Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование частоты мутантных по локусу гликофорина A клеток у лиц, подвергшихся действию ионизирующего излучения

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование частоты мутантных по локусу гликофорина A клеток у лиц, подвергшихся действию ионизирующего излучения"

р р§пра5д РУК0ПИСИ

2 5 ДЕК ?1

Селиванова Елена Ивановна

ИССЛЕДОВАНИЕ ЧАСТОТЫ МУТАПТНЫХ ПО ЛОКУСУ ГЛИКОФОРИНА А КЛЕТОК У ЛИЦ, ПОДВЕРГШИХСЯ ДЕЙСТВИЮ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ.

) и

/С

03.00.01 - Радиобиология

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

.Обнинск, 2000

Работа выполнена в Медицинском радиологическом научном центре РА

Научный руководитель:

кандидат биологических наук И. А. Замулаева

Официальные оппоненты:

I* "

доктор биологических наук,

профессор

А.В. Севанькаев

доктор биологических наук,

нрофессор

И.И. Пелевина

Ведущая организация:

Институт биохимической Физики РАН

Защита состоится "19" декабря 2000 г. в часов на заседании специализированного совета Д. 001. 11.01 в Медицинском радиологическо научном центре РАМН по адресу: 249020, Калужская обл., г. Обнинск, ул. Королева, д. 4.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Медицинского радиологического науного центра РАМН, г. Обнинск.

Автореферат разослан "_ ноября 2000 г.

А

Ученый секретарь Диссертационного совета Доктор медицинских наук, Профессор ,

В. А. Куликов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. При вступлении человества в эпоху практического применения ядерной энергии и катастроф, с ней связанных, возникла необходимость решения таких проблем, как влияние повышенного* фона радиации и других мутагенных факторов окружающей среды на наследственность человека; прогнозирование отдаленных последствий облучения. После аварии на ЧАЭС эти проблемы особенно обострились. Возникла настоятельная необходимость ретроспективной оценки накопленных доз в различных популяциях облученных людей - ликвидаторов аварии и жителей загрязненных радионуклидами территорий.

Традиционный для биодозиметрии метод - оценка нестабильных хромосомных аберраций - позволяет надежно оценить поглощенную дозу з короткие сроки после облучения. Для оценки радиационного воздействия в отдаленные сроки наиболее перспективными являются методы, основанные на выявлении стабильных мутаций в геноме. К их числу следует отнести метод флуоресцентной in situ гибридизации, позволяющий выявить стабильные структурные мутации, и ряд тестов, определяющих мутации по отдельным генным локусам. Среди этих тестов метод определения мутантных по локусу гликофорина А клеток является одним из наиболее перспективных, поскольку мутации по этому локусу способны сохраняться и даже накапливаться в течение всей жизни человека (Langlois R.G. et al., 1987). Кроме того, к преимуществам метода следует отнести то, что он выполняется на эритроцитах и для исследования необходимо всего 0,1 мл периферической крови, то есть проблема доступности биоматериала решается легко. Анализ производится на проточном цитометре, что делает метод высокотехнологичным, производительным и позволяет обследовать большие контингенты людей. Метод основан на определении иммунофенотипа эритроцитов по экспрессии

аллельных форм гликофорина А. Определяя частоту эритроцит нарушенной экспрессией, можно судить о частоте мутаций в этом л Однако это суждение является косвенным, т.к. мутации происхо; ядросодержащих клетках-предшественниках эритроцитов, а опреде проводится с использованием зрелых эритроцитов, лишенных ядра, ч позволяет проанализировать ДНК в клетках с измененным фенотипом и I доказать их мутантный генотип. Поэтому в литературе для обозна эритроцитов с измененной экспрессией отдают предпочтение тер "вариантные эритроциты", хотя термин, "мутантные эритроциты" ■ используется достаточно широко.

Возможность использования гликофоринового теста с и биодозиметрии острого воздействия исследована американскими и японс учеными у лиц. переживших атомную бомбардировку (ЬапзЫэ Я-в. < 1987; В'^Ьее \V.L_ е1 а1., 1990; Ак1уата М. е! а1„ 1991). Ими показано, что ' вариантных клеток, выявленных данным методом, положительно коррел! с дозой, полученной при остром облучении. В отличие от острого вл1 пролонгированного облучения на частоту мутантных клеток по лс гликофорина А практически не изучено.

Цель н задачи исследования. Целью работы является ои информативности гликофоринового теста для биодозиметрии и биоиндик пролонгированного облучения в сравнении с острым облучением. Для этого предполагалось решить следующие задачи: -проанализировать уровень мутантных клеток по локусу гликофори у лиц, подвергшихся острому облучению, и оценить зависимость э параметра от дозы облучения;

-определить частоту мутантных клеток по локусу гликофорнна А после пролонгированного облучения, оценить зависимость этого параметра от дозы облучения;

-сравнить информативность метода при остром и пролонгированном облучении;

-исследовать возможность использования гликофоринового метода для оценки риска отдаленных (канцерогенных) последствий облучения и формирования групп риска в отношении онкологических заболеваний. иучная ноиизна. Проведенные исследования позволили впервые получить .иные о частоте мутантных клеток по локусу гликофорнна А при юлонгированном облучении у лиц с большой и малой накопленной дозой, в м числе у ликвидаторов аварии ЧАЭС, подвергшихся радиационному ¡лучению в дозах до 0.25 Гр, и определить зависимость частоты мутантных | этому локусу клеток от дозы пролонгированного облучения в широком апазоне доз. Показано, что зыход мутантных клеток на единицу дозы при олонгированном облучении примерно в 3 раза ниже, чем при остром.

Впервые установлено, что частота мутантных по локусу гликофорнна А еток выше в группе онкологических больных до лечения по сравнению со эровыми донорами сходного возраста. Эти данные показали перспективность именения гликофоринового теста для оценки канцерогенного риска. тактическая значимость работы. На основе полученных данных дтверждена возможность использования гликофоринового теста для ологической дозиметрии в отдаленные сроки после облучения. В работе ределены параметры линейной зависимости доза-эффект, которые являются ювои для вычисления дозы облучения при проведении биологической (иметрии по данным гликофоринового теста. В отношении острого 1учения показано хорошее соответствие параметров линейной зависимости,

установленных в нашей работе и в исследованиях других авторов, что и;

важное практическое значение для международной стандартизации мето^

проведения биологической дозиметрии у разных контингентов облучен

лиц. В отношении пролонгированного облучения показана относите/

невысокая информативность гликофоринового теста и возможш

проведения только групповой биодозиметрии при дозах не менее 1-2 Гр. Та

/

образом, в работе определены ограничения при проведении биологичес дозиметрии на основе гликофоринового теста в случаях острого пролонгированного облучения.

Как известно, эффективность лечения онкологических больных пре: всего определяется стадией заболевания. Формирование групп повышенн риска важно для раннего выявления злокачественных новообразований работе показана целесообразность применения теста для формировании гр; риска в отношении отдаленных (канцерогенных) последствий облучения , целенаправленной первичной профилактики и ранней диагност! онкологических заболеваний.

