Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование АТФ-связывающих центров ферментов с помощью флуоресцентных аналогов нуклеотидов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование АТФ-связывающих центров ферментов с помощью флуоресцентных аналогов нуклеотидов"

г Г и ОД

' РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

- '! АИР ISS-'i---------------

ИНСТИТУТ ХИМИЧЕСКОЙ ФИЗИКИ ИМ. H.H. СЕМЕНОВА

На правах рукописи

Кондратьева Татьяна Александровна

ИССЛЕДОВАНИЕ АТФ-СВЯЗЫВАЮЩИХ ЦЕНТРОВ

ФЕРМЕНТОВ С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ АНАЛОГОВ НУКЛЕОТИДОВ

03. 00. 02. - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1994

Работа выполнена во Всероссийском научном центре по безопасности биологически активных веществ

Научный руководитель:

Доктор биологических наук Л.В.Татьяненко Официальные оппоненты:

Доктор химических наук,

профессор Б.И.Курганов

Кандидат биологических наук С.Ю.Дружинин

Ведущая организация: Институт физиологически активных веществ РАН

Защита состоится "21" алАеиЛ/ 1994 г.

/

в /У час. на заседании Специализированного совета Д. 002.26. 07 в Институте химической физики РАН. Адрес: 117 977, Москва, В-334, ГСП-1, ул. Косыгина, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической физики РАН.

Автореферат разослан МХ^'и^о, 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат химических наук

М.А.Смотряева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из актуальных задач современной энзимологии является установление механизма действия ферментов, выяснение вопроса о том, каким образом химическое строение ферментов обеспечивает их высокую специфическую активность.

Среди большого разнообразия различных ферментов особый интерес представляют ферменты, которые ускоряют химические процессы, протекающие с затратой энергии. К ним относятся различные АТФазы, в частности АТФазы, катализирующие активный транспорт ионов и других веществ против концентрационных градиентов, а также АТФазы, сопрягающие гидролиз АТФ с химическими превращением низкореакционных соединений, таких, например, как молекулярный азот и т.д. Эти ферменты катализируют наиболее важные процессы, происходящие в живой природе.

Нитрогеназа является центральным ферментом биологической фиксации азота и играет ключевую роль в кругообороте азота в природе.

Транспортные АТФазы обеспечивают мышечное сокращение, биоэнергетические процессы, проведение нервного импульса, а также стимулируют процессы биосинтеза.

Пространственная структура этих ферментов мало изучена, так же как и расположение активного центра на глобуле белка и взаимное расположение каталитически активных групп. Из-за методических трудностей получения кристаллов белка метод рентгеноструктурного анализа пока неприменим к большому количеству белков, особенно белков, связанных с биологическими мембранами. В связи с этим в настоящей работе проводилось изучение строения активных центров

нитрогеназы и других ферментов с помощью кинетических и спектральных методов.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось исследование структуры АТФазного центра нитрогеназы и Са-АТФазы, а также нуклеотидсвязывающего центра креатинкиназы с помощью аналогов субстрата методом спектрофлуориметрии.

В задачи исследования входило:

- изучить конформацшо е-АТФ в растворе и в АТФ-связывающем центре нитрогеназы, креатинкиназы и Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума методами спектрофлуориметрии

- выяснить стехиометрию Мо-Ре-белок : Бе-белок в составе азотфиксирующего комплекса

- изучить топографию активного центра нитрогеназы различными спектрофлуориметрическими подходами с использованием е-АТФ

- разработать метод синтеза и изучить спектральные свойства аналога АТФ, обладающего флуоресцентными и фосфоресцентными свойствами

Научная новизна. Установлено, что е-АТФ с разрывом 2'С-З'С связи рибозного кольца в водном растворе находится в более раскрытой конформации по сравнению с конформацией е-АТФ без разрыва 2'С-З'С связи

- спектрофлуориметрическим титрованием Мо-Ре-белка Ре-белком, меченым е-АТФ, показано, что стехиометрия Мо-Ре-белок : Ре-белок в составе азотфиксирующего комплекса равна 1 : 1

