Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование амплификации и экспрессии генов MDR и FOS в клетках человека, хомяка, мыши и их гибридах, различающихся по устойчивости к бромистому этидию

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование амплификации и экспрессии генов MDR и FOS в клетках человека, хомяка, мыши и их гибридах, различающихся по устойчивости к бромистому этидию"

институт цитологии российской академии наук

На правах рукописи УДК 577.218.3.530/575.22.46

ЛИПСКАЯ Лариса Анатольевна

ИССЛЕДОВАНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ И ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ЛЮК И РОБ В КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА, ХОМЯКА, МЫШИ И ИХ ГИБРИДАХ, РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ ПО УСТОЙЧИВОСТИ К БРОМИСТОМУ ЭТИДИЮ

Специальность: 03.00.25 — Клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

санкт-петербург 1992

Работа выполнена и Лаборатории генетических механизмов диффереи-цировкн и малнгпезации клеток Института цитологии РАН и Лаборатории оикогсматолопш Женевского Университета.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Т. Н. Игнатова; кандидат биологических наук К. В. Сальников.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук С. Н. Борхсе-ниус; доктор биологических наук С. А. Кетлинский.

Ведущее учреждение — Онкологический научный центр РАМН.

Защита состоится »64ЛЛХ/ЛлЛЛ 1992 г. в часов

на заседании Специализированного сойота Д.002.73.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064 г. Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологи

1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор биологических наук

Л. Н. Писарева

© Институт цитологии РАН, 1992

i ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. ,,

Актуальность темы исследования. Известно, что клетки млекопитающих под воздействием некоторых • циготоксических препаратов спонтанно приобретают устойчивость к широкому crrairrpy липофильных агентов, таких, как колхицин, адриамицин, винбластин, винкристин, актиномицин Д, эпиподофиллотоксин, бромистый этидий и ряду других ядов. Этот Феномен, называемый множественной лекарственной устойчивостью (ИЛУ), представляет серьезную проблему в химиотерапии опухолей человека. Подобный Феномен наблюдается также in vitro при культивировании клеток постоянных линий в присутствии определенных ядов (Endicott, . Line, 1989;.Juranka et al., 1909).

Типичным механизмом; обеспечивающим устойчивость клеток к ядам и антиметаболигзм является экспрессия в устойчивых клетках трапсмембрашшого гликопротеина с молекулярной массой 130-200 кДА, получившего название Р-гликопротеин (англ. "permeability"). Функционально Р-гликопротеин представляет собой энергозависимую помпу, удаляющую яда из устойчивых клеток, понижая тем самым внутриклеточное содержание яда. Р-гликопротеин кодируется одним из членов небольшого семейства генов - mdr генов, (multidrug resistant). СеМвЙСТВО mdr IBHOB включает как минимум, три гена у грызунов и два гена у человека.

Таблица 1.

Классификация генов mdr в клетках различных видов:

класс i класс II

человек MDR 1 MDR 2

мышь mdr la .ИЛИ mdr 3 mdr lb ИЛИ mdr- 1 mdr 2

хомячки Р8Р 1 . РЙР 2 F8P 3

Зкспероменты проведенные с применением- трансакции генов mdr показали.-что только гекы, относящиеся к I классу приводят К развитию фенотипа МЛУ (Dovault, Groas, 1990).

Повышенная экспрессия Р-гликопротеина. приводящая к развитию «генотипа МЛУ, достигается у млэкощтающих при помощи 'различных механизмов, включая амплификацию генов, выявляемую как на молекулярном уровне, так и при анализа кзриотипа устойчивых клеток в виде- дополнительного генетического материгла (Roninson с. al'.,' 1984; 5cott,o et al., 1Э86; .Riordan

et al., 1986; Shen et al, , 1986; Teeter et al.,.1986; van der Bliek et al.,.1986). аКТИВаЦИЮ ТраНСКрИПЦИИ (Shen et al., 1988) И трансляционную регуляцию (Bradley et al., 1989).

Предполагается, что в регуляции экспрессии гена mdr участвует комплекс Fos/Jun, который связывается с ар-1 сайтом в области промотора гена, причем для генов хомяка pgpi и мыши mdri/ib комплекс Foa/Jun осуществляет положительную регуляцию (Bhusman et al., 1992; ikegushi et al., 1991). Предполагается, что наличие добавочного сie-негативного элемента в области промотора мышиного гена mdr3, приводит к негативной регуляции экспрессии ЭТОГО гена комплексом Fos/Jun (Teeter et ь1., 1991). Косвенно об'этом свидетельствуют следующие данные: 1.Обработка клеток ядами группы МЛУ вызывает повышение в 3-6 раз экспрессии гена foa, предшествующее повышению экспрессии гена mdr (Bhusman et al., 1992); 2. В области промотора гена mdr 1 обнаружена специфическая регуляторная последовательность

Б"..,tgag/£tca...3', представляющая собой сайт связывания для комплекса fos/jun (Ueda et al., 1987; Hsu et al.. 1990). Имеются также сведения о прямой активации промотора mdr ДНК-тропными агентами (Knhno,19вЭ).

Таким образом исследование постоянных клеточных линий, обладающих МЛУ, может способствовать как пониманию механизмов, ' лежащих в основа селекционной амплификации генов, так и изучению координированной регуляции экспрессии. В данной работе в качестве модальной системы мы использовали клетки постоянных' клеточных линий, селектированных в присутствии бромистого этидия (БЭ). Используемые в ' работе клеточные лишга характеризовались пониженным накоплением селективного агента и в ряде случаев проявляли. перекрестную устойчивость и имели кариологические маркеры амплификации генов (Гринчук и др., 1883-, Гринчук, Игнатова, 1933; Ефимовэ и др.,- 1984).

