Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование циркулирующих ДНК и мРНК для неинвазивного пренатального определения пола, резус-фактора и диагностики синдрома Дауна у плода

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Использование циркулирующих ДНК и мРНК для неинвазивного пренатального определения пола, резус-фактора и диагностики синдрома Дауна у плода"

004610755

Л

На правах рукописи

БЛАГО ДАТСКИХ ЕКАТЕРИНА ГРИГОРЬЕВНА

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ ДНК И мРНК ДЛЯ НЕИНВАЗИВНОГО ПРЕНАТАЛЬНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛА, РЕЗУС-ФАКТОРА И ДИАГНОСТИКИ СИНДРОМА ДАУНА У ПЛОДА

03.01.03 - молекулярная биология

2 1 ОКТ 2ою

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва - 2010

004610755

Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии (заведующий - доктор биологических наук, профессор Носиков Валерий Вячеславович) ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» (ФГУП «ГосНИИ генетика»).

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, ФГУП «ГосНИИ генетика»,

г. Москва Серёгин Юрий Александрович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, Медико-Генетический Научный Центр РАМН, г. Москва

кандидат биологических наук, Институт Молекулярной Биологии

им. В.А. Энгельгардта РАН, г. Москва Грядунов Дмитрий Александрович

Ведущая организация: Научно-исследовательский Институт

Биомедицинской Химии имени В.Н. Ореховича РАМН, г. Москва

Защита состоится » октября 2010 года в 14 часов на заседании

Диссертационного совета Д.217.013.01 при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1.

Зинченко Рена Абульфазовна

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИ генетика». Реферат разослан «<?3 » сентября 2010 года.

Учёный секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук

Воюшина Т.Д.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Крайне важной является разработка неинвазивных и не требующих длительного времени генетических тестов, позволяющих диагностировать трисомию хромосомы 21 у плода, а также устанавливать его пол и резус-фактор в первом - начале второго триместра беременности.

Выяснение пола плода на ранних сроках беременности может предотвратить повторные случаи рождения больных детей в семьях с отягощенной наследственностью. В настоящее время основным методом пренатального установления пола будущего ребёнка является ультразвуковая диагностика, однако на ранних сроках беременности этот метод позволяет определять пол плода только по косвенным ультразвуковым маркерам.

Для выявления резус-конфликта беременной и плода в настоящее время применяют целый комплекс дорогостоящих и длительных клинических исследований, включающий измерение уровней специфичных материнских антител к резус-фактору, а также ультразвуковое исследование для определения скорости артериального потока крови средней мозговой артерии.

С целью пренатальной диагностики хромосомных синдромов в клинической практике проводится цитогенетический анализ клеток различных тканей плода. Для проведения этого анализа требуется применение инвазивной диагностики, обладающей, наряду с высокой точностью, превышающей в среднем 99%, серьёзными недостатками, - риском инфицирования плода и нежелательного прерывания беременности.

Цель и задачи работы. Целями данной работы были разработка систем для неинвазивного пренатального определения пола и резус-фактора плода по крови беременной женщины, а также разработка подхода для диагностики синдрома Дауна у плода. Для определения пола и резус-фактора плода проводилось обнаружение в крови будущей матери циркулирующих ДИК плода, содержащих участки генов ОУ514 и ИНО, соответственно. Для диагностики синдрома Дауна использовался метод, основанный на количественном генотипировании полиморфных маркеров в циркулирующих в крови матери РНК хромосомы 21 плода.

Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи:

1. Определить соответствующие возможностям медицинских центров России условия выделения и длительного хранения образцов плазмы крови, а также циркулирующих ДНК и РНК.

2. Разработать пригодную для неинвазивной пренатальной диагностики систему определения ДНК, содержащую маркер DYS 14, расположенный внутри многокопийного гена хромосомы У, кодирующего белок TSPY1, используя в качестве материала циркулирующие ДНК плода из плазмы крови беременных.

3. Разработать систему для пренатального определения резус-фактора плода с помощью амплификации в реальном времени двух экзонов гена RIID, используя в качестве материала циркулирующие ДНК из плазмы крови беременных.

4. Выбрать гены хромосомы 21, которые, согласно литературным данным, преимущественно экспрессируются в плаценте. Проанализировать их экспрессию с помощью ОТ-ПЦР (полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией) из РНК плазмы крови беременных женщин и контрольных образцов мужчин.

5. С помощью генотипирования образцов беременной женщины, будущего отца ребёнка и плода по полиморфным маркерам в выбранных генах оценить долю плодной РНК каждого гена в плазме материнской крови. Оценить возможность применения этого метода для диагностики трисомии по хромосоме 21.

Научная новизна работы.

• Созданы новые системы для безопасного неинвазивного определения пола и резус-фактора плода на ранних сроках беремешгости, обладающие большей чувствительностью по сравнению с описанными в литературе.

• Отработан оригинальный протокол хранения образцов плазмы, выделения и генетического анализа циркулирующих РНК с помощью ПЦР в реальном времени.

Проведено комплексное исследование концентрации мРНК трёх генов хромосомы 21 в плазме крови беременных женщин и доли данных мРНК, имеющих плодное происхождение.

Практическая ценность работы. Разработанные системы могут применяться в неинвазивной пренатальной диагностике при установлении пола и резус-фактора плода. Дальнейшая оптимизация предложенного подхода для диагностики синдрома Дауна позволит выявлять наличие трисомии у плода на ранних сроках беременности.

Апробация работы. Диссертационная работа была представлена на заседании Секции молекулярной биологии Учёного Совета ФГУП «ГосНИИгенетика» 20 июля 2010 года. Результаты настоящей работы докладывались на V-ом съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (г. Москва, Россия, 2009 г.). Материалы работы были представлены на международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (г. Москва, Россия, 2009 г.), а также на VI-ом съезде Российского Общества Медицинских Генетиков (г. Ростов-на-Дону, Россия, 2010 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ, включая 2 статьи, а также материалы съездов и международной конференции.

Структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание использованных материалов и методов, результаты и их обсуждение, выводы и список литературы. Материалы диссертации изложены на 113 страницах машинописного текста и содержат 6 таблиц и 19 рисунков. В работе процитированы 141 зарубежный и 7 отечественных литературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Настоящая работа была направлена на разработку методов безопасного и достоверного определения пола и резус-фактора будущего плода, а также на разработку подхода, пригодного для безопасной диагностики синдрома Дауна у плода по крови будущей матери с помощью циркулирующих плодных нуклеиновых кислот.

Циркулирующие внеклеточные плодные ДНК - это короткие участки плодных нуклеиновых кислот, циркулирующих в материнской плазме и сыворотке, которые наблюдаются иногда в несвязанной форме, свободными от обычных клеточных компонентов. Наличие плодных внеклеточных ДНК было продемонстрировано в 1997 году (Lo et al., 1997). Три года спустя было доказано наличие циркулирующих РНК в плазме (Poon et al., 2000). Эти два открытия послужили основой для развития неинвазивной пренатальной диагностики.

Появляется фетальная (от англ. «fetal» - плод) ДНК в кровотоке уже ка первом месяце беременности (Тамкович и др., 2008; Lo, 2008). В целом, внеклеточные ДНК

плода составляют 3-5% от всех циркулирующих в крови беременной внеклеточных ДНК при выделении их из плазмы. Это значительно затрудняет задачу исследователя при определении специфичных плодных локусов (Ьо й а1., 1999).

1. Неинвазивное пренатальное определение пола плода с помощью внеклеточной ДНК и маркера 0¥Б14.

Установление пола будущего ребёнка проводилось по схеме, представленной на рисунке 1:

Рисунок 1. Схема неинвазивного пренатального установления пола плода по образцам крови будущей матери.

Маркер DYS14 расположен внутри многокопийного гена хромосомы Y, кодирующего белок TSPY. Ген представлен в геноме человека в виде 50 копий. Разработанная нами система позволяет детектировать 9 гомологичных копий гена.

Известно, что концентрация внеклеточной ДНК плода в крови будущей матери составляет от 100 до 3 ООО копий/мл (Farina et al., 2003; Zhong et al., 2006; Lo et al., 2007; Lo et al., 2008). Нами проведена амплификация, с помощью которой удалось доказать, что минимальное определяемое в нашем эксперименте количество ДНК, содержащей маркер DYS14, составило 2 000 копий/мл крови, - это позволило судить о возможности применения разработанной системы в пренатальной диагностике пола будущего ребёнка. Результаты проведения ПЦР представлены в виде графика, из которого видно, что фактическое число молекул образцов было распределено по реакционным лункам согласно математическому закону - распределению Пуассона, что свидетельствует о попадании двух копий ДНК в реакционную смесь (рисунок 2).

Беременныеженщиныс установленным кариотиломплода

(25 .va,'чуткое и 15 ttevm)

Кровь ;-г Плазма

Циркулирующие ДНК

; Амплификация участка ДНК, : содержащего маркер ОУЭН ' с помощью ПЦР в реальном < | времени

и о н

о «

О

33

35

37

39

41

43

Пороговый цикл ((Л)

Рисунок 2. Распределение числа молекул ДНК в реакционных лунках подчиняется математическому закону Пуассона.