- е-АТФ взаимодействует с нитрогеназой и Са-АТФазой таким образом, что е-адениновая структура располагается в щели белковой глобулы

-3- е-АТФ в составе азотфиксирующего комплекса находится вблизи Ре-Мо-кофакгора

- получено новое производное е-АТФ, которое обладает флуоресцентными и фосфоресцентными свойствами

- на примере нитрогеназы, Са-АТФазы и креатинкиназы показано, что конформация нуклеотида в активном центре фермента в значительной степени зависит от природы этих ферментов.

Практическая значимость работы. Научные результаты, полученные в настоящей работе, могут быть использованы в лабораториях, занимающихся изучением структуры и механизма действия нитрогеназы, Са-АТФазы и других АТФаз.

- Вг-е-АТФ, обладающий флуоресцентными свойствами, может быть рекомендован для исследования топографии АТФ-связывающих центров ряда ферментов различными спектральными методами.

- е-АТФ, как было показано нами на примере пестицидов, динуклеотидов и полинуклеотидов /Изв. АН СССР, 1988/, может использоваться в качестве высокочувствительного флуоресцентного зонда для выяснения констант комплексообразования различных ионов металлов с комплексонами высокочувствительными спектрофлуориметрическими методами.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на 1У Всесоюзном биохимическом съезде (Москва, 1979), на I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), на У1 Баховском коллоквиуме по биологической фиксации молекулярного азота (Чернигов, 1980), УН Баховском коллоквиуме по азотфиксации (Тбилиси, 1983), на ГУ Международном симпозиуме по гомогенному катализу (Ленинград, 1984).

Публикации.По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

Струкгура работы.Диссертация состоит из введения, обзора литературы (I глава), методического раздела (II глава), экспериментальной части (III - Y главы), заключения и выводов.

Материал диссертации изложен на страницах, включает 56 рисунков и 8 таблиц. Список использованной литературы включает

наименования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выделение нитрогеназы. Компоненты нитрогеназы (Ре- и Мо-Fe-белки) выделяли из аэробных бактерий AzotoBacter vinelandii (штамм 0) модифицированным методом Брилла /1977/. По данным диск-элекгрофореза в 7% полиакриламидном геле выделенные белки были гомогенны, Rf = 0,79 (Fe-бвлок) и Rf = 0,30 (Mo-Fe-белок). Удельная активность Fe-белка составляла 1800-2600 нмоль С2Н2 мин^мГ"1. Mo-Fe-белок обладал активностью 1800-2300 нмоль С2Н2 мшНмг-1. Все работы по очистке и исследованию фермента проводились в атмосфере аргона.

Mo-Fe-белок, не содержащий Fe-Мо-кофактора, выделяли из AzotoBacter vinelandii (штамм UW - 45). Активность этого препарата в комплексе с Fe-бвлком и Fe-Мо-кофактором составляла 1000-1600 нмоль С2Н2 МИН^МГ"1.

Fe-Мо-кофакгор выделяли по методу Шаха и Брилла /1977/ из кристаллического Mo-Fe-белка экстракцией N-метйлформамидом. Соотаошение Mo : Fe в Fe-Мо-кофакторе составляло 1 : 7.

Выделение саркоплазматического регикулума. Проводилось из мышечных волокон быстрого типа (белые мышцы) задних конечностей кролика методом ступенчатого центрифугирования в градиенте сахарозы по методу Ритова /1977/. Удельная активность препарата составляла 10-12 мкмоль АТФ/мг белка в минуту.

Определение активности нитрогсназы и ее компонентов. Ферментативную активность определяли по восстановлению С2Н2 до С2Н4 на газожидкостном хроматографе "Цвет", модель 1-64 с пламенно-ионизационным детектором.

Определение активности Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума. АТФазную активность измеряли рН-метрически по методу Болдырева /Болдырев, 1977/ на рН-метре "рН-262".