Амплификация генов, как способ быстрой адаптации меток к' меняющимся условиям окружающей среда, .либо как модификация , генома клеток, специализированных для выполнения определенных Функции широко распространена у'Эукариот и часто встречается в ■ геномах раковых .клеток и постоянных' клеточных линий (stark, Viahl, 1904; Hamlin et al.',, 1984; Schimke, 1384). Наиболее привлекательной из предложенных гипотез амгшвдикации является модель диспропорциональной 'репликации с последующей

рекомбйнациея (Schimks, 1984). Основным следствием«, этой гипотезы является положение о постоянной генерации клеткой экстрахромосомных молекул (эДНК), содержащих копии активно экспрессирующихся генов. Предполагается, что экстрахромосомные молекулы способны автономно реплицироваться, многократно повышая' уровень- амплификации гена. , и, в ряде случаев, экскретироваться клеткой В окружающую среду. (Adama, 1985; Сальников, 1990). Эта модель в целом остается недоказанной, хотя отдельные элементы теории имеет эксперементальное подтверждение. "

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы ■ состояла в выяснении специфических и неспецифических компонентов молекулярнЬ-генетических механизмов МЛУ в клетках постоянных линия различного видового и тканевого происхождения и их гибридах, полученных путем одно- и многошаговой селекции в присутствии БЭ. Более того, поскольку обычно возникновение МЛУ обычно ассоциировано с генными амплификациями, мы попытались найти эксперементальные подходы к изучению более ■ общего явления, а именно, мы попытались проанализировать первичные процессы образования в клетке дополнительного генетического материала. .

Конкретные задачи исследования состояли в следующем: .1 .Для выяснения участия в механизме устойчивости Р-гликопротеинов, являющихся специфическим компонентом МЛУ, провести анализ структуры, перестроек и экспрессии генов mdr в клетках линий, устойчивых к БЭ.

2.Для выяснения возможных механизмов регуляции экспрессии гена mdr прорости анализ структурных перестроек и экспрессии гена fos в клеточных линиях, экспрессирующих mdr.

■ З.Для выяснения неспецифических компонентов МЛУ провести изучение изменения активности эндогенных нуклеаз как развитие ответа' на стрессовые воздействия в клетках, не имеющих амплификации гена mdr и не экспрессирующих Р-гликопротеин.j

4.Для выяснения процессов приводящих к амплификации генов провести анализ экстрахромосомной ДНК в клетках, устойчивых к 'различным концентрациям БЭ, а также изучить связь процессов клеточной гибели в условиях стресса под воздействием ядов с процессами образования экстрзхромосомной и внеклеточной ДНК. Научная новизна работы. В' процессе выполнения работы мы

показали, что клетки различных линий, селектированные на устойчивость к БЭ и обладающие МЛУ содернют амплификацию генов таг I класса.. сопровождающуюся повышенной экспрессией. Амплификация различных генов при селекции человеческого хронического промиелолеикоза К5в2 в присутствии дцриамицина и БЭпозволяэт предположить специфичность БЭ как субстрата дня Р-гликопротеина, кодируемого геном мой г. Мы показали, что в некоторых' клеточных, линиях устойчивость к возрастающим концзнтрациям БЭ может достигаться за счет регуляции экспрессии генов таг. Данные об амплификации, и экспрессии гена ^в в некоторых линиях с МЛУ позволяют предполагать,, что этот ген может участвовать как в позитивной, - так и в негативной регуляции экспрессии гена таг.

Кроме того, нам удалось обнаружить довольно редкий случай так называемой "нетипичной МЛУ" - клетки обладают устойчивостью" к высоким концентрациям БЭ в отсутствии амплификации, и экспрессии генов таг. Мы показали, что в . этих линиях приобретение устойчивости к БЭ сопровождается • увеличением активности гп2+- независимой эвдовуклеазы, что возможно, имеет отношениз к изменению взаимодействия ДНК-тропных агентов с внутриклеточными мишенями.

Нам удалось получить некоторые новые данные об- • образовании амплифицированных последовательностей, которые укладываются в рамки теории амплификации Шимке (БсЫтке, 1984). В частности мы показали, что в клетке существует-внерепликативныи синтез ДНК, в том числе в условиях стресса под воздэаствдам ядов, приводящий к 'генерации эДНК, содержащих амплиФицированвыв последовательности. Копии амплифицированных последовательностей выделяются клеткой в окружающую среду. Более того, мы показали, что Фракция эДНК .в клетке неоднородна по составу и частично происходит вслздствии .процэссов, не связанных с оверрепликацией. а, возможно с делецией, репарацией, рекомбинацией. Мы впервые показали, что в процессах • образования эДНК участвует гг/^-независимая эндонуклеаза.

Практическая 'ценность работы. ' Полученные результаты углубляют имевшиеся представления о молекулярных механизмах 'устойчивости клаток к ядам и антиметаболигам. Данные о амплификации-и экспрессии гена таг ■ в клетках, устойчивых к БЭ значительно дополняют представления о Феномене МЛУ и имеют не

только1 теоретическую, но и практическую ценность в связи с широким использованием подобных ДНК-тропных агентов в химиотерапии опухолей. Данные об амплификацир и экспрессии гена foe в некоторых линиях с МЛУ могут способствовать пониманию механизма регуляции экспрессии гена mdr. Обнаруженные нами линии с "нетипичной устойчивостью" могут служить эксшрементальнои моделью для изучения других "не mdr-зависимых" механизмов обеспечения устойчивости клеток к ядам и антиметаболитам. Предложенный метод анализа гетерогенности Фракции эДНК с использованием импульсного мёчения БДУ открывает широкие возможности для дальнейшего-изучения Феномена образования и Функционирования эДНК ' с привлечением гибридазациоиного анализа конкретных Фракций. Сведения об экскреции клетками амплифицированных последовательностей, возможно содержащих копии активно экспрессирующихся генов, могут ' представлять интерес для практической онкологии.