Представленные на рисунке 3 кривые амплификации подтверждают возможность детектирования от 2 до 20 ООО копий хромосомы У в анализируемом образце.

В качестве контроля определения хромосомы У использовали маркер 5ЯУ, расположенный внутри однокопийного гена. По этому маркеру принято определять половую принадлежность образцов в судебной медицине, при малых количествах генетического материала. Положительным контролем прохождения ПНР в реальном времени служил участок однокопийного гена «домашнего хозяйства» ОАРИН.

Номер цикла

Рисунок 3. Определение нижнего предела обнаружения маркера ВУ514 с помощью ПЦР в реальном времени.

Амплификация участков ДНК, содержащих маркер ОУ414 с целью

определения половой принадлежности плода по образцам плазмы крови беременных женщин

В исследовании использовали 25 образцов крови женщин, беременных мальчиками и 15 - девочками, согласно данным кариотипирования. Ниже приведены результаты проведения амплификации в реальном времени участка маркера ОУБЫ, позволяющие судить о половой принадлежности плода (рисунок 4).

Анализ 39 образцов плазмы крови беременных подтвердил результаты кариотипирования - был установлен мужской пол плода в 24 случаях и женский - в 15, 1 результат оказался ложноотрицательным. Таким образом, чувствительность разработанной системы составляет 96%, а специфичность - 100%.

Для удобства отображения на рисунке приведены результаты анализа четырёх из 25 проанализированных образцов плазмы крови беременных мальчиками женщин. На рисунке также отображены результаты амплификации участка маркера Ж К, - они не явились информативными в данной ситуации, как видно, - одна копия этого маркера не всегда детектируема при малых количествах анализируемого генетического материала.

Номер цикла

Рисунок 4. Сравнительный анализ амплификации участков маркеров ОУ814 и ЗЛУ проводился на образцах плазмы крови беременных мальчиками женщин. Успешная амплификация маркера £>У574 позволила судить о мужской принадлежности плода. В нашем случае эффективность ПЦР составила 98%, что на 18% выше показателя системы, предложенной ранее ^¡ттегтапп е! а!., 2008).

Таким образом, разработанная нами система позволила, с помощью амплификации маркера ВУЗ!4, достоверно и безопасно установить пол плодов по образцам крови беременных женщин на ранних сроках беременности.

2. Неинвазивное пренатальное определение резус-фактора плода с помощью внеклеточной ДНК и гена КНО.

Установление резус-фактора будущего ребёнка проводилось по схеме, представленной на рисунке 5:

Рисунок 5, Схема неинвазивного пренаталыюго установления резус-фактора плода по образцам крови будущей матери.

Ген ШЮ, определяющий положительный резус-фактор человека, идентичен на 92% по нуклеотидной последовательности гену ЯНСЕ, обнаруживаемому и при отрицательном резус-факторе. Наибольшие отличия между генами наблюдаются в экзонах 7 и 10, поэтому одна из основных задач при установлении резус-статуса исследуемого образца, - это обнаружение именно этих экзонов гена ЯНИ.

Апробацию разработанной системы с целью определения нижнего предела обнаружения участка ДНК, содержащего ген /У7Д проводили на образцах крови мужчин с установленным ранее, по анализу крови, положительным резус-фактором. Проводили ряд последовательных разведений водного раствора геномной ДНК, в конечном итоге до 2 копий в мкл. В результате проведения серии опытов была установлена возможность обнаружения, как минимум, двух копий ДНК, содержащих ген Я1Ю в реакционной смеси (рисунок б), что позволило нам сделать вывод о пригодности системы для пренатальной диагностики резус-фактора по образцам плазмы крови беременных женщин.

! 28 беременных женщин с

отрицательным резус: фактором

Кровь

Плазма

Циркулирующие ДНК

Амплификация участков ' ДНК. содержащих экзоны 7 и 10 гена ЙНО с помощью ПЦР ' в реальном времени

Рисунок 6. Определение нижнего предела обнаружения ДНК, содержащей ген ЛЯ£> в реакционной смеси с помощью ПЦР в реальном времени.

Установление резус-фактора плода по образцам плазмы крови беременных

женщин

В исследовании использовали 28 образцов крови беременных с установленным ранее, по анализу крови, отрицательным резус-фактором матери. Анализ 21 образца указал на положительный резус-фактор плода, в 7 случаях был установлен отрицательный резус-фактор. Результаты анализа были подтверждены анализом крови детей после их рождения. Таким образом, чувствительность и специфичность разработанной системы составляет 100%.

Ниже приведены результаты проведения ПЦР в реальном времени участков экзонов 7 и 10 гена ЛЯД позволяющие судить о резус-факторе плода (рисунок 7). Положительным контролем прохождения ПЦР в реальном времени служил участок однокопийного гена «домашнего хозяйства» ОАРБН. Для удобства отображения приведены результаты анализа четырёх образцов плазмы крови беременных женщин.

Рисунок 7. Результаты амплификации участков экзонов 7 и 10 гена ШЭ из образцов плазмы беременных женщин позволили установить положительный резус-фактор плода.

Таким образом, предложенная нами система позволяет безопасно и достоверно устанавливать резус-фактор плода по крови его будущей матери.

3. Разработка подхода для диагностики синдрома Дауна у плода по образцам

плазмы крови беременных женщин.

Для разработки диагностического подхода мы использовали специфичные для плаценты мРНК (плацентарные мРНК), выделенные из крови беременной, - такой подход может предоставить достаточную для анализа информацию о плодном генотипе.

Определение количества и качества выделенной РНК

Сохранность РНК в образцах плазмы крови является одним из лимитирующих факторов разработки подхода, поэтому мы провели ряд экспериментов, чтобы отработать условия стабильного получения РНК из плазмы крови и последующую успешную амплификацию после проведения обратной транскрипции.

Для определения количества и качества выделенной РНК использовали

фрагменты генов «домашнего хозяйства» АСТВ и В2М. Ген бета-актина (АСТВ) был выбран из-за высокой экспрессии во всех клетках человека, что позволяет идентифицировать мРНК этого гена из минимальных возможных концентраций тотальной РНК. Однако для гена бета-актина обнаружено более 10 псевдогенов, геномные последовательности которых практически полностью гомологичны последовательности его мРНК. Это является большим недостатком, поскольку при наличии даже небольших следов геномной ДНК в образцах кДНК, последовательности псевдогенов также будут амплифицироваться, образуя продукты такой же длины. Для минимизации этого эффекта праймеры были подобраны таким образом, чтобы давать фрагменты разной длины в случае амплификации кДНК и геномной ДНК, что позволяет оценивать степень загрязнения геномной ДНК: один или оба праймера перекрывали границу двух экзонов или праймеры располагались внутри экзонов, разделённых шггроном.

Аналогичная ситуация с наличием большого числа псевдогенов характерна для большинства генов, которые часто используются как стандарты в исследованиях экспрессии. Поэтому нами в качестве второго стандарта был выбран ген В2М, для которого псевдогены не обнаружены. Для него праймеры также были подобраны таким образом, чтобы амплифицировать только кДНК гена, а не геномную ДНК.

Исследование сохранности РНК в крови и плазме крови

Для исследования степени деградации циркулирующей РНК цельную кровь хранили на льду в течение 1, 4 и 24 часов, после чего из неё производилось выделение РНК. Использовали три различных метода выделения: Хомчинскош (СЬотс2упз1а е1 а1., 2006) - с помощью реагента Тризол, с применением ионообменных колонок и новый комбинированный метод, объединяющий в себе первые два.

Сохранность РНК оценивали по интенсивности сигнала ОТ-ПЦР, для которой использовали пары праймеров, позволяющие амплифицировать фрагменты генов РЫС4, АСТВ и В2М. Аналогичный эксперимент был проведён с плазмой крови, которую после получения из цельной крови хранили при комнатной температуре, +4°С, -20°С и -70°С в течение 1, 4 и 24 часов.

Исследования показали, что хранение крови на льду в течение 24 часов не привело к существенному изменению эффективности амплификации участков

выбранных генов (различия не более 20 %). Также отмечена высокая сохранность циркулирующей РНК в плазме при +4°С и -70°С в течение 24 часов (снижение уровня сигнала не более 20%). При этом сохранность образцов при комнатной температуре и замораживании на -20°С в течение 24 часов была снижена на 50% и 30%, соответственно. Таким образом, была подтверждена достаточно высокая стабильность циркулирующей РНК, показанная и другими авторами.

Кроме того, проводилась оценка увеличения сохранности РНК после добавления двух реактивов, теоретически замедляющих деградацию РНК: «RNAlater» («Ambion», США) и Тризол. Добавление реагента «RNAlater» привело к резкому снижению выхода РНК при выделении всеми доступными методами, что делает невозможным его использование для анализа циркулирующих РНК. Напротив, добавление реагента Тризол, в состав которого входит 0,8 М гуанидин тиоционат и фенол (pH 4,0), существенно повысило сохранность РНК. В частности, было показано значительное увеличение сохранности циркулирующей РНК после хранения плазмы крови при -70°С в течение 4-6 месяцев (таблица 1).

Таблица 1.

Результаты выделения РНК из образцов плазмы крови разных сроков хранения с использованием ионообменных колонок («QIAamp® Viral RNA mini kit», «Qiagen», США) и добавлением 1,25 объёма реагента Тризол.

Срок хранения образцов РНК Средний выход РНК, мкг Доля успешной ОТ-ПЦР, %

Добавление реагента Тризол перед хранением Добавление реагента Тризол после хранения Добавление реагента Тризол перед хранением Добавление реагента Тризол после хранения

1-10 дней 2,8 ±1,3 2,4 ±0,9 100 93

4-6 месяцев 1,9 ±1,0 0,5 ±0,3 67 13

В некоторых статьях, описывающих методы выделения нуклеиновых кислот из плазмы крови, часто предлагается добавлять в кровь 1% раствор формальдегида для

повышения физической прочности клеток крови, предотвращения их лизиса и выхода в плазму внутриклеточных нуклеиновых кислот (011а11ап е( а!., 2004).

В проведённых нами экспериментах было показано, что выделение и анализ РНК из плазмы крови, обработанной раствором формальдегида, сильно затруднены, по-видимому, из-за ковалентных сшивок между РНК и белками плазмы. В 58% образцов амплификация фрагментов выбранных генов оказалась невозможна, для других количество продукта ПЦР было снижено на 1-2 порядка. Разрушение ковалентных сшивок с помощью инкубирования раствора РНК с протеиназой К в течение 1 часа при температуре 70°С позволило повысить эффективность ОТ-ПЦР, однако различия не были существенными.

Отработка оптимального метода выделения циркулирующих мРНК

Было проведено сравнение трёх известных из литературы методов выделения РНК: два классических метода с использованием смеси фенола и гуанидин тиоцианата (с помощью реагента Тризол) (СЬотсгупзк1 е1 а1., 2006) и с использованием ионообменных колонок, а также новый комбинированный метод, объединяющий в себе первые два (2Ьоп§, 2008). Сравнение проводилось следующим образом. Образцы плазмы разделяли на 3 равные части. Из каждой части выделяли РНК одним из трёх методов и проводили ОТ-ПЦР с использованием трёх маркерных генов. Добавление реагента Тризол, если было необходимо по протоколу, проводилось сразу перед выделением.

РНК выделяли из 30 свежих образцов плазмы (хранение: 1-10 дней при-70°С) и из 30 образцов плазмы длительного срока хранения (4-6 месяцев при -70°С). Результаты исследования подтвердили данные последних публикаций о значительном преимуществе комбинированного метода для выделения из плазмы крови РНК невирусного происхождения (таблица 2). Данный метод оказался единственным, с помощью которого удалось успешно выделять РНК из образцов плазмы после длительного хранения с достаточно высоким выходом.

Таблица 2.

Результаты выделения РНК из образцов плазмы крови разных сроков хранения тремя методами: с помощью фенола-гуанидин тиоцианата (реагент Тризол), ионообменных колонок («Viral RNA mini kit», Qiagen) и комбинированного метода.

Срок хранения образцов Средний выход РНК, мкг Доля успешной ОТ-ПЦР, % I

Тризол Viral RNA mini kit Тризол+ Viral RNA mini kit Тризол Viral RNA mini kit Тризол+ Viral RNA mini kit

1-10 дней 0,9 ±0,7 3,1 ±1,7 4,3 ±2,1 66 100 100

4-6 месяцев 0,1 ±0,1 0,3 ±0,2 1,1 ± 0,5 0 14 43

Идентификация генетических маркеров, пригодных для проведения исследования

Измерение соотношений аллелей, транскрибируемых с хромосомы, приводящей к анеуплоидии, позволяет выявить анеуплоидию (Ьо И а1., 2007). Этот подход называется «РНК-ОНП» (ОНП - однонуклеотидный полиморфизм) и основан на наличии внутри амплифицируемой последовательности полиморфного маркера.

Преимуществами данного подхода являются: 1) наличие множества копий мРНК, транскрибируемых со специфичного для плаценты гена; 2) мРНК - маркеры могут легко быть обнаружены с помощью ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) или других методов амплификации, без применения более сложного метода (Ьо, 2008).

Необходимым условием для эффективного применения метода РНК-ОНП является гетерозиготный генотип данного полиморфного маркера у ребёнка. Теоретически, увеличение информативности метода РНК-ОНП может быть достигнуто включением в панель полиморфных маркеров нескольких генов, обнаруживаемых в материнской плазме.

Для анализа хромосомного дисбаланса пригодны полиморфные маркеры в циркулирующих РНК, обладающие следующим свойствами:

1. РНК должны специфично экспрессироваться в плаценте, причём в той её части, которая содержит только клетки с генотипом плода.

2. Кодирующие гены должны лежать в критической области, ассоциированной с синдромом Дауна, на хромосоме 2Ц22.

3. Поскольку для анализа подходят только гетерозиготные генотипы, то полиморфные маркеры должны обладать максимальной гетерозиготностыо.

Анализ баз данных и литературных источников помог выявить несколько генов и полиморфных маркеров, обладающих всеми перечислетшми свойствами. Это гены РЫС4, 0.\'МТЗ[. и нетранслируемая РНК с21ог/105. В них были выбраны для анализа 3 полиморфных маркера, обладающих достаточно высокой гетерозиготностыо (более 30%).

На рисунке 8 представлены схематические изображения генов и полиморфных маркеров внутри этих генов. Отображено также схематическое расположение генов внутри критического района синдрома Дауна - участка хромосомы 21, трисомия которого приводит к синдрому Дауна (Вар^а й а1., 2000).

PLAC4 c21orflOS DNMT3L

■21q22-3

rs8130833 rsl 1555158 rs7354779

Рисунок 8. Схематическое изображение расположения выбранных для исследования генов и полиморфных маркеров внутри них в минимальном участке хромосомы 21, трисомия которого приводит к синдрому Дауна.

Проведена экспериментальная проверка частот встречаемости всех 3 полиморфных маркеров (rs8130833, rsl155158 и rs7354779) в генах PLAC4, c21orfl05 и DNMT3L, соответственно, в выборке из 100 человек, представляющей население г. Москвы. Была подтверждена высокая гетерозиготность всех этих маркеров.

Для определения специфичности выбранных полиморфных маркеров для плаценты была проведена ОТ-ПЦР фрагментов, фланкирующих все 3 маркера, из РНК, полученной из плазмы крови беременных женщин. Одновременно с этим проводилась ОТ-ПЦР тех же маркеров из РНК контрольной группы мужчин. Было

проведено от 30 до 42 циклов ПЦР с шагом в 2 цикла, и определено количество циклов, при которых был получен специфичный сигнал (таблица 3).

Таблица 3.

Количество циклов ОТ-ПЦР участков, содержащих полиморфные маркеры в генах РЫС4, с21ог/105 и ДЫМГЗЬ, из образцов РНК из плазмы крови мужчин и беременных женщин.

1 РЫС4 с21от/105 DNMTЗL 1

1 Группа 1

(п8130833) (к11555158) (г*7354779) 1

| Беременные женщины 36 44 46 1

| Мужчины 40 - 1

Как видно из представленных результатов, для амплификации полиморфного маркера в гене РЫС4 потребовалось 36-40 циклов ПЦР. Однако оказалось, что экспрессия данного гена не полностью специфична для беременных женщин. При этом концентрация его РНК в плазме крови мужчин меньше в 10-20 раз, что соответствует дополнительным 4 циклам ПЦР, и это соотношение остаётся неизменным для всех проанализированных проб.

Возможно, неспецифичность экспрессии связана с тем фактом, что ген РЬАС4 полностью расположен в интроне гена ВАСЕ2, который экспрессируется в большинстве органов и тканей организма. Данное утверждение было проверено путём амплификации 5 участков гена РЬАС4 в 10 образцах кДНК яичников небеременных женщин, показавшей наличие экспрессии всех 5 участков гена.

По данным литературы, для амплификации фрагментов генов с21ог/105 и ОЫМТЗЬ требуется проведение не менее 44 циклов ПЦР, что свидетельствует о крайне низком уровне их экспрессии. Поэтому нами дополнительно была проведена амплификация 3 участков данных генов, содержащих полиморфные маркеры, с использованием 44-46 циклов ПЦР. Для большинства образцов (62%) было показано наличие специфичного продукта ПЦР.

Мы считаем, что полиморфные маркеры в гене Р1ЛС4 предпочтительны для использования в неинвазивной диагностике синдрома Дауна у плода по крови матери ввиду наивысшей концентрации РНК данного гена. При этом мы считаем, что гены

c21orfl05 и DNMT3L также пригодны для этой цели, однако их использование предполагает повышенные требования к чистоте лабораторных помещений из-за малого количества их РНК в материнской крови и связанной с этим опасности загрязнения.

Генотипирование полиморфных маркеров в генах PLAC4, с21ог/105 и DNMT3L

Удачная амплификация полиморфных маркеров в генах PLAC4, c21orfl05 и DNMT3L показала, что концентрация мРНК данных генов достаточна для последующего генетического анализа. Для дальнейшего использования полиморфных маркеров в данных генах следует также доказать, что их РНК происходит от плода, то есть имеет плодный генотип.

