Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование электронных свойств и молекулярных взаимодействий кофакторов переноса электрона в реакционных центрах фотосинтезирующих бактерий

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование электронных свойств и молекулярных взаимодействий кофакторов переноса электрона в реакционных центрах фотосинтезирующих бактерий"

005059193

На правах рукописи

ЗАБЕЛИН Алексей Александрович

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭЛЕКТРОННЫХ СВОЙСТВ И МОЛЕКУЛЯРНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ КОФАКТОРОВ ПЕРЕНОСА ЭЛЕКТРОНА В РЕАКЦИОННЫХ ЦЕНТРАХ ФОТОСИНТЕЗИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

16 Ж

Пущино-2013

005059193

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте фундаментальных проблем биологии Российской академии наук (ИФПБ РАН)

Научные руководители: доктор биологических наук, академик РАН

Шувалов Владимир Анатольевич

кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник, Шкуропатов Анатолий Яковлевич

Официальные оппонеиты: Прохоренко Изабелла Рувимовна, доктор

биологических наук, ИФПБ РАН, главный научный сотрудник

Терпугов Евгений Львович, кандидат физико-математических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биофизики клетки Российской академии наук, ведущий научный сотрудник

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего профессионального образования Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского

Защита состоится «13» июня 2013 г. в 11-00 на заседании диссертационного совета Д 002.066.01 при ИФПБ РАН по адресу: 142290, г. Пущино, Московская обл., ул. Институтская, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИФПБ РАН. Автореферат разослан сиг\г\1Л% 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Г.Н. Назарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Актуальность темы исследования. Первичное преобразование световой энергии в энергию разделенных зарядов, запускающее всю последовательность реакций фотосинтеза - глобального биосферного фотопреобразующего процесса -протекает в специализированных мембранных пигмент-белковых комплексах, называемых реакционными центрами фотосинтеза (РЦ). Для наиболее изученных в настоящее время в структурном и функциональном отношении РЦ пурпурных бактерий последовательность реакций переноса электрона может быть выражена схемой

Р*-РЪА* ^Р+На -Р+ОА",

где Р - первичный донор электрона, димер молекул бактериохлорофилла (БХл) а (Р* - синглетно-возбужденное состояние Р), ВА - первичный акцептор электрона, мономерный БХл, На - промежуточный акцептор электрона (бактериофеофитин, БФео), (}А - первичный хинонный акцептор. Квантовый выход процесса разделения зарядов с образованием ион-радикальной пары Р С!а" практически равен 1 [Шувалов, 1990]. Высокая эффективность и направленность первичного разделения зарядов в РЦ в значительной степени определяются как свойствами самих кофакторов переноса электрона в нейтральном и ион-радикальном состояниях, так и их взаимодействиями между собой и с белковым окружением. Детальное исследование таких свойств и взаимодействий имеет принципиальное значение для понимания механизма фотосинтетического разделения зарядов в РЦ на молекулярном уровне и является актуальной задачей.

Перспективным подходом к изучению электронных свойств кофакторов и их межмолекулярных взаимодействий является исследование РЦ с модифицированным составом пигментов и/или с изменениями в аминокислотной последовательности субъединиц. Ценная информация о том, какие особенности структуры и свойств кофакторов были эволгоционно отобраны и закреплены в природных группах микроорганизмов в качестве консервативных элементов, а какие были модифицированы с сохранением функции РЦ, может быть получена на основе сравнительных исследовании РЦ дикого типа, принадлежащих к различным родам фотосинтезирующих бактерий. Большое внимание в этом отношении привлекают РЦ нитчатой аноксигенной фототрофной бактерии СЫогоАехия (С/.) аигапПасш, которые близки к РЦ пурпурных бактерий по глобальной организации кофакторов и первичной фотохимии, но значительно отличаются от них по составу белка и пигментов. В частности, РЦ С/. аигапИасш состоит из двух белковых субъединиц (Ь и М) и содержит 3 БХл и 3 БФео [Бскк е! а!., 1995], тогда как РЦ ЕЬойоЪа^ег (ЯЬ.) яркаегоШея включает три субъединицы (Ь, М и Н), несущие 4 БХл и 2 БФео [Шувалов, 1990]. Несколько функционально важных аминокислот, характерных для РЦ пурпурных бактерий, отсутствуют в аминокислотной последовательности РЦ С/. аигапНасш [ОусЫпшкоу е1 а1., 1988а,Ь; 8Ыога\уа й а1., 1989]. Исследования РЦ С/, аигапйасш, однако, осложнены отсутствием данных об их кристаллической структуре. Использование спектральных методов остается одним из основных подходов к выяснению структурной организации и свойств кофакторов переноса

электрона в РЦ Cf. aurantiacus.

Фотоиндуцированная дифференциальная инфракрасная спектроскопия с Фурье преобразованием (ИК-Фурье-спектроскопия) обладает чрезвычайно высокой чувствительностью к молекулярным взаимодействиям, позволяя выявлять изменения на уровне отдельных химических связей в хромофорах и белковых субъединицах РЦ в ответ на процессы переноса электрона и разделения зарядов [Lutz and Mäntele, 1991]. Это делает дифференциальную ИК-Фурье-спектроскопию одним из наиболее адекватных методов для изучения структурной и электронной организации кофакторов переноса электрона в различном окружении и в различных редокс-состояниях в РЦ Cf. aurantiacus.

Точечные мутации аминокислот в окружении кофакторов дают ценную информацию об особенностях пигмент-белковых взаимодействий и их роли в «подстройке» спектральных и окислительно-восстановительных свойств молекул-переносчиков электрона. Характерной особенностью РЦ и других фотосинтетических комплексов является тот факт, что молекулы (бактерио)хлоринов нековалентно связаны с белком. Однако недавно в нашей лаборатории были получены РЦ точечного мутанта Rb. sphaeroides I(L177)H, в которых одна из молекул БХл необычно прочно, возможно, ковалентно связана с L-субъединицей белка [Fufina et al., 2007]. В отсутствие кристаллографических данных большой интерес представляло исследовать особенности пигмент-белковых взаимодействий, вызванных замещением изолейцина L177 на гистидин, методами фотоиндуцированной дифференциальной ИК-Фурье-спектроскопии и кругового дихроизма (КД).

Цель н задачи исследования. Цель настоящей работы - исследование электронных свойств и молекулярных взаимодействий кофакторов переноса электрона в нативных и генетически модифицированных реакционных центрах фотосинтезирующих бактерий методом фотоиндуцированной дифференциальной ИК-Фурье-спектроскопии.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Методом фотоиндуцированной дифференциальной ИК-Фурье-спектроскопии исследовать молекулярные и электронные свойства катион-радикала первичного донора электрона Р+ в РЦ Cf. aurantiacus при комнатной и криогенной температурах.

2. Исследовать взаимодействия бактериофеофитинового акцептора электрона НА с белковым окружением в нейтральном и анион-радикальном состояниях в РЦ Cf. aurantiacus.

3. Изучить особенности структуры и взаимодействий первичного донора электрона Р в мутантных РЦ Rb. sphaeroides I(L177)H с прочно связанной молекулой бактериохлорофилла.

Научная новизна и практическая значимость работы. На основе сравнения фотоиндуцированных дифференциальных ИК-Фурье-спектров P+Qa~ /PQa РЦ Cf. aurantiacus и Rb. sphaeroides R-26 получены новые доказательства в пользу димерной структуры Р+ в РЦ Cf. aurantiacus и охарактеризованы его

электронные и молекулярные свойства. Впервые зарегистрирован фотоиндуцированный Нд7НА дифференциальный ИК-Фурье-спектр для РЦ С/, аигапйаст. Выявлены особенности НА"/НА ИК-Фурье-спектра РЦ С/. аигапИасш по сравнению с исследованными ранее спектрами нативных и мутантных РЦ пурпурных бактерий. На этой основе получены новые данные о взаимодействиях бактериофеофитинового акцептора электрона с белковым окружением в нейтральном состоянии НА и их изменениях в анион-радикальном состоянии НА". Получены новые данные о структуре первичного донора электрона в мутантных РЦ ЛЬ. ьркасгоккз 1(Ы77)Н с прочно связанной молекулой БХл. Показано, что в данных РЦ первичный донор электрона сохраняет димерную структуру. Предложен возможный механизм образования ковалентной связи между Ь-субъединицей белка РЦ и БХл, основанный на реакции переэтерификации серина Ь244 и 173-эфирной группы молекулы РА.

Результаты диссертационного исследования представляют также интерес с прикладной точки зрения и могут быть использованы при разработке высокоэффективных искусственных преобразователей солнечной энергии, включающих в своем составе фотосинтетические РЦ, или использующих принципы функционирования природных фотосинтетических систем.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были представлены на следующих российских и международных конференциях: "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2005); "Ломоносов-2009" (Москва, 2009); VI Съезд Российского фотобиологического общества (Шепси, 2011); XX Пущинские чтения по фотосинтезу (Пущино, 2012).

По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 3 в рецензируемых журналах.

Структура н объём диссертации. Диссертация изложена на 116 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, объекты и методы исследования, результаты и их обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Работа содержит 38 рисунков и 1 таблицу. Список литературы включает 249 источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Обзор литературы. В главе 1 изложены современные представления о фотосинтезе в пурпурных бактериях и нитчатой аноксигенной фототрофной бактерии С/. аигаШ'шсих. Особое внимание уделено описанию основ инфракрасной спектроскопии с Фурье преобразованием.