Апробация- работы. Материалы диссертации были представлены на II Международном совещании по клеточному ядру <Суздаль 1889), на Всесоюзном совещании "Структура и Функции клеточного ядра" (Гродно, 1990), на 15 Международном конгрессе по биохимии (Иерусалим, 1991)., на п Всесоюзной конференции "Геном человека" (Переславль-Залвсский, 1991), на Всесоюзном совещании "Биология клетки а культуре" (Санкт-Петербург, 1992 v

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения,'" обзора литературы, материалов ' и методов исследования, результатов .собственных исследования, обсуждения, вывода® и списка литературы, содержащего публикаций отечественны!! и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 25 ' рисунжзии •и 7 таблицами.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДУ ИССЛЕДОВАНИЯ..

В работе использовали клетки постоянных клеточных линия с МДУ а также, их гибрида, полученные в результате одно- ш 'многошаговой селекции в присутствии КЭ в . повышающихся концентрациях:

1.К562 - линия человеческого хронического промиололегкозэ полученная от пациента на' стадии б-тзсткого криза (Lozzio пъ

- в -

V

al., 1981), а также. ев субЛЩЩИ ВЗ (K562/ADR-B3), селектор ванную в присутствии адриамицина (3 мкг/мл), и K562/EBR, селектированную В присутствии БЭ (3 МКГ/МЛ) (Ignatova et al., 1990).

2.L929 - мышиные ФИбробЛаСТЫ (Flow Lab, АНГЛИЯ), а также клонированные из нее линии ЬеЪг ЗМ5 и Lebr 350, устойчивые соответственно к 3 и БО мкг/мл БЭ (Сальников, 1988), и линию l 625, устойчивую к 25 мкг/ мл БЭ (Игнатова и др., 1975).

З'.НГххпа - гепатома мыши (Алексанян и др., 1972).

4.Sp 2/0 - миолома МЫШИ (Shulman et al., 1978), а Также клонированную из нее сублинию Sp/ebr-q , устойчивую к 5 мкг/мл БЭ (Березкина, 1989)'.

5.СН0-К1, клон 773 - Фибробласты китайского хомячка, а также клонированную из нее сублинию Cebr-2 (И), устойчивую к 1 мкг/мл БЭ. "

6.CHL-V79RJK - Фибробласты легкого китайского хомячка, устойчивые к уабаину (ЗмМ) и БДУ (30 мкг/мл) (клон любезно предоставлен для работы проФ. Ф.Радлом, Иельский университет, США), а также клонированные из них сублинии, устойчивые к БЭ: Vebr-2* (2 МКГ/МЛ), Vebr-5 (5 МКГ/МЛ) И Vebr-30 (30 МКГ/МЛ) (Гринчук И др. 1988).

7.HL-60 - человеческая промиелоцитическая лейкемия.

В работе использовали также внутривидовые гибриды:

1.гибрид "ХОМЯК-ХОМЯК", КЛОН 2302: (78-7 )Cebr2CON30Q XCHL-V79RJK, устойчивый к БЭ (1 мкг/мл) (Игнатова, 1983);'

2.гибрид "хомяк-ХОМЯК", КЛОН 787: (78-7 J СеЬг2соы300 х CHL-V79RJK, устойчивый к БЭ (2 мкг/мл) (Игнатова,,1983); ■ .

■ З.'микроклоточныи гибрид "МЫШЬ-МЫШЬ" Н625, полученный от СЛИЯНИЯ: HTXXIia х Lebr /325, УСТОЙЧИВЫЙ К БЭ (25 МКГ/МЛ) (Алексанян, Игнатова," 1984); •

и межвидовые гибрида:

1.гибрвд "МЫШЬ-ХОМЯК", КЛОН. 2230: Lebr 625 х CHL-V79RJк,устойчивый к БЭ (2мкг/мл) (Игнатова, 1983)-,

2.гибрид "мышь-хомяк", клон 383: Lebr 625 x CHL-V79RJK, •устойчивый к БЭ (10 шсг/мл) (Игнатова, i983); " • а таюке лимфоциты периферической крови человека..

Линия HL-60 получена, из коллекции клеточных культур лаборатории онкогемэтологии Женевского университета,.остальные линии получены из коллекции культур лаборатории Генетических

I Механизмов ДиФФеренцировки и Малигнезации клеток Института цитологии РАН.

Клетки линий HL-60, К562 и Sp 2/0 и их . производные культивировали на среда rpmi 1640, l929 и ее производные - на 199 среде, остальные клеточные линии культивировали на среда DMEM. Все среда содержали 10% сыворотки плодов коровы. Культивирование проводили в атмосфере 5% СОг,. Лимфоциты культивировали в среде 199 содержащей 10% аутологичной сыворотки.Клетки, устойчивые к БЭ, культивировали в присутствии соответствующей концентрации яда. Во всех эксперементах клетки находились в логарифмической стадии роста.

' Для получения лимфоцитов использовали свежезаготовленнУю кровь доноров, стабилизированную гепарином (25 ед/мл). Лимфоциты выделяли центрифугированием в градиенте Фикол-изопака (Ficoll-Iaopaque, Pharmacia).