Для определения количественного соотношения между РНК с генотипами плода и матери в плазме материнской крови мы использовали следующий подход. Из собранной коллекции крови были выбраны семейные пары, в которых будущие отец и мать были, согласно данным проведённого нами генотипирования, гомозиготны по разным аллелям полиморфных маркеров rs8130833, rsl 155158 и rs7354779. Таким образом, генотип плода должен быть гетерозиготным и, в случае отсутствия трисомии у плода, соотношение между аллелями в кДНК должно быть равно 1:1. Отклонение от данного соотношения в сторону генотипа матери будет свидетельствовать о содержании в плазме РНК с генотипом матери.

Из парных образцов крови (беременная женщина и будущий отец) были выбраны 30 с разными аллелями маркера rs8130833, 24 - с разными аллелями маркера rsl 155158 all - маркера rs?354779. Далее, выбрав подходящие для анализа семьи, мы провели генотипирование троек образцов: геномная ДНК и кДНК беременной, геномная ДНК будущего отца с помощью ПЦР в реальном времени с детекцией по конечной точке («TaqMan® анализ»).

Во всех случаях было установлено, что плод является носителем двух разных аллелей выбранных маркеров, унаследованных от обоих родителей. На рисунках 911, для удобства отображения, приведены результаты генотипирования 8 троек образцов.

Аллель А

Рисунок 9. Генотипирование маркера 130833 в тройках образцов: геномная ДНК и кДНК беременной, геномная ДНК будущего отца с помощью ПЦР в реальном времени с детекцией по конечной точке.

Аллель С

Рисунок 10. Генотипирование маркера гз11555158 в тройках образцов: геномная ДНК и кДНК беременной, геномная ДНК будущего отца с помощью ПЦР в реальном времени с детекцией по конечной точке.

и00е+006

8,000с+005

и

Будущие родители

Гетерозиготный контроль

0.000е-+001> 2,ОООеЧЮ5 4,000е+005

Аллель А

Рисунок 11. Гепотипирование маркера гз7354779 в тройках образцов: геномная ДНК и кДНК беременной, геномная ДНК будущего отца с помощью ПЦР в реальном времени с детекцией по конечной точке.

Рисунок 12. Схема проведения

генотипирования полиморфных

маркеров в образцах крови будущей

матери.

I Беременные женщины и | будущие отцы детей

/ Кровь

Плазма крови

т::

Итак, генотипирование будущего ребёнка по маркерам п-8130833, гя1155158 и п7354779 проводилось по схеме, представленной на рисунке 12.

Таким образом, генотипирование РНК плазмы крови беременных женщин показало возможность анализа генотипа плода, что делает данный метод пригодным для пренатальной диагностики синдрома Дауна. Однако наличие РНК с материнским генотипом, обнаруженное для всех полиморфных маркеров, затрудняет определение соотношения аллелей. Для повышения достоверности диагностики синдрома Дауна необходимо привлечение информации о большем числе маркеров в других генах хромосомы 21 и использование математических

I ДНК

РНК

и:::

(ДНК /

ПЦР полиморфных маркеров

Генотипирование полиморфных маркеров

алгоритмов, позволяющих избавиться от данной систематической ошибки. Для нахождения таких маркеров нужны широкомасштабные исследования транскриптома плазмы крови.

ВЫВОДЫ

1. Определены условия длительного хранения образцов плазмы крови и выделения циркулирующих внеклеточных ДНК и РНК, соответствующие возможностям медицинских центров России.

2. В целях неинвазивного пренатального определения пола плода разработана новая система обнаружения ДНК, содержащей маркер БУБИ, расположенный внутри многокопийного гена хромосомы У, кодирующего белок Т8РУ1 с помощью ПЦР в реальном времени. С использованием метода «цифровой ПЦР» показано, что разработанная система позволяет детектировать, как минимум, 2 копии хромосомы У в реакционной смеси. Генотипирование 40 образцов плазмы крови беременных с установленным кариотипом плода (25 мальчиков и 15 девочек) показало, что чувствительность разработанной системы составляет 96%, а специфичность -100%.

3. Разработана система для неинвазивного пренатального определения резус-фактора плода с помощью амплификации в реальном времени двух экзонов гена ЯЯ1). Анализ 28 образцов плазмы крови беременных с отрицательным резус-фактором с помощью разработанной системы показал, что чувствительность и специфичность разработанной системы составляет 100%.

4. В целях диагностики синдрома Дауна выбраны 3 гена хромосомы 21: Р1ЛС4, с21ог/105 и йММТЗЬ. Подтверждена возможность амплификации фрагментов этих генов на матрице РНК плазмы крови с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени. Генотипирование полиморфных маркеров п8130833, 155158 и г$7354779 в тройках образцов (геномная ДНК будущего отца, геномная ДНК беременной, кДНК плода) показало наличие в плазме крови беременной как РНК с её генотипом, так и РНК с генотипом плода.

5. Генотипирование РНК плазмы крови беременных женщин показало возможность анализа генотипа плода, что делает данный метод пригодным для пренатальной диагностики. Для повышения достоверности диагностики синдрома Дауна необходимо привлечение информации о большем числе маркеров в других генах критического района синдрома Дауна хромосомы 21 q22.3.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Благодатских Е.Г.. Серёгин Ю.А., Маркова Ж.Г., Шилова Н.В., Носиков В.В., Золотухина Т.В. Возможности использования циркулирующих в крови матери мРНК плацентарного происхождения для диагностики синдрома Дауна у плода. Медицинская генетика. 8(12), 24-30 (2009).

2. Благодатских Е.Г.. Никитин А.Г., Серёгин Ю.А., Благодатских К.А., Носиков В.В. Маркер DYS14 и определение пола по биологическим образцам. Молекулярная биология. 44(4), 646-649 (2010).

3. Мануйлова Е.Г. (Благодатских Е.Г.), Маркова Ж.Г., Шилова Н.В., Золотухина Т.В., Серёгин Ю.А. Определение возможности использования циркулирующих мРНК для пренаталъной диагностики синдрома Дауна. Материалы V-oro съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров, стр. 458, г. Москва, Россия (21-28 июня 2009 г.).

4. Мануйлова Е.Г. (Благодатских Е.Г.), Маркова Ж.Г., Шилова Н.В., Золотухина Т.В., Носиков В.В., Серёгин Ю.А. Определение возможности использования циркулирующих мРНК для пренаталъной диагностики синдрома Дауна. Материалы международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвящённой 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова, стр. 134-138, г.Москва, Россия (28 сентября - 2 октября 2009 г.).

5. Благодатских Е.Г.. Никитин А.Г., Маркова Ж.Г., Шилова Н.В., Золотухина Т.В., Носиков В.В., Серёгин Ю.А. Фоновая экспрессия затрудняет использование циркулирующих фетальных мРНК в материнской крови для диагностики трисомии по хромосоме 21 у плода. Материалы VI-го съезда Российского Общества Медицинских Генетиков, стр. 24-25, г. Ростов-на-Дону, Россия (14 -19 мая 2010 г.).

Подписано в печать: 17.09.2010

Заказ № 4123 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Благодатских, Екатерина Григорьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность темы.

Цели и задачи работы.

Научная новизна работы.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. НЕИНВАЗИВНАЯ ПРЕНАТАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА.

Плацента. Строение и функции.

Попытки и методы неинвазивной диагностики.

Клетки плода.

Эритробласты.

Трофобласты.

Циркулирующие нуклеиновые кислоты.

ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР).

Общие сведения.

ПЦР в реальном времени.

Анализ линейных разрушаемых проб (Та(зМак® анализ).

ПЦР с обратной транскрипцией.

Одностадийная ОТ-ПЦР.

Двухстадийная ОТ-ПЦР.

Цифровая ПЦР.

ПОЛИМОРФНЫЕ МАРКЕРЫ.

Мини- и микросателлиты.

Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ).

Однонуклеотидный полиморфизм (ОНП).

ПРЕНАТАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА СЦЕПЛЕННЫХ С ПОЛОМ

ЗАБОЛЕВАНИЙ.

Гемофилия типов АиВ.

Синдром Мартина-Белл.

Дистрофия Дюшенна.

Методы пренатальной диагностики пола плода.

ПРЕНАТАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА РЕЗУС-ФАКТОРА ПЛОДА.

Отрицательный резус-фактор. Клинические аспекты.

Гены группы Ян.

ПРИМЕНЕНИЕ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ СИНДРОМА ДАУНА.

Синдром Дауна. Клинические, генетические и социальные аспекты.

Внеклеточные плодные нуклеиновые кислоты в диагностике синдрома

Дауна. Попытки, подходы и методы.

Плацентарные мРНК. Попытки и методы. Выбор исследуемых генов и маркеров.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Образцы крови и плазмы крови.

Выделение геномной ДНК человека методом фенол-хлороформной экстракции.

Выделение циркулирующей ДНК из плазмы.

Выделение циркулирующей РЖ из плазмы.

Обратная транскрипция.

Параметры и компоненты ПЦР в реальном времени, а также ПЦР и ОТ

Пороговый цикл.

Олигонуклеотиды.

Условия ПЦР и последовательности праймеров.

Цифровая ПЦР.

Оценка эффективности проведения ПЦР.

Генотипирование полиморфных маркеров rs8130833, rs1155158 и rs

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

ПРЕНАТАЛЬНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛА ПЛОДА.

Цифровая ПЦР.

Амплификация участков ДНК, содержащих маркер DYS14 с целью определения половой принадлежности плода по образцам плазмы крови беременных женщин.

ПРЕНАТАЛЬНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ РЕЗУС-ФАКТОРА ПЛОДА.

Определение предела обнаружения участков гена RHD в реакционной смеси.

Установление резус-фактора плода по образцам плазмы крови беременных женщин.

РАЗРАБОТКА ПОДХОДА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ СИНДРОМА ДАУНА У ПЛОДА ПО ОБРАЗЦАМ ПЛАЗМЫ КРОВИ БЕРЕМЕННЫХ ЖЕНЩИН.

Определение количества и качества выделенной РНК.

Исследование сохранности РНК в крови и плазме крови.

Отработка оптимального метода выделения циркулирующих мРНК.

Идентификация генетических маркеров, пригодных для проведения исследования.

Генотипирование полиморфных маркеров в генаXPLAC4, c21orf105 и DNMT3L.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Использование циркулирующих ДНК и мРНК для неинвазивного пренатального определения пола, резус-фактора и диагностики синдрома Дауна у плода"

Одним из направлений пренатальной диагностики является выявление социально значимых наследственных заболеваний человека. В их число входят преимущественно тяжёлые моногенные синдромы и хромосомные патологии, которые приводят к инвалидности с рождения ребёнка, и для которых оправдано прерывание беременности в случае обнаружения.

За последние годы показано, что только треть всех наследственных заболеваний имеет традиционный моногенный аутосомный тип наследования [1]. Характер наследования остальных не согласуется с законами Менделя, предполагающими одинаковое действие генов, полученных от обоих родителей. Сцепленные с полом заболевания, при которых мутантный ген находится на хромосомах X и У, влияют на качество жизни, зачастую они неизлечимы и приводят к смерти в раннем возрасте.

Иммунологическая несовместимость плода и матери по резус-фактору является основной причиной гемолитической болезни новорождённого. В некоторых случаях воздействие антигенов, проникающих через плаценту, приводит к гибели плода [2]. Резус-конфликт является главной причиной развития кривошеи, а белок ШгО — самым иммуногенным белковым антигеном группы крови у людей [2].

Хромосомная патология является причиной многих врождённых заболеваний, среди которых самым распространённым является синдром Дауна, вызванный полной или частичной трисомией по хромосоме 21. Тяжесть заболевания и риск конкретных клинических проявлений зависит от многих невыясненных факторов [3], но даже в лёгких формах синдром Дауна вызывает инвалидность с самого раннего возраста ребёнка.

Используемые в настоящее время для диагностики перечисленных заболеваний методы либо неточны, либо связаны с травмирующими инвазивными процедурами и риском прерывания беременности. Основные надежды в разработке безопасных и одновременно точных методов связывают с циркулирующими в крови беременной нуклеиновыми кислотами плода. С их использованием возможна диагностика генетических нарушений уже в первом триместре, когда прерывание беременности приносит наименьший вред матери.

Наша работа нацелена на разработку безопасных и достоверных методов установления пола и резус-фактора будущего ребёнка, а также подхода для неинвазивной пренатальной диагностики синдрома Дауна у плода.

Актуальность темы

Выяснение пола плода на ранних сроках беременности может предотвратить повторные случаи рождения больных детей в семьях с отягощённой наследственностью. В настоящее время для установления пола плода основным методом является ультразвуковая диагностика, однако на ранних сроках беременности этот метод позволяет судить о наличии заболевания только по косвенным ультразвуковым маркерам.

Для выявления резус-конфликта беременной и плода в настоящее время применяют целый комплекс дорогостоящих и длительных клинических исследований, включающий измерение уровней специфичных материнских антител к резус-фактору, а также ультразвуковое исследование для определения скорости артериального потока крови средней мозговой артерии.

С целью пренатальной диагностики хромосомных синдромов в клинической практике проводится цитогенетический анализ клеток различных тканей плода. Для проведения этого анализа требуется применение инвазивной диагностики, обладающей, наряду с высокой точностью, превышающей в среднем 99%, серьёзными недостатками, -риском инфицирования плода и нежелательного прерывания беременности.

Крайне важной является разработка неинвазивных и не требующих длительного времени генетических тестов, позволяющих диагностировать трисомию-21 у плода, а также устанавливать его пол и резус-фактор в первом — начале второго триместра беременности.

Цели и задачи работы

Целями данной работы были разработка систем для неинвазивного пренатального определения пола и резус-фактора плода по крови беременной женщины, а также разработка подхода для диагностики синдрома Дауна у плода.

Для определения пола и резус-фактора плода проводилось обнаружение циркулирующих ДНК участков генов DYS14 и RHD, соответственно. При разработке подхода для диагностики синдрома Дауна использовался описанный в литературе метод, основанный на генотипировании полиморфных маркеров в циркулирующих РНК хромосомы 21.

Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи:

1. Определить соответствующие возможностям медицинских центров России условия выделения и длительного хранения образцов плазмы крови, а также циркулирующих ДНК и РНК.

2. Разработать пригодную для неинвазивной пренатальной диагностики систему определения ДНК, содержащую маркер DYS 14, расположенный внутри многокопийного гена Y-хромосомы, кодирующего белок TSPY1, используя в качестве материала циркулирующие ДНК из плазмы крови беременных.

3. Разработать систему для пренатального определения резус-фактора плода с помощью амплификации в реальном времени двух экзонов гена RHD, используя в качестве материала циркулирующие ДНК из плазмы крови беременных.

4. Выбрать гены хромосомы 21, которые, согласно литературным данным, преимущественно экспрессируются в плаценте.

Проанализировать их экспрессию с помощью ОТ—ПЦР из РНК плазмы крови беременных женщин и контрольных образцов мужчин.

5. С помощью генотипирования образцов беременной женщины, будущего отца ребёнка и плода по полиморфным маркерам в выбранных генах оценить долю плодной РНК каждого гена в плазме материнской крови. Оценить возможность применения этого метода для диагностики трисомии по хромосоме 21.

Научная новизна работы

• Созданы новые системы для безопасного неинвазивного определения пола и резус-фактора плода на ранних сроках беременности, обладающие большей чувствительностью по сравнению с описанными в литературе.

• Отработан оригинальный протокол хранения образцов плазмы, выделения и генетического анализа циркулирующих РНК с помощью ПЦР в реальном времени.

• Проведено комплексное исследование концентрации мРНК 3 генов хромосомы 21 в плазме крови беременных женщин и доли данных РНК, имеющих плодное происхождение.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Благодатских, Екатерина Григорьевна

Выводы

1. Определены условия длительного хранения образцов плазмы крови и выделения циркулирующих внеклеточных ДНК и РНК, соответствующие возможностям медицинских центров России.

2. В целях неинвазивного пренатального определения пола плода разработана новая система обнаружения ДНК, содержащей маркер DYS 14, расположенный внутри многокопийного гена хромосомы Y, кодирующего белок TSPY1 с помощью ПЦР в реальном времени. С использованием метода «цифровой ПЦР» показано, что разработанная система позволяет детектировать, как минимум, 2 копии хромосомы Y в реакционной смеси. Генотипирование 40 образцов плазмы крови беременных с установленным кариотипом плода (25 мальчиков и 15 девочек) показало, что чувствительность разработанной системы составляет 96%, а специфичность — 100%.

3. Разработана система для неинвазивного пренатального определения резус-фактора плода с помощью амплификации в реальном времени двух экзонов гена RHD. Анализ 28 образцов плазмы крови беременных с отрицательным резус-фактором с помощью разработанной системы показал, что чувствительность и специфичность разработанной системы составляет 100%.

4. В целях диагностики синдрома Дауна выбраны 3 гена хромосомы 21: PLAC4, c21orfl05 и DNMT3L. Подтверждена возможность амплификации фрагментов этих генов на матрице РНК плазмы крови с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени. Генотипирование полиморфных маркеров rs8130833, rs1155158 и rs7354779 в тройках образцов (геномная ДНК будущего отца, геномная ДНК беременной, кДНК плода) показало наличие в плазме крови беременной как РИСК с её генотипом, так и РНК с генотипом плода.

5. Генотипирование РНК плазмы крови беременных женщин показало возможность анализа генотипа плода, что делает данный метод пригодным для пренатальной диагностики. Для повышения достоверности диагностики синдрома Дауна необходимо привлечение информации о большем числе маркеров в других генах критического района синдрома Дауна хромосомы 2Ц22.3.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Благодатских, Екатерина Григорьевна, Москва

1. Дадали E.JL, Барышникова Н.В. 2006. Болезни с нетрадиционными типами наследования. Генетика. Москва: Академкнига; 468-500.

