynth Res. 75( 1): 11 -27.

94. Rokka A, Zhang L, Aro EM. (2001). Rubisco activase: an enzyme with a temperature-dependent dual function? // Plant J. 25(4):463-71.

95. Saitou N., Nei M. (1987). The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees // Mol. Biol. Evol. 4(4): 406425.

96. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual // 2 ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

97. Sanger F., Nicklen S., Coulson A. R. (1977).DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. 74(12): 5463-5467.

98. Sato T, Atomi H, Imanaka T. (2007). Archaeal type III RuBisCOs function in a pathway for AMP metabolism // Science 315 (5814): 10031006.

99. Schagerl M. and Oduor S.O. (2008). Phytoplankton community relationship to environmental variables in three Kenyan Rift Valley saline-alkaline lakes // Marine and Freshwater Research, 59: 125—136.

100. Schauder R, Widdel F, Fuchs G. (1987). Carbon assimilation pathways in sulfate-reducing bacteria II. Enzymes of a reductive citric acid cycle in the autotrophic Desulfobacter hydrogenophihis II Arch Microbiol 148:218-225

101. Schdfer, S., C. Barkowski, and G. Fuchs. (1986). Carbon assimilation by the autotrophic thermophilic archaebacterium Thermoproteus neutrophils II Arch. Microbiol. 146: 301-308.

102. Selesi D., Schmid M., Hartmann A. (2005). Diversity of green-like and red-like ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large-subunitgenes (cbbV) in differently managed agricultural soils // Appl. Environ. Microbiol. 71(1): 175-184.

103. Shortland AJ (2004). Evaporites of the Wadi natrun: seasonal and annual variation and its implication for ancient exploitation // Archaeometry 46:497-516

104. Sorokin D.Y., Gorlenko V.M., Namsaraev B.B., Namsaraev Z.B., Lysenko A.M., Eshinimaev B.T., Khmelenina V.N., Trotsenko Y.A., Kuenen J.G. (2004). Prokaryotic of the north-eastern Mongolian soda lakes // Hydrobiologia,. 522: 235-248.

105. Sorokin D.Y., Igor I. Rusanov, Nikolai V. Pimenov, Tatjana P. Tourova, Ben Abbas and Gerard Muyzer (2010a). Sulfidogenesis under extremely haloalkaline conditions in soda lakes ofKulunda Steppe (Altai, Russia). FEMSMicrobiol Ecol, 73(2):278-90.

106. Sorokin D.Y., Kuenen J.G. (2000a). A novel facultatively autotrophic hydrogen-oxidizing bacterium from alkaline environment. Extremophiles 4: 237-245.

107. Sorokin D.Y., Kuenen J.G. (2005a). Chemolithotrophic haloalkaliphiles from soda lakes. FEMSMicrobiol. Ecol. 52(3): 287-295.

108. Sorokin D.Y., Robertson L.A., Kuenen J.G. (2000b). Isolation and characterization of alkaliphilic, chemolithoautotrophic, sulphur-oxidizing bacteria. Ant. van Leeuwenhoek 77(3): 251-262.

109. Sorokin D.Y., Tourova T.P., Sjollema K.A., Kuenen J.G. (2003). Thioalkalivibrio nitratireducens sp. nov., a nitrate-reducing member of an autotrophic denitrifying consortium from a soda lake // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53(6): 1779-1783.

110. Sorokin Dimitry Yu., Tatjana P. Tourova, Anatoly M. Lysenko and Gerard Muyzer (2006a). Diversity of culturable halophilic sulfur-oxidizing bacteria in hypersaline habitats. Microbiology 152: 3013-3023.

111. Sorokin DY, Kovaleva OL, Tourova TP, Kuenen JG & Muyzer G (2010b) Aerobic carboxydotrophy at extremely haloalkaline conditions in Alkalispirillum/ Alkalilimnicola strains isolated from soda lakes // Microbiology 156: 819-827.

112. Sorokin DY, Muyzer G, Brinkhoff T et al. (1998). Isolation and characterization of a novel facultatively alkaliphilic Citrobacter species -Nb. alkalicus II Arch Microbiol, 170: 345-352.

