Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование биосинтеза и некоторых физико-химических свойств инулазы Aspergillus awamori BKMF - 2250

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование биосинтеза и некоторых физико-химических свойств инулазы Aspergillus awamori BKMF - 2250"

Р Г 5 СД

~ 5

воронежский государственный университет

На правах рукописи

ТЕРТЫЧНАЯ Татьяна Николаевна

исследование биосинтеза и некоторых физико-хкшмесюк свойств инулазы АзрегдШиз акатоП ВЮ& - 2250 (03.00.04 - биохимия, 03.00.23 - биотехнология)

автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата (Зпологичегасих наук

Вороне» - 1934

Работа выполнена на кафедре биохимии и микробиологии Воронежской государственной технологической академии

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Н.А.Жеребцов Научный консультант: кандидат технических наук,

старший преподаватель 1 О.С.Корнеева

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор В.Р.Шатилов доктор биологических наук, ■ профессор А.В.Веретенников Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский

институт пищевой биотехнологии

Защита состоится "с*?/1 1994 года в__._ часов

на заседании специализированного совета ( К 063.48.14 ) Воронежского государственного университета ( 394693, Воронеж, Университетская площадь, 1 ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВГУ. Автореферат разослан 1994 года .

Ученый секретарь специализированного совета,

кчндилат биологических наук, доцонт Коышеьа

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Мтулльнооть проблем. Ферменты широко используются в народном хозяйстве нашей страны. Особенно актуально их применение в пищевой, легкой промышленности, медицине, генетической инженерии. Ферментные препараты уникальны по своей природе, они позволяют получить продукты высокого качества и с большим выходом.

В исследовании ферментов наиболее актуальными являются такие вопросы, ¡сак расшифровка их структуры; влияние различных физико-химических факторов на конформзшпо этой структуры и связанных с ней механизмов активации и инактивации ферментов; идентификация . функциональных групп их юталитических центроз, расшифровка механизма катализа. Репение этих вопросов имеет парное прагагческо? значение с точки зрения рационального использования ферментных препаратов и интенсификации технологических процессов.

В последние годы возрос интерес к исследованию фермента киу-лазн. Ннулаза (2,1-я- Д - Фруктан-Фруктогидролззн, !КГ> 3.2.1.7) -фермент, пкреко распространенный в виских растсикях и микроорганизмах. Она осуществляет превращение инулина и других поли'рук-тозидоз во фруктозу. Инулин в достаточно боль:;';;;: колтеестпах содержится в клубнях и корневищах многих растений (топинамбур, то-пинсолнечник, цикорий, одуванчик и др.) Очевидно, ннулаза играет налную роль в превращении резервных полкфруктозкдов в мобильную фруктозу !;лк источник углерода и энергии для гкссих растений и микроорганизмов.

Инулава-перспективный Фермент в производстве диетических продуктов. В связи с этим заслуживает особого внимания подбор эффективных продуцентов ннуллз. В решении этого вопроса перспективными являются микромицеты - микроорганизмы, обладателе широким спектром Ферментоз, способных к интенсивному биосинтезу целевого фермента при удачном подборе рационального режима этого синтеза.

Сама ке инулааа является высокоспецифичным ферментом, что позволяет получить гидролизаты инулина высокого качества. ■

Настоящая работа выполнялась в соответствии с тематикой научных исследований кафедры биохимии и микробиологии Воронежской государственной технологической академии по проблеме "Изыскание оптимальных условий микробного синтеза ферментов и исследование их физико-химических свойств". Эта проблема включена в Координационный план РАН по программе "Микробиологический синтез и научные .основы микробиологического получения практически ценных веществ". ■

. Цель и аадачм исследования. Целью работы было найти высокоспецифичный продуцент инулазы, получить активный препарат для гидролиза инулинсодержащего сырья, исследовать его каталитические свойства, представить хотя бы в первом приближении механизм. его' действия на гликозиднда (фруктозидные) связи в молекуле инулина.

Для достижения'поставленной цели предусматривалось решить следуюцие задачи:

отбор активного продуцента инулазы среди микромицетов;

- исследование условий биосинтеза инулазы и рационального режима культивирования продуцента;

- разработка эффективного метода выделения и очистки инулазы из поверхностной культуры продуцента:

- исследование некоторых физико-химических сройотв инулазы: рН - и температурный оптимум действия, рН - и термоетабильность ферчэНта;

- идентификация Функциональных групп активного центра фермента, исследование механизма действия инулазы;

- использование препарата инулазы ь производстве некоторых пищевых продуктов.

Научная помета. Отобран микромииет АврегеШиз а*а.-юг!

В1ШГ-2250, осуществляющий эффективный биосинтез инулавы "(активность фермента на 25-30 7. превышает этот показатель у известных ранее продуцентов).

Разработан рациональный режим биосинтеза инулазы в условиях твердофазного культивирования продуцента.

Получен высокоочищенный препарат инулазы 1120х. Найдены оптимальные рН и температура действия фермента, определены его рН- и термостабильность.