Положения, выносимые на защиту.

1. Частота N0 мутантных клеток по локусу гликофорина А зави< от возраста контрольных необлученных доноров.

2. Существует зависимость выхода N0 мутантных клеток локусу гликофорина- А от дозы острого облучения. Выход I мутантных клеток составляет 32.2 х 10"6 клеток при увеличении до на 1 Гр.

3. Существует дозовая зависимость для образования > мутантных клеток при пролонгированном облучении. Вых мутантных клеток в этом случае составляет 9.5x10-6 клеток/Гр , ч примерно в 3 раз ниже, чем при остром облучении.

4. Использованный нами вариант гликофоринового метода позволяет проводить групповую биологическую дозиметрию при остром облучении, начиная с 30-50 сГр, при пролонгированном - 1-2 Гр.

5. Статистически значимое увеличение частоты N0 мутаптных клеток у больных раком гортани и гортаноглотки до начала лечения по сравнению с контрольными донорами делает гликофориновып метод перспективных! при формировании групп риска в отношении онкологических заболеваний.

Апробации работы. Основные положения диссертации представлены на третьем съезде по радиационным исследованиям (Москва, 1997 г.), на международной конференции по биодозиметрии и ЭПР-спектроскопии (Москва-Обнинск 1993 г.) л на международном конгрессе "Энергетнка-3000" (Обнинск, 1998).

Диссертационная работа апробирована на конференции экспериментального сектора МРНЦ РАМН 26 апреля 2000 г. Пуоликаиии. По материалам диссертационной работы опубликовано Э научных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 106 страницах машинописного текста, содержит 12 рисунков, 11 таблиц, состоит из введения, 4-х глав, заключения и выводов. Список литературы включает 79 наименований, из них 62 иностранных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для проведения анализа пригодны образцы крови только гетерспиготных по локусу гликофорина А доноров, которые составляют около 50% пепуляции.

На поверхности эритроцитов гетерозиготных доноров представлены о( аллельные формы гликофорина А - N и М. Поэтому на первом этапе работ проводили фенотипирование крови здоровых доноров и больных методе 'агглютинации эритроцитов в присутствии антител к М - и N-фори гликофорина A (Orto Diagnostic Systems Inc.,USA). Из 250 обследованных л^ гетерозиготными по локусу гликофорина А оказались 127 человек, у которых дальнейшем была определена частота мутантных клеток.

29 человек составляли контрольную группу. Обследовано также 12 ли получивших острое облучение в течение нескольких часов, 67 человек пролонгированным облучением в течение нескольких недель или лет, из них i ликвидаторов аварии на ЧАЭС. Данные физической дозиметрии ликвидаторе аварии на ЧАЭС получены из справок, выданных дозиметрической службс "Укрытие". Для остальных облученных лиц были известны результат физической дозиметрии (для 72%) или дозы, вычисленные на основаш кариологического анализа вскоре после облучения (для 28%).

19 больных раком гортани и гортаноглотки из отделения лучевого хирургического лечения заболеваний верхних дыхательных путей МРН РАМН обследовались до лечения. По данным анамнеза и опроса, больные i имели ранее контакта с ионизирующим излучением или другил. генотоксическими факторами на работе или по месту проживания.

Отобранная кровь гетерозиготного фенотипа фиксировалась. Процеду[ фиксации клеток проводили, как описано в работе Langlois et al., 1990. Д этого эритроцитам придавали шарообразную форму и фиксировали формальдегиде. Затем клетки окрашивали высокоспецифичньм моноклональными антителами к М-форме и N-форме, меченны.ч флуорохромными красителями. Моноклональные антитела к М-форме (кле 6А7, International Blood Group Reference Laboratory - IBGRL, UI

предварительно биотинилировали по стандартному протоколу. Антитела к N-форме гликофорина А (клон BRIC 157, IBGRL,UK) конъюгировали с ФИТЦем по стандартному протоколу. Рабочие концентрации подбирали в предварительных экспериментах для каждой партии антител. Окрашенные образцы анализировали на проточном цитофлуориметре FACS Vantage (Becton Dickinson), оборудованном 488 им лазером (Enterprise 621, Coherent Inc.,USA) со скоростью 1500 кл/сек. Мощность лазера составляла 100 mW. Для измерения флуоресценции фикоэритрина использовали узкополосный фильтр 575/26 им, ФИТЦа - 530/30 нм. На основе показателей сзеторассеяння выделяли район неповрежденных эритроцитов, затем анализировали флуоресценцию флуорохромов только в этом районе. Подавляющая часть эритроцитов MN донора связывает оба антитела (анти-М и анти-N). Небольшое число клеток в контрольном образце связывает только антиМ- антитела. Это мутантные NO-- и NN-клетки. Интенсивность их флуоресценции по фикоэритрину составляет не более 1% от интенсивности флуоресценции эсновной массы MN-клеток. В то же время по ФИТЦу NN- клетки флуоресцируют примерно в 2 раза интенсивнее, чем N0- или MN-клетки. Эти 2 факта и определяют принципы компьютерной обработки данных и построение шалитических регионов при определении частоты мутантных N0 и NN слеток. Частота мутантных клеток определяется как соотношение числа клеток I аналитическом регионе N0 или NN к общему числу клеток в регионе MN. Соличество проанализированных клеток составляло 1-2x106 (2-4 файла по х105 клеток в каждом).

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программ îraf4win (Golden Software, Inc.) и Origin (Microcal Software, Inc.). Рассчитывали остоверность различий, используя критерии Стьюдента и Менн-Уитни /рбах, 1964).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На первом этапе работы проведена оценка воспроизводимс результатов определения частоты мутантных Nßf и NN клеток у двух доно| Выполнение такого исследования позволяет оценить точность и надежн< метода, от которых в конечном итоге, зависит способность метода выяв; генетические эффекты облучения. С целью изучения воспроизводимс результатов кровь доноров подвергали многократному анализу (в средне раз в 5-7 дней, всего 6-14 раз). Частота N0 вариантных эритроцитов в кр одного донора составила (12.8 ± 3.4) -10'6 (среднее ± стандартное отклонен частота NN эритроцитов - (31.8 ± 6.7) - 10'6. У другого донора-(10.3 ±5.8)-для N0 -клеток, (4.4 ± 2.2) -10'6 для NN-клеток соответственно. Получен! результаты достаточно хорошо согласуются с данными других авторо внутрииндивидуальной вариабельности N0 и NN клеток (Langlois et al.,H Jensen et al., 1996).

