Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование малеиновой кислоты культурой Alcaligenes xylosoxidans 260 и пути повышения эффективности этого процесса

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сафронова, Ирина Юрьевна, Москва

-'"} Г.

, Л ; ' ч,

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М. В.ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

САФРОНОВА Ирина Юрьевна

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МАЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ КУЛЬТУРОЙ АЬСАЬЮЕИЕЗ ШШЗХЮШ 260 И ПУТИ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЭТОГО ПРОЦЕССА

Специальность 03.00.07 - микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент Е.В.Семенова

Москва - 1999

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ...................................................... 4

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. Синтетические органические соединения, как один из видов химического загрязнения и их классификация...................................................6

ГЛАВА 2, Использование микроорганизмами синтетических

органических соединений.............................. 8

2.1. Трансформация, как один из путей использования микроорганизмами синтетических органических соединений.......................................................10

2.2. Особенности роста микроорганизмов на синтетических органических соединениях...................................15

2.3. Генетический контроль процессов деструкции ксенобиотиков........................................ 19

2.3.1. Плазмиды деградации................................ 19

2.4. Влияние процесса диссоциации бактерий на активность штаммов-деструкторов................................. 21

ГЛАВА 3. Использование малеиноЕОЙ кислоты микроорганизмами.... 23

3.1. Малеиновый ангидрид и малеиновая кислота, как компоненты сточных вод.______........................ 23

3.2. Бактерии-деструкторы малеиновой кислоты.............. 25

3.3. Основные пути метаболизма малеиновой кислоты......... 28

ГЛАВА 4. Биотехнология очистки сточных вод....................31

4.1. Принципиальная схема очистки сточных вод............. 32

4.2. Биологическая основа очистки сточных вод............. 34

4.2.1. Активный ил........................................ 34

4.2.2. Применение ассоциаций микроорганизмов для интенсификации биоочистки сточных вод.............. 36

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 5. Объекты и методы исследований........................ 39

5.1. Объекты исследований................................. 39

5.2. Условия хранения..................................... 39

5.3. Среды и условия культивирования...................... 39

5.4. Методы исследований..............................................42

5.4.1. Идентификация исследуемой бактерии................. 42

5.4.2. Поиск плазмид деградации малеата у A.xylosoxidans.. 43

5.4.3. Выяснение пути использования малеиновой кислоты у

A. xylosoxidans .........................................................44

5.4.4. Исследование природы капсул A.xylosoxidans и

B.subtili s......................................... 46

5.4.5. Иммобилизация клеток A.xylosoxidans,.........................49

РЕЗУЛЬТАТЫ

ГЛАВА 6. Идентификация исследуемой бактерии................... 51

ГЛАВА 7. Поиск плазмид деградации малеата у A.xylosoxidans.... 56 ГЛАВА 8. Направление использования малеата - трансформация

или деградация?...................................... 57

8.1. Рост A.xylosoxidans на среде с различными концентрациями малеата в качестве единственного источника углерода...........................................58

8.2. Особенности роста A.xylosoxidans на среде с двумя источниками углерода................................. 65

ГЛАВА 9. Биохимический путь трансформации малеиновой кислоты

A.xylosoxidans...................................................71

ГЛАВА 10. Трансформация малеиновой кислоты диссоциантами

A.xylosoxidans...................................... 72

ГЛАВА 11. Использование малеиновой кислоты смешанной

культурой микроорганизмов........................... 80

11.1. Трансформация малеиновой кислоты

ассоциацией бактерий в периодической культуре....... 81

11.2. Трансформация малеиновой кислоты ассоциацией бактерий в непрерывной культуре..................... 89

11.3. Физическая организация ассоциации бактерий,

активно использующей малеиновую кислоту.....____.... 93

11.3.1. Исследование природы капсул A.xylosoxidans____.... 94

11.3.2. Исследование межклеточного матрикса В.subtilis.... 95 ГЛАВА 12. Трансформация малеиновой кислоты

иммобилизованными клетками A.xylosoxidans.......... 104

12.1. Трансформация малеата иммобилизованными клетками диссоциантов A.xylosoxidans в периодическом

режиме............................................. 104

12.2. Трансформация малеата иммобилизованными клетками A.xylosoxidans в непрерывном режиме................ 106

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ...............................................109

ВЫВОДЫ....................................................... 124

ЛИТЕРАТУРА..........................................................125

Введение.

В последнее время в окружающую нас среду в результате антропогенного влияния в больших количествах поступают стойкие, часто токсические синтетические соединения, накопление которых создает реальную опасность для биосферы. Наиболее перспективными, а е ряде случаев единственно возможными, методами восстановления окружающей среды являются микробиологические методы- Существуют микроорганизмы, способные использовать высокие концентрации синтетических аналогов природных соединений. Всестороннее изучение физиологии таких микроорганизмов, причин и механизмов использования ими ксенобиотиков чрезвычайно актуально и имеет общенаучное и прикладное значение.

К числу токсических органических соединений, попадающих в окружающую среду, относится и малеиновая кислота - неприродный транс-изомер фумаровой кислоты. Ее получают химическим путем для использования в производстве винной и яблочной кислот, полимерных материалов, алкидных смол, детергентов. В то же время, малеиновая кислота является побочным продуктом ряда производств. При попадании этого вещества в сточные воды без очистки, его концентрация в водоемах иногда существенно превышает предельно допустимую (60,0 мг/л).

