Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование транслокаций для картирования генов гороха

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Использование транслокаций для картирования генов гороха"

чС4

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ кцени М.В.ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи

РГ8 V. УДК: 575.116.4 : 582.739

ЛЮ ФУЧ1УН

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТРАНСЛОКАЦИЙ ДЛЯ КАРТИРОВАНИЯ ГЕНОВ ГОРОХА 03.00.15 - Генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

I

МОСКВА - 1997

Работа выполнена в лаборатории генетики растений кафе; генетики и селекции Московского государственного университета име М.В.Ломоносова в 1994-1997 года.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор биологических наук, профессор

Гостимский С.А.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор биологических наук, профессор доктор биологических наук, профессор

Богданов Ю.Ф. Гуков Ю.Л.

ВЕЩУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Московская сельскохозяйственная академия им.К.А.Тимирязева

Защита диссертации состоится -10 . 1997 г. час

на заседании Специализированного совета Д 002.49.01. в Инститз

общей генетики им.Н.И.Вавилова РАН по адресу: 117809, ГСП-г.Москва, В-333, ул. Губкина,3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОГен РАН

Автореферат разослан "_"_1997 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

Г. Н. Полу хин)

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕМЫ

Актуальность темы. Конечной целью генетического изучения ;ого-либо вида растений является познание структуры и организации > генетического аппарата (Захаров,1979). Однако понимание общих шципов организации, функционирования и эволюции генома каждого жретного вида невозможно без представления о генетических и физи-:ких картах хромосом.

Локализация новых генов повышает разрешающую способность генети-жого анализа и, таким образом, открывает возможность для углубле-i наших знаний о структуре генотипа, природе мутации, механизмах [ствия мутагенов и генетическом контроле отдельных признаков.

Кроме того, детальная генетическая карта дает возможность созна-гьно планировать гибридологическую работу по синтезу форм, совме-щих желаемые признаки.

В настоящее время в решении проблемы насыщения генетических карт ¡тигнуты значительные успехи брагодаря применению молекулярных жеров и новых подходов в генетическом анализе (Steven et al., >5). В связи со сказанным одной из наиболее актуальных на сегод-¡ний день проблем генетики следует считать генетическое и молеку-iHoe картирование генома растений.

Горох (Plsvm sativum L.) является не только классическим >ектом генетических исследований, но и широко распространенной [ьскохозяйственной культурой, поэтому исследования по частной [етике гороха имеют важное теоретическое и практическое значение.

Классическая карта гороха построена в основном стандартным мето-! — анализом расщепления в F2 от скрещивания мутантов с маркер-га линиями (Lamprecht, 1948,1953). Однако ограниченность числа фэлогических маркеров, пониженная жизнеспособность растений гомо-•отных по маркерным генам, наличие неидентифицированных хромосом: перестроек сильно усложняют классический генетический анализ и водят к появлению противоречивых результатов. В связи с этим [етическая карта хромосом гороха подвергалась постоянным измене-м (Lamm,1960,1979,1986; Folkeson,l990). Соотношение групп сцеп-ия и конкретных хромосом до сих пор окончательно не установлено >lkeson,1990).

Предпосылкой для построения точной и детальной карты хромосом юха является локализация новых мутаций, поиск большого числа ¡ых молекулярных и цитологических маркеров.

Использование реципрокных хромосомных транслокаций значительно

повышает эффективность локализации генов у растений.

К сожалению, противоречия в индентификации хромосом у имеющих транслокационных линий гороха привели к путанице в определении соо ношения груш сцепления и конкретных хромосом и не позволяют эффе тивно использовать эти линии в картировании генов у данного вида.

Именно в связи с этим нами была предпринята попытка тщательно анализа хромосомной структуры имеющихся в нашем распоряжении тран локационных линий гороха с целью последующего их применения дл картирования новых мутаций.

Цель и задачи исследования. Цель данного исследования заключ лась в изучении транслокационных линий гороха, собранных в генет ческой коллекции кафедры генетики МГУ, их использовании для картир вания новых мутаций, а также в выявлении RAPD-маркеров ДНК гороха, работе были поставлены следующие задачи:

1. Идентификация новых транслокаций и точное определение хромосо ной структуры коллекционных транслокационных линий.

2. Хромосомная локализация 6 новых мутаций с помощью использован реципрокных транслокаций.

3. Электронно-микроскопическая характеристика 6 новых мутант гороха.

4. Выявление полиморфизма ДНК гороха методом RAPD-анализа.

Научная новизна работы. Впервые в данной работе 11 транслок

ционных линий гороха были исследованы одновременно генетическими цитогенетическими методами. В результате изучения морфологии хрои сом в митозе и мейозе и применения дифференциальной окраски идеш фицирована 1 новая транслокация и уточнена хромосомная структура j ранее использованных транслокационных линий.

Впервые локализованы на конкретных хромосомах 5 новых мута1 гороха ("w-2", "curl", "fa", "хл-42" и хл-18").

Впервые выявлен внутривидовой полиморфизм ДНК у мутантов и мг керных линий гороха с помощью RAPD-анализа. Показано, что гибриды наследуют RAPD-спектры обоих родителей.

Практическая значимость. Полученные в настоящем исследова! результаты вносят определенный вклад в изучение генома гороха.

Идентифицированные транслокационные линии могут быть рекомещ ваны для быстрого картирования новых мутаций.

Гибриды F1 и их потомства, созданные на основе скрещиваний мез транслокационными и маркерными линиями и мутантами гороха, уже настоящее время используются в учебном практикуме кафедры генетта

лекции МГУ и могут быть рекомендованы многим учебным заведениям [Я демонстрации фудаментальных генетических и цитологических зако-1мерностей.

Апробация работы. Основные результаты исследований были доложены i Международной конференции студентов и аспирантов по фундаменталь-:м наукам "Ломоносов - 97" (Москва,1997), на научных семинарах |федры генетики и селекции МГУ и на научном семинаре Института щей генетики РАН.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литера-ры, материалов и методов исследования, результатов и обсувдения, «лючения и выводов, списка литературы. Иллюстративный материал лючает 31 рисунков и микрофотографии, 20 таблиц. Список литературы [считывает наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе были использованы следующие образцы гороха (Písum itivum Ъ.) из коллекции кафедры генетики и селекции биологического [культета МГУ:

Сорта: Немчиновский, Раний зеленый, Виола;

Транслокационные линии: L-4, М-10, L-25, L-58, L-83, L-84, 108, L-111, L-112, L-114, Twt;

Маркерные линии: L-1238, М-313, хл-7, Усатый;

Мутанты: "Скрученный" (curl), "Безвосковой" (w-2), "Штамбовый" а), и 3 хлорофильных мутанта (хл-15, хл-18 и хл-42).

Анализ ыетафазных хроиосом проводили на временных давленных ;етокарминовых препаратах. Препараты готовили из первичных корешков ipoxa после обработки их 8-оксихинолином в течение 6-8 ч и фиксации ацетоалкоголе (1:3). Исследовали не менее 10 метафазных пластинок, юпараты фотографировали на пленку «Микрат-орто» на микроскопе B0VAL-4 (ГДР) при помощи микрофотонасадки МФН-11. Параметрические мерения проводили на фотографиях. Определяли абсолютную длину (La), ■носительную длину хромосом (Lr) и плечевой индекс (1ь). Достовер-ють разницы средних величин вычисляли по Стьюденту (Лакин,1990).

Анализ мейоза. Анализ метафазы-I мейоза в материнских клетках :льцы у гибридов , полученных при скрещивании сорта Немчиновский транслокационными линиями и при скрещивании транслокационных линий кду собой, осуществляли на временных давленных препаратах, окра-нных ацетокармином после фиксации в ацетоалкоголе(1:3).

Дифференциальное окрашивание проводили с помощью обработки хро-

мосом раствором Ва(ОН)2 и последующей окраски красителем Гимза.

Локализация мутаций осуществлялась в основном с помощью трансло кационных линий. С помощью ацетокарминовой методики анализировал пыльцу у всех растений F2, полученных от скрещиваний мутантов транслокационными линиями. Сцепление между транслокационной точкой морфологическим маркером оценивали по критерию %г (Lamm, 1950 Perason, 1969).

Особенности морфологии и анатомии морфологических и хлорофильны мутантов исследовали на сканирующем (HITACHI S-405A) и просвечиваю щем электронном микроскопе (JEM-100B).

RAPD анализ. Экстракцию ДНК для RAPD анализа (Random Arapliíie Polymorphic DNA) проводили из молодых листьев гороха {Moller е al., 1992). Реакцию ПЦР осуществляли в амшшфикаторе Hybaid (0MN-thermal cycler, HB-TRE-05) в следующем режиме : I. 95°С - 3 мин 30"с - 1 мин, 72°С - 1 мин — 2 цикла; II. 94°С - 1 мин, 37°С - 1 мин, 72°С - 1 мин — 40 циклов. Реакционная смесь объемом 25 мя содержала 67 мМ Трис-HCl (рН=8.7), 16 мМ (NH4)gS04, 2.5 MM MgCl. 0.002% Tween, 0.002% NP-40, по 0.3 мМ каждого из дезоксирибонуклес зидтрифосфатов (dATP,dCTP,dITP,dGTP), 0.5 мкМ праймера и 0.06 ед Taq-полимеразы (Силекс). Продукты амплификации анализировали помощью электрофореза в 2%-ном агарозном геле.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1.Цитогенетическая идентификация транслокаций у гороха

1.1. Анализ кариотипов транслокационных линий

Морфометрический анализ кариотипов сорта Немчиновский и одинна; цати транслокационных линий (табл.1) свидетельствует о том, что линии Ь-83 в транслокацию вовлечена 3 и 5 хромосомы, в линии L-84 3 и 6 хромосомы, в линииях L-4, М-10, L-25, L-108, Twt в трансл< кации участвует одна из метацентрических хромосом. В линиях М-1< L-25, L-108, Ii—111 транслокации затрагивают одну из спутничы хромосом. В линиях L-83, L-84, Twt в транслокацшо вовлекается хромосома, а в линиях L-4, L-83, L-84 - 3 хромосома.

Проведенные наш исследования по анализу кариотипов соматическ клеток транслокационных линий гороха показывают, что относитель: легко в митозе идентифицируются перестроенные хромосомы в лини L-83, L-84, но с помощью морфометрического анализа невозможно точ определить транслокационные линии: L-4, L-25, М-10, L-108, Tw L-111, L-112 в которых участвует одна из метацентрических хромое

Таблица 1. Морфометрические параметры хромосом гороха

Название Параметр N2 хромосом

линий 1 2 3 4 5 6 7

Немчино-вский Ьг(%) Спутник 1ь 6.56±0.06 1.14±0.04 6.27+0.08 1.08±0.05 7.19±0.08 3.01 ±0.13 6.91 ±0.11 0.84±0.04 1.87±0.12 8.72±0.11 1.74±0.07 6.74+0 1,73±0 12 10 7.61+0.11 1 .02±0.05 2.30±0.10

Ь-4 Ьг(%) Спутник 1ь 4.65±0.12***6.41+0.10 1.86±0.09***1.08±0.03 8.75+0.12 1.96±0.04 ***6.99±0.09 0.60+0.03 ***1.88+0.08 8.49± 0.11 1.79±0.06 7.05±0 1.65±0 06 08 7.70±0.18 0.82+0.02 2.28+0.06

М-10 ЬГ(Ж) Спутник 1ь 6.40±0.09 1.10±0.02 3.78±0.09***7.03±0.10 1 .53+0.06***2.91±0.14 6.85Ю.15 0.74+0.03 1.62±0.08 8.56±0.08 1.59±0.07 6.74±0 1.58±0 10 08 10.75±0.12*** 0.91±0.03 1.19+0.03***

Ь-25 т?(%) Спутник 1ь 6.15±0.09** 6.36±0.08 1.46±0.05***1.08±0.04 7.14±0.02 2.88±0.08 7.05±0.06 0.62±0.01 1.98±0.05 8.40+0.05 1.81+0.03 6.74±0 1.70±0 05 04 8.25±0.05* 0.9+0.02 2.08±0.08

Ъ-83 ЬГ(Ж) Спутник 1ь 6.30±0.03 1.11±0.04 6.07±0.07 1 .09±0.03 9.64+0.11 1.49±0.04 ***7.19±0.09 0.71 ±0.03 ***1.92+0.03 7.19±0.09***6.51±0 1.41±0.03***1.54+0 10 04 7.36±0.12 0.83±0.02 2.20+0.06

Ь-84 Ьг(%) Спутник 1ь 6.59±0.07 1.11+0.03 6.03±0.09 1.11 ±0.03 4.02+0.06 1 .49±0.03 ***6.94±0.11 0.68+0.02 ***2.12+0.06 8.63±0.10 1.75±0.01 10.19+0.10***7.60+0.12 0.90±0.02 1.38+0.03** 2.44+0.33

Достоверность различий между контролем и опытом: *,♦*,«** Р<0.05,0.01,0.001 соответственно

Таблица 1. Продолжение

Название Параметр N0 хромосом

линий 1 2 3 4 5 6 7

Ь-108 ЬГ(Ж) Спутник 1ь 6.25±0.09 1.08±0.03 4.89±0.07 1.44+0.08 ***7.13±0.09 ***2.98±0.12 9.03+0.12***8.49±0.09 1.00±0.03 1.60±0.07* 1.75±0.05 7.00±0.06 1.68±0.04 7.20±0.07 0.74±0.04 2.27+0.08

Ь-111 ЬГ{Ж) Спутник Iй 6.54±0.07 1.07±0.02 6.07+0.08 1.04±0.02 7.33±0.16 3.22+0.19 7.24±0.12 0.85±0.03 2.06*0.08 6.68±0.13***6.88±0.15 2.79±0.15***1.92+0.11 9.17+0.10*** 0.8«±0.03 1.47+0.04***

Ь-112 ЬГ(Ж) Спутник 1ь 6.52±0.07 1.21±0.03 6.40+0.07 1.08±0.02 6.55±0.07***7.18±0.08 0.86+0.03 2.95±0.01 1.91 ±0.06 8.61±0.11 1.63±0.06 6.98±0.13 1.55+0.55 7.75±0.10 1.03+0.03 2.08±0.08

1-114 Ьг(%) Спутник 6.82+0.08 1.21 ±0.03 6.54+0.05 1.08±0.02 7.25±0.09 2.84+0.15 6.88±0.09 0.83±0.04 1.87±0.10 9.84±0.13 1.78+0.06 6.52±0.13 1.72+0.05 7.52±0.05 1.08±0.07 2.36+0.12

Ту?1; ьг(%) Спутник 1ь 6.40±0.07 1.07±0.03 5.66+0.06***7.10+0.06 1.37±0.05***2.92±0.10 7.15+0.14 0.64±0.02 1.91 ±0.08 8.39±0.15 1.59±0.11 7.65+0.14***7.65+0.103 0.97+0.04 1.26+0.04***2.10+0.06

Ь-58 ьг(%) Спутник 1ь 6.78+0.22 1.12+.05 6.07±0.13 1.04±0.02 7.27±0.08 3.06±0.09 6.92+0.06 0.57+0.04 2.10+0.10 8.41 ±0.10 1.81±0.03 6.94±0.12 1.85+0.08 7.61+0.13 0.81 ±0.03 2.25+0.13

I и 2), или одна из спутничных хромосом.

Дифференциальная окраска. Для идентификации транслоцированных 1утшчных хромосом использовали метод дифференциального окрашивания, элученные данные (рис.1) показали, что наиболее четкие С-полосы у энтроля образуются в районе ядрышковых организаторов, находящихся а 4 и 7 паре хромосом. На 4 хромосоме блок гетерохроматина имеет злее терминальное положение и захватывает сам спутник по сравнению таким же блоком 7 хромосомы.

Применение С-окрашивания показало, что в кариотипе линии М-10 у ары транслоцированных спутничных хромосом имеются субтерминальные этерохроматиновые блоки, в то время как у другой пары спутничных ромосом имеются более терминальные гетерохроматиновые блоки. Эти анные свидетельствуют о том, что в линии М-10, в транслокации чествует 7, а не 4 хромосома (рис.1).

4 7 4 7

О О НС

Контроль М-10

Рис.1. Дифференциальная окраска спутничных хромосом гороха.

Таким образом, использование дифференциального окрашивания спут-ичных хромосом в транслоцированных линиях гороха показало, что этот етод позволяет дифференцировать спутничные хромосомы, участвующие в ерестройке.

1.2. Анализ ыейоза

Для окончательного выяснения вопроса о том, какая из хромосом частвует в транслокации в исследуемых линиях, мы проанализировали онфигурации М-1 мейоза у 47 возможных гибридов первого поколения, олученных от взаимного скрещивания разных транслокационных линий, конфигурация хромосом в М-1 мейоза в скрещиваниях большинства линий, роме линии Ь-58, оказалась стабильной и состояла либо из одного шьца с шестью хромосомами и четырех бивалентов, либо из двух колец :з четырех хромосом и трех бивалентов (табл.2). В скрещиваниях с частием линии Ь-58 были обнаружены различные конфигурации (табл.2).

Таблица 2. Конфигурация хромосом у гибридов Г1, полученных при скрещивании транслокационнымх линий

Линия Конроль Ь-114 Ь-112 Ь-111 Ь-108 Ь-84 Ь-83 Ь-58 Ь-25 М-10

Ь-4 04+511 204+311 ©6+411 ©6+411 2©4+311 204+311 ©6+411 ©6+411 204+311 ©6+411 2©4+ЗП

М-10 ©4+511 ©6+411 ©6+411 ©6+411 ©6+411 ©6+411 204+311 204+311 ©6+411

Ь-25 04+511 2©4+ЗН ©6+411 2©4+ЗИ 204+311 2©4+311 204+311

1-58 711 ©6+411 204+311 ©4+511 204+311 ©4+511

Ь-83 04+511 204+311 2©4+31 ©6+411 ©6+411 204+311 ©6+411

Ь-84 ©4+511 ©6+411 204+31 ©6+411 204+311 204+311

Ь-108 ©4+511 ©6+411 ©6+411 2©4+31 204+311

Ь-111 04+511 204+311 2©4+31 06+411

Ь-112 ©4+511

Ь—114 ©4+511 ©6+411

ТиП ©4+511

Примечание: об — кольцо из 6 хромосом; 2©4 — два четырехчленных кольца; II — бивалент.