Идентифицированы функциональные, группы активного центра фермента, принимающие участие в акте катализа. В виде рабочей гипотезы предложен механизм разрыва 3-2,1-фруктозидных связей в молекуле инулина инулазой. Показана целесообразность применения полученного ферментного препарата в производстве диетических продуктов (хлеба, печенья) и этилового спирта из топинамбура.

Ярлгсттссялл ппачнпссть ¡хгботн. Производственные испытания по культивированию продуцента инулазы твердофазным способом па Мичуринском экспериментальном заводе с целью получения гысоксак-тивного спнртоосалденного препарата инулазы дали подожительпге результаты.

Препарат инулавачорип ПЮх апрсбировгн при лрсиздолстве диетических изделий с использованием полуфчбргкота из топ:ш»Лура г АООТ "Хлебозавод N 1" г.Воронежа.

Проведены лабораторные исследования примэиешм пр&ичрата инулазы в технологии мучных кондитерских изделий и этилового спирта.

¿лрсб&рм |«5игч. Основные результаты исследований по теме диссертации докладывались и обсухдались на международных, республиканских конференциях. Они были представлены на Российской конференции "Биосинтез Ферментов микроорганизмами" (Москва,1993), на 10-й научной конференции "С®р>«»нти и их практическое нспольуопа-

ние" (Казани,1394), - на международной конференции "Прогрессивные технологии и техника в пищевой промышленности" (Краснодар,1994), на конференции с международным участием "Проблемы ресурсосберегающих и природоохранных технологий и оборудования для переработки и хранения сельско-хозяйственного сырья" (Краснодар,1993), на научных конференциях Воронежской государственной технологической академии за 1992-19£4т.г.

Публикации. Основные • результаты настоящей диссертационной работы изложены в 10 публикациях.

' Структура и объем работы. Диссертация изложена на 171 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы,- объектов и методов исследований, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литература (172 источника) и приложений. Иллюстрационный материал включает 35 рисунков, 28 таблиц.

t

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объект исследований. При выборе продуцента инулазы использовали культуры ыикромицетов родов Aspergillus, Pénicillium, Rhi-zopus, полученные из Всеросийской коллекции микроорганизмов.

Культивнроват:е продуцента. Твердофазное культивирование проводили в колбах емкостью.750 см3, содержащих 20 г среды по воздушно-сухой массе.Выращивание продуцента проводили при 30-34°С В течение 95 Ч.

При исследовании влияния источников углерода и азота глубинное культиьирование осуществляли в колбах емкостью VU) см3, со-дерладих по 100 cmj питательной среды, на лабораторной качалке с. частотой вращения 4 с (уровень аэрации 1.4 г Ov/дм-'ч) в течение 120 ч при SG-S2 сС.

Определение аюиыюст фермента. Инулагнуы и ииьертаь-.иую ак-

/

-■явности устанавливали по количеству редуцирующих веществ при гидролизе инулина и сахарозы исследуемым объектом. За единицу инулазной активности принято качество фермента, которое катализирует образование 1 мкм редуцирующих веществ (фруктозы) за 1 мин в стандартных условиях. За единицу инвертазной активности . принято ' количество фермента, которое катализирует образование 2 Мкм редуцирующих веществ (фруктозы и глюкозы) за 1 мин в стандартных условиях. Количество образующихся редуцирующих веществ в пробе определяли полумикрсметодом Бертрана (под ред. Ермакова, 1987).

Мзгематшссяое ¡ишшроватю n/tcnepш.'ентл. При подборе рационального режима культивирования использовали полный факторный эксперимент (Ш>Э 24) с применением центрального композиционного ротатабельного униФормпланирования (Грачев, 1979).

"ид2Х'Лн<з и очист!са ферментов. Для выделения технических . препаратов ферментов использовали осаждение органическими растворителями. Для получения высокоочищенной инулазы были разработаны методы, включающие несколько стадий очистки. В ходе выделении препарата, полученного осаждением этанолом, проводили Фракциони- 9 рование белков сульфате»! аммония. От нпзкомолекулярннх соединений • шулазу отделяли гель-фильтрацией на сефадексе G-25. Далее использовали гель-храматографга на сефадексе G-100. Аналитический электрофорез проводили в полиакриланидном геле по методу Давись (Davis, 1964). Определение молекулярной массы осуществляли хрса-тографическим методом (Kulkarni, Vehrotra, 1970).

Нссхододапке фиоико-хнпмческих сесйстз и iir.eirnt£>ntrjma ;:сяо-ssmr.ix групп лстппого центра фермента проводили на высоко очищенных препаратах.

В ходе исследовании были использованы общепринятые катоды.-белок определяли по методу Лоури (Lcwry. 1951), об-уи азст т:о Кь-ельд&пю (Белозерский, Проскуряков, 1951). гл?:ксу ■ )•-»•••-••

дазным методом (Щербухин и др., 1970).

Статистичасая обработка результатов. Опыты проводились в 3-4 - кратном повторении, причем аналитические определения для каждой пробы осуществляли в трех повторностях. Обсуждаются только те результаты, которые были воспроизводимы в каждом опыте.