113. Sorokin DY, Tourova TP, Schmid M et al. (2001). Isolation and properties of obligately chemoautotrophic and extremely alkali-tolerant ammonia-oxidizing bacteria from Mongolian soda lake // Arch Microbiol 176: 170-177.

114. Sorokin, D.Y., Tourova, T.P., Bezsoudnova, E.Y., Pol, A. & Muyzer, G. (2007a). Denitrifcation in a binary culture and thiocyanate metabolism in

115. Thiohalophilus thiocyanoxidans gen. nov. sp. nov. — a moderately chemolithoautotrophic sulfur-oxidizing Gammaproteobacterium from hypersaline lakes II Arch Microbiol 187: 441—450.

116. Sorokin, D.Y., Zhilina, T.N., Lysenko, A.M., Tourova, T.P. and Spiridonova, E.M. (2006c). Metabolic versatility of haloalkaliphilic bacteria from soda lakes belonging to the Alkalispirillum-Alkalilimnicola group // Extremophiles 10: 213-220.

117. Stoner M. T., Shively J. M. (1993). Cloning and expression of the D-ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase form II gene from Thiobacillus intermedins in Escherichia coli /IFEMS Microbiol. Lett. 107(2-3): 287-292.

118. Tabita F.R. (1988). Molecular and cellular regulation of autotrophic carbon-dioxide regulation in microorganisms // Microbiol Rev 52: 155-189.

119. Tabita F.R. (1999). Microbial ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase: adifferent perspective // Photosyn. Res. 60: 1-28.

120. Tabita F.R., McFadden B.A. (1974). D-Ribulose 1,5-disphosphate carboxylase from Rhodospirilhan rubrum II J. Biol. Chem. 249(11): 34593464.

121. Thauer, R.K. (2007) A Fifth Pathway of Carbon Fixation. Science 318: 1732-1733.

122. Tolli J., King G. M. (2005). Diversity and structure of bacterial chemolithotrophic communities in pine forest and agroecosystem soils // Appl. Environ. Microbiol. 71(12): 8411-8418.

123. Van de Peer Y., De Wachter R. (1994). TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment // Comput. Applic. Biosci. 10(5): 569570.

124. Ward B.B., Martino D.P., Diaz M.C. and Joye S.B. (2000). Analysis of ammonia-oxidizing bacteria from hypersaline Mono Lake, California, on the basis of 16S rRNA // Appl Environ Microbiol 66(7): 2873-2881.

125. Ward D. M., Weller R., Bateson M. M. (1990). 16S rRNA sequences reveal numerous uncultured microorganisms in natural community. Nature. 345:63-65.

126. Watson G.M.F., Tabita F.R. (1997). Microbial ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase: a molecule for phylogenetic and enzymological investigation//FEMSMicrobiol. Lett. 146(1): 13-22.

127. Whitney S.M., Shaw D.C. and Yellowless D. (1995). Evidence that some dinoflagellates contain a ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxyganase related to that of the alpha-proteobacteria // Proc.R.Soc. London Ser. B 259: 271-275.

128. Wiegel J. (1998). Anaerobic alkalithermophiles, a novel group of extremophiles II Extremophiles 2(3): 257-67.

129. Wood AP, Kelly DP (1991). Isolation and characterisation of Thiobacillus halophilus sp. nov., a sulphur-oxidizing autotrophic eubacterium from a Western Australian hypersaline lake // Arch Microbiol 156:277-280.

130. Wood, H. G., Ljungdahl, L. G., (1991). Autotrophic character of the acetogenic bacteria // In: Variations in autotrophic life (Shively, J. M. and Barton, L. L. (Eds)), p. 201-250. Academic Press, London.

131. Yang X., Williams M.A.J. (2003). The ion chemistry of lakes and late Holocene desiccation in the Badain Jaran Desert, Inner Mongolia, China // Catena. 51: 45-60.

Информация о работе

Ковалева, Ольга Леонидовна
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.02.03

Диссертация

Исследование генов РуБисКО и АТФ-зависимой цитратлиазы у фото- и хемоавтотрофных бактерий, и анализ их разнообразия в осадках солёных и содовых озёр - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы