Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование углеводородокисляющих бактерий для восстановления нефтезагрязненных земель в условиях Крайнего Севера

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Маркарова, Мария Юрьевна, Сыктывкар

"V? -У у

О

с? О

и

Российская академия наук Уральское отделение Коми научный центр ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ

На правах рукописи

МАРКАРОВА Мария Юрьевна

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ ЗЕМЕЛЬ В УСЛОВИЯХ КРАЙНЕГО СЕВЕРА

03.00.07 - микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель кандидат биологических наук С.А. Иларионов

Научный консультант доктор биологических наук И.Б.Арчегова

Сыктывкар - 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ.................................................................... 5

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. ХАРАКТЕРИСТИКА ТУНДРОВЫХ ПОЧВЕННЫХ ЭКОСИСТЕМ

1.1. Экологические особенности тундровых почв и основные нарушения их при нефтедобыче............................................................10

1.2. Экологические особенности микрофлоры тундровых

почв............................................................................ 14

Глава 2. ВЛИЯНИЕ СЫРОЙ ИЕф.ТШДА ПОЧВЕННУЮ МИКРОФЛОРУ • Ай.::.;:

2.1. Воздействие нефти на почвенный биоценоз...................... 18

2.2. Характеристика углеводородокисляющих микроорганизмов

и некоторые представители этой трофической группы........................22

Глава 3. РЕКУЛЬТИВАЦИЯ ЗАГРЯЗНЕННЫХ НЕФТЬЮ ПОЧВ

3.1. Основные принципы рекультивации нефтезагрязненных

почв............................................................................................................................25

3.2. Методы технической рекультивации 26

3.3. Методы биологической рекультивации 27

3.3.1. Активизация естественной микрофлоры в нефтезагрязненных почвах 27

3.3.2. Использование микробиологических препаратов для разложения нефти в почвах 32

3.4. Принципы выборе методов рекультивации нефтезагрязненных земель на Севере..............................................................35

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 4. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

4.1. Объекты исследования 40

4.1.1. Характеристика района исследования.............. ....................40

4.1. 2. Характеристика нефтей Усинского нефтяного месторождения............................................................................ 43

4.1.3. Характеристика препарата «Деваройл»................................................44

4.2. Методы исследования

4.2.1. Выделение, определение, хранение углеводородокисляющей микрофлоры и изготовление инокулятов отдельных культур..............................................................................44

4.2.2. Методы количественного учета отдельных групп

почвенной микрофлоры..................................................................................................46

4.2.3. Методы анализа нефти..................................................................................48

4.2.4. Агрохимические методы анализа почв........................ 49

4.2.5. Определение дыхательной активности почвы по скорости выделения С02......................................................................................... 52

4.2.6. Определение ферментативной активности почвы............ 53

4.2.7. Аминокислотный анализ.......................................... 55

4.2.8. Статистический анализ результатов............................ 56

Глава 5. ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ АБОРИГЕННОЙ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩЕЙ МИКРОФЛОРЫ И СОЗДАНИЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ ДЕСТРУКЦИИ НЕФТИ В ТУНДРОВЫХ ПОЧВАХ 5.1. Микробиологическая характеристика нефтезагрязненных

почв Усинского района............................................... 57

5.2. Физико-биохимическая характеристика отдельных культур углеводородокисляющих бактерий, выделенных из

тундровых нефтезагрязненных почв Усинского района..... 61

5.3. Углеводородокисляющая активность выделенных культур.. 64

5.4. Изготовление препарата МУС-1 на основе выделенных

видов углеводородокисляющей микрофлоры................... 69

5.4.1. Жидкая форма препарата (МУС-1) 69

5.4.2. Изготовление препарата на органическом носителе (Лиг-носорбент-1) 70

Глава 6. ИСПЫТАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПОЛУЧЕННОГО БАКТЕРИАЛЬНОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ РАЗЛОЖЕНИЯ НЕФТИ

6.1. Изучение эффективности биодеструкции нефти при уровнях загрязнения почвы от 1 до 20%............................................................................72

6.2. Влияние рыхления на эффективность разложения нефти при высоких (до 30%) дозах загрязнения почвы нефтью............ 87