2. Объекты и методы исследования. В качестве объектов исследований в работе использовали изолированные РЦ ЯЬ. $р1гаего1с1ез 11-26, С/, аигапйасш, а также РЦ ЯЬ. sphaeroid.es дикого типа и мутантные РЦ ЯЬ. sphaeroid.es, в которых

изолейцин в положении 1Л77 замещен на гистидин (1(Ы77)Н) [Рийпа е1 а1., 2007]. Выделение реакционных центров осуществляли при помощи стандартных

методик путем обработки хроматофоров детергентом ЛДАО с последующей очисткой методом ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе.

Фотонакопление восстановленного бактериофеофитина (На) в РЦ в растворе измеряли при комнатной температуре в вакуумируемой кварцевой кювете в присутствии дитионита натрия (2 мМ) в качестве восстановителя и цитохрома с (0,2 мМ) или красителей нейтрального красного (0,1 мМ) и индиготетрасульфоната калия (ОД мМ) в роли медиаторов переноса электрона. Разностный спектр («свет-минус-темнота») получали вычитанием спектра поглощения, измеренного в темноте, из спектра, измеренного во время освещения образца в течение 2 мин постоянным светом через систему светофильтров КС-19 и ФС-7 (1100 нм > X > 720 нм; -120 мВт/см2).

Приготовление образцов для ИК-Фурье-спектроскопии

Поскольку коэффициенты экстинкции ИК полос кофакторов РЦ относительно невелики (на 1-2 порядка меньше коэффициентов экстинкции полос в электронных спектрах), а присутствие воды приводит к сильному фоновому поглощению (оптическая плотность 1 уже при толщине слоя 10 мкм), для ИК-измерений использовались образцы в виде пленок микронных толщин, содержащих высококонцентрированные РЦ с минимально возможным содержанием воды. С этой целью несколько микролитров концентрированной суспензии РЦ ЯЬ. ¿ркаегоМез или С/. аигаШгасш в буферном растворе наносили на подложку из СаР2 с тонким слоем вакуумной смазки по ее краю, частично высушивали РЦ в токе газообразного аргона и накрывали второй подложкой из СаР2. При сжатии подложек относительно друг друга в держателе криостата получали вакуум-плотную оптическую ячейку, содержащую частично дегидратированные слои РЦ. Образцы для измерения Р+<3"/Р(2 ИК-спектров не содержали экзогенных добавок. При измерении ИК-спектров НдТНа к РЦ добавляли экзогенный донор электрона (дитионита натрия) и медиаторы переноса электрона (индиготетрасульфонат калия и нейтральный красный).

Измерение ИК-Фурье-спектров

Измерения инфракрасных спектров поглощения РЦ в области 4000-1000 см"1 проводили на вакуумируемом ИК-Фурье-спектрометре Вгакег ГРЯббу/З. Для освещения образцов актиничным светом в кюветное отделение был вмонтирован вакуум-плотным образом гибкий световод. Такая модификация позволила измерять фотоиндуцированные ИК-спектры без нарушения стандартных вакуумных условий спектрометра. В качестве источника актиничного света использовался осветитель ОВС-1, соединенный со световодом. Система светофильтров ФС-7 и КС-14 обеспечивала возбуждение РЦ в области <Зу-полос поглощения бактериохлорофиллов и бактериофеофитинов (1100 нм > X > 720 нм; ~2 мВт/см2). Имеется также возможность освещения образцов импульсами света в микросекундном временном интервале. Для низкотемпературных измерений использовали оптический азотный криостат с температурным контроллером Эресас (Великобритания).

Типичные условия измерения ИК-Фурье-спектров: 1) диапазон 4000 -

1000 см"1; 2) светоделитель КВг; 3) детектор DTGS; 4) разрешение 4 см"1; 5) вакуум 3 мбара; 6) для предотвращения актиничного эффекта света He-Ne-лазера перед образцом помещалась пластинка из германия. Фотоиндуцированные дифференциальные («свет-минус-темнота») ИК-Фурье-спектры представляли собой разницу между ИК-спектрами, записанными во время освещения образца постоянным актиничным светом и до освещения.

Измерение спектров кругового дихроизма (КД)

Спектры КД измеряли на установке с фотоупругим модулятором (50 кГц), собранной в лаборатории и близкой описанной ранее в работе [Breeze and Ке, 1972]. Спектр КД, представляющий собой разность поглощения лево- и правоциркулярно поляризованного света AL-AR, регистрировали на самописце.

Измерение электронных спектров поглощения

Спектры поглощения образцов в ультрафиолетовой, видимой и ближней ИК-области (250-1300 нм) измеряли на спектрофотометрах Shimadzu UV 1601 PC, Shimadzu UV 3101 PC и Agilent 8453. Для измерений спектров поглощения при криогенных температурах (95 К) использовали тот же оптический криостат с контроллером температуры (Specac), который применялся для ИК-Фурье-измерений.

3. Результаты и их обсуждение

3.1. ИК-Фурье-спектроскопия фотоокнсления первичного донора электрона в РЦ Cf. aurantiacus

Ключевым элементом, вовлеченным в процесс разделения зарядов, является первичный донор электрона Р, синглетно-возбужденное состояние (Р ) которого передает электрон на первичный акцептор в течение нескольких пикосекунд, запуская все последующие реакции фотосинтеза. При этом Р трансформируется в катион-радикальную форму (Р4), которая входит далее в состав всех последовательно образующихся состояний с разделенными зарядами с конечной локализацией электрона на молекулах хинонных акцепторов Qa и Qb. Хотя данные оптической спектроскопии и ЭПР позволяли предполагать димерную структуру первичного донора электрона в РЦ Cf. aurantiacus [Bruce et al., 1982; Fieck et al., 1995; Ivancich et al., 1996], исследования электронной структуры P+ и молекулярной организации Р+ и Р в этих РЦ остаются важной задачей. Для этой цели мы использовали метод фотоиндуцированной ИК-Фурье-спектроскопии, который наряду с возможностью исследования колебательных свойств и взаимодействий кофакторов позволяет также регистрировать электронные переходы очень малой энергии в инфракрасной области спектра, характерные для димеров пигментов [Breton et al., 1992].

Контроль состояния РЦ в частично дегидратированных пленках

Для того чтобы оценить состояние РЦ в условиях уменьшенного содержания воды, которое требуется для ИК-экспериментов, были проведены измерения

спектров поглощения и спектров фотоиндуцированных изменений поглощения (700-1000 нм) в РЦ Cf. aurantiacus и Rb. sphaeroides R-26 в частично дегидратированных пленках при комнатной температуре и при 95 К (рис. 1).

Рис. 1. Спектры поглощения (Л) и фотоиндуцированные дифференциальные спектры P+Qa7PQa (Б) РЦ Rb. sphaeroides R-26 (/) и Cf. aurantiacus (2) в частично дегидратированных rweiucax при 95 К. Спектры поглощения нормированы по полосе при 885 нм. Дифференциальные спектры нормированы по отрицательной полосе при 885 нм. Вставка показывает кинетику фотоиндуцированных изменеш1Й поглощения при 884 нм в пленке РЦ Cf. aurantiacus. Стрелки J и J отмечают, соответственно, включение и выключение

700 750 800 850 воо eso юоо акгиничного освещения света.

Длина волны, нм

Спектры обоих типов РЦ хорошо соответствуют аналогичным спектрам, описанным ранее для нормальных условий гидратации. Это показывает, что (1) использованная процедура получения тонкослойных пленок для ИК-Фурье-измерений не нарушала структурную целостность РЦ; (2) препараты сохраняли функциональную активность в реакциях разделения зарядов с образованием конечного состояния P+Q".

Димерная структура Р+ в РЦ Cf. aurantiacus

На рис. 2А показаны низкотемпературные фотоиндуцированные дифференциальные ИК-Фурье-спектры P+Qa7PQa РЦ Rb. sphaeroides R-26 и Cf. aurantiacus в частично дегидратированных пленках при 95 К.

Рис. 2. А - Низкотемпературные (95 К) фотоиндуцированные (свет-минус-темнота) дифференциальные ИК-Фурье-спектры Р+(2а~/Р<Зл РЦ ЛА. ¡ркаегоккх 11-26 (I) и Cf. аигапНасш (2) в частично дегидратированных пленках в области 4000-1200 см"'. 10000 интерферограмм усреднены для каждого РЦ с использованием трех отдельных образцов. Б - В увеличенном масштабе показана область 1800-1200 см"1 спектров, представленных на панели А.

Одна из наиболее выраженных общих особенностей спектров — присутствие широкой полосы поглощения при -2650 см"1 с плечом при -2200 см"1. Полоса при -2650 см'1 принадлежит низкоэнергетическому электронному переходу, связанному с переносом положительного заряда ("дырки") с одной половины окисленного димера Р+ на другую [Breton et al., 1992]. Плечо при -2200 см'1 было приписано переходу со второй высшей заполненной молекулярной орбитали (ВЗМО-1) на ВЗМО в молекуле РА+, несущей положительный заряд в катион-радикальном состоянии первичного донора электрона [Breton et al., 1992]. Оба эти перехода отсутствуют в ИК-спектре мономерпого БХл+ и являются уникальными характеристиками димертюй структуры окисленного первичного донора электрона. Подобно интенсивным полосам, наблюдаемым в ИК-Фурье-спектре РЦ Rb. sphaeroides R-26 при 1548, 1478, 1296-1284 см"1 (рис. 2Б, кривая 1), инфракрасные полосы в спектре РЦ Cf. aurantiacus при 1567, 1481 и 1294-1285 см (рис. 2Б, кривая 2) могут быть отнесены фазово-фононным колебательным модам окисленного первичного донора электрона. Колебательные моды такого типа формально запрещены по симметрии в мономерном БХл, однако, они усиливаются благодаря сопряжению с электронным переходом переноса дырки, также являясь индикаторами димерной структуры Р+ [Reimers and Hush, 2003].