2. Neil D. Avent. 2008. RHD Genotyping from Maternal Plasma: Guidelines and Technical Challenges. Prenatal Diagnosis. 444, 185-201.

3. Roper R.J., Reeves R.H. 2006. Understanding the basis for Down syndrome phenotypes. PLoS Genet. 2 (3), e50.

4. Evans M.I., Wapner R.J. 2005. Invasive prenatal diagnostic procedures 2005. Semin. Perinatol. 29 (4), 215-218.

5. Dennis Lo Y.M., Chiu R.W.K. 2008. Noninvasive Prenatal Diagnosis of Fetal Chromosomal Aneuploidies by Maternal Plasma Nucleic Acid Analysis. Clin Chem. 54 (3), 461-466.

6. Malone F.D., Canick J.A., Ball R.H. et al. 2005. First-Trimester or Second-Trimester Screening, or Both, for Down's Syndrome. N Engl J Med. 353 (19), 2001-2011.

7. Учебное издание "Генетика". 2006. Москва: ИКЦ "Академкнига".

8. Driscoll D.A., Gross S. 2009. Prenatal Screening for Aneuploidy. N Engl J Med. 360 (24), 2556-2562.

9. Sood R., Zehnder J.L., Druzin M.L., Brown P.O. 2006. Gene expression patterns in human placenta. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (14), 54785483.

10. Girardi G., Bulla R., Salmon J.E., Tedesco F. 2006. The complement system in the pathophysiology of pregnancy. Mol. Immunol. 43 (1-2), 68-77.

11. Murphy S., Rosli S., Acharya R. et al. 2010. Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use. Curr Protoc Stem Cell Biol. Chapter 1, Unit 1E.6.

12. Marangon F.B., Alfonso E.C., Miller D. et al. 2004. Incidence of microbial infection after amniotic membrane transplantation. Cornea. 23 (3), 264-269.

13. Clayton A., Harris C.L., Court J., Mason M.D., Morgan B.P. 2003. Antigenpresenting cell exosomes are protected from complement-mediated lysis by expression of CD55 and CD59. Eur. J. Immunol. 33 (2), 522-531.

14. Manoogian S.J., Bisplinghoff J.A., McNally C. et al. 2008. Dynamic tensile properties of human placenta. J Biomech. 41 (16), 3436-3440.

15. Rachakatla R.S., Troyer D. 2009. Wharton's jelly stromal cells as potential delivery vehicles for cancer therapeutics. Future Oncol. 5 (8), 1237-1244.

16. Lapaire O., Holzgreve W., Oosterwijk J.C., Brinkhaus R., Bianchi D.W. 2007. Georg Schmorl on trophoblasts in the maternal circulation. Placenta. 28 (1), 1-5.

17. Litton C., Stone J., Eddleman K., Lee M. 2009. Noninvasive prenatal diagnosis: past, present, and future. Mt. Sinai J. Med. 76 (6), 521-528.

18. Lo Y.M., Corbetta N., Chamberlain P.F. et al. 1997. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lancet. 350 (9076), 485-487.

19. Poon L.L., Leung T.N., Lau T.K., Lo Y.M. 2000. Presence of fetal RNA in maternal plasma. Clin. Chem. 46 (11), 1832-1834.

20. Hahn S., Zhong X.Y., Holzgreve W. 2008. Recent progress in non-invasive prenatal diagnosis. Semin Fetal Neonatal Med. 13 (2), 57-62.

21. Bianchi D.W., Flint A.F., Pizzimenti M.F., Knoll J.H., Latt S.A. 1990. Isolation of fetal DNA from nucleated erythrocytes in maternal blood. Proc Natl Acad Sci US A. SI (9), 3279-3283.

22. Prieto B., Candenas M., Venta R., Ladenson J.H., Alvarez F.V. 2002. Isolation of fetal nucleated red blood cells from maternal blood in normal and aneuploid pregnancies. Clin. Chem. Lab. Med. 40 (7), 667-672.

23. Falcidia E., Parano E., Grillo A. et al. 2004. Fetal cells in maternal blood: a six-fold increase in women who have undergone amniocentesis and carry a fetus with Down syndrome: a multicenter study. Neuropediatrics. 35 (6),321.324.

24. Mavrou A., Kouvidi E., Antsaklis A. et al. 2007. Identification of nucleated red blood cells in maternal circulation: a second step in screening for fetal aneuploidies and pregnancy complications. Prenat. Diagn. 27 (2), 150-153.

25. Troeger C., Zhong X., Burgemeister R. et al. 1999. Approximately half of the erythroblasts in maternal blood are of fetal origin. Mol. Hum. Reprod. 5 (12), 1162-1165.

26. Huang R., Barber T.A., Schmidt M.A. et al. 2008. A microfluidics approach for the isolation of nucleated red blood cells (NRBCs) from the peripheral blood of pregnant women. Prenat. Diagn. 28 (10), 892-899.

27. Ishihara N., Matsuo H., Murakoshi H. et al. 2002. Increased apoptosis in the syncytiotrophoblast in human term placentas complicated by either preeclampsia or intrauterine growth retardation. Am. J. Obstet. Gynecol. 186 (1), 158-166.

28. Alberry M.S., Soothill P.W. 2008. Non-invasive prenatal diagnosis: implications for antenatal diagnosis and management of high-risk pregnancies. Semin Fetal Neonatal Med. 13 (2), 84-90.

29. Rijnders R.J.P., Van Der Luijt R.B., Peters E.D.J, et al. 2003. Earliest gestational age for fetal sexing in cell-free maternal plasma. Prenat. Diagn. 23(13), 1042-1044.

30. Lo Y.M., Zhang J., Leung T.N. et al. 1999. Rapid clearance of fetal DNA from maternal plasma. Am. J. Hum. Genet. 64 (1), 218-224.

31. Alberry M., Maddocks D., Jones M. et al. 2007. Free fetal DNA in maternal plasma in anembryonic pregnancies: confirmation that the origin is the trophoblast. Prenat. Diagn. 27 (5), 415-418.

32. Lun F.M.F., Tsui N.B.Y., Chan K.C.A. et al. 2008. Noninvasive prenatal diagnosis of monogenic diseases by digital size selection and relative mutation dosage on DNA in maternal plasma. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (50), 19920-19925.

33. Lo Y.M., Leung T.N., Tein M.S. et al. 1999. Quantitative abnormalities offetal DNA in maternal serum in preeclampsia. Clin. Chem. 45 (2), 184-188.

34. Такмкович C.H., Власов B.B., Лактионов П.П. 2008. Циркулирующие ДНК крови и их использование в медицинской диагностике. Молекулярная биология. 42 (1), 12-23.

35. Lo Y.M.D. 2008. Fetal nucleic acids in maternal plasma. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1137, 140-143.

36. Rainer Т.Н., Lo Y.M., Chan L.Y. et al. 2001. Derivation of a prediction rule for posttraumatic organ failure using plasma DNA and other variables. Ann. N. Y. Acad. Sci. 945, 211-220.

37. Jahr S., Hentze H., Englisch S. et al. 2001. DNA fragments in the blood plasma of cancer patients: quantitations and evidence for their origin from apoptotic and necrotic cells. Cancer Res. 61 (4), 1659-1665.

38. Dennis Lo Y.M., Chiu R.W.K. 2007. Prenatal diagnosis: progress through plasma nucleic acids. Nat. Rev. Genet. 8 (1), 71-77.

39. Ng E.K.O., Tsui N.B.Y., Lau Т.К. et al. 2003. mRNA of placental origin is readily detectable in maternal plasma. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (8), 4748-4753.

40. Lo Y.M.D., Tsui N.B.Y., Chiu R.W.K. et al. 2007. Plasma placental RNA allelic ratio permits noninvasive prenatal chromosomal aneuploidy detection. Nat. Med. 13 (2), 218-223.

41. Costa J., Benachi A., Gautier E. 2002. New strategy for prenatal diagnosis of X-linked disorders. N. Engl. J. Med. 346 (19), 1502.

42. Grootkerk-Tax M.G.H.M., Soussan A.A., de Haas M., Maaskant-van Wijk P.A., van der Schoot C.E. 2006. Evaluation of prenatal RHD typing strategies on cell-free fetal DNA from maternal plasma. Transfusion. 46 (12), 2142-2148.

43. Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю., Семёнов П.А. 2009. ПЦР в реальном времени. Москва: БИНОМ.

44. Kleppe К., Ohtsuka Е., Kleppe R., Molineux I., Khorana H.G. 1971. Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases. J. Mol. Biol. 56 (2), 341-361.

45. Saiki R.K., Scharf S., Faloona F. et al. 1985. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 230 (4732), 1350-1354.

46. Higuchi R., Dollinger G., Walsh P.S., Griffith R. 1992. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology (N.Y.). 10 (4), 413-417.

47. Higuchi R., Fockler C., Dollinger G., Watson R. 1993. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology (N.Y.). 11 (9), 1026-1030.

48. VanGuilder H.D., Vrana K.E., Freeman W.M. 2008. Twenty-five years of quantitative PCR for gene expression analysis. BioTechniques. 44 (5), 619626.