Зависимость выхода мутантных гликофориновых клеток от возра контрольных доноров. Была исследована зависимость частоты мутант! эритроцитов от возраста в группе необлученных доноров от 13 до 57 j Частота N0 мутантных клеток увеличивалась с возрастом в среднем приме] на 3% в год от исходного значения, коэффициент корреляции составил С (таблица 1). Частота NN клеток не коррелировала с возрастом (г=0.13). Таблица 1. Частота вариантных эритроцитов в зависимости от возрос

Вид мутаций Число доноров Возраст доноров, ■ лет Параметры линейной регрессии Y=a + ЬХ г Р

а b

N0 мутации 26 13-57 6.1-10"6 0.20-10"6 0.47 0.01

NN мутации 26 13-57 4.2-10"6 0.15-10"6 0.13 0.34

По данным других авторов увеличение частоты N0 мутантных клеток :оставляет 1-2% в год (Cole, 1993). Достоверного увеличения с возрастом шстоты NN клеток не было обнаружено ни в нашей, ни в других работах Menichine et al., 1991, Kyoizuini et al., 1996).

JamicH.MOcTb частоты мутантных клеток от дозы острого облучения. При

»спользопании метода п целях биологической дозиметрии представляется фезнычайно важным предварительно провести сопоставление параметров laniiciiMOCTH доза-эффект, полученных в разных лабораториях у разных сонтингентов облученных. С этой целью была определена частота зариантных |ритроцитов у 12 лиц, подвергшихся действию острого облучения в результате ¡варий на различных предприятиях атомной промышленности. Для построения рафика была также использована контрольная группа з составе 17 человек ходпого возраста. Полученные данные представлены на рисунке 1 и в таблице

'исунок /. Зависимость частоты мутсштных клеток по локусу чикофорина А от дозы острого облучения.

150 0

Э

I

О

□

0.0

л

0.0

1 о

2.0

3.0

4.0

Доза, Гр

Таблица 2. Параметры линейной регрессии при остром облут (У=А+ВХ).

Мутантные клетки Свободный член (А) ± sd Наклон регрессии (В) ± sd Коэффициент корреляции (г) Р

NGT 12.6 ±2.6 32.2 ±2.7 0.92 <0.0001

NN 16.4±7.9 0.87±8.2 0.02 0.92

Линейная модель выбрана для удобства сравнения полученных в да! работе результатов с литературными данными, т.к. именно этой моде пользовалось большинство исследователей. Наблюдалась высокая кор'рел: частоты N0 клеток с дозой у - облучения, независимо от времени, прошедг после окончания облучения. Эти результаты подтверждают данные др; авторов, исследовавших случаи острого облучения в японской попул; жертв атомной бомбардировки Хиросимы и в группе ликвидаторов авари ЧАЭС с острым радиационным синдромом (Jensen et al.,1995, Kyoizun al.,1989) (p: ' гок 2).

Для NN мутантных клеток этой корреляции не наблюдалось.

Таким образом, во-первых, наше обследование лиц, подвергш острому облучению свыше 10 лет тому назад, подтвердило данные способности радиационно-индуцированных гликофориновых мутг сохраняться в организме продолжительное время (Langlois et al., 1987). Во-вторых, только частота N0, но не NN вариантных эритроцитов коррелиро с дозой облучения. В-третьих, прирост частоты N0-icaeTOK на единицу i был близок во всех проведенных исследованиях, в том числе и в Hai несмотря на относительно небольшое количество доноров, обследован нами (рисунок 2). Это свидетельствует о высокой надежности воспроизводимости метода.

Рисунок 2. Зависимость частоты муташппых клеток по локусу гликофориш А от дозы острого облучения по данный разных авторов.

Доза, Гр

Kyoizumi et al., 1989, Y= 27.0+34.0 X Jensen et al., 1995, Y= 16.0+27.0 X Представленная работа, Y=12.6 +32.2 X

Зависимость частоты мутаптных клеток от дозы пролонгированной облучения. Результаты обследования 67 облученных лиц представлены н; рисунке 3. Наблюдается корреляция с дозой облучения только частоты N6 мутантных клеток.

Рисунок 3. Зависимость частоты мутантных по локусу гликофорипа / клеток от дозы пролонгированного облучения.

Доза, Гр

В случае пролонгированного облучения наклон дозовой зависимости примерно в 3 раза ниже, чем при остром облучении. Таблица 3 показывает результаты статистической обработки параметров линейной регрессии. Обращают на себя внимание лица, получившие облучение в очень высоких дозах, более 10 Гр. Частота мутантных клеток у этих лиц по существу определяет наклон дозовой зависимости, поэтому точность физической дозиметрии имеет в данном случае особенно важное значение. Указанные лица входят в состав специальной группы по изучению остатков высокорадиоактивных материалов, находящихся под саркофагом разрушенного реактора в Чернобыле. Физическая дозиметрия у них была

проведена с помощью индивидуальных карманных кварцево-волоконных дозиметров. Кроме того, для этих лиц известны данные биологической дозиметрии по хромосомным аберрациям и ЭПР-спектрометрии (Беуап'каеу е1 а!.1995), которые практически совпадают друг с другом и с результатами физической дозиметрии.

Таблица 3. Параметры линейной регрессии при пролонгированном облучении (У=А+ВХ).

Мутантные клегки Свободный член (А) = sd Наклон регрессии (B)isd Коэфшшент I р корреляции 1 (г! I

NN клетки 10.5=1.7 0.14±0.6 0.02 | o.s: 1

N0 клетки 17.5±2.1 9.6±0.9 0.75 <0.0001

В литературе имеются ограниченные данные по зыходу гликофориновых мутаций в зависимости от дозы при пролонгированном облучении. В 1995 году группа Jensen et al. опубликовала данные по частоте мутантных клеток у 23 ликвидаторов аварии на ЧАЭС. облученных в интервале до 1 Гр. Выход N0- мутаций в этой работе составлял 4.1x10"6 клеток на 1 Гр (р=0.3). В 1997 году Tucker et al. также использовали линейную модель для оценки выхода мутантных клеток у 27 человек с дозами до I Гр. В этой работе выход составил 12.2x10"6 клеток на 1 Гр при достаточно высоком р=0.06. По данным Рождественского и др. 1998, линейный прирост частоты N0 вариантных клеток . у облученных в дозах 0.22-0.58 Гр составляет 2.3-10"6 клеток/Гр при р > 0.05, что ставит под сомнение наличие самой дозовой ?ависимости. Таким образом, в нашей работе впервые статистически дестоверно определены параметры-линейной зависимости доза-эффект при фолонгированном облучении в широком интервале доз.

Для частоты NN-Мутантных клеток корреляции с дозой при

пролонгированном облучении не наблюдалось, что согласуется с результатаг других авторов (Jensen et al. 1995).

Наибольший интерес вызывает влияние малых доз ионизируют

радиации на возникновение гликофориновых мутации, т.к. подавляющ

большинство населения загрязненных районов живет в таких условия

Большинство обследованных (57 лиц из 67 ) облучено в относителы

небольших дозах (до 0.25 Гр). Эту подгруппу составили ликвидаторы авар!

на ЧАЭС. Проведено сравнение частоты мутантных клеток в данн<

подгруппе и у контрольных доноров сходного возраста (таблица 4). Среди

частота Ы0-мутантных клеток у ликвидаторов аварии на ЧАЭС состави.

21.2x10"6, у контрольных лиц - 17.2x10"6. Однако расчеты по критерию Мен

Уитни свидетельствуют об отсутствии статистически значимых различий.