ВЫБОР АКТИВНОГО ПРОДУЦЕНТА ИНУЛАЗЫ. ИССЛЕДОВАНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ БИОСИНТЕЗА ФЕРМЕНТА ПРИ ТВЕРДОФАЗНОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ

Выбор активного продуцента инулааи. Из 41 штамма микроорганизмов различных таксономических групп инулазная активность обнаружена у 23 штаммов. Микроорганизмы выращивали твердофазным способом на среде из пшеничных отрубей, с начальной влажностью 60 % при тепературе 30°С в течении 44 ч. Из них способностью к интенсивному биосинтезу инулазы обладали штаммы грибов Aspergillus awamorl и Aspergillus nlger. Особенно эффективный биосинтез фермента показал гриб Aspergillus awamorl BKMF-2250 (табл.1). Он был отобран для дальнейших исследований. Инулаза данного штамма обладала способностью и к гидролизу сахарозы (коэффициент J/S был равен 0,25, где J и S - активности по инулину и сахарозе соответственно) .

При исследовании влияния источников углерода на биосинтез инулазы использовали сахарозу, инулин, крахмал, рафинозу, глюко-ву, фруктозу, мальтозу, декстрины, ксилозу и галактозу.. Источники углерода вносили в количестве 1 % по углероду в питательную среду следующего состава, 7.: КНгРОг-ОЛ; NaN03-0,2; MgS04'7H20 - 0,05; КС1 - 0,005; FeSO^VH^O - 0,01; pH - 5,0. Лучшими источниками углеродного питания оказались рафиноза, мальтоза и крахмал. Инулин и сахароза не оказывали значительного индуцирующего эффекта на биоошт-з инулисш. Следовательно, наблюдается конститутивная при-

рода синтеза фермента.

Таблица 1

Биосинтез инулазы некоторыми микромицетами

Наименониние культуры Каталитическая ед/г активность, J / S

по инулину 110 сахарозе

1. Aspergillus awamori 808 246,13 769,16 0,320

2. Aspergillus awanori 2250 255.30 1021,20 0,250

3. Aspergillus niger 39. 10,15 1127,78 0,009

4. Aspergl llus nlger 40 • 17,52 876,00 0,020

5. Aspergillus niger 801 12,00 1714,29 0,007

б. Aspergillus niger 1119 14,20 ' 617,39 0,023

*7 Aspergillus niger 2039 13,72 1372,00 0,010

В качестве источников азота нами были испытаны минеральные и органические формы азотного питания. Оказалось, что лучшее влияние на биосинтез фермента оказывает кукурузный зкстрат; среди минеральных солей - (МН4)2НРО4, МН4НйР04.

Интересно отметить, что при культивировании микроминета Аь'-регрШиБ. аналог! ВКМр-2250. на средах с различными источниками углерода'и азота активность инулазы коррелирует с активностью ин-вертазы; коэффициент ^/У не меняется и'равен 0,25. Это указывает или на сходный характер регуляции обеих активностей в клетках, продуцента, или на Наличие одного фермента, гидролизующего и инулин и сахарозу.

Подбор оптимальных условий дли твердофазного нультнвиро&гнил продуцента. Несмотря на ряд существенных недостатков, прежде всего связанных с т|'\'догмк|'я'тмо, ограничении."! ьш иоп-.ш.лоснния' м^Vа-

низации и автоматизации производственных процессов, поверхностный способ культивирования продуцентов ферментов находит широкое применение и имеет определенную перспективу. Главным его достоинством является высокий выход целевых продуктов.

В качестве основных факторов, влияющих на биосинтез инулазы, били выбрани: XI - температура культивирования, °С; хг - крахма-ЛИСТОСТЬ отрубей, X; Хз - влажность среды, X; . X4 - продолжительность процесса, ч. Бее эти факторы совместимы и некоррелированы между собой. Критерием оценки влияния каждого фактора на процесс биосинтеза инулазы Азрет^! Пии жатог! В1ШГ-2250 служила активность инулазы ь поверхностной культуре (у, ед/г).

В результате статистической обработки экспериментальных данных получено уравнение регрессии, адекватно описывающее данный процесс под влиянием исследуемых факторов, ед/г:

У -'602,62 + 11,10 Х2 + 88,94 хэ + 14,78 х4 - 13,58 хахг ■+ + 22,36 Х1Х3 - 11,77 Х1Х4 + 6,32 Х2Хз - 8,40 Х2Х4-- 37,14 XIй - 60,36 хг2 - 40,27 Х32 - 19,34 Х42. (1)

Таким образом, получены данные о влиянии различных факторов на Оиосилтеа инулазы микромицетом А$(.*>г&1 Низ аигиюМ ВКМР-8260 и Построена математическая модель процесса, позволяющая рассчитать активность инулазы в поверхностной культуре внутри выбранных интервалов варьирования факторов.

За оптимальные интервалы изменения параметров для биосинтеза инулазы Лх^геШии ¿мсшюЫ ВКМР-2250 при твердофазном выращивании следует принять: температуру культивирования 32-3-1 °С , крах-иалиетость отрубей 26,0-26,5 X, влажность среды 65-70 X, продолжительность процесса 96-97 ч. При таких значениях параметров активность инулазы в поверхностной культуре составляет 812-858 ед/г.