49. Nolan Т., Hands R.E., Bustin S.A. 2006. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1 (3), 1559-1582.

50. Holland P.M., Abramson R.D., Watson R., Gelfand D.H. 1991. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5' 3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. Proc Natl AcadSci USA. 88 (16), 7276-7280.

51. Bustin S.A. 2002. Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. J. Mol. Endocrinol. 29 (1), 23-39.

52. Ramachandran C., Melnick S.J. 1999. Multidrug resistance in human tumors—molecular diagnosis and clinical significance. Mol. Diagn. 4 (2), 8194.

53. Desjardin L.E., Perkins M.D., Wolski K. et al. 1999. Measurement ofsputum Mycobacterium tuberculosis messenger RNA as a surrogate for response to chemotherapy. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 160 (1), 203-210.

54. Fairman J., Roche L., Pieslak I. et al. 1999. Quantitative RT-PCR to evaluate in vivo expression of multiple transgenes using a common intron. BioTechniques. 27 (3), 566-570, 572-574.

55. Ghossein R.A., Rosai J. 1996. Polymerase chain reaction in the detection of micrometastases and circulating tumor cells. Cancer. 78 (1), 10-16.

56. Benachi A., Costa J. 2007. Non-invasive prenatal diagnosis of fetal aneuploidies. Lancet. 369 (9560), 440-442.

57. Morrison T.B., Weis J.J., Wittwer C.T. 1998. Quantification of low-copy transcripts by continuous SYBR Green I monitoring during amplification. BioTechniques. 24 (6), 954-958, 960, 962.

58. Palmer S., Wiegand A.P., Maldarelli F. et al. 2003. New real-time reverse transcriptase-initiated PCR assay with single-copy sensitivity for human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma. J. Clin. Microbiol. 41 (10), 4531-4536.

59. Gentle A., Anastasopoulos F., McBrien N.A. 2001. High-resolution semiquantitative real-time PCR without the use of a standard curve. BioTechniques. 31 (3), 502, 504-506, 508.

60. Wong M.L., Medrano J.F. 2005. Real-time PCR for mRNA quantitation. BioTechniques. 39 (1), 75-85.

61. Vandesompele J., De Paepe A., Speleman F. 2002. Elimination of primer-dimer artifacts and genomic coamplification using a two-step SYBR green I real-time RT-PCR. Anal Biochem. 303 (1), 95-98.

62. Lo Y.M.D., Lun F.M.F., Chan K.C.A. et al. 2007. Digital PCR for the molecular detection of fetal chromosomal aneuploidy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (32), 13116-13121.

63. Tong Y.K., Ding C., Chiu R.W. et al. 2006. Noninvasive Prenatal Detection of Fetal Trisomy 18 by Epigenetic Allelic Ratio Analysis in Maternal Plasma: Theoretical and Empirical Considerations. Clin Chem. 52 (12),2194-2202.

64. Old R.W., Crea F., Puszyk W., Hulten M.A. 2007. Candidate epigenetic biomarkers for non-invasive prenatal diagnosis of Down syndrome. Reprod. Biomed. Online. 15 (2), 227-235.

65. Warren L., Bryder D., Weissman I.L., Quake S.R. 2006. Transcription factor profiling in individual hematopoietic progenitors by digital RT-PCR. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (47), 17807-17812.

66. Diehl F., Li M., Dressman D. et al. 2005. Detection and quantification of mutations in the plasma of patients with colorectal tumors. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (45), 16368-16373.

67. Свердлов Е.Д. 2009. Очерки структурной молекулярной генетики. Москва: Наука; 1.

68. Jeffreys A.J., Allen M.J., Armour J.A. et al. 1995. Mutation processes at human minisatellites. Electrophoresis. 16 (9), 1577-1585.

69. Pennisi Е. 1998. A closer look at SNPs suggests difficulties. Science. 281 (5384), 1787-1789.

70. Crawford D.C., Akey D.T., Nickerson D.A. 2005. The patterns of natural variation in human genes. Annu Rev Genomics Hum Genet. 6, 287-312.

71. Hsu D.T. 2010. Cardiac manifestations of neuromuscular disorders in children. Paediatr Respir Rev. 11 (1), 35-38.

72. Dati E., Baldinotti F., Conidi M.E. et al. 2010. A Girl with Tomboy Behavior: Lesson from Misdiagnosis in a Baby with Ambiguous Genitalia. Sex Dev. 4(3), 150-154.

73. И.Ю. Барков, B.A. Бахарев, H.A. Каретникова. 1999. Пренатальное определение пола (обзор литературы). Проблемы репродукции. 1, 5-14.

74. Collins P., Baudo F., Huth-Kuhne A. et al. 2010. Consensus recommendations for the diagnosis and treatment of acquired hemophilia A. BMC Res Notes. 3(1), 161.

75. Aledort L.M. 2010. Optimizing the treatment of haemophilia B: laboratory and clinical perspectives. Haemophilia. 16 Suppl 6, 1-2.

76. Lo-Castro A., D'Agati E., Curatolo P. 2010. ADHD and genetic syndromes. Brain Dev. Электронная публикация.

77. Estigarribia В., Erwick Roberts J., Sideris J., Price J. 2010. Expressive morphosyntax in boys with Fragile X syndrome with and without autism spectrum disorder. Int J Lang Commun Disord. Электронная публикация.

78. Hill M.K., Archibald- A.D., Cohen J., Metcalfe S.A. 2010. A systematic review of population screening for fragile X syndrome. Genet Med. Электронная публикация.

79. Jordan B.R. 1991. Fragile X-linked mental retardation and the difficulties of reverse genetics. Bioessays. 13 (5), 243-251.

80. Vulliamy Т., Mason P., Luzzatto L. 1992. The molecular basis of glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency. Trends Genet. 8 (4), 138-143.

81. Hsu D.T. 2010. Cardiac manifestations of neuromuscular disorders in children. Paediatr Respir Rev. 11 (1), 35-38.

82. Bushby K., Finkel R., Birnkrant D.J. et al. 2010. Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 1: diagnosis, and pharmacological and psychosocial management. Lancet Neurol. 9 (1), 77-93.

83. Fayssoil A., Nardi O., Orlikowski D., Annane D. 2010. Cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy: pathogenesis and therapeutics. Heart Fail Rev. 15(1), 103-107.

84. Larsson A., Crang Svalenius E., Lundqvist A., Dykes A. 2010. Parents' experiences of an abnormal ultrasound examination vacillating between emotional confusion and sense of reality. Reprod Health. 7 (1), 10.

85. Nabhan A.F., Faris M.A. 2010. High feedback versus low feedback of prenatal ultrasound for reducing maternal anxiety and improving maternalhealth behaviour in pregnancy. Cochrane Database Syst Rev. 4, CD007208.

86. Whitworth M., Bricker L., Neilson J.P., Dowswell T. 2010. Ultrasound for fetal assessment in early pregnancy. Cochrane Database Syst Rev. 4, CD007058.

87. Ajayi G.O. 2009. Chorionic villus sampling: analysis of the first 350 singleton pregnancies by a single operator. Clin Exp Obstet Gynecol. 36 (4), 251-253.

88. Kong C.W., Leung T.N., Leung T.Y. et al. 2006. Risk factors for procedure-related fetal losses after mid-trimester genetic amniocentesis. Prenat. Diagn. 26(10), 925-930.

89. Willruth A., Vieten J., Berg C., Gembruch U., Geipel A. 2010. Decision Making and Attitudes towards Invasive Prenatal Diagnosis in the Early Second Trimester. Ultraschall Med. Электронная публикация.

90. Nakata N., Wang Y., Bhatt S. 2010. Trends in prenatal screening and diagnostic testing among women referred for advanced maternal age. Prenat Diagn. 30 (3), 198-206.

91. Sekido R. 2009. SRY: A transcriptional activator of mammalian testis determination. IntJBiochem Cell Biol. 42 (3), 417-420.

92. Zimmermann B.G., Maddocks D.G., Avent N.D. 2008. Quantification of circulatory fetal DNA in the plasma of pregnant women. Prenatal Diagnosis. Totowa, NJ, USA: Humana Press. 219-231.

93. Flegel W.A., von Zabern I., Wagner F.F. 2009. Six years' experience performing RHD genotyping to confirm D- red blood cell units in Germany for preventing anti-D immunizations. Transfusion. 49 (3), 465-471.

94. Avent N.D., Finning K.M., Martin P.G., Soothill P.W. 2000. Prenataldetermination of fetal blood group status. Vox Sang. 78 Suppl 2, 155-162.

95. Avent N.D. 1998. Antenatal genotyping of the blood groups of the fetus. Vox Sang. 74 Suppl 2, 365-374.

96. Avent N.D., Madgett T.E., Lee Z.E. et al. 2006. Molecular biology of Rh proteins and relevance to molecular medicine. Expert Rev Mol Med. 8 (13), 1-20.

97. Avent N.D., Reid M.E. 2000. The Rh blood group system: a review. Blood. 95 (2), 375-387.

98. Van Kim C.L., Colin Y., Cartron J. 2006. Rh proteins: key structural and functional components of the red cell membrane. Blood Rev. 20 (2), 93-110.