8-производные адениновых нуклеотидов бьши получены реакцией АТФ с а,р-дибромэтилацетатом (Схема I). Вг-е-производные соответствующих нуклботидов получали из Вг-производных с последующей конденсацией ¡с а,р-дибромэтилацетатом при рН 4,5 - 5,5. Очистка проводилась на колонке с ДЭАЭ-

Получение флуоресцентных аналогов АТФ.

Схема 1.

сефадексом А-25 элюированием линейным градиентом (0 - 0,5 М) триэтиламмонийбикарбонатного буфера.

Получение диальдегидных производных адениновых нуклеотидов проводилось с помощью реакции с NaJC>4 при 2°С в темноте в течение 1 часа с последующей очисткой гельфильтрацией на сефадексе G-10. Степень окисления нативного и флуоресцентного АТФ, определенная с дифенилгидразином и феррицианидом, составляла - 98% .

Аффинную модификацию ферментов проводили с помощью 3 часового инкубирования при 2°С фермента с 10-кратным избытком нуклеотида, окисленного перийодатом натрия и очищенного гельфильтрацией на сефадексе G-10, с последующим восстановлением 10-кратным избытком боргидрида натрия в течение 30 минут. От избытка метки освобождались гельфильтрацией на колонке с сефадекс G-25.

Модификация с о-фталевым альдегидом (о-фа) проводили с помощью 2-часовой инкубации фермента при комнатной температуре с раствором о-фа, перекристаллизованного из пентана.

Квантовый выход определяли методом сравнения квантового выхода е-АТФ и Br-e-АТФ, имеющих одинаковые ^в03б.=312 нм и Я.макс =415 нм, на спектрофлуориметре "Aminco-Bowman" (USA).

Определение расстояния между донором и акцептором методом спектрофлуориметрии. В случае диполь-дипольного переноса энергии с хромофора на тушитель расстояние между ними определяли по формуле Ферстера-Галанина. Для нитрогеназного комплекса использовали три значения фактора ориентации, а затем сравнивали значения Ro и R.

Определение констант связывания. Проводили по уравнению:

/Ьска. п П

где Ьсвяз - концентрация связанных ионов металла, ЬСВОб -концентрация свободных ионов металла, Р - исходная концентрация нуклеотида, п -число связывающих центров, Ксвяз. -константа связьшания.

Расчеты производили по интенсивностям флуоресценции нуклеотида в присутствии и отсутствии ионов тушителя.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Изучение нитрогеназы с помощью аналогов АТФ. В качестве аналогов АТФ использовали диальдегидное производное АТФ (о-АТФ), о-АТФ, восстановленный КаВН4 (ов-АТФ), е-АТФ, Вг-АТФ, о-е-АТФ, ов-е-АТФ, Вг-е-АТФ и п-азидоанилидо-е-АТФ. ов-АТФ был более чем в 30 раз менее эффективным субстратом, чем АТФ. о-АТФ, е-АТФ, о-е-АТФ, ов-е-АТФ. Вг-е-АТФ и п-азидоанилидо-е-АТФ были неэффективны в нитрогеназной реакции нитрогеназы. Из них е-АТФ и ов-е-АТФ конкурентно и обратимо ингибировали активность фермента (К;= 5-9 х 10"4М и 3-5 х 10"4М, соответственно). о-АТФ и о-е-АТФ ингибировали фермент необратимо, повидимому за счет образования с ферментом основания Шиффа, а п-азидоанилидо-е-АТФ не ингибировал фермент и не связывался с ним (100-кратный избыток, облучение при 360 нм). На основании этих данных предполагается, что пространственная структура нуклеотида играет важную роль в АТФазной реакции нитрогеназы.