Выделение и электрофорез ДНК и РНК. ДНК из клеток выделяли методом Фенольной депротеинизации (Маниатис и др., 1984) с последующим центрифугированием в градиенте - CsCi. ДНК из ядер выделяли ПО методу Дюка (Duke et al,, 1983). эДНК выделяли по методу Хирта (Hirt, 1967). Внеклеточную ДНК (внДНК) выделяли из • раствора Хенкса, кондиционированного свежевыделенными лимфоцитами и из , сред, в которых культивировались клетки, как описано (Васюхин и др., 1991). Высокомолекулярную РНК для анализа по Нозерну выделяли из культивируемых клеток ПО методу-Бирнбойма (Birnboim, 1988).

ДНК Фракционировали в горизонтальных блоках 0.8-1% геля агарозы в .буфере ХАЕ (Маниатис, 1984). На дорожку наносили 10 мкг. ДНК . ЭдектроФорез РНК проводили в 1.2% агарозйом "денатурирующем" Формалъдегидном геле (Birnboim, 19В8). На дорожку наносили 30 мкг РНК. После электрофоретического разделения препараты ДНК и РНК анализировали методом блоттинга , ПО Саузерну (Southern,1975) и Нозерну (МаНИЭТИС, 1984). Гибридизацию проводили с пробами, меченными 0£,Р методом случайного праймера (Random-primer kit, Amersham). УдеЛЬНЭЯ активность проб ДНК варьировала от 2 до 3.5х109 имп/мин/мкг. Гибридизацию с mdr и fos проводили в мягких условиях ' (гибридизацию проводили при 37°С, отмывки при комнатной темпиратуре), гибридизацию с л-сателлитом проводили в жестких условиях при 65°С. .

t

Плазмиды. Плазмида . pDR4,7 содержащая гены китайского хомячка pgpi и pgp2, клонированные в векторе pSP64 по Xbai, любезно предоставлена И.Ронинсоном (Roninson et al,1986).

Плазмида рАС12, полученная субклонированием Фрагмента экзона гена актина миокарда человека (2.9г.п.н., BamHi-Bgiii) из плазмида PHRL-83R (Gunning et al.,1984) В ВвКТОр pUC 19, ' любезно предоставлена В.И.Васюхиным (Институт цитологии РАН).

Плазмида рмта, полученная шинированием Hind ш Фрагмента ДНК митохондрии клеток 1929 размером 1.8 т.п.н. в вектор рис 19, любезно предоставлена К.В.Сальниковым. (Институт цитологии РАН). . _

Плазмида р foei , содержащая вставку 1,3 т.п.п. вирусного гена foe ПО Patl В pBR 322 ( Curran et al., 1982), ЛЮбезНО предоставлена М.С.Григорян ( ИМБ РАН).

В качестве пробы a-сателлита хромосомы 11 человека использовали коммерческий препарат Фирмы Опсог. >

Выделение плазмидной ДНК проводили методам щелочного лизиса ( Birnboim, Doly, 1979).Затем плазмидную ДНК очищали в градиенте CsCi ( 1мг/мл ) с БЭ (Маниатис и др. 1984 ).

Анализ активности эндогенных нуюлзаз ■ проводили в соответствии с общепринятыми биохимическими методами. Белки ядерного экстракта получали по метода Ксмптопа и Цидловского (Conpton, Cidlowsky, 1987). Белки разделяли методом электрофореза 83x83x1.5 мм в 12.5-15 % полиакриламидтгам геле , используя буферную систему Лэммли (Laemmii, 1970). Нуклеазную ' активность белков определяли по методу. Розент^ля и Лака ( Rosental, Lacks, 1977). ' ' .

Выявление в препаратах'ДНК, амплифиштрованных молекул. Для мечения бромдезоксиуридином (БДУ) глотки культивировали -в присутствии ЗмМ БДУ" и 3 мМ тимидина. • БДУ включается в новосинтезируемую ДНК,, что 'увеличивает ее плавучую плотность в. градиенте CsCi. Метод позволяет отделить помеченную ДНК (LL -light-light) от ДНК. прошедшей 1 цикл репликации и содержат/эй 1-моченную црпь (ш - light-heavy), и ДНК, прошедшей 2 цикла реПЛЖСаЦИИ И ИМвЮЩЗЙ 2 меченные Цаш: ' (НИ' - heavy-heavy) (Von1 ' Hoff.et al.,1988).

' РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. «.

. В результате проведенного в работе гийрвдизационного анализа нам удалось обнаружить амплификацию и-экспрессию генов шсЗг в ряде клеточных линия, селектированных на устойчивость к БЭ и обладающих МЛУ (табл.2).

Таблица 2.

Амплификация и экспрессия генов пк!г в клетках человека, хомяка и мышц, селектированных на устойчивость к БЭ.

линия размеры Фрагментов . выявляемые при гибридизации в т.п.н. уровень амплификации х раз экспрессия предполагаемый ген

K582/ADR-B3* 13.5 10 ? MDR1

K562/EBR 7.2 10 + MDR2

Lebr ЗМ5 7.2 - - mdrlb

Lebr 350 ■ 7.2 - - mdrlb

Sp2/EBR-5 7.2 10 + mdrlb

Н625 7.2 И 3.5 10-30 + ■ mdrla. mdrlb

Cebr-2(Ii) 3.5-4 И 2 10 + pgpl, pgp2

КЛОН 2302 3.5-4. И 2 - + pgpl, pgp2

КЛОН .787 . 3.5-4 и 2 10 + pgpl, pgp2

Vebr-2 3.5-4 И 2 10-100 + pgpl, pgp2

Vebr-5 3.5-4 И 2 10-100 ++ pgpl, pgp2

Vebr-30 3.5-4 И 2 10-100 +++ • pgpl, pgp2

КЛОН 223Q. 9.6; 7.2; Фрагмент 7.2 + rr.dr la

3.5-4 и 2 в 4-5 рас

КЛОН 383 9.6; 7.2: . Фрагмент 7.2 7 mdr la

3.5-4 и 2 в 10 раз

* - клон был■селектирован в присутствии адриамицина. i

1. Анализ структурных перестроек и амплификации генов mdr в клетках линии хронического цромиелолеикозэ человека К562. •устойчивых К БЭ ИЛИ APR.

При anaJiiise гидролизованнсй ЕооШ ДНК исходной линии К562 мы показали, что с пробой pgр1-2 гибркдизуется два Фрагмента с молекулярными массами (м.м.-) 4.5 и 13.5 т.п.н. Эти Фрагменты

соответствуют генам mdr2. и MDRI человека (Roninson et al., 1986). В клетках K562/adr-B3 мы обнаружили амплификацию гена mdr1. Известно, что в полученных независимо аналогичных клеточных ЛИНИЯХ k562/adr (Sugimoto et al., 1987) ЭКМПЛИФИКаЦИИ подвергается также ген mdri, кроме того показано, что устойчивость к адриамицину обычно сопровождается экспрессией гена mdri.

В 'клетках K562/ebr мы обнаружили амплификацию . и повышенную экспрессию гена mdr, причем размер Фрагмента, гибридизующегося с пробои pgp 1-2 составляет 7.2 т.п.н. Ронинсон И соавт. (Roninson et al., 1986), ИСПОЛЬЗУЯ аналогичные условия гибридизации, обнаружили Фрагмент такого же размера в клетках карциномы человека, kb-ai, обладающиеи млу. Используя геноспецифическую гибридизацию, авторы (Roninson et al., 1986) показали, что, вероятно, этот Фрагмент соответствует гену mdr 2, который возможно подвергался перестройке в процессе амплификации. Амплификация различных генов при селекции к различным агентам позволяет нам предположить специфичность БЭ как субстрата для Р-гликопротеина, кодируемому геном mdr 2.

2. Анализ структуры)-тс перестроек и экспрессии генов mdr в клетках мышей, устойчивых к БЭ;

В клетках Sp 2/EBR-5 мы обнаружили амплификацию гена mdr,'' размер Фрагмента которого (7.2 т.п.н.), выявляемый' при гибридизации с пробой pgpi-2 по м.м. соответствует гену mdr lb (Demidova et al.,1992). Появление амплиФшсации этого гена' сопровождается возникновением оверэкспрессии.

МЫ показали, ЧТО клетки Lebr ЗМ5 И Lebr 350, в отличии от остальных устойчивых к БЭ- 'линий, не имеют амплификации гена mdr. Кариологический анализ показал, что никаких

морфологически обнаруживаемых проявлении -генных амплификации (ДМ, ГОО, Д00) в этих клетках не наблюдается. (Гринчук и др.,. 1988). Более того, нам не удалось зафиксировать экспрессии этого гена в устойчивых линиях. Мы предположили, .что • обеспечение устойчивости к яду при "не-Р-гликопротеиновом механизме" может происходить при участии агентов, опосредуюидос - взаимодействие яда с внутриклеточными мишенями, в частности при' участии эндонуклеазы, принимающей участие в эксцизиошюй репарации ДНК. Косвенным свидетельством повышения активности нуклеаз .может служить увеличение количества Фракции

" ""А ' •

низкомолекулярной ДНК в клетке. Мы показали, что количество ЭДНК В клетках устойчивых ЛИНИЙ ЬеЬг ЗМ5 и ЬеЬг 350 достигает 118% и 174% соответственно от количества эДНК в чувствительных клетках. эДНК, при анализе методом электрофореза имеет специфическую Фрагментацию (Фрагменты 0.2 т.п.н. и кратные ему), которая образуется под действием Са2+Мв2+- зависимой эндонуклеазы. Анализ. выхода растворимого хроматина (табл. 3) свидетельствует о том, • что в устойчивых клетках повышена активность гп2+- малочувствительной эндонуклеазы, причем увеличение активности нуклеазы коррелирует со степенью устойчивости клеток.

Мы предполагаем, что повышение активности эндогенных нуклеаз в клетках ЬеЬг змь и ЬеЪг 350 связано с Фенотипом лекарственной устойчивости. Снижение проницаемости плазматической мембраны (Сальников, 1986) и одновременное повышение репарационных способностей клеток могут вместе обеспечивать не-Р-гликопротеиновый механизм устойчивости.

Таблица 3.

■Выход растворимого хроматина из ядер, клеток, чувствительных и устойчивых к БЭ.

"Условия инкубации клеток3 Количество вышедшей ДНК, % от тотальной, х - с-

из 1слеток Ь 929 ЬеЬг 350

0°С 37° С о • 2+ 37 С, '¿п 2.9 ± 0.7 12.1 - 2.1 1.4 ± 1.1 5.6 ± 1.3' 23.4 ± 5.3 7.8^ 1.7 .

а - длительность инкубации 4ч..

, З.Апализ структурных перестроек и экспрессии генов таг (рвр 1-3) в клетках китайского хомячка линий сно-кг и

„снь-у79шк. устойчивых к БЭ.

В клетках СеЬг-2 мы обнаружили амплификацию и повышенную •• сспроссию генов рвр1-2. При селекции ¡слеток снь-У79 ЫК в присутствии 2 мкг/мл БЭ, в клетках УзЬг-2 появляется

амплификация генов pgpi-2 примерно в 10. На последующих этапах селекции, в клетках Vebr-5 и Vebr-зо дальнейшего увеличения' степени амплификации не происходит, однако при анализе методом гибридизации по Нозерну РНК из этих клеток мы зафиксировали • последовательное усиление экспрессии гена pgp. Таким образом на основании полученных данных можно сделать вывод, что в клетках chl-v79' rjk при селекции на устойчивость к 2 мкг/мл бэ происходит амплификация гена- pgp, а дальнейшее повышение устойчивости происходит за счет регуляции уровня экспрессии гена pgp.