Таблица 4. Сравнение частоты мутантных клеток у ликвидаторов aeapi на ЧАЭС, получивших дозы менее 0.25 Гр, и контрольных лиц сходно, возраста.

Доноры Число доноров Процент курящих Пол (процент мужчин) Возраст, годы Частота мутантных клеток хЮ'6

Среднее Диапазон Мутации Среднее Диапазон Г

Контроль 21 56.3 75.0 40.7 30-57 N0 17.2 4.0-74.0

NN 11.5 1.0-31.8

Ликвидаторы 57 72.2 91.7 45.7 32-68 N0 21.2 1.0-110.0 >0.5

NN 10.9 0.0-110.3 >0.5

Результаты всех исследований частоты мутантных клеток по локусу гликофорина А у лиц, пролонгировано облученных в относительно небольших дозах до 0.25-0.50 Гр, свидетельствуют об отсутствии статистически значимого увеличения этого показателя по сравнению с контрольным уровнем (Веремеева, 1996, Аклеев и др., 1998, Inskip et al., 1997, Bigbee et al., 1997, Tawn et al., 1997, Tucker et al., 1997). По-видимому, это связано с относительно небольшой чувствительностью гликофоринового метода, особенно в случае пролонгированного облучения.

В подгруппе ликвидаторов, облученных в дозах до 0.25 Гр, отмечено наличие лиц с повышенной частотой гликофориновых мутаций (более 30x10"6) Среди контрольных лиц они составляют около 5%, среди ликвидаторов - около 15%. Однако, м по этому критерию (по частоте встречаемости доноров с большим числом мутаций) статистически значимой разницы между группами не отмечено. Наличие среди ликвидаторов лиц с высокими частотами мутантных клеток, может быть частично обусловлено предполагаемым нелинейным характером выхода цитогенетических повреждений в зависимости от мощности дозы в области малых доз облучения. Полученные нами результаты подтверждают предположение, что зависимость выхода частоты мутантных клеток от мощности дозы может носить нелинейный характер. Показанная нами форма зависимости мощность-эффект хорошо согласуется с представлениями Е.Б. Бурлаковой, которая полагает, что существуют такие мощности и/или дозы облучения, которые не сопровождаются включением деполнительной системы восстановления, или она включается с большой (адержкой. В этом случае должен существовать такой интервал низких доз или 1изких мощностей облучения, где реализуется большая доля полученных ювреждений, т.е. эффект растет, достигает максимума, а затем уменьшается Бурлакова и др., 1999).

Повышенная частота мутантных по локусу гликофорнна А клеток ка возможный критерий для формирования группы риска онкологически больных. Известные в настоящее время данные об определяя!щей рил мутаций клеточного генома в злокачественной трансформации клеи позволяют предполагать, что при оценке отдаленных канцерогешп. последствий облучения следует учитывать частоту мутаций в генах, сиязаннь со злокачественным перерождением. Однако, число онко- и антионкогсш достаточно велико, а методы определения мутаций в таких генах досгаюч! дороги, сложны и поэтому не пригодны для проведения гюпуляцноинь исследований. В то же время, если считать, что мутации возникают, основном, случайным образом во всех генах, то относительное колнчесп клеток с любым мутированным геном может отражать общий уроне! мутагенеза в организме. Поэтому определение частоты мутаций даже в гене не связанных непосредственно с канцерогенезом, может быть полезно л индивидуальной оценки канцерогенного риска (например, после облучени Чтобы косвенно проверить это предположение была оценена часто гликофориновых мутаций у 19 онкологических больных до лечения сравнении с контрольными донорами (21 человек). Результаты представлены таблице 5 и на рисунке 4. Из таблицы 5 видно, что средняя частота мутантш N0 эритроцитов у онкологических больных существенно выше, чем контрольных доноров (р<0.05, критерий Менн-Уитни). По литературш данным частоту мутантных клеток (Накоп е( а1., 1997, В1§Ьее ее а1., 1998) бо; 30-10"6 следует признать повышенной. В случае онкологических больных 11 19 значений для N0 эритроцитов, что составляет 59 %, являют повышенными по указанному критерию. В контрольной группе это чис значительно ниже (5%).

Рисунок 4. Сравнение частот N0 вариантных эритроцитов для групп онкологических больных и здоровых допоров.

О

о. о

X

о

О с о

3"

10

9 8 — 7 — 6

5

4 — 3

2 Ч 1

о

10 9

8 — 7 — 6 — 5 — А — 3 — 2 — 1

Здоровые доноры

N=21

20 40 50

1 СО 120 140

Онкологические больные до лечения

N=19

I

I

0 20 40 60 80 100 120 140 240 260 280

Частота клеток-вариант по локусу гликофорина А , 10-®

Таблица 5. Частота мутаитных эритроцитов по локусу гликофорииа , у онкологических больных и контрольных доноров.

Категория обследован пых Вид мутатных клеток Количество Возраст (годы) Частота N0 мутантных клсюк (•' О"6)

среднее диашпон

Контроль N0 21 30-60 17.2 4.0-7-4.0

Больные N0 19 25-70 50.9 6.0-260.0

Контроль NN 21 30-60 10.5 1.0- 31.8

Больные NN 19 25 -70 23.5 0.0- 1 <111 0

В отношении частоты NN клеток статистических различий между двум группами не выявлено (р>0.05).

Увеличение частоты клеток, несущих мутации в генах, не связанны: непосредственно с канцерогенезом, у онкологических больных по сравнении со здоровыми лицами, очевидно обусловлено несколькими причинами Поскольку большинство мутагенов являются также и канцерогенами повышенная частота мутаций, может свидетельствовать о генотоксическо? воздействии на данный организм в прошлом, а, следовательно, указывать и н; повышенную вероятность возникновения злокачественных новообразований ; таких лиц. С другой стороны, повышенная частота мутаций может быт! обусловлена и наследственными особенностями генома, приводящими к еп нестабильности, что увеличивает риск возникновения опухолей, как показан* для больных атаксией телеангиектазией, синдромом Блума, анемией Фанкош (Ьа^Ыэ е1 а1., 1989, Куо1гшш е1 а1., 1989). Интересные в этом отношенш данные получены группой японских ученых, обследовавших лиц, переживши? атомную бомбардировку в Хиросиме (Куо1гипи е1 а1., 1996). Авторь определили зависимость частоты мутантных клеток по локусу гликофорина А

от дозы облучения в двух группах: 1) лица с выявленными онкологическими заболеваниями; 2) лица без онкологических заболеваний. Оказалось, что выход мутантных клеток на единицу дозы у онкологических больных был в 2 раза выше, чем у лиц без онкологических заболеваний.

Таким образом, исходя из собственных и литературных данных, использование гликофоринового метода определения мутантных клеток представляется перспективным для формирования группы риска в отношении онкологических заболеваний с целью последующего наблюдения и контроля. Кроме того, формирование группы лиц с повышенными частотами по локусу гликофорина А до начала профессионального облучения помогло бы выявить людей, непригодных по наследственным особенностям для работы в условиях, связанных с генотоксическим действием различных агеитоз.

