Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование барьерной стойкости плазматической мембраны эритроцитов в условиях осмотического и температурного шока

ВАК РФ 03.00.22, Криобиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование барьерной стойкости плазматической мембраны эритроцитов в условиях осмотического и температурного шока"

РГЗ од

' о ГТ/; АКАДШ1Я НШ УКРА1НИ

1НСТИТУТ ПРОБИЛ КРЮБЮ10П1 ТА ШОИШЦИНИ

На правах рукопису

ПЬС1ИА Нэпа 1саах1ма.

ДОСДШШЯ БАР'БРНОI СТ1ЙК0СТ1 П1АЗНАТИЧН01 М1ЛБРАНИ ЕРИТР0ЦИТ1В В ШВАХ ОСМОТИЧНОГО ТА ТШПЕРАТУРНОПЗ ШОКУ

03.00.22 - ¡ср1об1олвг*я

АВТОРЕФЕРАТ

днсертацП на эдобутгя паукового ступени кандидата 61ол»г1чниз( наук

Х«рк11 - 1993

Робота вакон&ма в 1нстнтут1 проблей кр1еб!олвгИ та кр^еыадицмш АН У*ра!кц

доктор 61одог1чких маук, прсфесср ВоА.Боадареыко

дохтор б1олсг1чиах наук, професор П.А.Кал1пап

доктор б!олег1чних наук, професор А.В.Чуйко

Харк1вс1кий $1зкко - твхи!чаий 1нститут низьких температур АН Укра1ни

Захис-г в1дбудеться У?/" 1993 року в » г

иа зас1д&ин! спец1ал1зовало'1 ради Л 016.60,01 у 1нститут1 проблей кр!об1ологП та кр1омедицини АН Укра1к (310015, Харк1в-15, вул.Пвреяславська, 23).

3 дисертац1вю нокна оэжайомитися у б1бл1отец! 1нститута проблем кр!об1ологН та кр1 окедкцинк АН Укра!к

Автореферат раз!слано » / ^ ЦеЯшуп 1993 р.

Ёчвмнй секретар спвц1ал1зова*о? ради

доктор медициноьких наук А.Н.Голыдев

Науковнй кер1вннк:

0ф1ц|йв1 опоыэкти:

£одуча орган!зац!я:

ЗАГАЛШ ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ.

Актуалы'Лсть проблем«. У пая час одзрхана. голика к!льк!сть експеримнтальних даних, як! св!дчать про те, що одним з головних фактор.1л, ¡сонтролюпчих холодову та осмотичну чутливгсть кл1тини, е 1"х об'ем у момент охолодження та д! 1" г1пертон1чного стресу (/№-Гутсгп,1971,19791/:С1ГГСГ/1й197г'). При цьому зм!ну кл!тинного оЮё-му пов'язуоть з осмотичною в1даовхдд» кл!тини на зсув осмолярно-ст! зовн1шнього середовища (РЪггапЬ, \^12-1Ъ\ЦТ}егугТ1еЛ ,1971; Реду ,1987). Незважаючи на значний об'ем експериментальних даних, присвячених осхотичнин реакц!ям кл1тин, практично не дослужен! процеси, як1 «одулюють об'ей юитин та маоть у своему засно-в! зм!ну бар'ерних властивостей мембрани. Показано, то а умовах г!пертон!чного стресу в1дбувает!ся зв!льнення внутр!кл!тинних електрол!?!» {¡Ъгго^, 1972;¿вИ', 1967). У ряд! роб!т так! про-цеси роэглядавться як основа для пояснения механ!зм!в пошкод-кення кл!тин, когр! розвиваться при заморожувани1 (Б1лоус, Бон-даренко, 1985;/%? (гпМ. 1985). Необх!дно враховувати те, що по-руивння !оного гомеостазу кл!тини у г1пзросмотичних розчннах не-електрол!т1в вирааен! значно б1льве пор!вняно з в!дпов1дними зонами у розчинах солей ФопЕоп , 1^%ВегпЬагс{Ь, 1992). За!на !ояного балансу на мембран! в розчинах нвелактрол!т!в, наприклад, у сахароз!, пов'язаяа з 1вдукц!ею однонаправленного виходу кат!о-н!в !з кл!тини. Лод1бний перерозпод!л кат!он1з здатн!й вккликати додаткога обезвожування кл!тини внасл!док зиениення осмотичко? активност! цитозолг) та супутнього цьому виходу внутр!кл!тинно! води. Останне ноже кати несприятливий вплив на стан клгтини,особливо в умовах, коли кл!тинний об'ем Олизький до «!н!мального.

Враховувчи викладене мае значний !нтерес оц!нити вплив таких фактор!в, як зм!на кл!тинного об'ему та играти внутр!кл!тинних електрол!т!в на процеси, як1 лежать в основ! сенсиб!л!зац!1" ерит-роцит!в до эи!ни температурних та осмотичних умов середовица.