Известно, что обычно у китайского хомячка происходит амплификация' Bcei трех генов pgp в составе единого ампликэна (Van Der Bliek et al. , 1983) . В проанализированных НЭМИ клеточных ЛИНИЯХ китайского хомячка CHO-K1 и CHL-V79RJK амплификации подвергались в равной степени как pgpl-, так и 'rsp2, возможно в составе единого ампликона. Отсутствие геноспецифическои пробы на pgp3 не позволяет сделать окончательного вывода о характере амплификации генов pgp в проанализированных линиях.

По сравнению с клетками сн0-к1, клетки chl v79 rjk, чувствительные к БЭ, исходно имеют амплификацию генов pgpl,2, однако экспрессия этих гена в них отсутствует. Возможно, что наличие в чувствительных клетках амплификации генов, pgp и соответствующих хромосомных перестроек является результатом : предыдущей селекции- клеток VT79 из 'которых данный клон был выделен в присутстьш БДУ и уабаина.

Полученные результаты хорошо согласуются с данными кзриоло1ического анализа (Гринчук и др., 1988). Клетки, Vebr-2, Vebr-5 и Vebr-зо rjk- кариологически сходны между собой, но отличаются от исходного чувствительного варианта. В клетках устойчивых вариантов маркеры zl и гв - производные хромосомы 1 - характеризуются нестабильностью, морфологичосш проявляемой в виде Д00 (Б хромосоме Zl+) и Г00 (в хромосоме z6+). Таким образом, корреляция обнаруженной амплификации -генов pgp1,2 с описанными ранее хромосомными аберрациями, появляющимися' в устойчивых к БЗ клетках, предположить, что в клетках .хомяка линии сно-к1 и chl--V79 rjk. появление устойчивости_ к БЭ сопрс-зсгчдается емплификзциэй генов pgp локализованной в '• виде ТС') и.та ДОО в производных хромосомы 1.

- 13 7 •

4.Анализ структурных перестроек и экспрессии генов mdr в клетках гибридов "хомяк-хомяк", "мышь х мышь","мышь-хомяк".

Клон 787 (Гибрид CHL- V79 rjk х СеЬг-2СОЫЗОО), УСТОЙЧИВЫЙ к БЭ (1 мкг/мл) характеризовался наличием амплификации и экспрессии генов pgpi,2, в то время как полученный независимо анаЛИГИЧШЙ ГИбрИД КЛОН 2302 (ГИбрИД 'CHL- V79 rjk х СеЬг-2СШ300) не имел.амплификации и экспрессии генов pgpl,2.

В микроклеточном гибриде "мышь х мышь" HG25 мы обнаружили амплификацию гена и экспрессию гена mdri/ib. Кроме того, при гибридизации выявляется еще один Фрагмент, размером около 3-3.5 Т.п.н., ЧТО соответствует по М. М. гену mdr3/la (Demidova et al., 1992). Мы так же показали повышенную экспрессию гена mdr в клетках линии Н625. Известно, что повышенная экспрессия гена mdr з/ia проявляется. в клетках гепатом спонтанного происхождения или индуцированных различными канцерогенами (

Teeter et'al., 1990 Ikegushi et al., 1991). ПОСКОЛЬКУ ОДНИМ ИЗ

родителей линии Н825 является гепатома мыши, мы считаем, что амплификация. гена mdr3/ia • в данном случав является тканеспэдаФичной. *

В гибридах "мышь-хомяк" (клон 2230 и кчон 383) при гибридизации выявляется наличие характерных для обоих видов Фрагментов рестрикции, гомологичных пробе pep1-2, причем аМшиФикацил подвергается только ген radrib мыши. Степень амплификации этого гена коррелирует с уровнем устойчивости клеток'. '

■ Совокупность данных свид^ гельствует о том, что устойчивость к ядг.м и связанная с ней амплификация • генов mdr может наследоваться в гибридах. Наследование степени устойчивости и уровня амплификации генов mdr может варьировать.

5. Анализ структурных перестроек и эксщтессии roira foa а клеточных линиях, обладающих МЛУ.

Из 10 проанализированных клеточных личий мы обнаружили амплкФжа1Д'.!л гена foa, содержащую структурные перестройки только в двух линиях: Н625 и К562. В обоих случаях наличие амплификации гена foa сопровождалось его повышенной акспрессиеп.

В клетках лилии Ш25 мы ■ показали амплификацию генов mdriyla и nidr3, однако Нозерн анализ показал экспрессию только одного трамскрипта. Предполагается, что это транскрипт Х'ена ■

mdrl/ib, который, по нашим данным, участвует в обеспечении устойчивости к БЭ. Продукт гена foe в данном случае может осуществлять негативную регуляцию экспрессии амшшФицированного гена mdr.3 и положительную гена mdrl/ib, что подтверждает высказанное ранее предположение (Teeter et al.,. 1991) о характере регуляции экспрессии генов mdrl/ib и mdr3/i&.

АмшшФикация гена foe в клетках линии хронического промивлолеикоза человека К562,- полученной от пациента на стадии бластного криза, могла произойти вследствии развития МЛУ при лечении пациента химиотерапевтичесгайш препаратами. При селекции клеток КБ62 'на устойчивость к БЭ этидия исчезает ' амплификация' и повышенная экспрессия гена fos, и одновременно развиваете., амплификация и повышенная экспрессия гена MDR2. , Такив данные позволяют предполагать, что комплекс Fob/Jim участвует в негативной регуляции промотора гена. MDR2. •

В.Исследование возможных механизмов первичных процессов, приводящих к образованию в клетке дополнительного генетического материала-. ■

С помощью метода импульсного мечения БДУ мы показали, что Фракция эДНК клеток Lebr ЗМ5 (составляющая около 1% от обшей ДНК клетки) содержит примерно 15% амплифицированных (реплицирующихся более одного раза за клеточный цикл) последовательностей ДНК, которые вероятно могут экскретироваться в среду культивирования (рис.1).