Таким образом, присутствие в фотоиндуцированном ИК-Фурье-спектре РЦ Cf. aurantiacus специфических низкоэнергетических электронных переходов и маркерных колебательных полос (рис. 2), позволило заключить, что катион-радикал Р+ в этих РЦ имеет димерную структуру с положительным зарядом, распределенным между двумя сопряженными молекулами бактериохлорофилла а (РдиРв).

Вывод о димерной структуре Р1" п РЦ Cf. aurantiacus согласуется с наблюдением в спектре Р+/Р электронной полосы поглощения окисленного первичного донора электрона при 1243 нм (рис. 3, кривая 2; [Ivancich et al., 1996]), отнесенной триплет-сопряженному переходу, локализованному на молекуле Рв в

Рис. 3. Дифференциальные (окисленные-минус-нейтральные РЦ) Р+/Р спектры РЦ Rb. sphaeroides R-26 (1) и Cf. aurantiacus (2) в области 650-1350 нм, полученные при химическом окислении первичного донора электрона феррицианидом калия (1 мМ) в суспензии при комнатной температуре. На вставке показана область 1100-1350 нм в увеличенном масштабе.

Длина волны, нм

Этот переход запрещен по спину, но усиливается в присутствии Рд+, и интенсивность полосы в этой области спектра сильно зависит от величины электронного сопряжения между двумя половинами димера. Мы определили, что интенсивность полосы при 1243 нм в спектре Р+/Р в РЦ С/ аигапИасш уменьшена

димере Р+ [Reimers and Hush, 1995].

700 800 900 1000 1100 1200 1300

(~ в 1,5 раза) по сравнению с аналогичной полосой при 1247 нм в РЦ Rb. sphaeroides R-26 (рис. 3), что указывает на различия в электронных структурах димеров Р+ для этих РЦ.

Электронные свойства Р+ в РЦ Сf. aurantiacus

Электронная структура димера катион-радикала Р+ в РЦ Cf aurantiacus обсуждается на основе молекулярно-орбитальной модели [Plato et al., 1992; Parson et al., 1992], согласно которой энергии ВЗМО индивидуальных бактериохлорофиллов Ра. и Рв не эквивалентны друг другу, отличаясь на величину Ла'. Взаимодействие орбиталей молекул РА и Рв, энергия которого характеризуется величиной резонансного интеграла ри, приводит к образованию двух ВЗМО димера, разделенных энергетическим зазором АЕ = (Да'2 + 4PD2)"2- В рамках этой модели полоса переноса дырки в ИК-спектре Р+ принадлежит электронному переходу между ВЗМО димера, и ее максимум соответствует разности энергии ДЕ; отношение спиновых плотностей рА/рв (и, соответственно, положительных зарядов) на молекулах РА и Рв — функция Да'/|3П. Для РЦ Rb. sphaeroides рА/рв было экспериментально определено методом двойного электронно-ядерного резонанса и составило 2,1 [Lendzian et al., 1993]. Уменьшение интенсивности полосы поглощения Р+ в области 1250 нм (рис. 3) и при 2650 см"1 (рис. 2) указывает на ослабление электронного сопряжения в Р+, т. е., уменьшение pD, в РЦ Cf. aurantiacus по сравнению с РЦ Rb. sphaeroides R-26. Однако близкое значение ДЕ для обоих РЦ (-2650 см") предполагает пропорциональное увеличение Да' для РЦ Cf. aurantiacus. Таким образом, отношения величин положительных зарядов на молекулах РА и Рв в катион-радикале Р+, по-видимому, сравнимы для данных РЦ, или распределение заряда даже несколько более асимметрично в РЦ Cf. aurantiacus. Этот вывод не подтверждает предположение о более симметричном распределении заряда в Р+ в РЦ Cf. aurantiacus по сравнению с Rb. sphaeroides, сделанное ранее на основе данных (пре)резонансной рамановской спектроскопии [Ivancich et al., 1996].

Молекулярные взаимодействия карбонильных групп Р и Р* в РЦ Cf. aurantiacus

Различия в положении и интенсивности полос валентных колебаний С=0 групп молекул БХл, наблюдаемые между ИК-Фурье-спектрами P+QA/PQA РЦ Cf aurantiacus и Rb. sphaeroides R-26 в области 1760-1620 см"1 (рис. 2Б), в значительной степени отражают особенности взаимодействий Р и Р+ с белком в двух РЦ. В частности, исходя из известной аминокислотной последовательности РЦ Cf. aurantiacus [Ovchinnikov et al., 1988a,b; Shiozawa et al., 1989] и в согласии с данными рамановской спектроскопии [Ivancich et al., 1996] отрицательная полоса при 1635 см"1 (рис. 2Б) может быть приписана З'-ацетильной группе молекулы Рв, донором водородной связи для которой служит тирозин Ml87. Полосы валентных колебаний 13'-кето С=0 групп молекул БХл димера разрешаются при 1697 и 1687 см"1 в ИК-Фурье-спектре РЦ Cf aurantiacus при 95 К (рис. 2Б), указывая на то, что эти группы не вовлечены в образование водородных связей с белком, но,

возможно, находятся в различном диэлектрическом окружении. Присутствие в ИК-Фурье-спектре РЦ Cf. aurantiacus дополнительного дифференциального сигнала при 1741(+)/1733(-) см'1 показывает, что в этих РЦ 133-эфирные С=0 группы молекул РА и Рв спектрально более различимы, чем в РЦ Rb. sphaeroides R-26.

ИК-Фурье-спектроскопия Р+ в РЦ Cf. aurantiacus при физиологической температуре

В отличие от ситуации, наблюдаемой при криогенных температурах (рис. 1Б, вставка), освещение частично дегидратированных пленок РЦ Cf. aurantiacus постоянным актиничным светом при физиологических температурах приводит к долгоживущему выцветанию полосы Р (состояние P+Qa"), полное темновое восстановление которого составляет десятки минут или даже часы (рис. 4). Образование аналогичного долгоживущего (стабилизированного) состояния Р QA" является также характерной особенностью обычных водно-детергентных суспензий РЦ Cf. aurantiacus. Ранее состояние такого рода для РЦ Cf. aurantiacus не было исследовано, хотя упоминания о медленной темновой релаксации Р+ в этих РЦ в растворах при комнатной температуре можно найти в работах [Pierson

Рис. 4. Кинетика изменений поглощения первичного донора электрона Р при 865 им, отражающая образование и релаксацию долгоживущего состояния с разделенными зарядами в РЦ Cf. aurantiacus в частично дегидратированной пленке при 293 К. Кривые 1, 2 и 3 соответствуют длительности актиничного освещения (600 им > X > 350 нм; 1-2 мВт/см2) 1, 11 и 43 сек соответственно. Стрелки i и | показывают моменты включения и выключения актиничного света соответственно. Кривые были измерены на одном образце. Каждое последующее освещение производилось после полной релаксации изменений поглощения при 865 нм в темноте.

Доля долгоживущей формы P+Qa" в РЦ Cf aurantiacus увеличивается с удлинением времени актиничного освещения (рис. 4), и эта форма может быть накоплена в основной части РЦ. Долговременные фотоиндуцированные изменения поглощения были практически полностью обратимыми; после соответствующей релаксации в темноте РЦ сохраняли фотохимическую активность и циклы образования и релаксации как короткоживущего, так и стабилизированного состояний P+Qa* могли быть многократно повторены. Эти факты свидетельствуют о том, что образование долгоживущей формы Р Qa не связано с некоторой минорной фракцией РЦ с нарушенньми параметрами переноса электрона, но является характерным свойством основной части функционально активных РЦ Cf. aurantiacus. По-видимому, исходно быстро

and Thornber, 1983; Volk et al., 1991].

Время, сек

рекомбинирующая радикальная пара Р+(2а" (т~60 мс при импульсном освещении [В]апкепзЫр й а1., 1983; УепШгоП й а1., 1991]) в ходе длительного освещения переходит с небольшим квантовым выходом в медленно рекомбинирующее стабилизированное состояние Р+С2а" вследствие. предположительно, конформационных изменений белка, вызванных процессом фотоиндуцированного разделения зарядов. На данном этапе исследований нельзя, однако, полностью исключить из рассмотрения возможность вклада в накопление долгоживущего состояния в РЦ Су. aura.ntia.ais также альтернативного состояния Р (3А.--Х", где X - гипотетический, пространственно удаленный вторичный акцептор электрона, на который переносится электрон с Од" ((2В не сохраняется в изолированных РЦ С/. аигаШгасш).

Рис. 5 показывает спектр фотоиндуцированных инфракрасных изменений поглощения в диапазоне 4000-1200 см'1, отражающих образование стабилизированного состояния Р+0а" в РЦ С/ аигапНасш в частично дегидратированной пленке при 293 К. С этой целью ИК-Фурье-спектры регистрировались последовательно до освещения образца актиничным светом и спустя 5 секунд после его выключения, когда быстро рекомбинирующее состояние полностью релаксирует, в то время как долгоживущее состояние в значительной степени сохраняется (вставка к рис. 5).