99. Wagner F.F., Flegel W.A. 2004. Review: the molecular basis of the Rh blood group phenotypes. Immunohematology. 20 (1), 23-36.

100. Daniels G. 2001. A century of human blood groups. Wien. Klin. Wochenschr. 113 (20-21), 781-786.

101. Daniels G., Finning K., Martin P., Summers J. 2006. Fetal blood group genotyping: present and future. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1075, 88-95.

102. Wagner F.F., Flegel W.A. 2000. RHD gene deletion occurred in the Rhesus box. Blood. 95 (12), 3662-3668.

103. Wagner F.F., Moulds J.M., Flegel W.A. 2005. Genetic mechanisms of Rhesus box variation. Transfusion. 45 (3), 338-344.

104. Matheson K.A., Denomme G.A. 2002. Novel 3'Rhesus box sequences confound RHD zygosity assignment. Transfusion. 42 (5), 645-650.

105. Faas B.H., Beckers E.A., Wildoer P. et al. 1997. Molecular background of VS and weak C expression in blacks. Transfusion. 37 (1), 38-44.

106. Ridgwell K., Spurr N.K., Laguda B. et al. 1992. Isolation of cDNA clones for a 50 kDa glycoprotein of the human erythrocyte membrane associated with Rh (rhesus) blood-group antigen expression. Biochem. J. 287 ( Pt 1), 223-228.

107. Tsui N., Chim S., Chiu R. et al. 2004. Systematic micro-array based identification of placental mRNA in maternal plasma: towards non-invasiveprenatal gene expression profiling. J Med Genet. 41 (6), 461—467.

108. Morris J.K., Wald N.J., Watt H.C. 1999. Fetal loss in Down syndrome pregnancies. Prenat. Diagn. 19 (2), 142-145.

109. Korenberg J.R., Chen X.N., Schipper R. et al. 1994. Down syndrome phenotypes: the consequences of chromosomal imbalance. Proc Natl Acad Sci USA. 91 (11), 4997-5001.

110. Baptista M.J., Fairbrother U.L., Howard C.M. et al. 2000. Heterotrisomy, a significant contributing factor to ventricular septal defect associated with Down syndrome? Hum. Genet. 107 (5), 476-482.

111. Pritchard M.A., Kola I. 1999. The "gene dosage effect" hypothesis versus the "amplified developmental instability" hypothesis in Down syndrome. J. Neural Transm. Suppl. 57, 293-303.

112. Kerstann K.F., Feingold E., Freeman S.B. et al. 2004. Linkage disequilibrium mapping in trisomic populations: analytical approaches and an application to congenital heart defects in Down syndrome. Genet. Epidemiol. 27 (3), 240-251.

113. Hultén M.A., Patel S.D., Tankimanova M. et al. 2008. On the origin of trisomy 21 Down syndrome. Mol Cytogenet. 1, 21.

114. Kooij L., Tymstra T., Berg P.V.D. 2009. The attitude of women toward current and future possibilities of diagnostic testing in maternal blood using fetal DNA. Prenat. Diagn. 29 (2), 164-168.

115. Chiu R.W.K., Lau T.K., Leung T.N. et al. 2002. Prenatal exclusion of beta thalassaemia major by examination of maternal plasma. Lancet. 360 (9338), 998-1000.

116. Li D., Liao C., Li J. et al. 2006. Prenatal diagnosis of beta-thaiassemia in Southern China. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 128 (1-2), 81-85.

117. Chiu R.W.K., Lau T.K., Cheung P.T. et al. 2002. Noninvasive prenatal exclusion of congenital adrenal hyperplasia by maternal plasma analysis: a feasibility study. Clin. Chem. 48 (5), 778-780.

118. González-González M.C., García-Hoyos M., Trujillo M.J. et al. 2002.

119. Prenatal detection of a cystic fibrosis mutation in fetal DNA from maternal plasma. Prenat. Diagn. 22 (10), 946-948.

120. Dhallan R., Guo X., Emche S. et al. 2007. A non-invasive test for prenatal diagnosis based on fetal DNA present in maternal blood: a preliminary study. Lancet. 369 (9560), 474-481.

121. Dhallan R., Au W., Mattagajasingh S. et al. 2004. Methods to Increase the Percentage of Free Fetal DNA Recovered From the Maternal Circulation. JAMA. 291 (9), 1114-1119.

122. Chung G.T., Chiu R.W., Chan K.A. et al. 2005. Lack of Dramatic Enrichment of Fetal DNA in Maternal Plasma by Formaldehyde Treatment. Clin Chem. 51 (3), 655-658.

123. Chan K.A., Zhang J., Hui A.B. et al. 2004. Size Distributions of Maternal and Fetal DNA in Maternal Plasma. Clin Chem. 50 (1), 88-92.

124. Poon L.L., Leung T.N., Lau T.K., Chow K.C., Lo Y.D. 2002. Differential DNA Methylation between Fetus and Mother as a Strategy for Detecting Fetal DNA in Maternal Plasma. Clin Chem. 48 (1), 35-41.

125. Chim S.S.C., Tong Y.K., Chiu R.W.K. et al. 2005. Detection of the placental epigenetic signature of the maspin gene in maternal plasma. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (41), 14753-14758.

126. Chiu R.W., Chim S.S., Wong I.H. et al. 2007. Hypermethylation of RASSF1A in Human and Rhesus Placentas. Am J Pathol. 170 (3), 941-950.

127. Chan K.A., Ding C., Gerovassili A. et al. 2006. Hypermethylated RASSF1A in Maternal Plasma: A Universal Fetal DNA Marker that Improves the Reliability of Noninvasive Prenatal Diagnosis. Clin Chem. 52 (12), 2211 -2218.

128. Lui Y.Y., Chik K., Chiu R.W. et al. 2002. Predominant Hematopoietic

129. Origin of Cell-free DNA in Plasma and Serum after Sex-mismatched Bone Marrow Transplantation. Clin Chem. 48 (3), 421-427.

130. Grunau C., Clark S.J., Rosenthal A. 2001. Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation of critical experimental parameters. Nucleic Acids Res. 29 (13), e65.

131. Heung M.M.S., Jin S., Tsui N.B.Y. et al. 2009. Placenta-Derived Fetal Specific mRNA Is More Readily Detectable in Maternal Plasma than in Whole Blood. PLoS ONE. 4 (6), e5858.

132. Go A.T., Visser A., Mulders M.A. et al. 2007. 44 Single-Nucleotide Polymorphisms Expressed by Placental RNA: Assessment for Use in Noninvasive Prenatal Diagnosis of Trisomy 21. Clin Chem. 53 (12), 22232224.

133. Oudejans C.B.M., Go A.T.J.J., Visser A. et al. 2003. Detection of chromosome 21-encoded mRNA of placental origin in maternal plasma. Clin. Chem. 49 (9), 1445-1449.

134. Go A.T.J.I., Visser A., Mulders M.A.M. et al. 2007. C210RF105, A chromosome 21-encoded mRNA, is not a discriminative marker gene for prediction of Down syndrome in maternal plasma. Prenat. Diagn. 27 (2), 146-149.

135. Go A.T.J.I., Visser A., Betsalel O.T. et al. 2008. Measurement of allelic-expression ratios in trisomy 21 placentas by quencher extension of heterozygous samples identified by partially denaturing HPLC. Clin. Chem. 54 (2), 437-440.

136. Suetake I., Shinozaki F., Miyagawa J., Takeshima H., Tajima S. 2004. DNMT3L stimulates the DNA methylation activity of Dnmt3a and Dnmt3b through a direct interaction. J. Biol. Chem. 279 (26), 27816-27823.

137. Novakovic B., Wong N.C., Sibson M. et al. 2010. DNA methylationimediated down-regulation of DNA methyltransferase-1 (DNMT1) is1.coincident with, but not essential for, global hypomethylation in humanplacenta. J. Biol. Chem. 285 (13), 9583-9593.

138. Rodriguez-Osorio N., Wang H., Rupinski J., Bridges S.M., Memili E. 2010. Comparative functional genomics of mammalian DNA methyltransferases. Reprod Biomed Online. 20 (2), 243-255.

139. Seabright M. 1972. Human chromosome banding. Lancet. 1 (7757), 967.

140. Chomczynski P., Sacchi N. 2006. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat Protoc. 1 (2), 581-585.

141. Zhong X.Y., Holzgreve W., Huang D.J. 2008. Isolation of cell-free RNA from maternal plasma. Methods Mol. Biol. 444, 269-273.

142. Heung M.M.S., Tsui N.B.Y., Leung T.Y. et al. 2009. Development of extraction protocols to improve the yield for fetal RNA in maternal plasma. Prenat. Diagn. 29 (3), 277-279.

143. Farina A., LeShane E.S., Lambert-Messerlian G.M. et al. 2003. Evaluation of Cell-free Fetal DNA as a Second-Trimester Maternal Serum Marker of Down Syndrome Pregnancy. Clin Chem. 49 (2), 239-242.