Аналогичные результаты .мы. получили и при исследовании лимфоцитов периферической крови человека (рис.2). Этот объект ; представляет особый интерес для изучения процессов спонтанной амплификации, так как лимфоциты периферической крови . представляют собой покоящуюся популяцию клеток и в отсутствии митогенов не продиФерируют, .следовательно нн. и HL Фракции не могут образовываться в результате репликативного синтеза, нн Фракция составляла примерно 14% от .внДНК. При анализе методом дот-гибридизации. - с . пробой прицентромерного а-с.ателлита (известно, что а-сателлит практически не • подвергается амплификации) мы установили, что Фракция НН' внДНК лимфоцитов практически не содержит последовательностей, гомологичных пробе.-.

Исследование с помощью электронной микроскопии препаратов эГЗК клеток Lebr зм5 и внДНК лимфоцитов показало, что в обоих

- 15 т

тднк

внДНК

эДНК

тДНК

эДНК

внДНК

1МХ

50%->

0%.

I

-¿ш Р

Шт &

Рис .1 .Динамика распределения НН - Я > НЬ - и ЬЬ - ^ цепей в тотальной (тДНК), эДНК и внДНК в клетках ЬеЬг ЗМЗ, которые культивировали: А - 22 ч в присутствии БДУ; Б . - 22 ч в присутствии БДУ +24 ч в свежей среде без БДУ,

. тДНК

100%

50%-»

0%

эЛИК

1

внДНК тДНК

1'

Р I I '

III

I ъА <

эДНК

1 I

1 1

внДНК

|

Р _Р Й

I И1 ий!

Рис. 2 .Динамика распределения !Ш - В) , НЬ - ^ и ЬЬ - ^ цепей в тотальной' (тДНК), эДНК и онДНК в лимфоцитах периферической крови человека, которые культивировали: А - 16 ч в присутствии „БДУ; Б - Ю ч ч присутствии БДУ + 5 ч о свежей среде без БДУ»

случаях препараты содержат кольцэвые молекулы, контурная длина которых варыфовала от 0.1 до 2.8 мкм.

Мы предположили, что внерепликативныи синтез ДНК может .происходить и в условиях стресса под воздействием адов, блокирующих репликацию. Мы провели анализ ДНК клэток нь-ео, . культивируемых в присутствии колхицина (2мМ), гп2+(100 мМ) или в нормальных условиях методом импульсного мечения ЕДУ. Во внДНК во всех случаях присутствует НН Фракция - 3-5% Присутствие НН Фракциив ВНДНК клэток, обработанных колхицином, который блокирует клетки на стадии метаФззы, свидетельствует о том, что процессы, приводящие к синтезу этой ДНК не имеют отношения к общеклеточной репликации ДНК в 8 Фазе. НН-ДНК, выделенная из среда культивирования Нь-60, ^о данным денситометра содержит в 8 раз меньше последовательностей а-сателлита,- чем тотальная ДНК клеток. ,1

Полученные данные свидетельствуют, что ,по .'крайне мере НН Фракция эДНК образуется за счет внереплйкативной репликации и экскретируется из клетки в окружающую среду. Остальная часть эДНК возможпо является следствиэм процессов. рекомбинации, обратной транскрипции или Фрагментации хромосом. Поскольку к амплификации наиболее склонны активно экспрессируклцие'ся гены (БЫтке, 19В4), в условиях стресса под давлением агентов, блокирующих репликацию, амплификация таг, которой предшествует повышениэ ■ экспрессии • этого гена, может происходить' . с : привлечением механизмов внерепликативного синтеза ДНК, что может способствовать появлений устойчивых вариантов.

заключение:

Селекция клеток- с млу различного видового и тканевого происховдэния в присутствии ГО позволяет получить'варианты для выяснения специфических и не специфических компонентов млу, общих для млу и для стрессовой устойчивости клэток. Сочетание специфических и не .специфических компонентов ' может бьггь, по-видимому, разным и определяется оно, скорее- всего тканевым' происхождением, а также генетическим статусом исходных клеток к тему моменту, когда они были- использованы для селекции. Специфическим компонентом, определяющим устойчивость к БЭ, является экспрессия Р-глжолротеиков 1-го. класса. В клетках человеческого промнелолейкозс' К562 Р-гликопротеия, кодируемый

- 17 г

геном ШЖ2, может рассматриваться как специфический транспортер дяя'БЭ и, возможно, дай внутриклеточных пептидов.

Устойчивость к БЭ может обеспечиваться и без участия Р-гликопротеина. гп2+- малочувствительная зндонуклеаза возможно принимает участие в обеспечении устойчивости к БЭ в отсутствии специфического компонента (экспрессии Р-гликопротеина).

Структурно-Функциональные перестройки гена foa в клетках линий Н583 и Н825 позволяют считать, что БЭ индуцирует активность транскрипционной системы первичного ответа с участием комплекса ков/лт по типу обратной положительной (Н62Б) или обратной отрицательной (К562) связи.

Данные о существовании в клетках механизмов внерешмкативного синтеза ДНК, протекающего в том числе и в условиях стресса под воздействием агентов, блокирующих репликацию, позволяют предположить, что при селекции клеток в присутствии ядов и антиметаболитов именно эти механизмы участвуют в первичных процессах образования дополнительного гепетического материала, содержащего амплифицированные копии селективно-ценных:генов.

ВЫВОДЫ.