Анализ конфигураций мейоза у гибридов, совместно с данными мор-эметрического анализа и дифференциальной окраски хромосом, позволил цнозначно определить структуру исследованных транслокаций.

Обнаруженная нами в линии М-10 транслокация Т2_?в у гороха ранее е была описана. Таким образом, нами идентифицирована новая трансло-ационная линия гороха, которая может с успехом использоваться для становления связи определенных групп сцепления гороха со 2 и 7 ромосомами.

По литературным данным идентификация транспонированных хромосом линиях Ь—111» Ь-112, Ь-25 и Ь-108 подвергалась неоднократным изме-ениям (В11хг,1959; 5поас1,19бб; Ьатт,1974,1987; Ро1кебоп,1990; етпуМг е!; а1.,1993). В данной работе с помощью дифференциальной краски хромосом и анализа мейоза нами впервые показано, что линии -111, Ь—112, Ь-25 и М-10 включают перестроенную хромосому 7, в то ремя как в линии Ъ-108 затронута разрывом другая спутничная ромосома (4— хромосома). Таким образом, проведенный цитогенетичес-ий анализ позволил уточнить хромосомную структуру этих четырех ранслокационных линий, у которых имеются хромосомные структуры: -25(1-7), 1-111(5-7), 1-112(3-7), Ь-108(2-4).

Наши исследования еще раз подтверждают литературные денные о ромосомных структурах в пяти транслокационных линиях: в лшши Ь-83 атронуты 3 и 5 хромосома (В11хг,1959; Ро1кезоп,1990), в Ь-84 — 3 и хромосомы (Ьагпт,1987; Ро1кезоп,1990), в Ь-114 — 1 и 2—хромосома Ьатш,1987), Ъ-4 — 1 и 3— хромосома (ЕаЬоуа & Соз1;1т8к1,1980), а ^ представляет собой транслокацию мевду 2 и хромосомами гороха ТетпуМг ег а1.,1995).

Наибольшие затруднения при идентификации хромосом, вовлеченных в рвнслокацию, возникли при исследовании линии 1г-58. Бликст определил е как транслокацию Т4_6 (В11хг,1959). Это утверждение поддержали сам втор (В11х1;,1972) и Ламм (Ьатт,1974,1980). Последние данные дают овую интерпретацию Ь-58 как Т1-2 (Ро1кезоп,1990; Тетпуйг et 1..1993).

В мейозе у гибридов (Ь-4 х Ь-58) и (Ь-25 х Ь-58) наблюдалось армирование двух квадривалентов и трех бивалентов, что противоречит частию в транслокации линии Ь-58 хромосомы 1. Однако, учитывая естабильность хромосомных структур в мейозе у гибридов с линией -58, данные выводы нельзя считать окончательными без дополнитель-цх исследований.

Таким образом, комплексное цитогенетическое исследование транс-

локационных линий гороха позволило однозначно идентифицировать новую реципрокную транслокацию в линии М-10 и переопределить хромосомную структуру 5 ранее предложенных транслокационных линиий гороха и подтвердить структуру 5 других транслокационных линий.

2. Электронно-микроскопическая характеристика мутантов

С целью дополнительной характеристики новых мутантов гороха ми исследовали морфологию, анатомию вегетативных органов у морфологических мутантов и структуру хлоропластов у хлорофильных мутантов с помощью сканирующего и просвечивающего электронного микроскопа.

2.1. Характеристика морфологических мутантов

Мутант "Безвосковой". Исследование на сканирующем микроскопе показало, что верхняя сторона листочка исходного сорта Ранний зеленый покрыта плотным восковым налетом, форма которого похожа на бляшки, пластинки, длиной 1-2 мкм.

Восковой налет на нижней стороне листочка у контроля имеет форм} полосок, длиной 2.5-5.5 мкм. У контроля на обеих сторонах прилистников, на стебле и на бобах имеется плотный восковой налет с одинаковой формой полос соответствующего размера. Длина полос воска составляет 1.5-3.0 мкм.

У безвоскового мутанта на верхней поверхности листочка такж« имеется восковой налет, форма и размер которого сходны с таковыми з контроля. На нижней поверхности листочка, на обеих сторонах прилистника, на поверхностях стебля и бобов восковой налет у мутанта сильно уменьшен и имеет форму отдельных гранул. Иногда восковой налет ш поверхностях этих органов вообще не обнаруживается.

Мутант "Скрученный". С помощью сканирующего электронного микроскопа показано, что стебель у контроля имеет прямую форму, сосудист« -волокнистые пучки расположены параллельно друг другу.

Стебель мутантных растений закручен, сосудисто-волокнистые пучю расположены на поверхности стебля не параллельно друг другу, а 1 виде изогнутых линий. Листья у мутанта не развернуты, а сильно скручены.

Мутант "Штамбовый". Показано, что у контрольных растенй стебель округлый, неясно четырехгранный. Соцветие — кисть, в каждо1 соцветии обычно образуется 1-2 зачаточных цветка.

У мутанта в результате фасциации верхней части стебля верхушеч ный конус нарастания утолщается, узлы стебля сближены, цветочны' бутончики расположены скученно и цветки собраны в виде зонтика.

Подробности анатомического и морфологического строения данных тантных форм изучены впервые.

2.2. Структура хлоропластов у хлорофильных мутантов

У хлорофильных мутантов подробно исследовали структуру хлоро-ютов в молодых листочках.