Рис. 5. А - Фотоиндуцированный дифференциальный (свет-минус-темнота) ИК-Фурье-спекгр Р+(2а"/Р(2а, измеренный для частично дегидратированной пленки РЦ С/. аигапИасш в диапазоне 4000-1200 см"1 при 293 К. Усреднено 1024 интерферограммы. На вставке воспроизведена начальная стадия кинетики фотоиндуцированных изменений поглощения в пленке РЦ при 865 нм из рис. 4 (кривая 2): вертикальными линиями обозначен временной интервал, в течение которого регистрировался фотоиндуцированный ИК-Фурье-спектр. Б -расширенная низкочастотная (1800-1200 см"1) область ИК-Фурье-спеира, приведенного на панели А.

ИК-Фурье-спектр, измеренный при 293 К (рис. 5), близок по общей структуре ИК-Фурье-спектру, полученному при 95 К (рис. 2А, кривая 2), который включает сигналы только от быстрорелаксирующего состояния Р+С?а- Это относится как к области 4000-1800 см'1, где оба спектра содержат широкую полосу переноса дырки с максимумом при -2650 см"1 и плечом при -2200 см"1, так и к сильно

структурированной области 1800-1200 см"1. Это факт позволяет заключить, что при образовании долгоживущего состояния в РЦ Cf. aurantiacus не происходит значительных изменений ни электронной структуры димера Р+, ни его взаимодействий с ближайшим окружением. Небольшое уменьшение интенсивности полос, наблюдаемое в области 1480-1440 см"1, может указывать на влияние формирования долгоживущего состояния на свойства первичного хинона РЦ, поскольку наряду с интенсивными фазово-фононными полосами Р+ в этом частотном диапазоне ожидается также вклад полос анион-радикала QA" при 1479 и 1440 см"1 [Breton et al., 1991].

Детальная природа долгоживущего состояния с разделенными зарядами в РЦ Cf. aurantiacus и его возможная функциональная роль требуют дальнейших исследований. Возможно, это состояние родственно стабилизированному состоянию P+Qa\ активно исследуемому в последнее время в РЦ Rb. sphaeroides и отнесенному медленным конформационным перестройкам в месте связывания QA" и вблизи Р+, возникающим на секундной или минутной временных шкалах при фотоиндуцированном разделении зарядов в РЦ [Goushcha et al., 1997; Kaiman and Maroti, 1997; Нокс и др., 2001; van Mourik et al., 2001; Andreasson and Andreasson, 2003; Katona et al., 2005; Deshmukh et al., 2011]. По аналогии с РЦ пурпурных бактерий предполагается, что долгоживущее стабилизированное состояние P+Qa" может отражать особенности физиологического функционирования РЦ Cf. aurantiacus в условиях постоянного высокоинтенсивного или флуктуирующего освещения.

3.2. ИК-Фурье-спектроскопия фотовосстановления бактериофеофитинового акцептора электрона в РЦ Cf. aurantiacus

Согласно сравнительному анализу аминокислотной последовательности белковых субъединиц главным отличием в ближайшем окружении фотоактивного бактериофеофитина НА в РЦ Cf. aurantiacus от РЦ пурпурных бактерий является замена консервативного аминокислотного остатка глютаминовой кислоты в положении L104 на глютамин в эквивалентном положении L143 [Ovchinnikov et al., 1988а,b; Shiozawa et al., 1989]. Данные теоретических расчетов предсказывают значительную стабилизацию радикальной пары Р+Нд (на 0,04-0,05 мэВ) в РЦ Rb. sphaeroides вследствие электростатического взаимодействия между протонированным остатком глютаминовой кислоты L104 и НА [Michel-Beyerle et al., 1988]. Фолк и соавт. предположили, что замена более полярной Glu L104 на менее полярный остаток Gin в гомологичном положении может быть причиной экспериментально наблюдаемого увеличения свободной энергии состояния PfHA" на 0,04 мэВ в РЦ Cf. aurantiacus по сравнению с РЦ Rb. sphaeroides [Volk et al., 1998]. В настоящее время, однако, данные о свойствах сайтов связывания молекул БФео в РЦ Cf. aurantiacus практически отсутствуют. Для того чтобы получить информацию о молекулярных взаимодействиях На и На" с белковым окружением в РЦ Cf. aurantiacus, мы использовали метод фотоиндуцированной дифференциальной ИК-Фурье-спектроскопии в комбинации с методом стационарного фотонакопления НА" в условиях быстрого донирования электрона от экзогенного донора электрона к Р+ в составе фотогенерированной пары Р+НА".

Фотовосстановление НА в частично дегидратированной пленке РЦ С/, аигапйасш подтверждается селективным выцветанием <3Х и С>у полос при 538 и 753 нм, соответственно, и появлением полос поглощения анион-радикала I Iа" при 656, 898 и -942 нм в фотоиндуцированном электронном (500-1000 нм) дифференциальном спектре НАТНА (рис. 6, кривая 2).

Рис. 6. Фотоиндуцировшшые дифференциальные НаТНа спектры РЦ КЪ. ¡рИаегохйез Я-26 (/) и С/. аигапйасиз (2) в частично дегидратированных пленках в присутствии экзогенных донора электрона (дигиониг натрия) и медиаторов переноса электрона (индиготетрасульфонат калия и нейтральный красный) при комнатной температуре.

" ' 500 600 700 800 900 1000 Длина волны, ни

Существенно, что все наблюдаемые полосы смещены в область более коротких волн по отношению к аналогичным полосам, регистрируемым в НАТНА спектре РЦ Rb. sphaeroides R-26 (рис. 6, кривая 1). Оба дифференциальных спектра включают также коротковолновые электрохромные сдвиги и уменьшение дипольной силы полос поглощения мономерного БХл (в области 800 и 813 нм соответственно) и близко соответствуют спектрам фотонакопления НА, описанным в литературе [Shuvalov et al., 1986].

Рис. 7. Дифференциальные (свет-минус-темнота) На7На ИК-Фурье-спектры (18001200 см"1) РЦ Rb. sphaeroides R-26 (1) и С/ aurantiacus (2) в пленках в присутствии дитиоштга натрия, индиготетрасульфоната калия и нейтрального красного при комнатной температуре. Для каждого типа РЦ усреднено по 10000 интерферограмм. Спектры нормированы при 1745-1744 см'1 (спектр Cf. aurantiacus умножен на 2).

1800 1700 1600 1500 1400 1300 1200 Волновое число, см"1

Основные особенности фотоиндуцированного дифференциального ИК-Фурье-спектра НА/НА РЦ Cf. aurantiacus (рис. 7, кривая 2) в области 1800-1200 см" интерпретируются с учетом спектральных соотнесений, сделанных для ранее хорошо охарактеризованных РЦ дикого типа и мутантных РЦ пурпурных бактерий [Nabediyk et al., 1995; Breton et al., 1999], используя известную аминокислотную последовательность для РЦ Cf. aurantiacus и предполагая их структурную аналогию с РЦ Rb. sphaeroides.

Наиболее значимым отличием между двумя дифференциальными ИК-Фурье-

спектрами является тот факт, что полоса валентных колебаний 13'-кето С=0 группы анион-радикала НА" в спектре РЦ Cf. aurantiacus, локализованная при 1623 см"1 (рис. 7, кривая 2), смещена в высокочастотную область на 35 см"1 по сравнению с соответствующей полосой при 1588 см"1 в спектре РЦ Rb. sphaeroides R-26 (рис. 7, кривая /). В тоже время отрицательная полоса при 1675 см"1 в спектре РЦ Cf. aurantiacus, отнесенная валентной моде П'-ксто С=0 группы нейтрального НА, расположена почти при той же частоте, что и в РЦ Rb. sphaeroides (1674 см"1). В результате, хотя низкочастотные сдвиги полос валентных колебаний 13!-кето С=0 группы при переходе НА —» НА" в обоих РЦ больше, чем в сдвиг, наблюдавшийся при электрохимическом восстановлении БФео а в отсутствие образования водородной связи в растворе тетрагидрофурана (44 см"1), абсолютная величина сдвига для РЦ Rb. sphaeroides R-26 (86 см'1) значительно больше, чем для РЦ Cf. aurantiacus (52 см"1). Учитывая результаты теоретических расчетов, выполненных методом функционала плотности для феофитина a [O'Malley, 2000; Shibuya et al., 2010], эти данные объясняются в рамках схемы, согласно которой: (1) водородная связь усиливается при восстановлении НА и (2) водородная связь 13'-кето С=0 группы в анион-радикальном состоянии НА" с Gin L143 в РЦ Cf. aurantiacus значительно слабее, чем с Glu L104 в РЦ Rb. sphaeroides R-26. Последний вывод согласуется с коротковолновыми сдвигами максимумов полос поглощения НА" в электронном спектре НА"/НА в Cf aurantiacus (656, 898 и ~942 нм) по отношению к их положению в РЦ Rb. sphaeroides (662, 912 и ~965 нм) (рис. 6). Усиление водородной связи в анион-радикальном состоянии объясняется тем, что увеличение длины 131-С=0 связи и частичный отрицательный заряд на атоме кислорода карбонила в анион-радикале делают его лучшим акцептором водородной связи. Очевидно, Gin L143 в РЦ Cf. aurantiacus вовлечен в более слабую водородную связь с 13'-кето С=0 группой молекулы НА в нейтральном состоянии, чем Glu L104 в РЦ Rb. sphaeroides R-26, что подтверждается смещением в синюю область Qx полосы НА в Cf. aurantiacus (538 нм) относительно аналогичной полосы при 543 нм в Rb. sphaeroides R-26 (рис. 6). Предполагается, что Gin должен быть более слабым донором водородной связи, чем Glu из-за отличий в величине дипольных моментов между NH и ОН группами [Dorlet et al., 2001]. Отсутствие значительного различия в частотах валентных колебаний 13'-кето С-О группы нейтральной молекулы НА в двух РЦ (рис. 7), которое ожидалось бы в результате ослабления водородной связи к НА в Cf. aurantiacus, указывает на то, что другие факторы влияют на частоту колебаний этой группы. Наиболее вероятным кандидатом для этого является, по-видимому, различие диэлектрических свойств ближайшего окружения фотоактивного БФео в двух РЦ. В частности, Gin L143 в РЦ Cf. aurantiacus может обеспечивать более полярное локальное окружение для молекулы НА, чем Glu L104 в РЦ Rb. sphaeroides, так как согласно литературным данным постоянный диполь для глютамина примерно в три раза больше, чем для глютаминовой кислоты.