ВЫВОДЫ:

1. В работе подтверждено наличие возрастной зависимости выхода N0 мутантных клеток по локусу гликофорина А, который увеличивается приблизительно на 3% в год от исходного уровня.

2. Выход N0 мутантных клеток по локусу гликофорина А от дозы острого облучения составляет 32.2 х 10'6 клеток при увеличении дозы на 1 Гр. Параметры линейной регрессии, установленные в настоящей работе, мало отличаются от значений, установленных независимо в разных лабораториях для разных контингентов облученных людей, что свидетельствует о высокой надежности и воспроизводимости метода.

3. Показано наличие дозовой зависимости частоты образования N0 мутантных клеток при пролонгированном облучении. Выход мутантных клеток в этом случае составляет 9.6x10"* клеток/Гр , что, примерно, в 3 раза ниже, чем при остром облучении.

4. Использованный нами вариант гликофоринового мет позволяет проводить групповую биологическую дозиметрию I остром облучении, начиная с 30-50 сГр, при пролонгированном -Гр.

5. Показано статистически значимое увеличение частоты мутантных клеток у больных раком гортани и гортаноглотки сравнению с контрольными донорами, что делает гликофорино! метод перспективным для прогнозирования канцероген! последствий облучения и формирования группы риска в отноше! онкологических заболеваний.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИ1

1. Замулаева И. А., Селиванова Е. И., Нугис В. Ю., Надежина Н. М., Матв« Н.П., Каплан М. А., Саенко А. С. Использование метода определения мута по локусу гликофорина А для биологической дозиметрии острого пролонгированного облучения// 3-ий съезд по радиационным исследовани: Тез. докладов., Пущино.-1.997.-Т.2 - С.49-50.

2. Саенко А. С., Замулаева И. А., Смирнова С. Г., Орлова Н. В., Селиванов И., Матвеева Н.П., Каплан М. А., Цыб А. Ф. Определение частоты мутацш локусам гликофорина А и Т-клеточного рецептора: обследование ликвидатс аварии на ЧАЭС// Радиобиология и Радиоэкология.-1998.-Т.З8.-№2.-С. 171-1

3. Саенко А. С.,'Замулаева И. А., Смирнова С. Г., Орлова Н. В., Селиванов И., Нугис В. Ю., Надежина Н. М. Определение частоты мутаций по локу гликофорина А и Т-клеточного рецептора: информативность биологической дозиметрии острого и пролонгированного облучен Радиобиология и Радиоэкология.-1998.-Т.38.-№2.- С.181-190.

4. Замулаева И. А., Смирнова С. Г., Орлова Н. В., Селиванова Е. И., Саеню С. Выявление лиц с повышенной частотой мутаций в соматических клетках

возможный способ отбора лиц, непригодных к работе , связанной с профессиональным облучением// Тезизы международного конгресса "Энергетика-3000". Обнинск,-1998.-С.70.

5.Selivanova Е. I. Application of registration'of Glycophorin A locus mutations for biodosimetry// Тезизы международного конгресса Энергетика -3000. Обнинск,-1998,- С.77.

5. Saenko A. S., Zamulaeva I.A., Smirnova S. G., Orlova N. V., Selivanova E. I., vlatveeva N.P., Kaplan M.F., Nugus V.Y., Tsyb A.F. Determination of somatic nutation frequencies of Glycophorin A and T-cell receptor loci for biodosimetry of icute and prolonged irradiation// Astracts of international conference on liodosimetry and 5 International symposium on ESP dosimetry and application. 4oscow/Obnisk.-1998.- P.76.

. Saenko A. S., Zamulaeva I.A., Smirnova S. G., Orlova N. V., Selivanova E. 1., latveeva N.P., Kaplan M.F., Nugis V.Y., Tsyb A.F. Determination of somatic îutation frequencies of Glycophorin A and T-cell receptor loci for biodosimetry of rolonged irradiation// Int.J. of Radiation Biology.-1998.-V.73.-№6.- P.613-618. Saenko A. S., Zamulaeva I.A., Smirnova S. G., Orlova N. V., Selivanova E. I., latveeva N.P., Kaplan M.F., Nugis V.Y., Nadezhina N.M., Tsyb A.F. Determination somatic mutant frequencies at glycophorin A and T-cell receptor loci for odosimetry of acute and prolonged irradiation// Applied Radiation and Isotopes.-I00.-V.52.-'P. 1145-1148.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Селиванова, Елена Ивановна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Методы биологической дозиметрии.

1.2 Метод определения клеток, мутантных по локусу гликофорина А.

1.2.1 Характеристика гликофорина А и его М и N аллельных форм.

1.2.2 Разные способы определения мутантных по локусу гликофорина А клеток.

1.2.3 Уровень частоты мутантных клеток у контрольных доноров.

1.2.4 Использование гликофоринового теста в биологической дозиметрии острого радиационного воздействия.

1.2.5 Пролонгированное облучение и уровень мутантных клеток по локусу гликофорина А.

1.2.6 Определение уровня мутаций в соматических клетках с целью оценки риска онкологических заболеваний.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Доноры.

2.2 Фенотипирование крови доноров.

2.3 Фиксация клеток.

2.4 Иммунофлуоресцентное окрашивание фиксированных эритроцитов и их анализ. Подбор оптимальных условий протекания реакции.

2.5 Приготовление биотинилированных антител.

2.6 Проверка качества биотинилирования.

2.7 Приготовление антител, меченных ФИТЦ.

2.8 Проверка качества конъюгирования антител.

2.9 Статистическая обработка результатов.

ГлаваЗ. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Воспроизводимость лабораторного контроля.

3.2 Зависимость выхода мутантных по локусу гликофоринаА эритроцитов от возраста контрольных доноров.

3.3 Зависимость частоты мутантных клеток от дозы острого облучения.

3.4 Зависимость частоты мутантных клеток от дозы пролонгированного облучения.

3.5 Частота мутантных клеток по локусу гликофорина А у онкологических больных.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

4.1 Анализ распределения эритроцитов по экспрессии М-формы гликофорина А.

4.2 Частота мутантных клеток в различных популяциях необлученных контрольных доноров.

4.3 Влияние острого облучения на уровень мутантных клеток по локусу гликофорина А.

4.4 Влияние пролонгированного облучения на уровень мутантных клеток по локусу гликофоринова А.

4.5 Повышенная частота мутантных по локусу гликофорина А клеток как возможный критерий для формирования группы риска онкологических заболеваний.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование частоты мутантных по локусу гликофорина A клеток у лиц, подвергшихся действию ионизирующего излучения"

С момента открытия мутагенного действия ионизирующих излучений на живые организмы Меллером в 1927 году прошло немало времени, но проблема воздействия радиации стоит сейчас еще острее, чем прежде. Человечество реально вступило в эпоху практического применения ядерной энергии и катастроф, с ней связанных. При этом возникла острая необходимость решения таких жизненно важных проблем, как влияние повышенного фона радиации и других мутагенных факторов окружающей среды на наследственность человека; оценка влияния малых доз и отдаленных последствий облучения, как фактора, вызывающего злокачественное перерождение клеток и т. д. После аварии на ЧАЭС проблема особенно обострилась в связи с настоятельной необходимостью ретроспективной оценки накопленных доз в различных популяциях облученных людей - ликвидаторов аварии и жителей загрязненных радионуклидами территорий.