Для Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума флуоресцентные аналоги (е-АТФ, Вг-е-АТФ) конкурентно

ингибировали АТФазную реакцию. Производные АТФ с изменениями в рибозной части снижали в 3-10 раз активность фермента. Изменение длины фосфатного конца (от АМФ до АТФ и п-азидоанилидо-е-АТФ) существенно сказывалось на активности. Таким образом исследовались соединения, отличающиеся от АТФ в адениновой, фосфатной частях и по сахарному остатку. Для обоих ферментов необходима вся структура АТФ в целом, так как даже небольшие изменения ее очень существенно сказываются на активности ферментов.

Изучение структуры аналогов е-АТФ. Согласно гипотезе Сцент-Джорджи, в ферментативных реакциях, протекающих с участием нуклеотидов, истинным субстратом является комплекс [нуклеотид-Ме]2-. Для флуоресцентного аналога (е-АТФ) ион металла является тушителем флуоресценции. Квантовый выход е-АТФ, имеющий значение 0,6, резко падает при добавлении ионов одновалентных и двухвалентных металлов (Св+ , Си2+, №2+ , Со2+ , Бе24") Снижение квантового выхода такого комплекса обусловлено связью иона металла с полифосфатной частью, что способствует сближению с е-адениновой структурой е-АТФ и ов-е-АТФ. Титрование этих соединений ионами №2+ или Со2+ (которые заменяют ионы Мя2+ в АТФазной реакции) показало, что ов-е-АТФ тушится значительно хуже (Кд= 3 » 10"6М и 1,6 * 10"5М), что в результате разрыва связи 2'С-З'С рибозы образуются дополнительные степени свободы -возможность вращения вокруг этих связей. Таким образом в ов-е-АТФ адениновая часть удаляется от полифосфатной части молекулы.

При аффинном мечении нитрогеназы с помощью ов-е-АТФ с последующим восстановлением боргидридом до ов-е-АТФ тушение ионами Со2+ осущесвлялось не полностью, а только на 50%, но при значительно меньших концентрациях, чем для метки в растворе. При

этом константы диссоциации, вычисленные по результатам титрования для иммобилизованного нуклеотида составляли 8 х 10"6М, а для свободного - 1,6 х 10"5М. Это свидетельствует, о том, что в составе нитрогеназы о-е-АТФ находится в более сложенной конформации по сравнению с о-е-АТФ в растворе.

В составе нитрогеназы аффинная метка обнаружена у обоих компонентов (Мо-Ре- и Ре-белках). После разделения нитрогеназы на компоненты тушения флуоресценции Мо-Ре-белка не наблюдается. Это, повидимому, обусловлено расположением метки в кармане белковой матрицы, из-за чего ее доступность ионам Со2+ становится невозможной. У Ре-белка, напротив, флуоресценция возрастает на 10-30%, а затем снижается до исходного уровня. Такие изменения флуоресценции наблюдаются при соотношении [Ре-белок] : [е-АТФ] = 1:1. Аномальный характер этого тушения, возможно, связан с конформационными перестройками полипептидной цепи белка в районе АТФ-связывающего центра, в результате чего становится возможным удаление адениновой части от железо-серного кластера 4Ре-48 на расстояние в несколько ангстрем.

Топография АТФ-связывающих участков Ре-белка относительно ЖСК Мо-Ре-белка и Ре-Мо-кофактора. Явление индуктивно-резонансного переноса энергии между донором и акцептором позволяет количественно оценить расстояние между ними. Электронный спектр Мо-Ре-белка перекрывает почти всю ультрафиолетовую и видимую часть спектра и имеет характерное слабое разрешение, что позволяет его использовать в качестве акцептора для флуорофоров природного (триптофановые остатки МоРе-белка) и искусственного (е-АТФ) характера. Участок АТФазного центра Мо-Ре-белка расположен рядом с ЖСК, но удален от Ре-Мо-кофактора. Ковалентно присоединив метку к нитрогеназе, а затем

хроматографически разделив на компоненты (Мо-Ре-белок и Бе-белок) мы получили возможность исследовать меченые е-АТФ белки нитрогеназы с помощью тушителей. В качестве тушителей меченого-АТФ Бе-белка мы использовали три различных препарата Мо-Бе-' белка (Рис. 1):

Ре-белок Мо-Ре-белок I Мо-Ре-белок

Рис 1. Схема эксперимента.