В области поглощения 133-эфирных С=0 групп (1750-1700 см"1) в ИК-Фурье-спектре НА"/НА РЦ Cf. aurantiacus (рис. 7, кривая 2) зарегистрированы две отрицательные полосы при 1744 и 1722 см"1 и небольшое плечо при 1732 см"1. На

основании сравнения полученного спектра с аналогичными спектрами НА"/НА для РЦ Rb. sphaeroides R-26 (рис. 7, кривая I) и РЦ точечного мутанта E(L104)Q Blastochloris viridis [Breton et al., 1999], в котором остаток Glu L104 замещен на Gin, эти полосы приписаны 133-эфирным группам НА по крайней мере двух популяций РЦ Cf. aurantiacus, различающихся степенью вовлечения карбонилов V кольца молекулы НА в образование водородных связей с Trp L139 и Gin L143.

Таким образом, колебательные свойства карбонильных групп V кольца бактериофеофитинового акцептора электрона НА в РЦ Cf. aurantiacus во многом определяются присутствием аминокислотных остатков глютамина L143 и триптофана L139, которые, вероятно, образуют водородные связи с 13'-кето С=0 и 133-эфирной группами НА соответственно.

3.3. Структурные свойства и пигмент-белковые взаимодействия в мутантных реакционных центрах Rhodobacter sphaeroides I(L177)H

Отсутствие на момент начала диссертационного исследования кристаллографических данных о структуре мутантных РЦ I(L177)H значительно затрудняло понимание спектральных и функциональных последствий необычно прочного связывания БХл с белком, обнаруженного для этого мутанта [Fufina et al., 2007]. В частности, оставалась невыясненной природа первичного донора электрона Р в РЦ I(L177)H, который на основе измерения спектров поглощения при комнатной и низкой температурах мог быть интерпретирован либо как мономер [Хатыпов и др. 2005], либо как димер [Fufina et al., 2007]. В данной работе пигмент-пигментные и пигмент-белковые взаимодействия в РЦ I(L177)H были исследованы методами ИК-Фурье-спектроскопии и КД.

Структура первичного донора электрона

На рис. 8 представлены фотоиндуцированные дифференциальные ИК-Фурье-спектры P+Q7PQ для РЦ Rb. sphaeroides дикого типа и мутанта I(L177)H.

Рис. 8. А - Фотоиндуцированные дифференциальные ИК-Фурье-спектры Р Ч^ТРС} РЦ ЯЬ. зрИоегоикх дикого типа (1) и мутанта 1(Ы77)Н (2). Спектры нормированы по амплитуде полосы при 2700 см"1 (спектр 2 увеличен в 3 раза). Для спектров / и 2 усреднено 2048 и 4096 шггерферо грамм соответственно. Б - В увеличенном масштабе показана область спектров 18001200 см , представленных на панели А.

Как отмечено в разделе З.1., электронный переход при ~2700 см"' и колебательные фазово-фононные полосы -1550, 1480 и 1290 см"1, присутствующие в ИК-Фурье-спектре РЦ дикого типа (рис. 8, кривая 1), характерны исключительно для димерного катион-радикала Р+, состоящего из электронносорпяженных молекул БХл. Присутствие аналогичных полос в ИК-Фурье-спектре РЦ 1(Ы77)Н (рис. 8, кривая 2) позволяет заключить, что первичный донор электрона в мутантных РЦ является димером БХл с положительным зарядом, асимметрично распределенным между молекулами Рд и Рв в состоянии Р+. Уменьшение (~ в 3 раза) интенсивности полосы при -2700 см"1 и фазово-фононных полос (рис. 8) в мутантных РЦ указывает на ослабление электронного сопряжения между БХл в димере Р+. Вклад в этот эффект могут вносить также гетерогенность мутантных РЦ и уменьшение в результате мутации квантового выхода образования состояния Р+<3".

На рис. 9 показаны спектры КД для РЦ ЯЬ. ярЬаего'гйеь дикого типа и мутанта 1(1Л77)Н в состояниях с нейтральным (панель А) и окисленным (панель Б) первичным донором электрона Р.

Рис. 9. А, Б - Спектры кругового дихроизма РЦ Rb. sphaeroides дикого типа (У) и мутанта I(L177)H (2) в области 650-950 нм, измеренные до (а) и после (б) окисления первичного донора электрона Р феррицианидом калия (2 мМ). В - Дифференциальные (окисленные-минус-восстановленные РЦ) спектры КД дикого типа (/) и мутанта I(L177)H (2), рассчитанные ш спектров, приведенных на рис. 9, А и Б.

Дифференциальный (окисленные-минус-

восстановлеш1ые РЦ) спектр КД дикого типа (рис. 9В, кривая 1) демонстрирует два компонента, соответствующие уходу низко- (865 нм) и высокоэнергетического (811 нм) экситонных переходов Р. Присутствие аналогичных компонентов, отражающих экситонные полосы при 846 и 811 нм, в длина волны, нм дифференциальном спектре КД мутантного

препарата (рис. 9В, кривая 2) подтверждает вывод о димерной природе первичного донора электрона в РЦ I(L177)H. Однако наблюдаемые изменения в положении и амплитуде экситонных полос в спектре КД мутантных РЦ указывают на небольшие изменения экситонных взаимодействий в димере Р вследствие замены lie L177 —»Iiis.

Полученная недавно кристаллическая структура РЦ I(L177)H [Vasilieva et al., 2012] подтвердила вывод о сохранении димерной структуры первичного донора электрона в РЦ I(L177)H.

Гипотетический механизм образования ковалентной связи Анализ частотной области 1750-1620 см"1 дифференциального ИК-Фурье-спектра (рис. 8Б), в котором располагаются полосы валентных колебаний 3 -ацетильной, 13!-кето, 133-эфирной групп молекул БХл первичного донора электрона Р, показал, что 13 -кето- и 133-эфирная группы не участвуют в образовании предполагаемой ковалентной связи. Инфракрасные полосы 3 -ацетильных С=0 групп не разрешаются в ИК-Фурье-спектре, однако, участие этих групп в образовании ковалентной связи может быть исключено на основании анализа спектров поглощения мутантных РЦ 1(Ы77)Н. Колебательные моды 17 -эфирных С=0 групп не вносят вклада в фотоиндуцированный дифференциальный ИК-спектр. Интересно, однако, что в присутствии фермента хлорофиллазы эти группы могут вступать в реакцию переэтерификации с соединениями, содержащими первично-спиртовые группы, в том числе, с аминокислотами [М1сЬаЬк'1 й а1., 1987; Р1ес1ог е! а1., 1996]. На этой основе в работе предлагается гипотетическая схема, согласно которой ковалентная связь в мутантных РЦ образуется в реакции переэтерификации 173-эфирной группы молекулы Ра первичной спиртовой группой серина Ь244 с участием имидазола гистидина Ы77 в качестве каталитической группы. Однако с учетом имеющейся в настоящее время кристаллической структуры РЦ 1(Ь177)Н [УавШеуа й а1., 2012] механизм такого рода можно предполагать только в случае, если ковалентная связь образуется в ходе денатурации РЦ различными агентами (температура, органические растворители или детергенты).

Заключение

Реакционные центры Cf. aurantiacus сходны по первичной фотохимии и общей организации кофакторов с РЦ пурпурных бактерий, значительно отличаясь от них по составу белка и хромофоров. Сравнительные исследования РЦ Cf. aurantiacus и Rb. sphaeroides представляют большой интерес для выяснения универсальных особенностей энергетики и механизма первичного разделения зарядов в бактериальном фотосинтезе. Анализ результатов, полученных для РЦ Cf. aurantiacus, однако, сильно ограничивается отсутствием детальной кристаллографической модели для данного типа РЦ.

Метод фотоиндуцированной дифференциальной ИК-Фурье-спектроскопии чрезвычайно чувствителен к молекулярным изменениям, сопровождающим разделение зарядов в РЦ. Этот факт, а также возможность наблюдать электронные переходы очень малой энергии в ИК-области, являющиеся уникальной характеристикой димеров пигментов, делают ИК-Фурье-спектроскопию ценным источником информации об электронной и молекулярной организации кофакторов в РЦ. В данной работе метод фотоиндуцированной ИК-Фурье-спектроскопии был впервые использован для систематических исследований первичного донора электрона Р и бактериофеофитинового акцептора электрона НА в изолированных РЦ Cf. aurantiacus.