Производственные испытания технологии препарата инулазы ь условиях опытного цеха (¡.ерментных препаратов Мичуринского зкепе-

риментального завода показали, что микромицет Aspergillus avamori BKMF-2250 обладает высоким уровнем биосинтеза, технологичен и может быть использован в промышленности в качестве продуцента ину-лазы при твердофазном культивировании.

получение ферментного препарата инулазы и . исследование его свойств •

Пиделеииз и очистка фермента, Ферментный препарат инулазы получали из зкстрата поверхностной культуры гриба методом осаждения органическими растворителями (этанолом, ацетоном, изопропано-лом). Наиболее полное осаждение фермента всеми растворителями наблюдалось при рН 4,0. Очевидно, к этому значению рН близка изо-электрическая точка инулазы Aspergillus avaniori BKMF-2250. Концентрация растворителя значительно влияет не только на выход инулазы, но и на степень ее очистки. Лучшим осадителем для исследуемого фермента является ьтанол при концентрации его ь смеси 75 X.

Результаты по очистке инулазы представлены в табл. 2.

По разработанной схеме получен ферментный препарат инулазы с 98-кратной степенью очистки. Удельная активность наиболее активной фракции составляет 658,56 ед/мг белка. Определение молекулярной массы инулазы с помощью гель-хроматографии на сефадексе G-100 дало величину 105 кДа.

Heiioropus фнзшсо-киш!чес1ию свойства инулазы. Исследоьано влияние температуры и рН на активность инулазы; установлены рН-оптимум 4,0 и оптимальная температура 60°С.

Опыты по кислотной инактивации инулазы показали наибольшую стабильность фермента в интервале рН 4,0-6,0. Так, через 96 ч инкубации при температуре 40 °С фермент был инактиьирован при рН 4,0 на 10 X, при рН 5,0 - 6 х, при рН 6,0 - на '! X.

Линнмика и кинетика те рг и ческой и ки :л</шчл ияак1. ис-аили ин/-'

лазы исследовались в интервале температур 30-70 °0 в зоне рн 3,0-6,0. Достаточно высокую термостабильность фермент обнаруживал в зоне рН 4,0-6,0 и в интервале температур 50-60 °С. Было установлено, что активность инулазы коррелирует с активностью инвер-тазы. Во время инактивации коэффициент J/S (0,25) остается неизменным. Это говорит о том, что мы имеем дело с одним ферментом, который гидролизует как инулин, так и сахарозу.

Таблица 2

Очистка инулазы Aspergillus awamori BKMF-2250

Объем Актив-. Коли- Удел. Степень Выход,

фрак- ность чество активн.

Стадия ции, инулазы, белка, ед/мг очистки г

очистки см3' ед МГ . белка

Вытяжка из 2993,76 445,50 6,72 1,00 100,00

культуры 50,0 ±25,60 ±15,59 ±0,30

Осаждение этано- 1920,20 128,70 14,92 2,22 64,14

лом в соотноше- 20,0 ±18,44 ±4,50 ±0,67

нии объемов

1:1,5

Фракционирование 1419,64 25,51 55,65 8,28 47,42

сульфатом аммония, 3,0 ±13,52 ±0,89 ±2,50

Б5-75Х насыщения

Сефадекс Б-25 16,5 1359,17 17,96 75,67 11.26 45,40

±12,30 ±0,63 ±3,41

Сефадекс <3-100: 237,08 0,36 658.56 98.00 7,92

активная фракция 4,0 ±3.-50 ±0,01 ±17.50

Сопоставление полученных данных с литературными по другим гидролазпм (амилазам, протеазам) позволило прийти к выводу, что

инулааа Aspergillus avamorl BKMF-225Q обладает достаточно высокой кислотной и термической устойчивостью.

Установлено, что термическая и кислотная инактивация инулазы является типичной реакцией первого порядка и хорошо описывается уравнением (2):

о лоз А .

(2)

* = — Ч7Г

где к - константа скорости инактивации, ч-1; А0 - исходная активность фермента; А - активность в момент времени t .

В табл. 3 представлены данные кинетики инактивации инулазы Aspergillus airajmri BKMF-2250.

Таблица 3

Влияние температуры и рН на константу скорости инактивации фермента

Темпе- к • 102, ч'1 при рИ

ратура,

°С 3.0 4,0 5,0 6,0

' 30 0,035 0,022 0,016 0,019

40 0,141 0,105 0,063 0,080

50 0,661 0,400 0,251 . 0,313

60. 45,00 22,00 8,600 12,60

70 2834,00 977,00 279,00 518,00

Из тнбл.З видно,что температура и рН являются тесно взаимосвязанными факторами интенсивности процесса инактивации «фермента.