У наа час висловлено припучення, «о чутлив!сть кл!тин до зя!-ни температурних та осмотичних характеристик середовища залежить не т!льки в!д об'вмно! дег!дратац!1, але й в!д глибини обезвоку-вання пол!мерного б!лкового «ару, який утгороб цитоскелвт хл!ти-ни (Бондаренка, 1988). Припускаеться, що критичною фазою обезво-жування кл!тин в г!пертон!чних розчинах е набуття стану, коли з них видалявться об'екна вода, п!сля чого розвиваеться дег!драта-ц!я б!лкового шару {НеипбизЬ ,1985;Боноаренко ,1988). Враховувчи те, но <5!лко«ий скелет являв собою 10нний гель (.З^оккб.,

- ч -

1985-86; бйстШЗ ,1992), на стабхлЬнхсть л кого

значний впдив мае рН та !ониа сила середовища, можна припустити, що лроцеси, якх супроводжують обезвожування кл!тини ( в пзряу черту, зн1на концентрацп внутр1кл!гинних солей та внутр!о1тинного рН ) будуть впливати на структурну стаб1льн1сть меибрани. Це означав , що динам!ка реорган!зацП бокового гелю при обезвояуванн! глхтини в розчинах неедектрол!т1в буде визначати ступ1нь сенсиб!-л!зац1! еритроцит!в до наступит температурних та осмотичних зм!н умов середовища. Додатковим фактором, який контролюе роз вито к. де-стаб!л!зуючих явщ у боковому гел! може бути тривад1сть контакту о!тию! з неелектролИник середовищем.

Мета роботи» У зв'язху з вшсладеним вище, метою роботи в вив-чвняя вгииву початкових умов середовища (температуря, 1онно'1 сила, складу, рН) у розчинах неелектрол1т!в та зн1о&кних середовиц зи!н-ного складу на ег£йк!ст1 вригроциг!в до холодового та осмотичного впливу, а також до заморожугання.

Задачи досл1дкенняа

I. Оц!нити хритичн! хнгерлали часу, в мехах котрих з'являвть-ся чутлив1сть ермтроцит!в до наступно"! зм1ни температурних та осмотичних параметр!» середовица в залеаност! в!д початково! оско-лярност! та складу неелектрод1ткого розчину. Виявити критичне значения осмодярноот! неелектрол1тних середовиц, при яких еритроцити сенсиб!л1зуоться до наступних текпературних та осмотичних вплив!в при р!зк!й тривалост! ¡нкубацП, а також в залежност! в!д початкових осмотичних та температурних умов.

■ 2. 0ц1иити роль процес!в, пов'язаних з втратоп- внутр1кл!тин-них електролЖв у розыггку холодово! та осмотично!' чутливйст! еритроцит!в при обезвохуванв! в середовищах, як1 м! стять неелект-РОЛ1ТИ.

3. ¿ивчити вплив кислотно-основних характеристик неелектрол1т-них середовищ на роввиток холодово? та осмотичноГ чутлиаост! ерит-роцитхв. Оц!нити ступ!нь порувення кислотно-основного гомеостазу в кл!тин1 в залежност! в1д початкових осмотичних, кислотно-основних, 1онних параметр!в середовища та тривалост! 1Нкубац!Г еритро-цит!» у цих середовищах.

Оц!нити зв'язок м!ж глибинов обезвожування _еритроцит!в у неелектрол!тних та зм!шанних середовищах, ступенемУспрямованн!стю зк!н кл!тинного об'ему, а також характером модкф1каиП структури бокового скелету в залежност! в!д осмотичних, температурних та кислотно-основних параметр!в середовища.

Нау.кога новизна. Остановлено, ко ступень се:гсиб1л{зацГ/ еригроцит1и до охолодгеина га г!псрсиотичного стрзгу яонтролве-ться дзока групаии процзс1з: лроцесзли, пов'язаними з оснотич-ник обезгохуванняи кд1гиив та з ироцасаки, котр! мавть у сеогй основ1 зи1ну проникливост! мокбракн, що викликав зэ1льне:!нл внут-рхи!тинних електрол1тхв. Остакне суярозоджусться зсугои хиелот-но-основдоГ р1вновагн 1«итиии з сторону змениения рН, 140 висту-паз додагковим фактороу сенсибШзацИ кл!тини до холодого'1 та оокотичноУ дй". Структурно» основой зроотання чутливост! е зм1-ни стану бокового цитоскелету.

йкспериментально показано, цо знкамшя рН середоаища викдикае агрегацию 1зояьованих цитоскодетких комплексов; при набдияеин1 до критичного значения рй, яке в1дпов1дав 1зовлек?ричн1й точц1 основного компонента цитоскелетко! С11кк - спектрина - процес до-сягае максимально! 1нтенсиЕиосг1. Зкайдена залсшисть ступени ре-лаксац!? цигоскелетних комплексе при поверненн1 до внх1дних зна-чень кислотност! середовища в1д тон1чност1 цього середовища: при зб1льиенн! гон1чноег1 здатн!сть системи до самоягдиовлення падав.

Суиарник ефоктом процесгв звхльноння внутр1кл1тинних електро-л1т1в та зи1цення кислотно-основнох р1в::озаги цитозола з'явдяеть-ся додатковв, по вадшаенно до выкликанного осмотичнини уколами, змениення об'сму еритроцит!в» Вперие встановлено, що найб1дьшо-го розвитку цей процес набувае в уновах тривало! хнкубацй" ерит-роцит{в в иеелектрол1тних середовицах з низьким значениям рН.

Вперие показано, що введения солея на фон! 1 снувчо'г осмотич-но1 двг!дратац1! веде до зб!лывення об'ему ы^тин та зн!аення р!вня поикодвення при наступному охолоджеян!.

Впершв показано, що характер впливу кислотност1 г^перосмо-лярного неелектрол1тного середовица на чутлнв1сть еритроцит!в до холодового та осмотичного впливу мае протилежну спряиОЕанн!сть пор!внянно з впливом г1пер?он1чяого електрол^того середовища.

'¡оказано, що в розчиках, як! м!стять неелектрол1Ти, ¿актором, якик контролю« чутдив!сть эритроцит! в до холодового та г1перосмо-тичяого впливу, в тривал!сть перебування у цих середовидах. Ви-явлено д!ап&зон осмолярност1, у якоиу проявляв себе "часова" компонента сенс1бШзвцЙ' при Лнкубац!! еритроцит1в в розчинах не~ електрол!т!в. Лри осмолярност! середовища вице цього значения процес розвитку холодово1 чутливост! контроливться перевахно осмо-лярн!стю.

Охолодження еритроцит!в до -1960С'зм1нов напрямох впливу такого фактору, як рН середовища, на лротилежний, порхвнянно з охо-

лодкенняы клиин до

Основд! виеновкя, винесен1 до захисту.»

1. Чутливхсть еритроинтхв до холодового впливу у розчинах, як1 мстять неелектролхти, контрола&ться, поряд з осмодярн!отв та температурою середовища. тривал!сгв хнкубацН у г1пертои!ч-них уыовах.

2. Порушения 1онного гомеостазу еригроцит!», яке пов'язане з вкходом внутр!кл1'гинного кал!ю в укояах дег!дратац!2 в розчинах неелектрол!т!в супрозоджуеться зм!щенням кислотно-основно? р1вноваги клгтини в сторону зкеншення рН, що асоц1йовано з роз-витком чутливост! о!тин до наступного охолодження»

3« Характер впливу кислотност! г!леросмолярного неедектро-литного середовища на чутдивхсть еритроцит!в до дП температурного та осмотичного фактора мае протилеяну спрямованн!сть по-р1вняно з впливом г1пертон1чного сольового середовища.

Теоретично значения роботи. Представлен! результата роз-шмрювть уявлення про механ1зм, як!й контролюс чутлив!сть кл!тни до змпш температурных та осмотичкях унов середовища. ГЦдгвэрд-куеться припуцеккя, що структурной основов цього ыехан!зку в динам!чний стаи цитосколоту. ¿ксперииект&кыщй млтор1ва# приведений у робот!, дозшляе ьонкретизуватк едек&нти, понгодаен-ня яких в реальнкх укоьах охолодвеняя, закорогуваикя •№ в!дтаа~ вання нояуть впливати на структурну та фуккц!снальау ст!йк1сть ыЦтини, I в ряд! С1туац!й набувати особливого значения.

Практична значения роботу.. практично значения робота по-лягае в розробц! нових напрянк!в регуляцН стану кл!тин на етапах, як! передують охолодкеннв та зеноронуваннв з мотов повышения ст!йкост! до дП попкодкувчих фактор!в.

Апробац!я роботи. Основа! ыатер1алЕ» представлен! в дав!й робот! буди викледен! на Всесоюзна г.окфервнц!Г по б!ох1мН менбран (Шнськ, 1988), конферонц!ях молодих гчэнкх Хнститута проблем кр!об!олог!1 та кр!омедицыни АН УкраГка (Харк!в,1987, 1988, 1990» 1991), на Всосовзк!й хонференц!? "Реконструкц!я, стабШзац!я та репарац!я понкодквнннх б!олог!чних нембраа" (£даговещенськ,1989), на II М!*народн!й конференц!! "Усп!хи су-часно'1 кр1об!олог1'1" (Харк!в,1992), па IУ Украхнському б!ох!м!ч-ному з»1зд! СКи^в,1992).

Чубл1кац!1. По матер!алах дисортащИ опубл!ковано II на-ухогих робот.

Структура дисертац!?. Внконан! досд!дкбная в частиков пла-

нових наукових podir 1нститута проб лен Kpiotfiojsorii та кр!он8ди-цини АН Укра!'ни по тем!:

Диоертац1йна робота складаеться 1з вступу, 2 глав обл!ку л!-тератури, опису катер!ал!в та «етод!в, 4 глав власних досл!дненъ, 1х обговорввання, висновк!» та списку цитуемох л!тератури, вклв-чагчи 208 роб!т закордонних автор!» та 40 в!тчизняних. Робота викладена на Г25 стор!кках маяинописного тексту, и!стить 48 иа-лонк!в та 2 таблиц!.

3MICT РОБСМ

MAT ¿PI АЛИ ТА НЛ01Й ДОСЛДШЩ.

Об'вктом досл!дкень були еритроцити лвдики СИ група), хов-раха, цур!в. Кл1тини трич! мили 10-кратним об "мои ф!зиодог!чного розчину, який м!стив 5 мН фосфатного буферу. Т1н1 вритроцит!в одержували за методом Dodgе ,1963. 1зольоэан! цитоокелети ерит-роцит!в одержувалк за методом bectl/e/7,1985.