На основе низкотемпературных ИК-Фурье-измерений получены прямые доказательства димерной структуры первичного донора электрона в РЦ Cf. aurantiacus. Выявленное значительное сходство димеров Р в РЦ Cf. aurantiacus и Rb. sphaeroides, бактерий относительно удаленных друг от друга в эволюционном отношении, указывает на то, что димерный первичный донор электрона мог входить в состав фотосинтетического аппарата уже у ближайших общих предшественников пурпурных бактерий и нитчатых аноксигенных фототрофных бактерий. Известно, что образование димера снижает окислительный потенциал Р относительно мономерного бактериохлорофилла, а также формирует эффективную ловушку энергии электронного возбуждения от светособирающей антенны. Электронное сопряжение в димерном Р обеспечивает частичный перенос электрона между РА и Рв на временной шкале несколько сотен фемтосекунд и менее [Hamm and Zinth, 1995; Khatypov et al., 2012], что, как предполагается [Khatypov et al., 2012], может составлять начальную стадию высокоэффективного первичного разделения зарядов в бактериальных РЦ. Очевидно, димерная структура Р была эволюционно отобрана и сохранена в РЦ Rb. sphaeroides и Cf. aurantiacus как базовый элемент, надмолекулярные свойства которого имеют принципиальное значение для механизма бактериального фотосинтеза. Небольшие различия в электронной и молекулярной структурах димеров Р+ в РЦ Rb. sphaeroides и Cf. aurantiacus, по-видимому, обусловлены отличиями их ближайшего аминокислотного окружения.

Методом фотоиндуцированной ИК-Фурье-спектроскопии были исследованы молекулярные изменения, связанные с фотовосстановлением бактериофеофитинового акцептора электрона НА в изолированных РЦ Cf. aurantiacus. Полученные данные согласуются с моделью, предполагающей, что

(1) глютаминовая кислота в положении L104 в РЦ Rb. sphaeroides R-26 заменена на более слабый донор водородной связи, глютамин, в эквивалентном положении L143 в РЦ Cf. aurantiacus; (2) при образовании На" происходит усиление водородной связи 13'-кето С=0 группы На с Glu L104 или Gin L143; (3) диэлектрическое окружение белка может оказывать влияние на частоту валентных колебаний 13'-кето С=0 группы нейтральной молекулы НА и (4) РЦ гетерогенны по конформации 133-эфирной СЮ группы молекулы Нд.

Ранее было показано [Shuvalov et al., 1986], что редокс потенциал пары Р+/Р в РЦ Cf. aurantiacus уменьшен приблизительно на 110 мВ по сравнению с РЦ Rb. sphaeroides R-26, что при равенстве энергии Р-»Р* оптического перехода для двух РЦ (1,43 эВ) должно было бы приводить к пропорциональному уменьшению свободной энергии всех состояний с разделенными зарядами в Cf. aurantiacus, включая Р+НА". Однако, это, очевидно, не происходит, так как относительное понижение потенциала восстановления Нд в РЦ Cf. aurantiacus вследствие ослабления водородной связи будет приводить к возрастанию уровня свободной энергии состояния Р+НА" по отношению к уровню возбужденного состояния Р компенсаторным образом. . Таким образом, взаимодействие молекулы фотоактивного бактериофеофитина Нд с белком на уровне образования водородной связи является, по-видимому, одним из факторов, определяющих величины энергетических зазоров между состояниями, вовлеченными в первичное разделение зарядов в РЦ фотосинтезирующих бактерий.

Конформационная гетерогенность V кольца молекулы На может быть связана с описанными ранее в литературе неэкспоненциальным спадом возбужденного состояния Р* [Becker et al., 1991; Wachtveitl et al., 1998] и энергетической негомогенностью P'IIa" [Volk et al., 1998].

В отсутствие рентгеноструктурных данных метод ИК-Фурье-спектроскопии был использован для получения структурной информации относительно изолированных мутантных РЦ Rb. sphaeroides I(L177)H, содержащих молекулу БХл, прочно, возможно, ковалентно связанную с белком [Fufina et al., 2007]. Полученные данные не подтвердили первоначальное предположение о влиянии мутации Ile L177 -> His на природу первичного донора электрона, то есть замену димера на мономер [Хатыпов и соавт., 2005]. Показано, что димерная структура Р сохраняется в мутантных РЦ, хотя электронное сопряжение между бактериохлорофиллами РА и Рв, возможно, уменьшается по сравнению с РЦ дикого типа. Результаты работы позволяют предполагать, что 131-кето и З1-ацетильная С=0 группы, вовлеченные в сопряженную систему связей молекул БХл, а также 133-эфирная С=0 группа, по-видимому, не участвуют в образовании предполагаемой ковалентной связи. Недавно эти выводы были подтверждены данными рентгеноструктурного анализа [Vasilieva et al., 2012].

Выводы

1. Методами электронной абсорбционной спектроскопии и фотоиндуцированной дифференциальной ИК-Фурье-спектроскопии исследована природа первичного донора электрона Р в РЦ С/. аигапШст. Показано, что:

• Катион-радикал Р+ имеет димерную структуру с положительным зарядом, асимметрично распределенным между двумя сопряженными молекулами бактериохлорофилла а.

• Димер Р+ характеризуется более слабым электронным сопряжением между молекулами бактериохлорофилла по сравнению с Шз. зрИаего'1с1е$ 11-26.

• 3'-ацетильная С=0 группа молекулы Рв образует водородную связь (вероятно с тирозином М187), поглощая при 1635 см"1.

2. Показано, что колебательные, оптические и рсдокс свойства бактериофеофитинового акцептора электрона На в РЦ С/. аигапИасия в значительной степени определяются присутствием аминокислотного остатка глютамина 1Л43, который образует водородную связь с 13'-кето С=0 группой V кольца НА:

• П'-кето С=0 группа молекулы НА в РЦ С/. аигапИасих образует более слабую водородную связь с глютамином Ы43 по сравнению с водородной связью между НА и гомологичным остатком глютаминовой кислоты Ы04 в РЦ ЯЬ. ярИаегогс^ез 11-26.

• В анион-радикальном состоянии НА" происходит усиление водородной связи между 13'-кето С=0 группой БФео и глютамином 1Л43 или глютаминовой кислотой Ы04.

• Частотное положение полосы валентных колебаний 13'-кето С=0 группы нейтральной молекулы НА определяется, по-видимому, как водородной связью с белком, так и диэлектрической постоянной ее микроокружения.

• Существуют несколько популяций РЦ С/. аагапИасш, различающихся конформацией 133-эфирной С=0 группы НА.

3. Методами дифференциальной ИК-Фурье-спектроскопии и кругового дихроизма установлено, что катион-радикал первичного донора электрона в мутантных РЦ 1(Ь177)Н ЛЬ. зрИаегоШея с прочно связанным бактериохлорофиллом сохраняет димерную структуру. Однако ИК-Фурье-спектры Р+ не идентичны для мутантных РЦ и РЦ дикого типа, что, очевидно, обусловлено влиянием мутации Не Ы77 1Пя на электронное сопряжение в Р+, гетерогенностью мутантных РЦ и уменьшением в результате мутации квантового выхода образования состояния Р+<3~.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

Статьи:

1. Забелин А. А., Фуфина Т. Ю., Васильева JI. Г., Шкуропатова В. А., Зверева М. Г., Шкуропатов А. Я., Шувалов В. А. (2009) Мутантные реакционные центры Rhodobacter sphaeroides I(L177)H с прочно связанным бактериохлорофиллом а: структурные свойства и пигмент-белковые взаимодействия, Биохимия, 74, 86-94.

2. Zabelin A. A., Shkuropatova V. A., Shuvalov V. A., Shkuropatov A. Ya.

(2011) FTIR spectroscopy of the reaction center of Chloroflexus aurantiacus-. Photoreduction of the bacteriopheophytin electron acceptor, Biochim. Biophys. Acta, 1807, 1013-1021.

3. Забелин А. А., Шкуропатова В. А., Шувалов В. А., Шкуропатов А. Я.

(2012) ИК-Фурье-спектроскопия реакционного центра Chloroflexus aurantiacus: фотоокисление первичного донора электрона, Биохимия, 77,196-204.

Тезисы докладов:

4. Забелин А. А., Шкуропатов А. Я., Шувалов В. А. (2005) Исследование структуры первичного донора электрона реакционного центра Chloroflexus aurantiacus методом дифференциальной инфракрасной спектроскопии с Фурье преобразованием, 9-я Международная пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века», 18-22 апреля, Пущино, Россия, с.115.

5. Забелин А. А. (2009) Исследование структурных свойств и пигмент-белковых взаимодействий мутантных реакционных центров Rhodobacter sphaeroides I(L177)H с прочно связанным бактериохлорофиллом а, Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009», секция «Биология», 13-18 апреля, Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, с. 14-15.

6. Забелин А., Шкуропатова В., Шувалов В., Шкуропатов А. (2011) FTIR спектроскопия реакционных центров Chloroflexus aurantiacus, VI Съезд Российского фотобиологического общества, 15-22 сентября, пос. Шепси, с. 12.