1.Многоступенчатая селекция клеток линии хронического промиелоленкоза человека в стадии бластного криза КР.52в присутствии БЭ позволяет получать варианты с амплификацией и повышенной экспрессией гена мш 2,.,в присутствии адриамицина -гена мби 1, что позволяет предположить специфичность БЭ как субстрата для Р-гликопротеина, кодируемого геном МШ2.

• 2.Многоступенчатая селекция клеток миеломы мыши линии Бр2/0 и гибрида Н625 в присутствии БЭ позволяет . получит ь варианты с амплификацией и повышенной экспрессией гена таг1/1Ь.

3.Многоступенчатая селекция клеток линии китайского хомячка сно-К1 и снь^эилс в присутствии БЭ позволяет получать варианты с амплификацией 'как минимум двух генов таг (рер1,рвр2)'. • Дальнейшая селекция клеток \/еЬг-2(СНЬ-У7ЭМК) к "возрастающим концентрациям БЭ сопровождается не амплификацией генов таг, но усилением их экспрессии.

'' 4.В гибридных сочетаниях клеток, получепных при участии устойчивых к БЭ партнеров, устойчивость к яд4м и связанная с

ней амплификация геноэ mdr может наследоваться. Наследование | степени устойчивости и уровня амплификации генов- mdr может- i варьировать. • ,

Б. Селекция клеток гепатомы мыши НГххна в виде микроклеточного гибрида с тибробластами мыши Lebr 625, устойчивыми к БЭ (25 мкг/мл) позволила получить варианты с амплификацией и повышенной экспрессией гена foe. что позволяет предположить участие транскрипционного Фактора fos в позитивной

■ регуляции экспрессии гена mdri/ib и негативной - гена mdr3/ia.

| 6.Линия хронического промиелолеикоза человека в стадии властного криза ' К562 содержит . амплификацию структурно

■ перестроенного гена • fos. сопровождающуюся повышенной 1 экспрессией этого гена. Отрицательная корреляция между

появлением амшмфИка1|ии и экспрессии гена -MDR2 и исчезновением амплификации и экспрессии гена fos в клетках K562/EBR. •устойчивым к БЭ (3 мкг/мл), позволяет предполагать участие . транскрипционного Фактора fos в. негативной экспрессии гена MDR2. •

7.Многоступенчатая селекция Фибробластов. мыши L929 в присутствии- БЭ позволяет получить варианты, устойчивые к •высоким концентрациям БЭ в отсутствии амплификации и экспрессии геной mdr. "Нетипичная" лекарственная устойчивость в метках Lebr3M5 и Lebr350 сопровождается повышением активности - гп2+-малочувствительной эндонуклеазы.

' 8.Совокупность данных свидетельствует о том. что в клетке существуют механизмы внерепликативного синтеза ДНК, приводящие к постоянной' генерации экстрахромосомных молекул, содержащие амплифицированные последовательности. . Не' исключено, чтд подобные механизмы могут участвовать в процессах первично^ накопления амплификации селективно пенных генов в условия^ стресса под воздействием ядов.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Сальников К. В.. Липскал Л. А.. Житкович A.B.. Рол1. эндонуклеазы в образовании экстрахромосомной ДНК. // В кн. Всессюгшыа симпозиум "Структура и Функщга клеточного, ядра", Гродно." 12-14 ОКГ.- 1090,- Тез.докл.- М..- 1990,- С. 115.

- la.-

2.Vasyukhin V.I., Lipskaya L.A. , Anker P., Maurioo P.A.\ Lyatey J., Lederrey C., Stroun M. DNA amplification aa the origin of released DNA by cells. // Abatr. of 15th International congress of biochemistry. - Jerusalem.- 1991.•» P.132.

3.Ирвкауа L.A., Vasyukhin V.I., Anker P., Maurice P. A., Lyatey -J. , Lederrey C. ■ Stroun M. Apoptosis and the released DNA by cells. // Absti*. of 15th International congress df biochemistry. -'Jerusalem.-.1991.- P.318.

4.Липская Л.А.,- Кукекова А.В. .Человеческая миелоидная линия К562 содержит амплификацию гена fos, которая теряется при селекции на устойчивость к бромистому этидию. // Тез. Всесоюзной конференции '"Биология клетки в культуре" цитология. - 1992,- 1.34.- - N.9. - С.

5.Липская Л.А., Житкович А.В., Васюхин В.И., Цветков А.Г. и Сальников К. В. Участив эндонуклеазы в образовании экстрахромосомной ДНК и возможные механизмы возникновения амплификации генов. // Цитология. 1992.- Т.34. - N.12. - С. .

e.Berioskina K.V., Ignatova T.N., Qrinchuk Т.М., Lipskaya L.A., 'Vaayukhin V.I., Gamaley I'., Caulin A. Isolation and genetic characterization of a new mouse multldrug-reaistant. myeloma line SPKBR-5, se.lected with ethidium bromide. // Somatic Cell. Molec. Genetics, submitted, .

7.Гринчук .T.M., Липская Л.А., Васюхин В.И., Сорокина Е.А., ' Арцыбашева И.В., Игнатова Т.Н. Амплификация и оверэкспрессия генов mdr в'клетках- китайского хомячка CHL-V79 юк, высокоустойчивых к бромистому' этидоо, коррелирует с наличием кариолопэтегга'х маркеров амплификации. // Цитология. -1Э93. - Т.За. - N.. - С.

/в. Липская Л.А.. Гринчук I.M. Житкович- А.В.', '.Сорокина Е.А., Сальников К.В. Нетипичная лекарственная устойчивость: клетки линии L929, устойчивые к бромистому этидию но имеют амрлификации и экспрессии гена' mdr. // Молекулярная биология, -в'печати.