По данным табл.3 мы провели термодинамический анализ кинетики процесса инактивации. Поскольку инактивация была необратимой, поэтому определить ее истинные термодинамически* нар ¡метры - Э.ч-тнлынш Д Н, свободную знерпго Д1з.ЯНТрОШ*М л'.'>- Н0'"1-" '.•ЛЧЧ-'О

воспользовавшись теорией переходного комплекса, мы можем дать. термодинамическую характеристику процесса инактивации, определив важнейшие параметры этого комплекса дН д G и дь (табл.4). По графикам Аррениуса, описывающим зависимость lg k-f(l/T), была определена энергия активации Еакт процесса инактивации. 1

Таблица 4

Термодинамическая характеристика переходного комплекса инактивации инулазы Aspergillus awmvri BKMF - 2250

Температура, °С РН . Еакт * АН Дб 5* AS, Дж • К ''•моль 1

хДж ' моль" -1

30-50 3,0 122,6 120,0 93,8 83,6

50-70 3,0 347,6 344,8 84,0 >'733,2

30-50 4.Q 120,7 118,1 94,5 75,0

50-70 4,0 324,6 . 321,8 86,0 708,2

30-50 5,0 114,9 112,3 95,9 52,4

50-70 5,0 292,0 289,3 88,6 602,7

Как видно из табл. 4, инактивация инулазы Aspergillus awamo-

Н ВКМГ-2250 носит сложный характер. По-видимому, это связано с тем, что в формировании белковой глобулы фермента принимают участие два типа взаимодействий: гидрофобные силы и различные виды электростатических связей. В зоне рН 3,0 - 6,0 и сравнительно не-. бысоких температур (30-50 °С) происходит разрушение слабых электростатических, по всей видимости, водородных связей, которые играют незначительную роль в формировании белковой глобулы, и, таким образом, приводят к меньшей потере каталитической активности.

• - ^

00 этом свидетельствует Небольшие значения изменения энтропии дБ.

При теинературах ЕЫ&г ЬО^'д 1^резкй возрастает;это дает воз-

ыолность предполагать, что в формирование белковой глобулы фермента важный вклад вносят гидрофобные взаимодействия.

Идентификация функциональных групп активного центра ннулаи Aspergillus awareon' BUMF - 2250. Идентификация функциональных групп, принимающих участие в катализе, помогают расшифровать механизм действия ферментов. Однако литературные данные о функциональных группах инулаз, ответственных за катализ, весьма малочисленны.

Для того чтобы более убедительно представить, какие группы входят в активный центр инулазн Asperglllus aw?.<rjri EK!!F-2CC0, необходимо найти несколько независимых совпадающих эксперт.1читальных критериев.

Широко испольвуемш методом для получения предварительных данных об идентификации функциональных групп гжтивного центра фермента является анализ зависимости шшшиости фермента от рН, ir-f (рН) (рис.1, а,б ). Профиль кривых.актибНость-pH свидетельствует об участии в элементарном акте разрыва 0 -2,1- фруктогидной связи в инулине двух Функциональных групп. Форма сбеих ветвей кривой характерна для профиля кривых диссоциации иинигенных групп аминокислот.

А Я III --и--—1—1--

2,0 зо ^о s,o i бо 7,0 pif гр Л° W Z0 р-Ч

Л Ркг I Pk,\ 6 \рк2

а .

Рис. 1 Влияние рН на активность инула^и cri Л us а»лпл i

LK.M.F-2250; a - зависимость £»*f (рН): 1 - ПОЛуЧсНН.чЛ ЗКОИсрИМгН-тплыю; 2 -- рассчитанная теоретически; 6 - определение рК фуякии•

опальных групп с помощь»'графика Г (рН).

Как известно, ь общем виде ИрН) для ферментов описывается уравнением ; '

где У-начальная скорость реакции при соответствующем значении рН; 1?тлх ~ 1'а ле скорость при рН-олтимуме; К-$ и Кг - константы ионизации активных 1'рунп каталитического центра Фермента для "кислой", и "щелочной" ветвей соответственно. Уравнение (У) предетаьлнет собой теоретическое уравнение 1^-ШН1]) при условии, что Н+ - ионы оказывают влияние лишь на ионизацию каталитически активных групп фермента и не затрагивают его структуры в целом.

Из уравнения (3) 'вытекает важное следствие: при рН - рКт или при рН - рКй 1?- Т-е- ПРИ скорости расщепления субстрата

ферментом, равной половине скорости в оптимуме рН, константа ионизации каталитически активной группы фермента численно равна концентрации Н* -ионов среды. Исходя из этого были определены (рис. 1,а) рК-1 и рКг для инулазы; они оказались равными 2,8 и 5,5, что соответствует рК карооксильной группы, ьероятно, аспара-гинолой или 1'луташ1ж>вой кислоты и рК имидааольний группы гисти-дина. Найденное по этому методу величины рКа и'рКг были близки .к значениям рК , найденным по Диксону и Уэббу (рис. 1,6). Построенная по уравнению (3) теоретическая кривая (рН) близка по профилю к экспериментальной кривой (рис. 1,а). Это дает основание считать, что здесь мы Имеем дело только с ионизацией каталитически активных групп - карбоксильной и имидазольной.