Холодовий вок еритроцит!в моделввали на основ! загальнопри-нятох методики &Л66/7 , Уипд, 1977, В експериментах використову-валась 2%-иа. суспенз!я еритроцит!в. Р!вень геиол1за визначали по виходу гемоглоб±на за допомогою спектрофотометра Cv-AA (Л^ЗДЗнм). При заморожуванн! викориотовувались кр!опротекгори - fliJT—1000 та гл!церин, як! додавались в ал!хвоту, «Шбрану в кожн!й точц! часу безпосередньо перед заморожуванням (к!нцева концентрац!я -15%).

£им!рювання об'ему еритроцит!в проводили за допомогов двох метод!в - спектроскоп!? Ыпульс!» опору {(Хкезоп ,1985) та ге-матокр!тиии методой (центрифуга типу НГ4-8).

Вим!рювання к!нетики л1зиоу еритроцит!в, викликаиого унола-ки кислотност! середовища, проводилось за допомогоп метода мало-кутового розс!ювання св!тла суспенз!ею кл!тии {bati/mer ,1982). на установи!, створен!й на баз! монохронатора 0-4А =720 нм). За допомогоп цюго метода ?акож рег!стрували к!нетику переход!в форм кл!тин (Аегтярьов,1988), Морфолог!чний контроль эд1йснввали за допомогою м!кроскопа типа В!олам. горму кл!тин класиф!кували по bessis ,1973.

¿их!д кал!ю з вритроциг!в визначали методом /Пасву, 1984 за допомогою вал!нои!цихового електроду 0P-K-O7II3 СУгортина).

Вим1ргиаиня внутр!кл!тинного рН проводили за методом $003 , Вогол, 1981 за допомогою рН-метра 0P-2I2 (Угорщива). Вим1рвван— ня динам!ки кислотност! середовиц 1нхубац!? per!стрували тим же

електродом, запис сигналу зд!йсиювади зо допомогов самописця Т—21 СЧехословаччима).

электрофорез б!лк!в гШв еригроцит!в проводили за методом ,1970. Гел! скан!рували на денситометр! СД -200 С »540 им).

Вим!рпвання лроцес!в агрегацЦг цитоскелета проводили за допо-могою метода малокутохого розс!ввання, яс описано вице ( "720 хм).

Осмотичний тиск середовица вим!рввалк на осмометр! типу 0НКА-1Ц-О1. Статхстичиа обробка результат!» експериквнт!в проводилась за методом tinepa - Сг'вдекта. як описано Бейл1.1963.

РЕЗУЛЬТАТ« ВЛАСНИХ ДОС! I ДЖЕН Ь ТА IX ОБПОВОРйШ.

у

I-I. Холодовий иок еригроцит!» в неелектрол!тмих та зм!ванкнх середовицах: значения вну?р!кл1тиниого електрол1ткого гомеостазу.

Проведен! експерииенти показали, «о осиолярн!сть середовища при 1ихубац!1 еритроцит1в у розчинах невлектрол!т|в не е единим фактором, який контролве чутлнв1сть кл!тин до холодового току. Значку роль вмехан!зм! сенсиб1л!зацН в!д!грае тривах!сть !нкуба-utí кл!тини на початковому етап! перед охолодхенням. Показано, № еритроцити иабувавть чутлив!сть нав!ть в середовицах, осиолярн!сг ь яких незначно перевищуе ф1зиолог!чинй р!вень - 450 мосмоль (мал.1).

Типова х!нетнка сенсиб1л!зац11 еритроцит1в до охолоджемня в неелектрол1тних середовицах мае дв! Ф&зи - початкову фазу зростах-ия чутливосг! i плато, коли чутлив!сть заливавтьоя на одному р!в-н! Сиал.1,2), Лерва фаза в!дпов!д&е перiоду, в мехах якого «вид-к!сть зв!л*кеикя внугр!кл!тинного кал!в достатньо велика Сиал.З).

Законом!риосг!, отриман! для розчин!в сахарози, спостер!га-лися 1 в г!перосмотичиих розчинах нан!толу (мал.2). ¡Остановлено, цо фактор часу в найб!льш!й к!р! проявляемся в неелектрол!тних середовицах з осмолярн!стю мице 1000 мосмоль, вице дього р!вия значения фактору часу н!велоеться (мах.4).

Динам! ка виходу !он!в кал!о з ернтроцит!в, як! !нкуб1ровал»-ся в розчинах неелектрол!т1в, в!дпов!дав динамиц1 розвитку чутли-вост! до охолодхення (мал.9). Зв!льнеиня !он!в контролюеться осмо-лярн!ств середовица (на.10). Вклвчения в середовнце !нкубацП KQ 1нг!б!руе зв!льнешя внутр1ы!тинного кал!в; введения KCI або JfaCI в кояцентрацИ 130 мИ повн!сто бдокув вих!д!ои1в кал1в. Хлор!д-!он, введений э непроникавчмм кат!оном (хол!нхлор!д), !нг!б!руе цей процес в 2 рази слабее (мал. 12).

Зм1ки кх!тиниого об'вку, в»кликан! зв!льненням кал!в (додат-ков! по в!днооеняо до зумовлених оонотичлими умовами) були заф!к-

сован! в розчинах сахарози з оомолярн!стю до 0,5 М. При зро-станн! осмолярност! до О,В на фон! значно? осмотичнох дег!д-ратац!У змхни об*ему, виклик&н! втратою !он!в К*, м!н!мальн! (мал.II).