1. Мо-Ре-белок нативный (выделенный из дикого штамма азотобактера)

2. Мо-Ре-белок, имеющий ЖСК и Ре-Мо-кофактор после кислотно-щелочной обработки с удаленными ЖСК

3. Мо-Ре-белок, выделенный из мутанта азотобактера ШУ-45, который не имеет Ре-Мо-кофактора.

Характеристики этих белков приведены в таблице 1.

-11-Таблица 1.

№№ Препарат п/п фермента Удельная активность (НМОЛЬ С2Н2/МИН мг белка) Содержание Fe, Mo (г-атом/моль белка) Fe/Mo

Mo Fe

1. Мо-Ре-белок (дикий штамм) 2400 1,9+0,05 32+0,5 16,7

2.а. Мо-Ре-белок мутантный (из ЦЛУ-45)

б. Мо-Ре-мутант

+Ре-белок

в. Мо-Ре-мутант

+Мо-Ре-белок

г. Мо-Ре-белок

после обработки НС1 + Ре-белок

0,4-0,8

16-20 25-40

950±50

Далее из меченого Ре-белка и всех трех вариантов Мо-Ре-белков образовывали нитрогеназный комплекс, исследуя изменение флуоресценции иммобилизованного е-АТФ. При

титровании меченого Бе-белка нативным Мо-Бе-белком наблюдали 4-кратное тушение флуоресценции е-АТФ в составе Бе-белка со смещением максимума флуоресценции на 15-20 нм коротковолновую область. Стехиометрия белков в образующемся комплексе равна 1 : 1 (Рис. 2).

Рис 2. Сдвет максимума флуоресценции Бе-белка, меченого е-АТФ , при титровании Мо-Бе-белком: нативным (•) и из мутанта азотобактера Ц\У-45 (о).

Аналогичное тушение (в 4 раза) и сдвиг максимума флуоресценции получили и для Мо-Бе-белка с удаленными ЖСК. При титровании меченого Бе-белка Мо-Бе-белком из мутантного штамма 1ЛУ-45 интенсивность флуоресценции е-АТФ не падает, а максимум флуоресценции сдвигается на 15-20 нм в коротковолновую область (см. рис. 2). Практически одинаковое тушение флуоресценции меченого е-АТФ Бе-белка нативным Мо-Бе-белком и Мо-Бе-белком без ЖСК свидетельствут о том,что основной вклад в тушение флуоресценции вносит кластер Бе-Мо-кофактора. По величине этого тушения по формуле

где 10 - интенсивность флуоресценции без тушителя,

I - интенсивность флуоресценции в присутствии тушителей, влияние которых описывается суммой по всем действующим тушителям,

Я - расстояние от-АТФ до тушителя,

Яо -характерное расстояние между тушителем и хромофором, флуоресценция которого за счет миграции энергии уменьшается в два раза

где N - число Авогадро,

п - показатель преломления среды, К2 - фактор ориентации, характеризующий взаимную ориентацию направления векторов моментов переходов в доноре и акцепторе,

т|- квантовый выход флуоресценции донора, ДА.) - спектральное распределение интенсивности флуоресценции донора,

е- молярный коэффицент поглощения акцептора. При расчетах использовались следующие значения: п = 1,68; К=1/3; 0,583;

Оценено расстояние от АТФ-связывающего участка Бе-белка до Бе-Мо-кофактора Мо-Бе-белка. Это расстояние с учетом значений фактора ориентации 2/3 (для случайной ориентации) и 0,475 (для жесткой фиксации) находятся в пределах (15 + 1) А (табл. 2). Оценка

9000* 1п10«К2« т} \ Г(Я)£(А)ЛгсЦ 128* п4

5/6.

минимального расстояния, на котором ощущуается вклад в тушение ЖСК Мо-Ре-белка на основании этих расчетов составила (23 + 2) А.