Наличие в активном центре инулазы карбоксильной и имидааоль-ной групп подтверждают найденные игам величины теплоты ионизации этих групп. Рассчитанные по уравнению Вант-Гиффа.теплоты ионизации ^ункптчмлыин групп ока;ни>ин.. равными д.чу "кислой" ь-"п;и

(3)

кривой 11,0 кДж/моль и для "щелочной" - 30,0 кДж/моль, что соответствует теплотам ионизации карбоксильной и имидазольной групп.

Типичной реакцией на имидазольную группу гистидина является фотоокисление. Фотоокисление осуществляли при разных значениях рН и температуры в присутствии метиленового синего, играющего роль фотосенсибилизатора.

Фотоокисление приводит к разрыву гетероциклического ядра имидазола и к инактивации фермента. Результаты опытов (рис. 2, а,б) показали, что инулаза подвергалась интенсивной фотоинактивации, которая также описывается уравнением реакции первого порядка (рис. 2,6).

са%

£3 60 а> 20

\ \ JJ

ч л

ч

ffj £ c\S

q3 0,2 0,1

....., Л

У

3

a

s Tv

з

б

S tv

Рис. 2. Инактивация инулазы Aspergillus awamorl BKiF-2250 •фотоокисления; a: 1 - с метиленовым синим на свету при рН 4,0; 2- без метиленового синего на свету; 3-е метиленовым синим в темноте; б - зависимость lg [Eol/lEl от времени t; CEqI и [El -начальная концентрация активного фермента и его концентрация ь момент времени X.

Наряду с фотоокислением имидазольной группы гистидина этой реакции в белках подвергаются также Фенилъная группа тирогинн и индольное кольцо триптофана. Однако в отличие от мтих групп интенсивность Фотоокисления имидазильной группы ЭагИСИТ от рН.

Опыты по фотзекиелению инулазы проводили в интг-рьалё ¡Н 3,0 - 7,0 и температуры ?0 - 50 °С. в уеломих, н кото; ¡••iiwr n C:i- :

ма по себе не теряет активность. На рис. 3 приведены данные Cfyk'fiрН). С уменьшением концентрации Н+-ионов в среде скорость фотоинактиваиии возрастает. Как видно на рис. 3, точка пересечения прямых на кривой lg k - f (рН) находится при рН 5,9, соответствующей рК имидазольной группы гистидина.

Рис. 3. Зависимость lg к - Г (рН) при фотоокислении инулавы Aspergillus awamori BKMF-2250 от рН при температуре 20 °С.

о

-О,г

-ofi -0,6

•

M

I 1 1 .1

ío 5,0 6,0 7,0 рН

Для подтверждения предположения об участии имидазольной группы в разрыве О -2,1-фруктозидной связи было исследовано влияние дизтилпирокарбоната (ДЭПК) на активность инулазы.

Зтоксикарбоксилирование имидазольной группы также приводило к развивающейся по времени инактивации фермента. Начальный период инактивации подчинялся экспоненциальному закону. Порядок реакции, определенный по методу Майлза (Hiles, 1978), был близок к первому (п -0.8). Это свидетельствовало о том, что под влиянием реагента модифицируется не более одной имидазольной группы.

Известно, что образование карбэтоксигиетидина приводит к увеличении поглощения света яри 242 нм, а модификация фенильного остатка тирозина - к уменьшению поглощения при 278 нм, но развивается она более медленно (Лосева, 1986). Из полученных нами дифференциальных спектров следует, что ДЭПК модифицирует в инулазе имидазольное кольцо гистидина.

Итак, найденные в экспериментах величины рК, расчеты теплоты ионизации. инактивация инулазы фотоокислением и действие специфического ["-агента Л-Г'ПК дает основание считать, что в разрыве Р •• ¡I I . ■■<■■• ¡!-,''v 'il | ; ' !< И/Л ИI НрИНИМ. !1чТ УЧЮ'ГИ" К' I ! i6f •! С ;И!!Ь НДЯ

группа глутаминовой или аспарагиновой кислоты и имидавольная группа гистидина.

О механизме рагацеш.-ения 8-2,1-<|)руктозидных связей и инулнне инулазой Лярсгц!Ииэ аяахюН ВШ-2250, В представлениях о механизме разрыва в -2,1-фруктозидных связей в молекуле инулина мы исходили из принципа ориентированной сопряженной атаки нуклео-фильных и электрофильных групп, находящихся в активном центре фермента. По всей вероятности, в каталитически активной паре кар-боксил-имидазол карбоксильная группа выполняет функцию нуклеофи-ла, а имидавольной группе отводится роль электрофильной (протоно-донорной) группы.

Мы предполагаем следующий механизм разрыва а -2,1-фруктозид-ной связи в молекуле инулина под действием инулазы А.агатог! ВКМГ-22Ь0 (рис. 4).

Рис, 4. Гипотетический мехлниам расщепления ц -И, i-'¡'рукти-зидной связи в молекул« инулина инулньой A. awv^nrJ rb'i.ir-Я21-0; G - концевой остаток г-люкози.