Вклвчення оолей у розчин неелекгрол!т1в р!зко зм!нюе характер залежност! холодово? чутливост! еритроцит!в в!д тривалост! !нкубац!1 (мал.15). В приоутносг! 100 мМ #аС1 еритроцити практично втрачають чутлив!сть до холодового шоку, якио осмо-лярн!сть неелектрол!тного середовища нище 1000 мосмоль (мал.13). Пор!виввчм ц! дай! з результатами, як! подай! на мая. мохна зробити висновок, що ЮОО мосмоль е критична межа, вице яко! в механ!зм сенсиб1л!зац!! включалться процеси, пов'язан! з пере-важним гшкеох осмолярност! середовища. При нищих значениях ос-молярност! зростае роль процес!в, пов'язаних з поруиенням !онноГ р!вноваги на мембран!.

Конкретний характер сенсиб1л1зац!У еритрОцит!в залежить в!д !х видовоХ надежное?1, яка детерм!нуе динам!ку та спрямованн1сть перерозпод!лу влектрол!т!в по обидва боки мембрани {.ХвйсНег, 1979). 7 випадсу зкмосплячих, коли працюоть системи, як! обмежу-пть втрати виутр!кл!тикних електрол1т!в (Мон!н,1987), еритроцити демонструвть б!льиу ст!йк!сть до г!перосмотмчного стресу та охолоджвинв пор!виянко з еритроцитами лодини (мал.17,16).

1-11. Об»ь...,х зм!ни кл!тини як фактор холодово! чуиивост!.

Их св!дчать результати наяих експеримент!», эб1льшення вм!сту меелектрол1та у середовиц] 1нкубацП р!зко зменоуе об'ем еритроцит!в; при цих же умовах в!дм!чаеться зр1ст чутливост! кл!тин до охолодження (мал.21). Вклоченыя у зовн!шне середовище електрол!т1в веде до зб!льшення об'вму кл!тини, при цьому спо-стер!габться значив зменьпення р!вня холодового шоку (мал.21). За допомогов спектроскоп!! 1мпульс!в опору показано, що в1днос-не зб1лывенля об'вму еритроцит!в на фок! вке !снуючого осмотичного обезвожування при введем! в середовище Лай в д!апазон! концектрац1й 50-250 мИ досягав 10? (мал.22).

Часова дкнам!ка зменьпення об'ему найб!льи ч!тко проявля-лася в 0,3-0,5 М розчинах саж&рози, при зб!львени! концентрацИ до 0,8 М така динам!г* н!велвстъся (мал.II). Причина цього може бути пов'язана э двома моментами: 1)реал!зац!бл> процесу в почат-ков!й фаз! !нкубац!Г та 2)обмеженяям об'смиих эм!н з боку 61л-кових структур кл!тини. Бнесок гемоглоб!ну також можливнй, бо

при набливенн! оенолярност! середовища до вказаних значень в!н р1зко зм!нсе сбо! в'язко-пластичк1 характеристики в 6Ы р!г!дно-ст1

показано, то для обмекення або обернения процесс, як! мо-ди£!кувть стан кл!тики при зм!к!Н об'ему на етап! перед охолод-кеиняи, достатньо зы!стити ос«олярн!сть до р!вия. який забеспе-чув високоампк1тудну рег!дратац!ю ("об'емиу") або ввести в зов-н1ши!й новлектрол1тний розчин електрох!ти, то здатно забеспечитк "структурну" (цитоскелетну) рег!дратац!в-йал.21г та 25.

У експеримент!, результата якого подан! на мая.24, ал!квота суспенз!'! кл!тин у коян!й точц! часу розводилась до 0,4 М~о1 концентрат I, а!сля чого кл!тини !нкуб1рували це 10 хвилии при 37°С, а пот!м 10 хвилин охолоджувались до 0°С. Процедура розведення зниауе чутлив!сть кл!тин до охолодження, але 1 в цьому випадку збер!габться залехн!сть р!вня сенсиб!л1зацП кл!тин в!д тривало-ст! контакту з дег!дратупчкМ середовищем» ,

попереднього розведення до v,4 н: гислн ноисредпвих-и дидолпп 1-0,7 N розчин сахарози, 2-попе- солей, К1нцева концентрац1я редньо розведенний до 0,4 И; 3- солей-0,Э М: 1-0,6 N розни* 0,6 М розчин, 4-попереднъо розве- сахарози, 2-попередне додан-дений до 0,4 М, рН«7>. ня 0,3 М *аС1, 3-попередке

додання 0,3 Н KCl, pH-7,

Виходячи з данях, як! подан! на мал.25, можна зробити висно-вок, що введения солей у неелектролигнв середовице в значн1й м!-pl ноже бути аналог!чно розведенив. Включения солей безпосередмо на стад!Г иоку не знижув'розвиток пошкодженъ (.мал. 27),

Проведения процедури, под!био1" описан!й на мал.25 в розчин! сахарози з рН=5,0 не заяоб!гае розвиток геиол!зу п!сля охолоджен-ня (мал.26). Враховуючи,и<в1нтенсивн1сть ьиходу внутр!кл!тинного

6'0 Ш Тьо

Тривал1сть !нкубац!1"Схв.)