6.3. Влияние рН и влажности на микробиологическую активность загрязненной нефтью почвы........................................... 92

6.4. Изучение влияния комплекса приемов биорекультиваци нефтезагрязненной тундровой почвы на процессы

разложения нефти..............................................................................................................97

ОБСУЖДЕНИЕ РУЗУЛЬТАТОВ..................................... 107

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.................................................................................. 117

ВЫВОДЫ.................................................................. 121

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ............................................... 123

ПРИЛОЖЕНИЕ........................................................... 144

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Проблема восстановления нефтезарязненных земель в настоящее время привлекает к себе особое внимание. При этом отмечено, что микробиологическая активность почв является одним из основных факторов очищения их от нефти (Мишустин, 1974; Коронелли и др., 1996). В биорекультивации нефтезагрязненных земель используют два основных подхода, один из которых направлен на стимулирование естественной микробиологической активности почв агротехническими и агробиологическими методами (Самосова, 1979; Усачева, 1982; Калачникова и др., 1986), второй - на усиление углеводородокисляющей активности почв за счет использования препаратов на основе алканотрофных микроорганизмов (Гусев и др., 1981; Коронелли и др., 1996; Янкевич и др., 1997; Оитеш1, 1988; Котикатакатига е/ а/., 1996). Многочисленными работами подтверждена эффективность обоих подходов, однако, есть ограничения для использования на практике тех или иных методов, связанные со спецификой почвенных и климатических условий, качественным составом нефти и ее концентрацией в почве после аварийных разливов.

Почвы Крайнего Севера характеризуются высокой степенью заболоченности, низкими значениями рН, пониженным содержанием гумуса (За-боева, 1975; Арчегова и др., 1997). В суровых климатических условиях формируется маломощный органогенный слой (Арчегова и др., 1994), скорость микробиологических процессов крайне низка (Стенина, 1959, 1964; Сушкина, 1960; Паринкина, 1989). На территории Республики Коми (РК) в зоне тундры и лесотундры расположены крупные нефтяные месторождения. До настоящего времени в нефтедобывающих районах РК не был испытан ни один из известных микробиологических препаратов и детально не изучена естественная углеводородокисляющая микрофлора. В связи с недостаточной проработкой вопроса о скорости процессов микробиологической трансформации нефти в тундровых почвах и факторах, опреде-

ляющих активность микробиологического разложения нефти, при восстановлении загрязненных нефтью земель в указанном регионе существуют серьезные трудности.

Целью исследования было изучение углеводородокисляющих микроорганизмов тундровых почв Республики Коми и возможности использования их при очистке нефтезагрязненных земель в условиях Крайнего Севера.

Основные задачи работы:

1 .Выделить из загрязненных нефтью тундровых почв углеводородо-кисляющие бактерии и изучить физиолого-биохимические особенности отдельных культур.

2. На основе изученного комплекса аборигенной углеводородокис-ляющей микрофлоры разработать бактериальный препарат, предназначенный для разложения высоковязкой нефти с повышенным содержанием тяжелых парафинов и гетероциклических соединений.

3. Изучить эффективность разработанного препарата при дозах нефтяного загрязнения от 1 до 35%.

4. Сравнить эффективность препарата для разложения нефти в условиях Крайнего Севера с одним из коммерческих биопрепаратов и с некоторыми агрохимическими и агротехническими способами стимулирования разложения нефти.

5. Разработать практические рекомендации по проведению рекультивации нефтезагрязненных почв Усинского района РК с использованием полученного препарата.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В условиях Севера для оптимизации процессов микробиологической очистки почв от нефти целесообразно использовать препара-

ты, изготовленные из видов местной, приспособленной к почвен-но-климатическим условиям, углеводородокисляющей микрофлоры, подобранной с учетом качественного состава нефти.

2. При проведении рекультивации тундровых почв с высоким уровнем начального загрязнения нефтью необходим комплексный подход, то есть, наряду с использованием микробиологических препаратов необходимо применять методы активизации аборигенной почвенной микрофлоры.