Мутант "хл-15". Установлено, что хлоропласта мутанта хл-15 :личаются от таковых у зеленых растений и имеют меньшие размеры по швнению с контролем. Количество ламелл в многочисленных гранах ючительно меньше, чем в норме. Граны более короткие, чем в норме, : число также уменьшено. Однако крахмальные зерна более многочис-¡нны и увеличены в размерах.

Мутант "хл-18". Электронно-микроскопическое изучение показало, .'о хлоропласты у гетерозиготных растений имеют меньшие размеры и >лее вытянутую форму по сравнению с хлоропластами контрольных расте-й. Число гран в строме уменьшено. Количество тилакоидов в гранах жже меньше, чем в контроле. Контакты между отдельными гранами ;рез стромальные тилакоиды значительно уменьшены. Зато зерна крах-ша в хлоропластах встречаются гораздо чаще, и их размер увеличен.

Мутант "хл-42". Структура хлоропластов у мутанта хл-42 отли-¡ется от структуры хлоропластов контроля меньшими размерами и более сруглой формой. Количество гран в строме и число тилакоидов в дельных гранах уменьшены. Ламеллярная система мевду гранами разви-1 гораздо слабее, чем в контроле. В строме хорошо видны осмиофиль-1е капли. В некоторых хлоропластах встречаются крахмальные зерна.

Исследование ультраструктурной организации хлоропластов у трех гарофильных мутантов гороха (хл-15, хл-18, хл-42) показало, что у ;ех мутантов наблюдаются существенные изменения в структуре пластид, с. пластиды отличаются от нормальных зеленых растений по форме, ззмеру и ламеллярной системе.

Известно, что дефицит хлорофилла у исследуемых мутантов контро-фуется ядерными генами. По-видимому, у данных мутантов затронуты гны, определяющие формирование нормальной структуры хлоропластов. ^следование данных хлорофильных мутантов также выявило большое шетическое разнообразие между ниш как по форме и размеру хлоро-настов, так и по количеству гран и тилакоидов.

Таким образом, полученные данные об изменении структуры пластид иорофильных мутантов гороха подтверждают представления других ^следователей о генетическом контроле ядра над формированием этосинтетического аппарата (Веттштейн,1982).

3. Локализация нутантных генов 3.1. Локализация мутации curl

Результаты анализа расщеплений в F2, полученных от скрещивания транслокационных линий с мутантом "Скрученный", указывают на отсутствие сцепления мутантного гена с хромосомами, вовлеченными в транслокации в линиях L-4, М-10, Ь-58, L-83, L-84, то-есть с хромосомам! 1,2,3,5,6 и 7 (табл.3). Однако в скрещивании L-84 х "Скрученный' обнаружено тесное сцепление гена а, локализованного в I группе сцепления (хромосома 6), с точкой разрыва транслокационной линии Ъ-84 i мутацией curl. В линии L-84 в транслокации участвуют 3 и 6 хромосом?

Результаты изучения совместного наследования мутации "curl" i известных маркеров, находящихся в 3-ей хромосоме (табл.3) показали, что данная мутация проявляет тесное сцепление как с геном chl-7, та} и с геном г, локализованным дистально на длинном плече 3-ей хромосомы (Folkeson,1990с). Полученные результаты подтверждают предположение о расположении гена curl на длинном плече 3-ей хромосомы, f сцепление мевду а и curl в скрещивании (L-84 х "Скрученный") представляет собой псевдосцепление, вызванное транслокацией в линии L-84

При сравнении наших данных, полученных при локализации и феноти-пическоь: изучении мутанта "Скрученный", можно утверждать, чт< мутация curl, вызывающая данный мутантный фенотип, представляв' собой новый аллель уже известного гена curl, который ранее бы. описан Марксом (Marx, 1986) и локализован в V группе сцепления (3-а хромосома).

По данным Маркса, кроссинговер между генами curl и г в разни скрещиваниях составляет 21.3 ± 4.6%, 21.5 ± 8.8%, 27.1 + 5.7%. ; нашей работе кроссинговер между генами curl и г составил 20.0 ± 2.4%, что достаточно хорошо согласуется с данными Маркса. По наши данным ген curl находится в 34.0 + 3.1% кроссинговера от гена chl-7 Поскольку ген chl-7 наследуется независимо от гена г (Ежова Гостимский,1981), то последовательность данных генов можно представить следующим образом: г—curl—chl-7.

Полученные нами данные подтверждают предположение о том, чт точка разрыва в 6-ой хромосоме линии Ъ-84 близка к гену (Lamm,1974,1987).

эркер-

Число растений в Г2

Частота

ie пары генотипы всего ^А XI ^АВ рекомбинации

(ШИИ генов AB Ab aB ab N <*)

-4 т1-3 curl 59 23 44 5 131 8.31* 0.92 3.87

т1-з i 60 22 39 10 131 8.31* 0.02 0.57

curl 1 79 24 20 8 131 0.92 0.02 0.31

-10 Т2-7 curl 51 13 45 10 119 0.68 2.04 0.03

т i 40 24 40 15 119 0.68 3.83 2.04

curl i 67 29 13 10 119 2.04 3.83 0.90

-58 Т1-2 curl 48 8 36 6 98 2.00 6.00* 0.12

Т1-2 a 45 11 35 7 98 2.00 2.30 0.01

curl a 69 15 11 3 98 6.00* 2.30 0.37

-83 Т3-5 curl 64 15 44 18 141 2.05 0.19 1 .99

Т3-5 If 37 10 21 13 81 2.09 0.50 2.57

curl If 44 18 14 5 81 0.10 0.50 0.07

-84 Т3-б curl 72 15 55 12 154 2.60 4.58* 0.14

Т3-6 a 76 11 41 26 154 2.60 0.08 13.85***

curl a 105 22 12 15 154 4.58* 0.08 13.74***

л-7 chl-7curl 202 89 63 9 363 5.16* 0.77 9.16** 34.0+3.08

иола г curl 386 177 152 6 721 3.66 0.06 46.11** 20.0+2.39

1е curl 374 130 164 53 721 9.99**0.06 0.15

1е г 387 117 176 41 721 9.99**3.66 2.33

,а - полустерильные и фертильше растения или доминантный и ецессивный фенотип первого гена, В,Ь - второй ген. —Р<0.05, 0.01, 0.001, соответственно.