о "То ' № '

Тривал!оть tHKyöauii Схв-)

кад1в в г!перосмотичних розчинах оахарози не залеаить в!д к1с-лотиост! середовища Смал.28), то в цьому випадку зи1ни об» ему, зккликая! вгратов кал!п, газко розгдядати як провЦний фактор цього яеища.

I—XII. Холодовий вок еритроцит1в: значения внутр!кд!тинноК кислотно—основной р!вногаги.

Зг!дко иодел! ¿GlV , Bookc/l'ff, 1987, зв1льнення з дегмра-тованих еритроцит!в 1он1в icaalo в частннов загального процесу зз1льнення г!перток1чного розчииу, цо метить оол! кал!в та КОН. Насл!дком цього процесу буде включения Н* до цитозол». Враховув-чи те, ао ввидк!сть включения Н+ у кл!тину в значн!й mípi визна-чавться показникон кислоткост! зовн!внього середовиаа 1986), було прнпудено, но дилам1кА сенсиб1л1зац1"1 еритроцит!в у неелоктрол1тн!х розчинах повинна залежити в!д такого параметру середовища, як рН. Якцо за вих!дний параметр взяти чутлив!сть ерктроцит!в до охододкеняя у эеелектрол!тн1х розчинах з рН«7,0, то зн1ззиая рН оерздогяча у лулту область приводить до зкеи меняя pinafi геиол1зув зсуз у кяслу область п1двищуе чутлнв!сть юл!— ТИП, во ОСОблИЗЭ £2рвЕ5К0 прн рН'5,0, Суттсва р!зниця в р!вн! сеискб!л!зацП вритроцат!з до охолодяеняя починав проявлятися на 90-у хвзлииу !икубац!Г, та стае наксик&дьиоп на 180-у хвилину, цо cníвпадав з дннам!ков зв1льневия íohíb калId (мал.32).

Врахоаувчи те, до головнин б!лком цнтосхелету е спвктрин, якай на к!нцях сво!х д1мер!в несе негативнаЯ заряд та молекули якого-ентроп1Ян! прукини, иокна припустити, що закислення внут-р!кл1тннйого вм!сту буде п1дсилвЕати процеси, як1 кають к!сце при дег1дратац1? кл!тини. До числа таких процес!в у перду чергу сл!д в!двести скорочония спектриноузх субодиниць, зменьшвния к1дькост! íx ефектнвних сяивок СVvotoda ,1992; Мали?, 1988) та, як насл!док, агрвгац1и та розварувания гелювих структур на облает!, зиоококонцемтрован! за (Нлком та облаот! г!дшарованого розчкиняка, Под!бн! процеси bírou! для ц!лого ряду б!лкових гелей. <Реб!вдер, 1966; 1змаЛлова,1974;£^ЛгЛ?/7 ,1970). Як показали результата наших эксперимент1в, зииженкя рН середовища викликав агрегац!в 1зольованих цятоскелетних комплекс i в (мал.39). При иаб-лиаенн! до критичного значения рН. яке в1дпов1дае !зоелекяричн!й точц! спектрину (5,0), прочее досягав каксиквльио! 1кточсивност!. Показана залеан!сть ступени релаксац!! цктоскелетнлх кокплекс1в пра повэряеая! до shsI.viux зкачеяь ккслотиост! саредовнца в!д то-hIhhoctí цг>ого озрэдожща: прг гб!летзяя| toi'.U-koct! здс.тн!сть

систет: до самов!дновлешш падае.

Ьа*!б1льва в^дносна зм!на сб'ему ерктроцктхв на фон! початко-во1 оскотичког дегЦратацП на 180-у хвнлину !нку6ац!'1 у неелект-ролхткоку розчин! вхдбуваегься якраз у кислих середовшцах (табл. I). При введена! до неелектрсл!тного середовища 0,15 М 1гаС1, як! тинчасно блокувть в/.ход виутр!кл!ткиного кал1в, часова р1зниця в об'ем!,,також, як р!зккця об'ену за рН, стае мШмальнов.

Рег!страц!я зк!щення рН незабу.;врекого зовминього середоаи-ща при експонувани1 у ньоку еритроцит!в показала, що наиб!л£ший зсув у луниу область слос?ер!гаеп>ся там, до о!тини демонстру-вть найб!лыиий ступень де^циту !он!в кал!ш Динам!ка зм!ни зов-н1шнього рН сп!впадала з динак!кос звиьнеиня цього кат!ону та з Д1;нам1ко£ сенсиб!л1з&ц!£ еритроцит!в до охолоджения (мал.33). Найб!льше закислення Енутр!кл!ти1Шого середовица при 1нкубац!1 еритроцит!в у неелектрол!тн!х розэднах спостер!галооь при иизь-ких значениях зовншнього рНСмал.З1»),

доказано, що на момент розаитку кайб1льших кислотних та !он-них зм1н внутр!кл1тинного середовяца та каГ!б!льи!й чутливост! до холоду були зарег1строван! на£б!лиз1 зм!ни в влектрофоретичнсну спектр!, поБ'язан!, насшперед, со спектринок (мал.36). Базденкя у сахарозкий розчин солей у оптимальных концснтрац!ях запоб!гало деетрукт!вних зм1и б!лков мембрани ^ыал.38). ¿роблеио припувення, що в умовах зиеньшання екранування негативно зарядженних молекул цитоскелегу збер!габться пластична гелева структура, яка хоча 1 В1др1зняеться В1Д нативн!й, але забеспечуе отруктурну стаб1льн1ст» мембрани.