3. Комплексность почв Севера определяет дифференцированный

подход к их восстановлению. Принцип универсальности здесь непригоден ни при использовании микробиологических препаратов, ни при проведении рекультивации другими способами.

Научная новизна:

Из тундровых нефтезагрязненных почв Усинского района PK выделены местные углеводородокисляющие психротолерантные бактерии; описаны физиолого-биохимические особенности и углеводородокисляющие свойства культур Pseudomonas alcaligenes, Rhodococcus erythropolis, Flavobacterium barbe, Agrobacterium radiobacter, Arthtobacter sp. На основе описанных культур разработан бактериальный препарат «МУС-1», эффективный для разложения нефти в условиях короткого и холодного летнего периода при уровне загрязнения почвы нефтью до 35% и в диапазоне pH 3,5-7,5. Изучены факторы, определяющие эффективность микробиологической деструкции нефти в тундровых почвах. Изучено влияние нефтяного загрязнения на отдельные трофические группы аборигенной почвенной микрофлоры нефтезагрязненных тундровых почв Усинского района PK.

Практическая значимость:

Разработан эффективный для восстановления нефтезагрязненных тундровых почв бактериальный препарат. Разработан способ получения

биологически-активного органического удобрения на основе гидролизного лигнина для использования его в комплексе с полученным препаратом при высоких (более 15%) концентрациях нефти в тундровых почвах. Разработаны практические рекомендации по проведению биологической рекультивации загрязненных нефтью земель в условиях Крайнего Севера с использованием полученного препарата.

Организация исследований. Работа выполнена в Институте биологии Коми научного центра Уральского отделения РАН в отделе геоботаники и рекультивации. Аналитические работы проведены совместно с экоаналитической лабораторией Института биологии Коми НЦ УрО РАН. Материалы, изложенные в главах экспериментальной части, получены в течение 1990-1998 гг. в процессе выполнения плановых тем НИР Института биологии, разделов Государственной научно-технической программы «Комплексное исследование океанов и морей Арктики и Антарктики». Разработанные в ходе выполнения работы методы использованы в выполнении хоздоговорных работ Института биологии.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на международных совещаниях (Сыктывкар, 1991, 1998; Екатеринбург, 1996; Москва, 1998), Всесоюзных и Республиканских молодежных конференциях (Сыктывкар, 1993; 1996; 1997; 1998). Результаты работы были заслушаны на заседаниях ученого совета Института биологии Коми научного центра УрО РАН (Сыктывкар, 1997; 1998), совместном заседании сотрудников лабораторий техногенных экосистем и геологической микробиологии ИЭГМ УрО РАН (Пермь, 1998).

Публикации. Материалы диссертационной работы опубликованы в четырех патентах, двух статьях, методических рекомендациях, в виде опубликованных докладов и тезисов докладов на конференциях.

Структура и объем работы. Работа изложена на 157 страницах машинописного текста и состоит из введения, трех глав литературного обзора, главы об объектах и методах исследования, двух глав полученных результатов исследования, обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложений. Список литературы состоит из 145 работ отечественных и 47 иностранных авторов. Иллюстративный материал включает 20 рисунков, 24 таблиц.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ТУНДРОВЫХ ПОЧВ

1.1. Экологические особенности тундровых почв и основные нарушения их при нефтедобыче

Как известно, устойчивость биоценозов к техногенным воздействиям и скорость их восстановления определяются индивидуальными почвенно-климатическими особенностями территорий (Бабьева, 1983). Существует ряд факторов, определяющих степень устойчивости экосистем к нарушением экологического равновесия и, соответственно, влияющих на скорость их восстановления. Агрохимические свойства почвы (кислотно-основные характеристики, запасы органического вещества) являются существенным фактором устойчивости к техногенным нарушениям. (Василевская и др., 1997; Капелькина, 1997). Физическая устойчивость почв, включая устойчивость поверхности и противоэрозионную стойкость почв, определяют сохранность среды для микрофлоры (Алиев и др.,1977; Адренсон, 1979; Ари-стовская, 1980). Эти факторы устойчивости зависят от таких параметров, как мощность органогенного и гумусово-аккумулятивного горизонта, запаса корней, оструктуренности и гранулометрического состава почвы (Василевская и др., 1997). Буферные возможности почв связаны с количеством и качеством опада и подстилки (Василевская и др., 1997; Попов и др., 1997; Солнцева, 1981).