3.2. Локализация мутации у-2

Изучение расщепления в от скрещивания мутантных растений без

Маркер-

Число растений в Т^

ные пары генотипы всего Хд %В

линии генов АВ АЬ аВ ab N

L-4 Т1- -3 W-2 161 49 151 45 406 0.48 0.73 0.003

М-10 Т2- -7 W-2 257 62 156 83 558 11.47*** 0.28 16.06**'

L-25 V -7 W-2 103 17 94 39 253 0.67 1.11 7.41**

L-58 Т1- -2 W-2 125 44 76 24 269 17.69*** 0.01 0.15

L-84 тз- -6 W-2 258 60 171 32 521 25.38*** 14.97*** 0.006

L-108 Т2- -4 W-2 211 59 211 62 543 0.02 2.14 0.05

Ь-111 Т5- -7 W-2 121 51 116 29 317 2.30 0.01 3.91*

Уса- аГ W-2 87 34 32 7 160 0.03 0.03 1 .60

тый le W-2 94 34 25 7 160 2.13 0.03 0.28

А,а - полустерильные и фертильные растения или доминантный и рецессивный фенотип первого гена, В,Ь - второй ген. *,**,*«* — Р<0.05, 0.01, 0.001, соответственно.

воскового налета с линиями Ь-4, Ь-58, Ь-84, Ь-108 показало отсу ствие сцепления мевду данной мутацией и точками разрыва используеш транслокационных линий (табл.4). В то же время полученные дант указывают на наличие тесного сцепления мутации с хромосомами, вовл< ченными е транслокации в линиях М-10 и Ь-25 и слабого сцепления точкой разрыва линии Ь-111 (табл.4). В линиях М-10, Ь-25 и Ь-Г транслокации затрагивают одну и ту же 7-ую хромосому.

При скрещивании безвоскового мутанта "у»-2" с маркерной лини* "Усатый" не обнаружено сцепления данной мутации с маркерным ген< а/, локализованным в 1-ой группе сцепления, и с геном 1е, распода женным в ГУ-ой груше сцепления (табл.4). Из этого можно сдела' вывод, что мутация ш-2, вызывающая отсутствие воскового налета ] поверхности листочков, прилистников, стеблей и бобов, расположена 7-ой хромосоме. Точки разрыва хромосом в линиях М-10, Ь-25 и Ь-1 локализованы на коротком плече 7-ой хромосомы, и этот факт свидет<

эствует о том, что мутантный ген также находится на коротком плече -ой хромосомы.

Исследованная нами мутация "w-2" по фенотипу очень похожа на звестную мутацию "wsp", локализованную в группе сцепления VII на тарой карте хромосом гороха (Lamprecht,1954). В нашей работе мутант-¿й ген w-2 локализован в хромосоме 7. Если гены w-2 и шзр аллельны,

3 полученные нами данные подтверждают результаты Folkeson (1990с) о ж, что сегмент wsp—ail принадлежит к группе сцепления VII, а не к руппе сцепления IV последней карты хромосом гороха (Plsum Genetics, 393.V.25).

3.3. Локализация мутации ía

Анализ гибридов F2 от скрещиваний между мутантом "Штамбовый", леющим фасциированный стебель, и транслокациями показал, что му-антный ген наследуется независимо от точек разрыва всех используе-¿X транслокаций (табл.5). Отсутствие сцепления мутантного гена и эчек разрыва исследованных транслокаций доказывает, что этот ген зходится на большом расстоянии от этих точек разрыва.

При скрещивании мутанта "ШтамбОЕЫй" с маркерной линией L-1238 и /■тантом w-2 не обнаружено сцепления фасциированной мутации с мар-зрными генами V группы сцепления (генами г, ti и gp), с геном w-2 /II группа сцепления), с генами а и i (I группа сцепления) и с знами wb и к (II группа сцепления) (табл.5).

Однако расщепление по мутации /а и гену le (группа сцепления IV) эстоверно отличалось от независимого дигибридного расщепления :3:3:1 за счет сцепления между двумя генами (табл.5).

У гороха уже идентифицированы два рецессивных генз /а и fas, Зусловливающие фасциацию стебля и локализование в группах сцепления

4 и III, соответственно (Хангильдин,1990). Гены fa и le расположены двух сегментах группы сцепления IV и находятся достаточно далеко

руг от друга (Pisum Genetics.1993).

Суммируя имеющиеся данные, можно придти к заключению, что иссле-эванная нами мутация "Штамбовый" локализована в IV группе сцепления эроха и, по-видимому, представляет собой новый аллель уже звестного гена fa. Расстояние от гена fa до гена le составило 2.0+2.4 кроссинговера.

Маркер-

Число растений в Р2

Частота

ные licjptí генотипы всего XA 4 ^AB рекомбинаци!

линии генов AB Ab aB ab N (Ж)

L-4 Т1-3 fa 118 29 96 21 264 3.41 5.17* 0.01

М-10 Т2-7 fa 116 22 102 32 272 0.06 3.84 2.37

L-83 Т3-5 fa 115 25 115 33 288 0.22 3.63 0.67

L-84 Т3-6 fa 116 41 106 27 290 1.99 0.37 1.18

а fa 169 55 53 13 290 2.33 1.12 1.66

L-108 Т2-4 fa 90 26 95 22 233 0.004 2.40 0.41

L-111 Т5-7 fa 135 28 128 40 331 0.08 3.51 1.86

L-1238 а fa 320 104 131 42 597 5.04* 0.09 0.01

I' fa 337 112 114 34 597 0.01 0.09 0.23

wb fa 338 116 113 30 597 0.35 0.09 1.20

к fa 341 115 110 31 597 0.57 0.09 0.60

le fa 322 132 129 14 597 0.35 0.09 21.54*** 32.0±2.