Традиционный для биодозиметрии метод - оценка нестабильных хромосомных аберраций - позволяет оценить поглощенную дозу в короткие сроки после облучения. Для оценки радиационного воздействия в отдаленные сроки более перспективными являются методы, основанные на выявлении стабильных мутаций в геноме. К их числу следует отнести методы дифференциальной окраски хромосом и флуоресцентной in situ гибридизации, позволяющие выявлять стабильные структурные мутации и ряд тестов, выявляющих мутации по отдельным генным локусам. В качестве материала для этих тестов используются клетки крови. Несомненно метод определения мутантных по локусу гликофорина А клеток является одним из наиболее перспективных в этом отношении, поскольку мутации по этому локусу способны сохраняться и даже накапливаться в течение всей жизни человека (Langlois R.G., Begbee W.L., 1987.). Кроме того, к преимуществам метода следует отнести то, что он выполняется на эритроцитах и для исследования необходимо всего 0,1 мл периферической крови, т.е. проблема доступности биоматериала решается легко. Анализ производится на проточном цитофлуориметре, что делает метод высокотехнологичным и позволяет избегать рутинных и малопроизводительных методик. Возможность использования гликофоринового теста с целью биодозиметрии исследована американскими и японскими учеными у лиц, переживших атомную бомбардировку (Langlois R.G. et al, 1987, Bigbee W.L. et al, 1990, Akiyama M. et al, 1991). Ими показано, что число мутантных клеток, выявленных данным методом, положительно коррелирует с дозой, полученной при остром облучении. Генотоксическое действие пролонгированного облучения представляется практически неизученным, несмотря на его актуальность.

Цель и задачи исследования:

Целью работы является оценка информативности гликофоринового теста для биодозиметрии и биоиндикации у людей при пролонгированном облучении в сравнении с острым облучением.

Для этого предполагалось решить следующие задачи: -проанализировать уровень мутантных клеток по локусу гликофорина А у лиц, подвергшихся острому облучению, и оценить зависимость этого параметра от дозы острого облучения; -определить частоту мутантных клеток по локусу гликофорина А после пролонгированного облучения, оценить зависимость этого параметра от дозы облучения;

-сравнить информативность метода при остром и при пролонгированном облучении;

-исследовать возможность использования гликофоринового метода для индивидуальной оценки риска отдаленных (канцерогенных) последствий облучения и формирования групп риска в отношении онкологических заболеваний.

Заключение Диссертация по теме "Радиобиология", Селиванова, Елена Ивановна

ВЫВОДЫ:

1. В работе подтверждено наличие возрастной зависимости для выхода N0 мутантных клеток по локусу гликофорина А для контрольных доноров, который составляет около 3% в год от исходного уровня.

2. В работе определена зависимость выхода N0 мутантных клеток по локусу гликофорина А от дозы острого облучения. Выход N0 мутантных клеток составляет 32.2 х10~6 клеток при увеличении дозы на 1 Гр. Параметры линейной регрессии, установленные в настоящей работе, мало отличаются от значений, установленных независимо в разных лабораториях, что свидетельствует о высокой надежности и воспроизводимости метода.

3. Установлено наличие дозовой зависимости для образования N0 мутантных клеток при пролонгированном облучении. Выход

Заключение

Выполненные в данной работе исследования направлены на решение актуальной проблемы современной радиобиологии и радиационной медицины - разработку методов биоиндикации и биодозиметрии в отдаленные сроки после действия ионизирующей радиации. С этой целью проведена оценка информативности метода определения клеток мутантных по локусу гликофорина А при остром и пролонгированном облучении.

Данный метод предполагает использование проточного цитофлуориметра, что делает его высокотехнологичным и позволяет избежать рутинных методик. Современный прибор и использование моноклональных антител, меченных флуорохромами, позволило выявлять достаточно редкие события (2-4 мутантных клетки на 105 нормальных клеток) и оперативно обследовать поступающий материал.

В ходе выполнения работы была определена фоновая частота N0 и NN мутантных клеток по локусу гликофорина А у необлученных доноров. Эти данные послужили контролем для последующей работы по выявлению мутантных клеток у облученных лиц.

В результате обследования лиц, подвергшихся острому облучению более 10 лет тому назад, были подтверждены данные о сохранении радиационно индуцированных гликофориновых мутаций в организме продолжительное время. Более того, наши результаты определения зависимости доза - эффект хорошо согласуются с данными, полученными в других лабораториях мира при обследовании сходного контингента.

При обследовании лиц с пролонгированным облучением было показано, что выход N0 мутантных клеток на единицу дозы в 3-5 раз ниже, чем при остром облучении. Это приводит к уменьшению чувствительности гликофориного метода при проведении биологической дозиметрии пролонгированного облучения по сравнению с острым облучением, учитывая значительные колебания индивидуальных значений частоты мутантных клеток у контрольных лиц и различия в индивидуальной реакции на облучение. Потому существенно ухудшаются возможности использования этого метода в целях индивидуальной биологической дозиметрии. В представленной работе исследована зависимость частоты мутантных клеток от мощности облучения в двух достаточно узких диапазонах доз и показано, что эта зависимость может быть немонотонной.

Результаты определения частоты мутантных клеток у онкологических больных свидетельствуют о перспективности использования данного метода для выделения группы риска в отношении онкологических заболеваний с целью последующего наблюдения и контроля. Данный метод также может применяться для выявления лиц, непригодных по индивидуальным особенностям генома для работы в условиях, связанных с генотоксическим действием различных агентов.

Таким образом, в данной работе рассмотрены широкие возможности использования теста, выявляющего мутации по локусу гликофорина А, метода относительно нового и в нашей стране практически невыполняемого .

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Селиванова, Елена Ивановна, Обнинск

1. Аклеев А.В., Веремеева Г.А., Куоизуми С. Влияние хронического радиационного воздействия на уровень соматических мутаций в клетках периферической крови людей в отдаленные сроки// Радиационная биология. Радиоэкология -1998.-T.38.-N4.-C.573-586.

2. Бурлакова Е.Б., Голощапов А.Н., Жижина Г.Н., Конрадов А. А. Новые аспекты закономерностей действия низко интенсивного облучения в малых дозах // Радиационная биология. Радиоэкология -1999.-Т.39.-N1.-C.26-35.

3. Веремеева Г.А. Влияние хронического радиационного воздействия на уровень соматических мутаций в клетках периферической крови людей в отдаленные сроки. Автореферат кандидатской диссертации.- Москва. -1996.

4. Воробцева И.Е., Дженсен Р., Евстратов И.Е. и др. Биологическая дозиметрия и реконструкция доз облучения: реальность и перспектива // Вестник новых медицинских технологий.-1996.-T.3.-N 2. -С.9-22.