Атом кислорода имеет больший отрицательный индукционный эффект, чем атом углерода, поэтому происходит перераспределение плотности электронного облака в в -2Л-фруктовидной связи. .За счет оттягивания электронов к атому кислорода в - 2,1-фруктозид-ной связи и к атому кислорода фуранозного кольца фруктозы атом Сг будет иметь меньшую плотность электронного облака. Иными словами, атом Сг обладает положительным индукционным эффектом. Под действием нуклеофильно-злектрофильной пары карбоксил-имидазолий происходит оттягивание электронов к "точке закрепления" имидазольной группы и их уход от "точки закрепления" карбоксила, что приводит к разрушению связи. Штриховые линии изображают соединение фермента с субстратом, ведущее к перераспределению электронов в фермент-субстратном комплексе и к исчезновению перекрытия 'электронных орбит между Сг и 0.

г

Исследование динамики гидролиза инулина инулазой подтверждает, что действительно разрыв идет по Сг-0-связи в молекуле инулина и, по-видимому, он осуществляется либо по многоцепочечному механизму, либо по механизму множественной атаки.

Иу,',;.;спс1п;о ферментного препарата идулдзл в прапзводстЕС хлг-буяочиих издалш. Разработан метод получения гидролизованного пюре из топинамбура ферментативным способом. Установлено, что наилучший результат достигается' при температуре 60 °С, рН 4,2, дозировке (¡>ермента б ед/г инулина, продолжительности гидролиза ?Л ч. Гидролпзованное пюре из топинамбура содержит 23 % сухих веществ, 14,2 % редуцирующих веществ, в том числе 11,4 % Фруктозы и 2,8 2, .глюкозы, белковых веществ 1,3

Методом симплекс-решетчатого планирования выбрана рецептура хлеба диабетического. Изделие обладает хорошими показателями качества: комплексная оценка качества 05 баллов, редуцирующих ве--¡■•етБ 5.6 X. г. том числе фрукто&н 3.6 X. глюкозы 2.0 7,. белковых

веществ 7,3 X.

С целью получения фруктозо-глюко&ного концентрата из топинамбура использовали экстракцию с последующим ферментативным оса-хариванинм инулина. Установлено, что наилучшими условиями экстрагирования сухих веществ из топинамбура являются измельчение клубной до частиц размером 3-5 мм, гидромодуль 1:1. температура 100 °С, продолжительность 40 мин. Максимальное количество редуцирующих веществ в экстракте 13,0 X.

ВнОран оптимальный режим гидролиза инулина топинамбура: дозировка фермента 8 ед/г, температура 60 °С, продолжительность гидролиза 12 ч. Получен гидролизат с массовой долей сухих веществ 14.0 редуцирующих веществ 13,0 рН 6,0.

Осуществлено концентрирование гидролиаата экстракта из топинамбура сублимационным способом. Фруктозо-глюкоэнмй концентрат характеризуется влажностью 4,3 X, количеством редуцирующих веществ. 92,7 X. Выбрана рецептура сдобного печенья с использованием Фруктозо-г.лкжояного концентрата. Изделие обладает хорошими по!«-зателями качества, его намокяемость 129 X, комплексная оценка качества У к банда, массовая доля редуцирующих Р.еиестк 28, У X: каха--роза отсутствует, это дает возможность рекомендовать его как диетический продукт.

Нсполыюкаша нпулазн при cбp¿txffca^at^^ топинамбур,ч в птанол. В исследованиях поклс-.анн возможность получения этилогюго спирта. Разработаны оптимальные условия сбраживания топинамбура п атаиол: температур 2Я-30 'начальное значение рН 5.0, продолжительность брожения 60 ч, дозировка инул'пчаморипп ШОх 2 од/г инулина. Выход спирта составляет 66.2 дал/т инулина. •

ВЫВОДЫ

1. Из 41 штамма проверенных микроорганизмов отобран Aspergillus ava.vari BKMF -2250, проявивший значительную потенциальную возможность к биосинтезу инулазы.

2. С использованием математического планирования эксперимента подобраны условия и рациональная питательная среда для твердофазного культивирования микромицета, обеспечивающие высокий уровень биосинтеза инулазы : температура 32-34 °С, крахмалистость пшеничных отрубей 25,0-26,5 % , влажность среды 65-70 % , продолжительность выращивания 96-97 ч. Активность инулазы в поверхностной культуре составляет 812-858 ед/г, что на 25-20 Z выше ранее известных продуцентов.

3. Оптимальными условия!,!;! для действия инулазы Aspergillus ■ ач-апюг! BKMF-2250 являются : рН 4,2 и температура 60 °С.

4. Разработан эффективный метод получения высокоочищенного препарата инулазы с удельной активностью 658,56 ед/мг белка и

. степенью очистки 98. Молекулярная масса фермента 105 кЛа. *

5. Установлено, что инактивация фермента описывается уравнением первого порядка. Инулаза Aspergillus атсатогЗ Bi'vilF - 2250 об. ладеет высокой кислотной и термической устойчивостью. Расчет термодинамических параметров процесса инактивации позволил заключить, что в формировании белковой глобулы фермента важную роль играют'Ьщрофобные взаимодействия.