г fa 352 104 99 42 597 0.61 0.09 2.81

ti fa 370 107 81 39 597 7.64* 0.09 4.73

gP fa 347 118 104 28 597 2.66 0.09 0.97

"W-2 " W-2 fa 169 47 54 16 286 0.04 1.35 0.04

1 fa 160 55 56 15 286 0.005 0.04 0.56

А,а - полустерильные и фертильные растения или доминантный и рецессивный фенотип первого гена, В,Ь - второй ген. »,**,*** — Р<0.05, 0.01, 0.001, соответственно.

3.4. Локализация мутации ха-18

Анализ расщеплений в F2, полученных от скрещивания хлорофиль ного мутанта ха-18 с транслокационными линиями показал, что данна мутация наследуется независимо от точек разрыва хромосом в линия

кер- Число растений в F„

ПаРи генов генотипы ^ Â Â ÛB

ИИ АВ Ab аВ ab N

V -3 ха-18 107 215 93 127 542 25.62***

0 V -7 ха-18 65 114 62 102 343 2.81

5 Ч -7 ха-18 28 52 23 54 157 0.57

3 V -2 ха-18 50 69 29 59 207 9.29*

3 -5 ха-18 62 98 56 96 312 3.19

4 тз- -6 ха-18 60 120 52 90 322 5.08

08 Т2- -4 ха-18 46 76 45 81 248 1 .16

11 Т5- -7 ха-18 65 88 53 89 295 7.36

238 а ха-18 85 127 27 52 291 0.72 3.48 4.98

wb ха-18 89 136 23 43 291 0.83 H M 4.96

к ха-18 88 132 24 47 291 0.06 tt » 4.49

le ха-18 73 146 39 33 291 0.01 Il_M 13.93**

г ха-18 64 108 48 71 291 39.20*** tt » 44.42***

tl ха-18 71 115 41 64 291 19.06** « M 22.95***

gP ха-18 91 127 21 52 291 0.001 »T_ft 7.62

г le 130 42 89 30 291 39.20*** 0.01 0.02

tl le 140 46 79 26 291 19.06** 0.01 0.004

gp le 166 52 53 20 291 0.001 0.01 0.37

. - полустерильные и фертильные растения или доминантный и ;ессивный фенотип первого гена, В,Ь - второй ген. »,*** — РС0.05, 0.01, 0.001, соответственно.

О, L-25, Ь-83, L-84, L-108, Ь—111 и сцеплена с точками разрыва мосом в линиях L-4, L-58 (табл.6). Представленные данные указывают на отсутствие сцепления данной

хлорофилъной мутации с хромосомами 2,4,5,6 и 7, вовлеченными в тран слокации в линиях М-10, L-25, L-83, L-84, L-108, L-111 и возможно' сцепление исследуемой мутации с одной из транслоцированных хромосо1 линий L-4 и L-58 — с хромосомой 1.

При скрещивании с маркерной линией L-1238 не обнаружено сцепле ния изучаемой мутации с маркерными генами a, wb и к, и gp групп сцепления VI, II и V, соответственно (табл.6). Однако найдено дост верное отклонение наблюдаемого расщепления по хлорофилъной мутации гену le (группа сцепления IV). Сочетание данных транслокационного сегрегационного анализа приводит к выводу, что ген аа-18 локализова в 1-й хромосоме (IV группа сцепления).

Необходимо отметить, что в скрещивании с маркерной линией выяв лено также сцепление между данной хлорофильной мутацией и маркеным генами г и tí группы сцепления V (табл.6). Однако факт сцеплени мутации ха.~18 с данными маркерами требует дополнительной проверки так как в анализируемой популяции Г2 было резко нарушено расщеплени по самим маркерным генам (%^=39.20 и 19.06).

3.5. Локализация мутации chl-42

Анализ расщеплений по признаку стерильности и фертильности в I от скрещивания мутантных растений "хл-42" с транслокационными ли ниями показал, что данная мутация наследуется независимо от точе разрыва в линиях L-4, L-58, Ь-83 и L-84 (табл.7). В то же время уст новлено, что в скрещиваниях мутанта с линиями М-10 и L-108 расщепле ние в F2 статистически достоверно отличалось от теоретическо1 (табл.7).

Транслокационные линии М-10 и L-108 имеют точки разрыва в хром< соме 2. Отсюда следует, что анализируемый мутантный ген расположен хромосоме 2 гороха.

Наши экспериментальные данные показывают, что в линиях М-1(

Я Я

L-108, L-114 и Twt в транслокацию вовлечена одна общая 2— хромосо( Выявление факта сильного сцепления между хлорофильной мутацш "chl-42" и точками разрыва хромосом в линиях М-10, Ь-108 и налич! литературных данных о сцеплении точек разрыва транслокационных лин L-108, L-114, Twt с маркерными генами р, vilo, Аср-4, локализовании! в группе сцепления VI (Ьашш,1980,1983; ТешпуИг et al.,1995) привод к выводу, что хромосома 2 соответствует группе сцепления VI.

О 4

кер- Число растений в

ии Пары генов генотипы всего *А х| Хдв

АВ АЬ аВ аЬ N

Т1-3 сМ-42 61 19 51 18 149 0.81 0.002 0.11

0 Т2-7 сШ-42 159 15 88 80 342 0.11 1.41 68.96***

в Т1-2 сШ-42 204 65 182 66 517 0.85 0.03 0.40

13 Т3-5 сЫ~42 125 40 93 36 294 4.41* 0.11 0.45

14 Т3-6 сЫ-42 90 35 65 25 215 5.70* 0.97 0.004

08 Т2-4 сЫ-42 167 6 135 66 374 2.10 6.59* 40.06***

I - полустерилыше и фертильные растения или доминантный и 1ессивный фенотип первого гена, В,Ь - второй ген. <*,*** — Р<0.05 , 0.01, 0.001, соответственно.

4. Применение ВДРБ анализа

С целью выявления полиморфизма ДНК мутантов и линий гороха был шен метод ИАРБ анализа с использованием 3 различных праймеров. <азано, что все праймеры при применении их в ПЦР с ДНК гороха азались эффективными и инициировали синтез от 6 до 15 специфиче-IX продуктов (ампликонов), хорошо выраженных и воспроизводимых на эктрофореграммах. Размеры анализируемых амплифицируемых фрагментов гадились в пределах от 100 до 2000 пн.