7. Забелин А. А., Шкуропатова В. А., Шувалов В. А., Шкуропатов А. Я. (2012) Спектральные исследования долгоживущего состояния с разделенными зарядами в реакционном центре Chloroflexus aurantiacus, XX Пущинские чтения по фотосинтезу и Всероссийская конференция «Разнообразие путей электронного транспорта и углеродного метаболизма при фотосинтезе», 25-29 июня, Пущино, Россия, с. 22.

Подписано в печать:

24.04.2013

Заказ №8418 Тираж - 120 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330^00 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Забелин, Алексей Александрович, Пущино

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт фундаментальных

проблем биологии Российской академии наук

На правей рукописи

0420135^1 А 4

ЗАБЕЛИН Алексей Александрович

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭЛЕКТРОННЫХ СВОЙСТВ И МОЛЕКУЛЯРНЫХ

ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ КОФАКТОРОВ ПЕРЕНОСА ЭЛЕКТРОНА В РЕАКЦИОННЫХ ЦЕНТРАХ ФОТОСИНТЕЗИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ

03.01.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: академик Шувалов В.А. к.б.н. Шкуропатов А.Я.

Пущино 2013

СОДЕРЖАНИЕ

СОДЕРЖАНИЕ 2

ВВЕДЕНИЕ 5

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Структурно-функциональные особенности бактериального фотосинтеза 9

1.1.1. Фотосинтетический аппарат пурпурных бактерий 9 Схема транспорта энергии и электронов в фотосинтетической мембране 9 Состав реакционных центров пурпурных бактерий. Расположение кофакторов и спектральные свойства 11 Перенос электрона в реакционных центрах пурпурных бактерий 17 Фотохимическое накопление бактериофеофитинового акцептора электрона в восстановленном состоянии 18

1.1.2. Фотосинтетический аппарат СЫого/1ехш аигапНасш 19 Электрон-транспортная цепь С/. аигапНасш 19 Фотосистема С/. аигапНасш 20 Реакционный центр С/. аигапНасш 22

1.2. Применение ИК-спектроскопии для исследования фотосинтеза 27

1.2.1. Основные принципы Фурье-спектроскопии 27

1.2.2. Дифференциальная ИК-Фурье-спектроскопия 29

1.2.3. Приемы соотнесения полос в дифференциальных ИК-Фурье-спектрах 30 Сравнение со спектрами модельных соединений 30 Изотопное замещение 33 Теоретические расчеты нормальных колебаний 34 Точечный мутагенез 35

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 36

2.1. Объекты исследования 3 6

2.1.1. Выделение и очистка бактериальных РЦ 3 6

2.1.2. Концентрирование РЦ и замена детергента 3 7

2.1.3. Реакция фотовосстановления бактериофеофитинового акцептора электрона

На в суспензии РЦ 38

2.1.4. Приготовление образцов для ИК-Фурье-спектроскопии 39

41

2.2. Методы

2.2.1. Измерение ИК-Фурье-спектров 41 Модификация Фурье-спектрометра для проведения фотоиндуцированных измерений 41 Методика получения фотоиндуцированных дифференциальных ИК-Фурье-спектров 42

2.2.2. Измерение спектров кругового дихроизма 42

2.2.3. Измерение электронных спектров поглощения при комнатной и криогенной температурах 43

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. ИК-Фурье-спектроскопия фотоокисления первичного донора электрона в РЦ

С/. аигапНасш 44

3.1.1. Контроль состояния РЦ в частично дегидратированных пленках 45

3.1.2. Димерная структура Р+ в РЦ С/. аигапНасш 48

3.1.3. Электронные свойства Р+ в РЦ С/, аигапйасш 54

3.1.4. Молекулярные взаимодействия карбонильных групп Р и Р+ в РЦ С/, аигапйасш 57

3.1.5. ИК-Фурье-спектроскопия Р+ в РЦ С/, аигапйасиз при физиологической температуре 59

3.2. ИК-Фурье-спектроскопия фотовосстановления бактериофеофитинового

акцептора электрона в РЦ С/. аигапИаст 63

3.3. Структурные свойства и пигмент-белковые взаимодействия в мутантных

реакционных центрах Шо^Ъа^ег $рЬаего1(1е$ 1(Ь 177)Н 81

3.3.1. Структура первичного донора электрона 82

3.3.2. Гипотетический механизм образования ковалентной связи 92

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 94

ВЫВОДЫ 97

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 98

Список принятых сокращений

БХл - бактериохлорофилл

БФео - бактериофеофитин

ВЗМО - высшая занятая молекулярная орбиталь

ВЗМО-1 - вторая высшая занятая молекулярная орбиталь

ДМ - и-додецил-Р-Б-мальтозид

ДЭЯР - двойной электронно-ядерный резонанс

ИК-Фурье-спектроскопия - инфракрасная спектроскопия с Фурье преобразованием кДа - килодальтон

ЛДАО - А^-лаурил-тЧА^-диметиламино-А^-оксид

мкс - микросекунда

мс - миллисекунда

нм - нанометр

пс - пикосекунда

РЦ - реакционный центр

см'1 - обратный сантиметр

Фео - феофитин

фс - фемтосекунда

ФС 2 - фотосистема 2

ЭПР - электронный парамагнитный резонанс

Вд и Вв - мономерные БХл, расположенные в активной (А) и неактивной (В) по переносу

цепи кофакторов соответственно

В1. viridis - Blastochloris viridis

Cf. aurantiacus - Chloroflexus aurantiacus

На и HB- молекулы БФео, расположенные в активной (А) и неактивной (В) по переносу цепи кофакторов соответственно

Р - первичный донор электрона, димер молекул бактериохлорофилла Qa и Qb - первичный и вторичный хинонные акцепторы соответственно Rb. sphaeroides - Rhodobacter sphaeroides

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. Первичное преобразование световой энергии в энергию разделенных зарядов, запускающее всю последовательность реакций фотосинтеза - глобального биосферного фотопреобразующего процесса - протекает в специализированных мембранных пигмент-белковых комплексах, называемых реакционными центрами фотосинтеза (РЦ). Для наиболее изученных в настоящее время в структурном и функциональном отношении РЦ пурпурных бактерий последовательность реакций переноса электрона может быть выражена схемой

Р* -> Р+Вд - Р+На — Р+ОА , где Р - первичный донор электрона, димер молекул бактериохлорофилла (БХл) а (Р* -синглетно-возбужденное состояние Р), Вд - первичный акцептор электрона, мономерный БХл, Нд - промежуточный акцептор электрона (бактериофеофитин, БФео), Ра -первичный хинонный акцептор. Квантовый выход процесса разделения зарядов с образованием ион-радикальной пары Р+(^а" практически равен 1 [Шувалов, 1990]. Высокая эффективность и направленность первичного разделения зарядов в РЦ в значительной степени определяются как свойствами самих кофакторов переноса электрона в нейтральном и ион-радикальном состояниях, так и их взаимодействиями между собой и с белковым окружением. Детальное исследование таких свойств и взаимодействий имеет принципиальное значение для понимания механизма фотосинтетического разделения зарядов в РЦ на молекулярном уровне и является актуальной задачей.

Перспективным подходом к изучению электронных свойств кофакторов и их межмолекулярных взаимодействий является исследование РЦ с модифицированным составом пигментов и/или с изменениями в аминокислотной последовательности субъединиц. Ценная информация о том, какие особенности структуры и свойств кофакторов были эволюционно отобраны и закреплены в природных группах микроорганизмов в качестве консервативных элементов, а какие были модифицированы с сохранением функции РЦ, может быть получена на основе сравнительных исследовании РЦ дикого типа, принадлежащих к различным родам фотосинтезирующих бактерий. Большое внимание в этом отношении привлекают РЦ нитчатой аноксигенной фототрофной бактерии СМого/1ехш (С/.) аигапйасш, которые близки к РЦ пурпурных бактерий по глобальной организации кофакторов и первичной фотохимии, но значительно

отличаются от них по составу белка и пигментов. В частности, РЦ Cf. aurantiacus состоит из двух белковых субъединиц (L и М) и содержит 3 БХл и 3 БФео [Feick et al., 1995], тогда как РЦ Rhodobacter (Rb.) sphaeroides включает три субъединицы (L, М и Н), несущие 4 БХл и 2 БФео [Шувалов, 1990]. Несколько функционально важных аминокислот, характерных для РЦ пурпурных бактерий, отсутствуют в аминокислотной последовательности РЦ Cf. aurantiacus [Ovchinnikov et al., 1988a,b; Shiozawa et al., 1989]. Исследования РЦ Cf. aurantiacus, однако, осложнены отсутствием данных об их кристаллической структуре. Использование спектральных методов остается одним из основных подходов к выяснению структурной организации и свойств кофакторов переноса электрона в РЦ Cf. aurantiacus.

Фотоиндуцированная дифференциальная инфракрасная спектроскопия с Фурье преобразованием (ИК-Фурье-спектроскопия) обладает чрезвычайно высокой чувствительностью к молекулярным взаимодействиям, позволяя выявлять изменения на уровне отдельных химических связей в хромофорах и белковых субъединицах РЦ в ответ на процессы переноса электрона и разделения зарядов [Lutz and Mantele, 1991]. Это делает дифференциальную ИК-Фурье-спектроскопию одним из наиболее адекватных методов для изучения структурной и электронной организации кофакторов переноса электрона в различном окружении и в различных редокс-состояниях в РЦ Cf. aurantiacus.