Таблица 2.

Оценка расстояний (А) между е-АТФ в АТФ-связывающем центре Ре-белка и ЖСК Мо-Ре-белка при образовании нитрогеназного

комплекса.

Яо для Ре-белка для Мо-Ре-белка Ях Кг И.з ДИ-з 1^4

на 1 кластер на 1 кластер

23±2 33±2 13±1 15±1 17 4±1 21-25

где ДЛз - изменение расстояния между местом посадки е-АТФ на белке и его ЖСК в результате конформационного перехода при образовании комплекса. При расчете использовали 3 различных значения фактора ориентации.

При образовании комплекса из меченого Ре-белка с мутантным Мо-Ре-белком происходит увеличение флуоресценции е-АТФ, видимо, вследствие конформационной подвижности полипептидной цепи Ре-белка в области связывания АТФ. Оценено расстояние удаления е-адениновой части Ре-белка от ЖСК Ре-белка - (4 + 1) А. Расстояние от е-АТФ в составе Мо-Ре-белка от ЖСК Мо-Ре-белка составляет 10-12 А , а от Ре-Мо-кофактора - 18-23 А .е-АТФ в Ре-белке находится в 10-14 А от ЖСК этого белка.

Полученные результаты позволяют предположить наличие в нитрогеназе 2 АТФ-связывающих центров, один из которых расположен ближе к ЖСК, а второй - ближе к Ре-Мо-кофактору.

Определение глубины залегания и микроокружения е-АТФ в АТФазных центрах. Использование тушителей различной полярности и заряда позволяют сделать выводы не только о доступности метки в составе белка, но и о ее микроокружении, т.е. характеризовать АТФ-

связывающий центр. Наклон зависимости Штерна-Фольмера ^ -1 от

[Т] для свободной метки принимается за единицу, а значение ее в долях этой величины - свидетельство размещения метки в щели. Отсутствие тушения метки в составе Мо-Бе-белка ионами Со2+ (и наличие тушения для акриламида и йодид-иона) свидетельствуют о размещении метки в щели белковой глобулы и наличии положительного заряда. Кроме того по увеличению доступности метки после разделения на компоненты можно вполне определенно сказать о расположении АТФ-связывающего центра на стыке 2 компонентов.

Изучение триптофановых остатков. Из компонентов нитрогеназного комплекса триптофановые остатки содержатся только в Мо-Ре-белке. Максимум спектра флуоресценции триптофанилов этого белка составляет 340 нм, что свидетельствует о гидрофобном окружении их на белковой макромолекуле. После разделения комплекса на компоненты их доступность тушителям увеличивалась в несколько раз, что предполагает их расположении на стыке белков, или по крайней мере их части, обладающей большим квантовым выходом.

Изучение триптофановых остатков Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума показало, что основная часть остатков триптофана доступна как для нейтральных тушителей, так и для тушителей, несущих заряд. Для ионов Со2+ наблюдается более высокая степень тушения, что позволяет предположить наличие

хелатирующих групп рядом с тршггофанилами. Как и для нитрогеназы, триптофановые остатки Са-АТФазы расположены в щели белковой матрицы.

Исследование влияния Вг-е-нуклеотидов на АТФазы. Аналоги пуриновых нуклеотидов широко используются для изучения различных классов ферментов. С целью расширения класса этих соединений был синтезирован ряд бромированных аналогов е-адениновых нуклеотидов - Br-е-нуклеотиды. Полученные соединения очищали методом колоночной хроматографии на ДЭАЭ-сефадексе А-25 линейным градиентом триэталаммонийбикарбонатного буфера. Определены температуры плавления, элементный состав, вычислена электрофоретическая подвижность относительно природных АТФ, АДФ и АМФ в различных системах растворителей. рН зависимость электронных спектров Вг-е-АТФ показала отсутствие этой зависимости в интервалах рН 7-10. Выявлено, что бром не влияет на электронные уровни молекулы.