Тундровые и лесотундровые ландшафты, к которым приурочены основные месторождения нефти в РК, характеризуются низкой степенью устойчивости к нарушениям экологического равновесия (Арчегова и др., 1997). Это связано с условиями формирования тундровых почв и биоцено-тических связей. По температурному режиму эти почвы относятся к группе холодных с длительным сезонным промерзанием, находятся в мерзлом со-

стоянии 7-7,5 месяцев (Забоева, 1975). Глубина промерзания по годам колеблется от 0,6 до 1,2 м. Период активного почвообразовательного процесса равен 2,5-3 месяцам. Содержание перегноя в среднем составляет 1-2%, очень редко достигает 8%. Почвенный раствор беден минеральными соединениями. Условия криогенеза влияют на качественный состав почвы, прежде всего на ее гранулометрический состав, увеличивая долю мелкодисперсных частиц (Симонов, 1997; Турсина, 1997; Фоминых, 1997), что в известной мере создает анаэробные условия в почве, усиливающиеся при нефтяном загрязнении (Солнцева, 1985; Тишкина, 1985; Тишкина и др., 1989; Мукатанов и др., 1980).

Глубокое промерзание и длительное мерзлое состояние минеральных пород не способствует освоению биотой толщи пород (Арчегова и др.,

1996). Одной из важных особенностей тундровых почв является малая мощность органо-аккумулятивного горизонта, определяющая высокую степень уязвимости их к техногенным нарушениям (Арчегова и др., 1995). По уровню продуктивности тундровый биогеоценоз относят к «очень малопродуктивным» (Игошева, 1996), а биологический круговорот может быть охарактеризован как застойный с низким потенциалом самоочищения почвы, длительным разложением в ней органических веществ (от 1-2 до 10 и более лет) (Акулыпина и др., 1997). Органо- (торфянисто-)-аккумулятивный слой слабо связан с минеральной породой, потому что корневая система растительного сообщества (80-90% от общей массы корней, проникающих до 50 см вглубь) сосредоточена в органогенном слое (Арчегова и др., 1996). Такое структурное строение биогеоценотической системы обусловливает очень медленное ее возобновление и высокую чувствительность к малейшему техногенному воздействию (Капелькина и др.,

1997).

Криогенные процессы определяют особенности формирования азотного режима тундровых почв: низкую миграцию азота по профилю, сосредоточение его в верхних горизонтах за счет криогенных процессов и гене-

тических особенностей почв (Безносиков, 1997). Горизонтальная миграция по катенам открытого типа исключает азот из биологического круговорота в агроценозах и может привести к опасности загрязнения окружающей среды, а по катенам закрытого типа создает очаги повышенной концентрации и геохимическую контрастность ландшафтов по азоту. Внесение высоких доз минеральных и органических удобрений, их медленная трансформация в тундровых почвах и последующее вымывание в водоемы, способствует регрессивным изменением альгофлоры (Стенина, 1997).

Неоднородность состава и структуры почв Севера, высокая степень их заболоченности определяют контрастность накопления поллютантов в почвенном профиле (Садов и др., 1997). Наблюдается четкая дифференциация распределения углеводородных компонентов нефти в почвах тундр и активный разнос поллютантов, которые усиливаются вследствие фракционирования нефти при ее миграции: перемещение более легких компонентов вглубь почв и вниз по рельефу приводит к ее выходу в фоновые почвы и расширению площади первичного очага загрязнения, выходу в водотоки и водоемы (Рыбин и др., 1996; Солнцева, 1997).

В тундровых почвах углеводороды могут сохраняться многие десятилетия (\¥ез1:1аке, 1978). За счет переувлажненности происходит сдвиг в сторону процессов анаэробного разложения, в ходе которого накапливаются продукты полураспада нефти. Это вызывает ингибирование процессов биодеградации нефти (СМи, 1978).

В районах нефтедобычи на Севере среди наиболее характерных нарушений почвенного покрова выделяют по степени нарушенности т