III. Изис еритроцят!в, я кий ви кликан знихеиням рН зовн!шнього свредовища.

У глав! подан! результат» досл^дивнь динам!к4 процесу л!зиса ер^троцит!», який розвиваеться в умовах зникення рН зовн!шнього середовица. Встановлено, то при досгнекн! рН розчину 4,9,значно зросгае щвидк!сть л!зису Смал.42). Обробка еритроцмт1в акридином оранжевом, який викликав агрегац!ю б1лкогих структур мембрани, прискорив лiзио кл!тин (.табл.2). Лод!бник результат споствр!гав-ться при зкрвпленн! о!лков цктоскелету га мембрани через додатко-в! дисуль^дн! зв'язки.як! утворюються п!сля обробки кл!тин хло-р!дом кад>Ля (табл.2).

Аосл!дксн! зм!нн <рорм»кл!тин, як !нтегрального параметру, що в!дображае зм!ни. стануТопорних систем. Динам!ка трансформац!! бу-

ла представлена фазами: дискоциг - стоиатоцит - сфера (мал„ йвйдк!сть переходу коитролювалаоь температурою та рН. При кабли-аснн! зозшшнього рН до 5,0 спос?ер1галось значив зменызення ко-вф1ца5нту сфер!чност! (сферуляц1я) еритроцит!» та ?1н1» (мал,40). Припусхавться, то в основ! транс<;ормацП лежать процеси супряжеи-ня бар'ерно"! нест1йкостх та нест!йкост1 до виг1ну, як! при критичному поедяанн! викликають появу пори. Зниження рН ноже стати пусковим фактором зриву бартерной стхйкост! та ст1йкост1 до виг!-ну внасл1док модиф1кад1У скелетного коыплеку.

Глава 17 лрисвячена особливостян кр1огемол1зу еритроцит!в у неелектрол!тнях середолищах при ивгативних температурах» Показано, то при експонируванн! еритроцит!в при Т=-Ю°С у розчинах не-електрол!т!в такох сгостер!гаеться часова динам!ка л!зису кл1тин, яка коитролветься осмолярн!стю сервдовшца (мал.44). При заморожу-ванн! такох виэначавться розвитох гвяол!зу протягом часу, але вплив осмотичиого фактору отае менья вирааеняим (мал.45). Споетв-р!гаеться одночасовий вих!д ус!х кривих на плато в 1нтервал1 3060 хвилин» казалекно в!д осмолярност! середовища. Останнс св!д-чи-гь про те, цо до иохан{зму пошкодженяя кл!тин при заморокуван-

в неелектрол!гн!х середовищах залучвнн фактори, як! в!дсутн! при охолоджеин! до 0°С. Охолвдаеяяя вритроциг1в.до ~196°С зм!нюв напрямок впливу рН зовн!внього середовища (мал.47). Найб!льш! пош« кодаення в!дбу»ались у луаи!х сервдовицах, в протилежн!сть тому, яо спост«р1гаеться при охОлодаенЛ кл1тик,як£ проходить без кри-стал!зац!йиих процес!» (мал,32). Под1бна рН-залежн!сть в{дэначае-ться при перенос! еритроциг!х з розчинов сахарози у сольов! сере-' довища з одночасним охолодхенням до С°С (мал.46).

ВИСДОВКИ.

I. Ступень сенсибШзацН еритроцит!в до охолоджения та г1-пертон!чиого стрвсу у розчинах, що м!стять нвелектрол!ти, контро-лсеться двоиа трупами пронес!в: процесами, лов'язаними з осмотич-ним обезвожуванням кл!тин, та з процесами, як1 масть в основ! эм!-ии проникливост! мембраки, во приводить до зв1льнення внутр!кл!-тинних електрол1т!в. Останнв супроводжуетьоя додатковим, по в!д-ношеннв к выкликанному осмотичними уновами, эмеиъгаениям щетинного об'ему. Введения елестрол1т!в у неелектрол!тн! середовища зм1-нве в!дпов!дь еритроцит!в на тривала експокувакмя в г!перосмотич-них середовицах 1 розвиток чутлнвост! до охолодхення. У цьому ви-

- и -

падку кл1тини деионструюгь зб!льпення об*ему пор!вкяно того, що досягаеться в умогах неелектрол^тного розчиву.

2. У середовицах, що м1стять неелектрол1ги, чутлив!сть ерит-роцат хололового га оснотичного впли?у контролветься, кр!м осмолярност! та температуря роз чину, тривал!ств експонирування у дег!дратувчих уновах. Гривал1сть !нкубацй" визначае кежу ссмо-лярност!, в и где якоГ в!дбуваеться зм!на бар'ериих влас'ивоствй мембрани та розвиток холодового шоку. Тривал1сть 1нкуба1Ш коит-ролсе холодову чутлив!сть еритроцкт!в лвдими в !нтервал! осмо-лярност! до 1000 мосмоль. При п!двиценн! осмолярност! середовица вице цього значения, вплив часового фактору н!велветься, Холодова ч/тлив1сгь контролветься переважно осмолярн!ств розчину.