6. Профиль кривой активность инулазы - рН, зависимость lEv_f(pH), величины рК ионогенных групп, расчет теплоты ионизации этих групп, фотоинактивация инулазы в присутствии метиленового синего,йнгибирование инулазы дизтилпирокарбонатом позволили зак-лочитъ, что в активный центр фермента входят карбоксильная и ими-дазольная группы. Предложен механизм разрыва О -2,1-Фруктозилной связи ь молекуле инулина инулазой Asf^rgi 1 lvs л»агогj BKMF- 2250.

7. О ПОМОЩЬЮ ОИМШН'Ю.-рииеТЧ«Т<'I О Планирования рецептуры И.Ч-ДНЛИЙ показана ЦеЛеСиибразНисТЬ ИСПиЛЬЗииаНИЯ ГИЯролИЗоЬаННОГо пюре и фруктозо-глкжозного концентрата в производстве диетических продуктов.

8. Наличие ииулазы в сбраживаемой среде позволяет полностью перевести инулин в этанол.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Корнеева О.С. и др. Инулаза микромицета Aspergillus ¿wa-inori . Препаративное получение и некоторые физико-химические свойства. / O.G. Корнеева, H.A. Жеребцов, Г.П. Шуваеьа, P.M. Чус-тафаев, Т.Н. Тертычная // Биотехнология,- 1993,- М7,- С. 31-05.

У.. Тертычная Т.Н.. Корнеева 0.0. . Ei-firiiiioh H.A. Огюопб полу-. ЧННИЯ III'рГ/ПКОООраНННХ ПОЛУфЯ'Г'рИКНГиИ И.« ТОПИННМ|>У|И /V '¡'<-'3. Д"КИ. Рос. научн.-практ. конф. С МеВДУНар. участ. "Проолсмы ресурсосОе-регоших и .природоохранных технологий » нОоруд. для п*|»/|ц<б. и хранения с.-х. сырья", I. Краснодар, «иг. )РОЗ г.- Краенп-

дар. 19ЯГ>,- С. 15.

3. Тертычная Т.Н., Корнеекд О. С. , Крындина Л. Ii. Получение гидролизатов из топинамбура// Тез. докл. Рос. научн.-нракт. конф. с междунар. участ. "Проблемы ресурсосберегающих и природоохранных технологий и оборуд. для нерераб. и хранения с.-х. сырья", г. Краснодар, 24-26 аьг. Ii.-tOi.-s I'.- Краснодар, 14ti.i. С. 15-16.

4. Тертычная Т.Н.. Корнееда 0.0. Игтмй продуцент инулаг-м // Тез. ДиКЛ. конф. "БИОСИНТРЗ фермеНТпН МИКрООрГаНИ: М'МИ", Г. М'ь'К-ва, 26-27 окт. К'ЧЗ г.- М. . - г. |ПГ».

5. Корнеев.4 0.0. , ГерТНЧНа.1 I.H. Ни< i.'1'M 1-е:, г...... 'I 4 /•-'■-1/

/(/<-• HW'tlttrl-r'fCO на Средах с 1И1Ч-Г11М« > / < 11 и'--р.1 --1Ч

ХКК111 отч-v. науч. KrjH-1". *»t !•..>:•. i . - Ь- .р-.-ме•. ; ; - 1. -5.

6. Тертычная Т.Н.. Корнеева О.С., ЖеребцоьН.А. Aspergillus awatK>ri-2£50 - придуцент инулааы / Вороне«, технол. ин-т.- Воронеж, 1904.- 5 о.- Деп. в ВИНИТИ 06.04.94, N 646-В94.

7. Корнеева О.С. и др. Топинамбур - нетрадиционное сельскохозяйственное сырье / 0.0. Корнеева, H.A. Жеребцов, Т.Н. Тертычная, Ю.С. Сербулов, К.В. Харченков // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук.- 1994.- 114,- С. 67-68..

В. Шеламова С.А., Дерканосова Н.М., Тертычная Т.Н. Получение и использование полуфабрикатов для производства диетических изделий // Тез. докл. междунар. научн. конф. "Прогрессивные технологии и техника в пищ. пром-сти", г. Краснодар, 19-21 сент. 1994 г.- Краснодар, 1994.- С. 103-104.

9. Дерканосоьа Н.М., Шеламова O.A., Тертычная Т.Н. Разработка технологии производства диабетических изделий из ржаной муки

.// Тез. докл. междунар. научн. конф. "Прогрессивные технологии и техника в пищ. пром-сти", г. Краснодар, 19-21 сент. 1994 г.Краснодар, 1994.- С. 211.

10. Жеребцов H.A., Корнеева O.G., Тертычная Т.Н. О механизме расщепления Е-2,1-фруктозидных связей в инулине инулазой Aspergillus awamori Z250.- [ Приняла к печати в "Биохимию"].

Подписано в печать 15.11.94 г.Формат бумаги 60x90 1/16. Бумага для множ.ап. Печ.л.1.0. Заказ ЗЯ Тираж 100

594017, Воронеж, пр.Ревалвцки, 19, УОЛ Б1ТА