Каждому из праймеров соответствовал специфический спектр ампли-зов ДНК гороха, отличающийся от других количеством фрагментов и их змером, а также интенсивностью их амплификации. При анализе резуль-тов ПЦР с ДНК различных образцов, было выяснено, что некоторые пликоны (например, 750 пн для В340, 670 пн и 990 пн для В474) исутствовали в спектрах продуктов амплификации всех исследованных разцов, в то время как другие были характерны не для всех геноти-в (рис.2). Количество полиморфных фрагментов у каждого мутанта или нии зависело от генотипа и нуклеотидной последовательности аймера.

Исследование спектров амплифицируемых фрагментов ДНК используе-

мых 10 образцов гороха с тремя праймерами выявило всего 19 RAPD-маркеров. Эти полиморфные амплифицированные фрагменты ДНК могут бить эффективно использованы для картирования генома гороха в качесттве молекулярных маркеров.

Исследование характера наследования ПЦР-продуктов показало, что в целом гибриды F1 от скрещиваний мутантов (хл-18, хл-15, хл-42, w-2 и fa) с маркерной линией L-1238 имеют суммарные спектры обоих родите лей. Новых гибридных молекулярных форм в гетерозиготах выявлено не было.

И 1 2 34 56789 Ю

1636 пн — 1018 ПН —

506 пн — 396 пн —

100 пн —

Рис.2. Продукты амплификации ДНК сорта и линий гороха с праймером В474. М - маркер (1kb ladder), 1 - Раний зеленый, 2 - хл-18 (гомозигота), 3 - хл-18 (гетерозигота), 4 - w-2, 5 - Скрученный; 6 - хл-15, 7 - Немчиновский, 8 - хл-42, 9 - Штамбовый; 10 - L-123? Стрелками показаны полиморфные фрагменты.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе мы попытались картировать несколько морфологических и хлорофильных мутаций гороха с применением реципрокны; транслокаций.

Предварительно с помощью морфометрического анализа хромосом i митозе и исследования поведения хромосом в мейозе нами было установлено, что транслокационная линия М-10, представляет собой нову1 транслокацию между 2 и 7 хромосомами. Методом дифференциально]

раски хромосом показано, что одна точка разрыва локализована в ротком плече 7— хромосомы, и вторая - в длинном плече хромосомы 2.

Проведенный онтогенетический анализ позволил уточнить хромосом-ю структуру ранее описанных транслокационных линий. Так, нами впер-е показано, что линии L-111, L-112, L-25 и М-10 включают перероенную хромосому 7, в то время как в линии L-108 затронута разры-м другая спутничная хромосома (4— хромосома).

Наши исследования подтвердили хромосомную структуру в транслока-онных линиях L-4, L-83, L-84, L-114 и Twt.

Используя транслокационные линии, мы показали, что 4 изученных ми мутации "w-2", "curl", "chl-42" и "ха-18" сцеплены с точками зрыва и локализованы в разных хромосомах гороха.

Установлено, что мутация "w-г", контролирующая отсутствие воско-iro налета на нижней стороне листочков и прилистников, находится в хромосоме, мутация "chl-42", вызывающая хлорофильный дефект, нахо-;тся во 2— хромосоме и тесно сцеплена с точками разрыва 2— хромо->мы в транслокациях L-108 и М-10.

В результате применения транслокаций обнаружено псевдосцепление ■тации curl с маркером а, локализованным в группе сцепления I. На ¡новании сцепления с генами г и chl-7 данный мутантный ген был жализован в группе сцепления V (хромосома 3). Полученные данные зидетельствуют о том, что рассматриваемые гены расположены в после-)вательности г—curl—chl-7.

Установлено, что мутация "ха-18" сцеплена с точками разрыва зомосом в линиях L-4 и L-58, в которых участвует общая хромосома 1, ричем мутантный ген тесно сцеплен с маркером 1е, расположенным в IV руппе сцепления (1 хромосома).

При локализации новых мутаций с помощью транслокационных линий ам не удалось обнаружить сцепление мутации "fa", обусловливающей голщение стебля и зонтичное расположение цветков. Но положение /тации "fa" удалось определить с использованием специальных маркерах линий. Показано, что мутация "fa" проявляет сцепление с марке-ом 1е, и локализована в группе сцепления IV (1 хромосома).

выводы

1. Впервые 11 транслокационных линий гороха были одновременно сследованы генетическими и цитогенетическими методами, в результате

чего идентифицирована 1 новая транслокация, уточнена хромосомн; локализация 5 ранее использованных транслокационных линий и подтве] кдена хромосомная структура у 5 других линий.

2. Использование в генетическом анализе набора транслокационш линий позволило локализовать на конкретных хромосомах 4 новых мут; ции гороха ("w-2", "curl", "хл-42" и "хл-18").

3. С помощью маркерных линий мутация "Га", вызывающая утолщеш стебля и зонтичное расположение цветков, локализована в 1— хром< соме.

4. При электронно-микроскопическом анализе установлено, что мутанта "w-2" нарушено формирование воскового налета на нижней ст< роне листочков, на обеих поверхностях прилистников и на поверхности стебля и бобов. Показано, что у мутанта "curl" изменена анатом! стебля и листьев. У мутанта "Га" нарушено формирование соцветий.

5. С помощью просвечивающей электронной микроскопии установлен* что у исследуемых хлорофильных мутантов нарушена структу] хлоропластов.

6. Методом ПЦР с использованием случайных праймеров выявл* внутривидовой полиморфизм ДНК у мутантов и маркерных линий гороха.

7. Показано, что гибриды F1, полученные от скрещивания разн линий гороха, наследуют RAPD-спектры обоих родителей.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Лю Фучжун. Изучение хромосомных транслокаций у гороха -Тезисы докладов Международной конференции студентов и аспирантов i фундаментальным наукам "Ломоносов - 97". Москва. 8-10 апреля 1997. печати.

2. Лю Фучжун, Марченко А.Н., Гостимский С.А. Идентификация нов« транслокации у гороха // Доклады Академии Наук. 1997. В печати.