3. Лроцас зв!льнеиня внутр!кл1тинного кал!в супроводжуеться зм!щенням кислстно-основно! р!вноваги кл1тини у 61к знижения рН. Глибина розвитку останього процесу залежигь я1д кислотност! де-гЦратуючих розчин!в, у яких юЦтини експонуються поперед охо-лодгкениям. Характер впливу кислотност! г!перосмолярного неелект-рол!тного середовида на холодову та осмотичну чутлив:сть еритро-цит1в мае протилежну спрямоваии!сть пор!вняно з г!порто-н!чнмм сольоаян розчшюм.

Зииження рН середовица, а також п1двищеиня осмолярност! викликае крекувакня еритроцит1в. Вважаеться, що в основ! цих зы1ы лежать процеси, пов'язан! з! зм!хов стану бокового гелю, який утворке цитоскелет. ¡1ри набликени! до критичиихо значения рН (5,0) кл!тини та т!н! трансформуються у сфери» що може в1до-бражати прочем порушеиия прикр!пленмя скелету до мембрани, як! суг.роводжувть об'еике стиснення б!лкового гелв. Нася1дком таких процес!в стае прискорення л!зису, зумовленогс зм¡тениям рН зов-н!ашього середовища.

|]*РШК РОБОТ, ЯК1 0ЛУШК0ВАН1 ПО ТШ ЛЙС£РТА1Л1.

1. Пес!на Н.1.. Двгтярьов О.В. 1!зис еритроцат!в, зумовле-ний закислемкям середовица.- В зб«: "Тезиси доклад1в II Всесовз* но? конфереицИ по б!ох!м1"1' мембран", 1988,. И1иськ, с. 104.

2. Двгтярьов О.В,, Пвс1на Н.1. Роль пер!фер!чхих б!лков еритроцит!в у процес! л!зису, зумовленого закислениям середовиш У зб.: "Теоретичн! та практичн! аспекти сучасно! кр!об!олог!1", 1989, Харьков, ^аукова думка, с,18-21.

3. Пвс1«а Н.1., Бондареико В.А. Досл!дження впливу Сс1С12 и: структуру мембран ерктроцит!в при р!зних стресах.- У зб,: "Реко!

етрукц!я, стаб1л!зад1я та рзпарац!я поякодзсеиих б!олог!чэах мембран", Тез. доп. BcecoD3Horo снмпзз1уму, Благовецснськ» 1989, с.72.

flscÎKa НЛ., Бондареико В.А. Оснолярн!сть середовища та тривал!сть 1нкубацИ як два яэзалежних фактори, як! контролювть чутлив!стъ вритроднт!в до охолодження у середовищах, що м1отять неелоктрод1т,- V зб.:"Б1ох1и!чи! аспекта кр!опошкодквния та кр!о-захксту кл!тинних систен,~Харк1в, с.26-33.

5. Пес1на H.I«, Руденко C.B. Особливосг! розвитку холодового аоку еритроцит!» у середовищах, чо м!стять неелектрол1т.- У зб.: "Холодовий анаб1сз", Харк1в, IHKi К. Ш Ущ 1991, с.32-36.

б» Пвс1на H.I., Бовдаренкэ В„А. Холодова чутлив!сть еритроца-т!в у середовищах, що м1стят! невлектрэл!ти: значения часового фактору в iидуmiî спраятливостi до температурного та осмотичногв стреоу,- У зб.: "Б1ох1м1чн1 аспекты холодових адаптац1й", Харк!в, ИШКАНУкр.. 1991, о.130-123,

7. Бондареико Т.П., !(ельн1кова О.В., tleotsa H.I. Внесок тен-пературно! та осмотичио! компонент у розвнток xpioreMoii3y при ке-гативних температурах,- У зб«: "21знко - xiMÎMHi процесн в кр!о~ б1олог!чних системах", Xapxis, IïïKi К. АН У*р„ 1991. с.3-13,

8. ¡leo i на H.I. Фактори, як! контроявють чутлив!сть еритроци-т!в до охолодження у розчинах, що мхстять меелектрол1т.~ У зб.: "Вплив холода на' б!олог!чн! об'вкти", K.UVÛ , Наукова думка, 1992,

с.50-56.

9. Пвс1на H.I., Бондареико В.А.,, Фактори, як! контролювть чутли»1сть еритроцит!в до охолодження у розчинах, що м!стять не-електрол1ти,- У зб,: "Усп!хи сучаско! Kpioôioxoriï", Тез. доп. II MiïHapoflHiii конференцП, Харк1», 1992, с.138-139. ^

10. П«с1на H.I., Семенченко 0.JD. Значения скелет - мембраного комплексу еритроцит!в у процес1 розвитку чутливост! до зм1ни тем-пературно-осмотичннх умов середовица.- У зб.: "Тез. доп. У1 Укра-ÏHCbKoro б!ох1мичиого з'Гзду1', Ки!в, 1992, ч.Ш, с.91.

11. Песiна H.I. Розвиток чутливост! еритроцит!в до охолодхеи-ия у середовищах, цо м!стять неелектрол!ти// Проблеми кр!об!оло-riï.— 1993, M.- с.52-54.