5. Имянитов Е. Н., Князев П.Г. Роль антионкогенов в опухолевом процессе // Эксперим. Онкология.-1991.-Т.14.-С.З-18.

6. Имянитов У.Н., Комочков И.В., Лыщев А.А., Того А.В. Молекулярная и клиническая онкология: точки соприкосновения // Экспериментальная онкология.-1993.-Т. 15.-С.З-8

7. Ленц. Медицинская генетика. Медицина. Москва.- 1984.тС.59.

8. Лихтенштейн А.В., Шапот B.C. Опухолевый рост: ткани, клетки, молекулы //Пат. физиол. Экспер. Тер.- 1998.-N3.-C.25-41.

9. Ю.Мораска, Эрба. Проточная цитометрия // Культура животных клеток. Методы (под ред. Фрешни). Мир.-1989.-С. 182-211.

10. П.Рождественский Л.М., Окладникова Н.Д., Смирнова и др. Оценка уровня мутаций в локусе гликофорина А у лиц, подвергавшихся хроническому воздействию ионизирующей радиации // Радиационная биология. Радиоэкология.- 1998.-T.38.-N3.-C.443-450.

11. Севанькаев А.В., Саенко А.С. Соматический мутагенез как биологический дозиметр радиационного воздействия // Радиационная биология. Радиоэкология.- 1997.-T.37.-N4.-С.560-565.

12. Севанькаев А.В., Насонов А.П. Биологическая дозиметрия по хромосомным аберрациям в культуре лимфоцитов человека // Обнинск.-1979.

13. Сугахара Т., Ватанате М., Нива О., Никайдо О. Новое в концепции радиационного канцерогенеза // Мед. Радиология и Радиацион. Безопастность.-1995.-Т5.-С.57-60.

14. Урбах В.Ю. Биометрические методы // "Наука".- Москва.-1964.-С.247-250.

15. Akiyama М., Kyozumi S, Hirai Y et al. Studes on chromosome aberrations and HPRT mutations in lymphocytes and GPA mutation in erythrocytwes ol atomic bomb survivors // Mut. and the Envir.-1990.-partC.-P.69-80.

16. Akiyama M., Nakamura N.,Hakoda M. et al. Somatic cell mutations in Atomic Bomb survivors // Radiat. Res., Supplement. -1991.-P.278-282.

17. Akiyama M., Kusunoki Y.,Umeki S. et. al.Evaluation of four somatic mutation assays as biological dosimeter in humans // Radiation Research.-1992.-V.il. -P. 177-182.

18. Akiyama M., Kyoizumi S., Hirai Y et al. Mutation frequency in human blood cells increase with age // Mutation Res.-1995.-V.338. -P.141-149.

19. Akiyama M, Umeki S, Kusunoki Yet. al. Somatic-cell mutation as a possible predictor of cancer risk//Health Phys.-1995. -V. 68(5). -P.643-649.

20. Aklyev A.V., Kossenko M.M., Silkina et al. Health effects of radiation incidents in the Southern Urals // Stem cells -1995 -V.13- Suppl.-P.58-68.

21. Albertini R. J. Somatic gene mutations in vivo as indicated by the 6-thioguanine-resistant T-lymphocytes in human blood // Mutation Res.-1985.-V.150.-P.411-422.

22. Albertini R.J., Sullivan L. M., Berman J.K.et al. Mutagenicity monitoring in humans by autoradiographic assay for mutant T lymphocytes // Mutation Res.-1988. -V.204. -P.481-492.

23. Albertini R.J., Nickas J.A., Robison S.H. et al. Human environmental monitoring using in vivo somatic cell gene mutations as indicators of adverse effects // Environ, and Mol. Mutagen.-1990.-V.15.-N17-1990.

24. Anstee D.J. Blood group MNS-active saloglycoproteins of the human erythrocyte membrane. Immunobiology of erythrocyte. (Sandler S.G.,Nusbacher J.,Schanfield M.S.,Ed.) New York.- 1980-p.67.

25. Arlett C. F., Lehmann A. R. Human disorders showing increased sensitivity to the induction of genetic damage // Annu. Rev. Genet.- 1987.-V.12.- P.95-115.

26. Awa A. A. Persistent chromosome aberration in the somatic cells of A-bomb survivors, Hiroshima and Nagasaki // J. Radiat. Res.- 1991 -Y.32. P.265-274.

27. Awa A. A, Neriishi S., Honda T. et al. Chromosome aberration frequency in cultured blood-cells in relation to radiation dose of A-bomb survivors // Lancet. -1971-V.2.-P.903-905.

28. Awa A.A., Sofuni Т., Honda T.et al. Relationship between the radiation dose and chromosome aberrations in atomic bomb survivors of Hiroshima and Nagasaki // J. Radiat. Res.-1978-V.19.-P.126-140.

29. Awa A. A., Ohtaki K., Iton M.et al. Chromosome aberration data for A-bomb dosimerty reassessment // New Dosimetry at Hiroshima and Nagasaki and Its Implications for Risk Estimates.-1988.-N9.-P. 185-202.

30. Bender M.A., Gooch P.C. Types and rates of X-ray-induced chromosome aberrations in human blood irradiated in vitro // Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.- 1962.-V.48.-N4.-P.522-532.

31. Bigbee W.L.,Langlois R.G., Swift M.et al. Evidence for an elevated frequency of in vivo somatic cell mutations in ataxia telangiestasia // Am. J. Hum. Genet.-1989.-V.44. -P.670-674.

32. BigbeeW.L., LangloisR.G., Stanker L.H. et al. Flow cytometric analysis of erythrocyte populations in Tn syndrome blood using monoclonal antibodies to glycophorin A and Tn antigen // Cytometry.-1990.-V. 11.-P.261-271.

33. Bigbee W.L.,Jensen R.H., Veidebaum T et al. Biodosimetry of Chernobyl cleanup workers from Estonia and Latvia using the glycophorin A in vivo somatic cell mutation assay // Radiat. Research. -1997. -V.147. -P.215-224.

34. Bigbee W.L.,Jensen R.H., Veidebaum T. et al. Glycophorin A biodosimetry in chernobyl cleanup workes from the Baltic countries // В M J.-1996.-V.312.-P. 1078-1079.

35. Bishop J.M. Molecular themes in oncogenesis // Cell.-1991.-V.64.-P.235-248.

36. Cole J., Skopek T.R. Somatic mutant frequency, mutation rates and mutational spectra in the human population in vivo // Mutation Res.-1994.-V.304.-P.33-105.

37. DuPont B.R., Bigbee W.L., Grant S.G et al. Molecular analysis of glycophorin A variant reticulocytes // Environmental and Mol. Mutagen.-1991 .-V. 17.-N. 19.-P.23.(abstract)

38. Ekblom M.,Gahmberg G.G., Anderson L.C. Late expression of M and N antigens on glycoforin A during erytroid differentiation // Blood.-1985.-V.66-P.233-236.