В спектрах возбуждения имеется полоса в области 300-320 нм, а в спектрах флуоресценции - в области 415-420 нм. Вычислен квантовый выход Вг-е-АТФ - 0,025, что значительно ниже, чем у е-АТФ (0,6). Исследована зависимость квантового выхода Вг-е-АТФ (Рис. 3) от рН. рК=4,1. Повидимому за флуоресценцию ответсвенна непротонированная форма гетероцикла.

Вг-е-АТФ обладает также фосфоресцентными свойствами. Спектры возбуждения и эмиссии фосфоресценции представлены на рис. 4.

рН-зависимость спектров фосфоресценции приведена на рис. 3. Максимальная фосфоресценция проявляется в области рН 6-10. рК = 3,9. Время жизни фосфоресценции составляет около 2 # 10_2сек.

Рис 3. рН - зависимость эмиссии флуоресценции и фосфоресценции Вг-е-АТФ.

1 - флуоресценция, возбуждение при 312 нм, Хмакс=420нм.

2 - фосфоресценция, возбуждение при 310 нм, Хмакс=470нм.

Концентрация нуклеотида 1*10"4М.

Рис. 4. Спектры возбуждения и эмиссии флуоресценции и фосфоресценции Вг-е-АТФ

-181. Спектр возбуждения, регистрация флуоресценции при 420нм,

2. Спектр флуоресценции, возбуждение при 312нм,

3. Спектр возбуждения, регистрация фосфоресценции при

470нм,

4. Спектр фосфоресценции при рН 8.0, возбуждение при ЗЮнм,

5. Спектр фосфоресценции при рН 6.0, возбуждение при ЗЮнм,

Спектры фосфоресценции регистрировали при 77°К в универсальном буферном растворе.

Проведно исследование тушения флуоресценции Вг-е-АТФ ионами двухвалентных металлов. По степени тушения флуоресценции эти ионы располагались в ряд: Мп2+<2п2+<Со2+<№2+<Си2+. М§2+,Са2+,Сс12+ не влияли на флуоресценцию. Определены значения констант диссоциации по тангенсу угла наклона зависимости Р/Ьсвяз от 1/Ьсвоб. Полученные результаты представлены в таблице 3.

Для изучения конформации этого нуклеотида в составе фермента было проведено аффинное мечение креатинкиназы с помощью диальдегидного производного Вг-е-АДФ. При титровании креатинкиназы, меченой Вг-е-АДФ ионами Со2+, зависимость Р/Ьсвяз от 1/ЬСВОб. имела перегиб, свидетельствующий о наличии двух центров связывания АДФ. В одном из центров нуклеотид находился в более раскрытой конформации по сравнению с Вг-е-АДФ в растворе.

-19-Таблица 3

Константы диссоциации 8-Вг-е-АТФ с ионами двухвалентных

металлов

Ион рКа 1к,% Кд, РКд Кд,

металла М для е-АТФ, М

Мп++ 0,7 24,8 2,26*10-5 4,6 8,3*10-6

2п++ 9,6 69,7 4,6*10-6 5,3 5,9*10-5

1,5*10-4 3,9

Со++ 9,6 96,2 8,00*10-6 5,1 1,07*10-5

N1++ 9,4 97,0 5,0*10-6 5,3 -

Си++ 7,53 98,0 4,5*10-6 5,34 2,44*10-6

1к - предельное тушение данным ионом металла в %.

рКа - константа основности иона металла, вычисленная из значений Ка.

Кд - эффективная константа диссоциации комплекса нуклеотид-ион металла.

рКа = Кд рКд = 18 Кд

Выводы

1.АТФ-связывающий центр нитрогеназы расположен на расстоянии около 20 А от Ре-Мо-кофактора Мо-Ре-белка.

2.При взаимодействии с АТФ-связывающим центром нитрогеназы АТФ в комплексе [АТФ-Ме]2- располагается в полости белковой глобулы на стыке Бе- и Мо-Ре-белков и находится в сложенной конформации.