Точечные мутации аминокислот в окружении кофакторов дают ценную информацию об особенностях пигмент-белковых взаимодействий и их роли в «подстройке» спектральных и окислительно-восстановительных свойств молекул-переносчиков электрона. Характерной особенностью РЦ и других фотосинтетических комплексов является тот факт, что молекулы (бактерио)хлоринов нековалентно связаны с белком. Однако недавно в нашей лаборатории были получены РЦ точечного мутанта Rb. sphaeroides I(L177)H, в которых одна из молекул БХл необычно прочно, возможно, ковалентно связана с L-субъединицей белка [Fufina et al., 2007]. В отсутствие кристаллографических данных большой интерес представляло исследовать особенности пигмент-белковых взаимодействий, вызванных замещением изолейцина L177 на гистидин методами фотоиндуцированной дифференциальной ИК-Фурье-спектроскопии и кругового дихроизма (КД).

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - исследование электронных свойств и молекулярных взаимодействий кофакторов переноса электрона в нативных и

генетически модифицированных реакционных центрах фотосинтезирующих бактерий методом фотоиндуцированной дифференциальной ИК-Фурье-спектроскопии.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Методом фотоиндуцированной дифференциальной ИК-Фурье-спектроскопии исследовать молекулярные и электронные свойства катион-радикала первичного донора электрона Р+ в РЦ С/. аигапНасш при комнатной и криогенной температурах.

2. Исследовать взаимодействия бактериофеофитинового акцептора электрона Нд с белковым окружением в нейтральном и анион-радикальном состояниях в РЦ С/. aura.ntia.cus.

3. Изучить особенности структуры и взаимодействий первичного донора электрона Р в мутантных РЦ КЪ. sphaeroid.es 1(Ы77)Н с прочно связанной молекулой бактериохлорофилла.

Научная новизна и практическая значимость работы. На основе сравнения фотоиндуцированных дифференциальных ИК-Фурье-спектров Р+0а7РС>а РЦ С/. аигапНасш и КЬ. 8рЬае^с1е5 11-26 получены новые доказательства в пользу димерной структуры Р+ в РЦ С/. аигапИаст и охарактеризованы его электронные и молекулярные свойства. Впервые зарегистрирован фотоиндуцированный На"/На дифференциальный ИК-Фурье-спектр для РЦ С/. аигапНасш. Выявлены особенности Нд'/На ИК-Фурье-спектра РЦ С/. аигапНасш по сравнению с исследованными ранее спектрами нативных и мутантных РЦ пурпурных бактерий. На этой основе получены новые данные о взаимодействиях бактериофеофитинового акцептора электрона с белковым окружением в нейтральном состоянии На и их изменениях в анион-радикальном состоянии На". Получены новые данные о структуре первичного донора электрона в мутантных РЦ ЯЬ. 8рЬаего1йв8 1(Ь177)Н с прочно связанной молекулой БХл. Показано, что в данных РЦ первичный донор электрона сохраняет димерную структуру. Предложен возможный механизм образования ковалентной связи между Ь-субъединицей белка РЦ и БХл, основанный на реакции переэтерификации серина Ь244 и 17 -эфирной группы молекулы Ра-

Результаты диссертационного исследования представляют также интерес с прикладной точки зрения и могут быть использованы при разработке высокоэффективных искусственных преобразователей солнечной энергии, включающих в своем составе

фотосинтетические РЦ, или использующих принципы функционирования природных фотосинтетических систем.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были представлены на следующих российских и международных конференциях: "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2005); "Ломоносов-2009" (Москва, 2009); VI Съезд Российского фотобиологического общества (Шепси, 2011); XX Пущинские чтения по фотосинтезу (Пущино, 2012).

По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 3 в рецензируемых журналах.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Структурно-функциональные особенности бактериального фотосинтеза

1.1.1. Фотосинтетический аппарат пурпурных бактерий

Схема транспорта энергии и электронов в фотосинтетической мембране

Процесс фотосинтеза пурпурных бактерий протекает во внутрицитоплазматических мембранах, включающих светособирающие комплексы, реакционный центр, цитохром (цит) ¿с 1-комплекс и АТФ-синтетазу. Сама мембрана выступает в роли непроницаемого барьера для ионов, разделяя водный матрикс клетки на цитоплазму и периплазму. На рис. 1А показаны комплексы пурпурной бактерии ЯИос1оЬас1ег (КЬ.) sphaeroid.es (ранее КИоЛорхеиЛотопа* sphaeroid.es), участвующие в циклическом электронном транспорте, приводящем к возникновению градиента протонов, который необходим для синтеза АТФ.

Рис. 1. А - Белки и кофакторы, участвующие в переносе электрона в фотосинтетической мембране КЬ. sphaeroides (взято из [КаЮпа е1 а1., 2005]). Б -Энергетическая схема циклического транспорта электрона в бактериальном фотосинтезе. Ри£Х - белок, входящий в состав ЬН1-РЦ комплекса, роль которого, по-видимому, состоит в предотвращении нежелательного близкого контакта между белками ТН1 и сайтом РЦ и способствовании процессу обмена хинон/дигидрохинон в мембране [НоИеп-Оуе й а1„ 2008].

Квант света, поглощенный светособирающими комплексами (ЬН), передается на

первичный донор электрона Р870, расположенный в реакционном центре (РЦ). Затем в

*

результате серии быстрых реакций электрон с синглетно возбужденного состояния Р870 переносится на вторичный хинонный акцептор <3в (рис. 1 Б). Водорастворимый цитохром Сг восстанавливает окисленный первичный донор Р87о+- Поглощение второго кванта света

приводит к образованию дважды восстановленного Qb2\ который присоединяет два протона из цитоплазмы, превращается в дигидрохинон (QH2) и покидает сайт связывания Qb. Хинон из пула в мембране занимает освободившийся Qß-сайт. QH2 окисляется в Ъс\-комплексе в ходе Q-цикла; при этом четыре протона «переносятся» из цитоплазмы в периплазму. Два электрона, полученные при окислении дигидрохинона восстанавливают два цитохрома сг, завершая цикл. Четыре протона направляются обратно в цитоплазму через CFi-CFo АТФ-синтетазу, в результате чего происходит синтез АТФ из АДФ и неорганического фосфата. Пурпурные бактерии способны осуществлять также нециклический транспорт электронов, используя низкопотенциальные доноры, такие как H2S или сукцинат, и восстанавливать разнообразные акцепторы, в том числе NAD+ и СОг [Knaff, 1978].

Фотосистема пурпурных бактерий включает реакционный центр и связанные с ним светособирающие комплексы. В пурпурных бактериях обычно присутствуют два типа светособирающих комплексов: LH1 и LH2. Комплекс LH1 окружает РЦ (рис. 2); LH2-комплексы не имеют непосредственного контакта с реакционным центром, но передают на него энергию электронного возбуждения через LH1. Между РЦ и LH1 была обнаружена четкая стехиометрия 1:1, в то же время число LH2 варьирует в зависимости от условий роста бактерий, таких как интенсивность света и температура [Schulten, 1999]. Кристаллографические структуры LH2 получены для Rps. acidophila (2,0 Ä) и Phaeospirillum СPhs.) molischianum (2,4 Ä) [Gabrielsen et al., 2009]. LH2 (Б800-850) построен из блоков, состоящих из гетеродимера белковых субъединиц а и ß и нековалентно связанных с ними трех молекул бактериохлорофилла а и одной молекулы каротиноида. 8-9 таких блоков образуют кольцевую структуру диаметром -65 Ä. 18 молекул БХл тесно взаимодействующих молекул расположены перпендикулярно плоскости мембраны и образуют спектральную форму Б850. Остальные 9 мономерных отдельных молекул БХл 800 упакованы между спиралями ß-апобелка с плоскостями порфириновых колец параллельно плоскости мембраны. Структура LH1 [Bullough et al., 2009], в общем, сходна с таковой для LH2, однако число блоков, участвующих в образовании кольцевой структуры LH1 больше. Около 16 a-ß-гетеродимеров формируют структуру LH1. Кроме того, отсутствуют пигменты, аналогичные Б800 в LH2, а максимум поглощения сильно взаимодействующих бактериохлорофиллов сдвинут до 875 нм (так называемые Б875 пигменты).

После поглощения фотона молекулами бактериохлорофилла комплекса LH2 серия быстрых стадий переноса энергии приводит к передаче возбуждения к LH1 и далее к РЦ (рис. 4; [Fleming and van Grondelle, 1997]). Перенос энергии между пулами бактериохлорофилла Б800 и Б850 в LH2 происходит за ~1 пс, что согласуется с предсказаниями на основе теории Ферстера и с относительной ориентацией пигментов.

Б875

Рис. 2. Схема времен и путей переноса энергии в фотосинтетической единице пурпурной бактерии [Fleming and van Grondelle, 1997].

Поскольку пигменты Б850 экситонно сопряжены, то возбуждение практически моментально делокализуется между всеми 18 бактериохлорофиллами (рис. 2). Перенос с Б850 на Б875 занимает ~3 пс. Сопряжение между пигментами в кольце Б875 достаточно сильное, поэтому, как и в Б850 наблюдается «быстрая» делокализация возбуждения. Вследствие того, что пигменты Б875 и РЦ расположены друг от друга на расстоянии 35-40 А, процесс переноса энергии на этой стадии является наиболее длительным и составляет 35-50 пс.

Состав реакционных центров пурпурных бактерий. Расположение кофакторов и спектральные свойства

Фотохимические реакционные центры фотосинтезирующих ба