39. Furthmayer, Structural comparison of glycophorins and immunochemical analysis of genetic variants //Nature.-1978.-V.271.-P.519-526.

40. Grant S.G, Bigbee W.L., In vivo somatic mutation and segregation at the human glycophorin A (GPA) locus: Phenotypic variation encompassing both gene-specific and chromosomal mechanisms // Mutation Res.-1993.-V.288.-P.163-172.

41. Gui H.X., Cheng W.Y. Detection of the variant frequency in human erythrocytes using glycophorin A locus mutation assay // Radiat. Prot. Dosimetry.-1998.-V.77.-N.l/2.-P.37-41.

42. Gullick G. The role of epidermal frowth factor receptor and c-erbB-2 protein in breast cancer // Int. J. Cancer.-1990.-N5.-P.55-61.

43. Hagman L.,Brogger A., Hansteen E. et al. Cancer risk in humans predicted by increased levels of chromosomal aberrations in lymphocytes :Nordic study group on the health risk of choromosome damage // Cancer Res.-1994.-V.54.-P.2919-2922.

44. Jensen R.H., Bigbee W.L. Direct immunofluorescence labeling provides an improved method for the glycophorin A somatic cell mutation assay // Cytometry.-1996.-V.23 .-P.337-343.

45. Jensen R.H.,Langlois R.G.,Bigbee W. L.,Grant S.G.,Dan Moorell, Pilinskya M.,Vorobtsova I.,Pleshanov P. Elevated freguency of Glycophorin A mutations in erythrocytes from Chernobyl accident victims // Radiatian Research.- 1995 .-V. 141 .-P. 129-13 5.

46. Jensen R.H., Leary J.F. Mutagenesis as measured by flow cytometry and cell sorting // Flow cytometry and sorting.-1990.-Wiley-Liss,Inc.-P.553-562.

47. Jensen R.H., Langlois R.G., Bigbee W.et al. Laser-based flow cytometric analysis of genotocity of human exposed to ionising radiation during the Chernobyl accident // SPIE, Laser applications in life sciences.-1990.-V.1403.-P.372-380.

48. Kyoizumi S., Nakamura N., Hakoda M. et.al.Detection of somatic mutations at the Glycoforin A locus in erithrocytes of Atomic bomb survivors using a single beam Flow sorter // Cancer Reseach.- 1989.-V.49.-P.581-589.

49. Kyoizumi S., Akiyama M., Cologne J.B. et al. Somatic cell mutations at the Glycoforin A locus in erithrocytes of Atomic bomb survivors: implication for radiation carcinogenesis // Radiat. Res.-1996.-V.146.-P.43-52.

50. Langlois R.G., Bigbee W.L., Jensen R.H. Measurements of the frequency of human erythrocytes with gene expression loss phenotypes at the glycophorin A locus // Hum. Genet.-1986.-V.74.-P.353-362.

51. Langlois R.G., Bigbee W.L., Kyozumi S., Nakamura N., Bean M.A.,Akiyama M., Jensen R.H. Evidence for increased cell mutations at the glycoforin A locus in atomic bomb survious // Science.- 1987.-P.236.

52. LangloisR.G., Nisbet В.А., Bigbee W.L., Ridinger D.N., Jensen R.H. An improved flow cytometric assay for somatic mutation at the Glycoforin A locus in humans // Cytometry.- 1990.-V.11.-P.513-521.

53. Langlois Bigbee W.Z.,Jensen R.M.Flow cytometric characterization of normal and variant cells with monoclonal antibodies specific for glycophorin A // J.Immunol.- 1985.-V.134.-P.4009-17.

54. Livingston G. K., Jensen R.H, Silberstein E.B.et al. Radiobioligical evaluation of immigrants from the vicinity of Chernobyl // Int. J. Radiat. Biol.-1997.-V.72.-N6.-P.703-713.

55. Lloyd D.C., Purrott R.J., Dolphin G.W.et al. The relatioship between chromosome aberrations and low LET radiation dose to human lymphocytes // Int. J. Radiat. Biol.-1975.-V.28.- P.75-90.

56. Lloyd D.C., Purrott R.J., Ruder E.J. The incide of unstable chomocome aberrations in peripheral blood lymphocytes from unirradited and accupationally fxposed people // Mut. Res.-1980.-V.72.-P.523-532.

57. Loken M.R., Shah V.O., Dattilio K.L., Civin С. I. Flow cytometric analysis of human bone marrow. I. Normal erythroid development // Blood. 1987. -V.69. - P.255-263.

58. Maurer J., Janssen J.W.G., Thiel et al., Detection of chimeric BCR-ABL genes in acute lymphoblastic leukemia by the polymerase chain reaction // Lancet.-1991.-V.337.-P. 1055-1058.

59. Menichine P., Abbondandolo A. Somatic gene mutation in Humans // New Horizons in Biological Dosimetry-1991.-P.267-279.

60. Mott G.M., Boyese J., Hewitt M., Radford M. Do mutation at the glycophorin A locus in pacients treated for Hodgkin s disease predict secondary leukaemia?// The Lancet.-1994.-V.343.-P.828-829.

61. Sala-Trepat M., Boyese J., Richard P.et al. Frequency of HPRT-lymphocytes andglycophorin A variants erythrocytes in Fanconi anemia patients, their parents and control donors // Mutation Res.- 1993.-V.289.-P.115-126.

62. Sevan'kaev A.V., Lloyd D.S., Edwards A.A., Moiseenko V.V. High exposures to radiation received by workers inside the Chernobyl sarcophagus // Radiat. Prot. Dosimetry.-1995.-V.59.-N2.-P.85-91.

63. Skvortsov V., Ivannikov A., Stepanenko et. al. Application of EPR retrospective dosimetry for large-scale accidental situation // International

64. Conference on Biodosimetry and 5 Internation Symposium on ESR Dosimetry and Applications.-Moscow/Obninsk.-1998.-P.45.

65. Slamon D.J., Clark G.M., Wong S.G. human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/NEU oncogene //Science.-1987.-V.235.- P. 117-182.

66. Straume Т., Langlois R.G., Lucas J.et al. Novel biodosimetry methods applied to victims of the Goiania accident // Health Physics.-1991.-V.60.-P.71-76.

67. Tates A.D., Bernini L.F., Natariajan A.T.et al. Detection of somatic mutations in man, HPRT mutations in lymphocytes and hemoglobin mutations in erythrocytes // Mutation Res.-1989.-V.213.- P.73-82.

68. Tawn E.J., Daniel C.P., Whitehouse C.A.et al. Advances in the approach to the study of somatic mutations in workes occupationally exposed to ionising radiation // Health effects of low dose radiation.- BNES.- London.-1997.

69. Tomita M, Furthmayer H., Marchesi V.I. Primary structure of human erythrocyte glycophorin A. Isolation and characterization of peptides anc complete amino acid sequence // Biochemestry.-1978.-V.17.-P.4756-4770.

70. Tucker .D.,Tawn E.J.,Holdsworth D. Biological dosimetry of radiatior workers at the Sellafild nuclear facility // Radiation Reseach 148,216-226 1997.