3.АТФ располагается в АТФазном центре нитрогеназы таким образом, что адениновая часть молекулы находится в гидрофобной щели белка, а трифосфатная часть, повидимому, на поверхности белковой глобулы.

4.Методом спектрофлуориметрического титрования Бе-белка, меченого е-АТФ, различными Мо-Ре-белками установлено, что в азотфиксирующем нитрогеназном комплексе стехиометрия МоРе-белок : Бе-белок равна 1:1.

5.Синтезированы и изучены спектральными методами Вг-е-адениновые нуклеотиды. Показано: а) квантовый выход этих соединений в 20 раз ниже, чем квантовый выход £-нуклеотидов, б) помимо способности флуоресцировать Вг-производные е-нуклеотидов обладают фосфоресцентными свойствами, в) флуоресценция Вг-производных 8-нуклеотидов тушится ионами металлов переходной группы.

6.Нуклеотиды в активном центре креатинкиназы и Са-АТФазы находятся в более раскрытой конформации по сравнению с активным центром нитрогеназы.

7.Проведенные в настоящей работе исследования АТФ- и АДФ-связывающих центров нитрогеназы, креатинкиназы и Са-АТФазы с помощью е-нуклеотидов свидетельствуют о том, что эти соединения являются хорошим инструментом для изучения нуклеотидсвязывающих центров различных ферментов и комплексообразования нуклеотидов с ионами металлов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Г.И.Лихтенштейн, Р.И.Гвоздев, И.З.Мицова, В.И.Евреинов,

Т.А. Кондратьева. Исследование топографии и механизма действия АТФазных центров нитрогеназы. //Тезисы ГУ Всесоюзного биохимического съезда, Москва, "Наука", 1979, т. 1, с. 258.

2. И.З.Мицова, Т.А.Кондратьева, Р.И.Гвоздев. Роль Ре-Мо-кофактора в образовании каталитически активного центра нитрогеназы. //Докл. АН СССР, 1980, т.251, с. 494-497.

3. Т.А.Кондратьева, Р.И.Гвоздев, Г.И.Лихтенштейн. Исследование конформации АТФ в каталитически активном АТФазном центре нитрогеназы. //Кинетика физико-химических реакций. Черноголовка, 1981, с. 128-129. .

4. Т.А.Кондратьева, Р.И.Гвоздев, И.С.Блажчук, А.И.Скрйпкин, А.В.Шишков. Исследование локализации природных и искусственных хромофоров на макромолекуле ферментов. //Тезисы I Всесоюзного биофизического съезда. Москва. 1982, т. 1, с.141.

-225. Т.А.Кондратьева, Громова Л.А. Исследование роли различных функциональных 1рупп АТФ в АТФазной реакции Са2+-М§2+-зависимой АТФазы саркоплазматического ретикулума. //Кинетика и механизм физико-химических реакций. Черноголовка, 1982, с. 170-171.

6. И.З.Мицова, Т.А.Кондратьева. Исследование строения АТФазного центра нитрогеназы азотобактера. //Биологическая фиксация молекулярного азота. Киев, 1983, с.223-225.

7. Т.А.Кондратьева, Р.И.Гвоздев, Л.В.Татьяненко. Спектральные свойства 8-бромэтенопроизводных адениновых нуклеотидов. //Химия гетероциклич. соед., 1983, № 7, с.987-992.

8. И.С.Блажчук, Р.И.Гвоздев, Т.А.Кондратьева, И.З.Мицова, А.Ю.Скрипкин, А.В.Шишков. Аминокислотные остатки поверхности контакта субъединиц. //ГУ Международный симпозиум по гомогенному катализу. Ленинград, 1984, т.2, с.111.

9 Т.А.Кондратьева, Р.И.Гвоздев, И.З.Мицова. РасположениеАТФ-связывающего участка Бе-белка относительно железо-серных кластеров 4Ре-4Б и железо-молибденсодержащего кофактора. //Биохимия, 1985, т. 50, вып. 12, с. 1965-1971.