По имеющимся в литературе сведениям способностью использовать малеиновую кислоту в качестве источника углерода и энергии обладают, в основном, некоторые виды родов Alcaligenes и Pseudomonas. Причем, эти микроорганизмы растут на средах, содержащих не более 5,0 г/л малеиновой кислоты (Скрябин, Головлева, 1976; Стейниер и др., 1979; Киприанова, 1984; Bergey's Manual..., 1984; Kimura et al., 1986). Сотрудникам кафедры

микробиологии МГУ удалось выделить штамм N 260, который был способен расти на среде с малеиновой кислотой в концентрации достигающей 25,0 г/л (Аркадьева и др., 1991).

В связи с этим, целью настоящей работы явилось исследование физиолого-биохимических особенностей штамма 260, определяющих способность этого организма использовать высокие концентрации малеиновой кислоты, его идентификация и подбор оптимальных условий утилизации малеата.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

1) идентифицировать исследуемый микроорганизм;

2) выяснить направление утилизации высоких концентраций малеиновой кислоты - деградация или трансформация;

3) выяснить путь утилизации малеата, то есть последовательность биохимических реакций и ключевые ферменты;

4) изучить влияние гетерогенности популяции штамма-деструктора на утилизацию малеиновой кислоты;

5) исследовать использование малеиновой кислоты смешанной культурой микроорганизмов;

6) подобрать наиболее оптимальный режим утилизации малеиновой кислоты штаммом 260.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Синтетические органические соединения, как один из видов химического загрязнения, и их классификация.

В настоящее время важную, если не первостепенную, роль в загрязнении окружающей среды играют синтетические органические соединения - вещества, несвойственные органическому миру и ранее (до развития органического синтеза) в природе не встречавшиеся.

К настоящему времени синтезировано более 6,0х10б неприродных соединений (Еекер и др., 1990). Особенно широкое распространение синтетические органические соединения получили в последние 45-50 лет. Производство синтетических химикалий составляет 2,0х108т/год (многие из них опасны), при том, что общий круговорот органических веществ в биосфере оценивается в 2,0xl01:I т/год, и все эти соединения минерализуются в природе. Мировая торговля включает 6,5х103 наименований; около 150 веществ производятся в массовых количествах (более 50,0х103т/год); уже сейчас в сточных водах встречается более 55 тысяч разнообразных синтетических соединений (Chakrabarty, 1991). Однако, возможности экотоксикологических служб по идентификации и обезвреживанию исчерпываются 1000 соединений, вред остальных неизвестен. Увеличение производства и применения этих веществ приводит к тому, что они становятся важным и весьма неприятным экологическим фактором (Shukla, 1990).

Среди применяемых методов очистки стоков от загрязнения синтетическими токсичными органическими соединениями микробиологическая очистка является наиболее дешевой, самой

доступной и, значит, наиболее перспективной, а на практике нередко единственно возможной (Илялетдинов, 1991).

Все синтетические органические соединения, загрязняющие окружающую среду, можно условно разбить на следующие основные группы: 1) неподвергающиеся превращениям под действием микроорганизмов (стойкие синтетические соединения); 2) подвергающиеся частичным превращениям в условиях трансформации или кометаболизма, но не являющиеся источником питания; 3) подвергающиеся неполным превращениям и частично утилизирующиеся; 4) полностью утилизирующиеся микроорганизмами в качестве единственного или основного источника питания (Карасевич, 1982). Позднее, данную классификацию значительно сузили: устойчивые синтетические органические соединения, средней устойчивости и неустойчивые в природных условиях (GalИ, 1990).

Рациональное использование микроорганизмов для разрушения синтетических органических веществ возможно только на основе установления общих закономерностей биодеструкции (Гвоздяк, 1973).

Все синтезированные человеком органические вещества имеют аналоги среди природных, и необычность их строения состоит в своеобразном размещении атомов в молекуле, а отнюдь не в наличии каких-то новых, неизвестных природе типов связи между ними. Исходя из этого, при рассмотрении микробной деструкции синтетических органических соединений ученые придерживаются традиционного для классической микробиологии деления веществ в соответствии с их химическим строением, с учетом того, какая часть молекулы вовлекается в биохимическую реакцию и источником какого элемента является это вещество. Такой подход позволяет объеденить все синтетические органические вещества в несколько

групп: источники углерода; соединения азота; серу-, фосфор- и галоген содержащие вещества; элементорганические соединения (Ротмистров и др., 1975).

Несомненное преимущество представленной выше химической классификации синтетических загрязнителей заключается еще и в том, что она позволяет рассматривать микробное разрушение целых групп веществ в соответствии с их строением, что дает возможность после накопления и систематизации экспериментальных фактов вывести определенные закономерности процесса минерализации самых разнообразных веществ, предвидеть пути их деструкции, предсказать с большой степенью вероятности наиболее подходящие таксономические группы микроорганизмов, способные быстро и эффективно их разрушать, то есть наметить действительно научный, а не чисто эмпирический, подход к решению сложной проблемы микробной очистки воды от синтетических веществ (Котляревский, 1990).

Глава 2. Использование микроорганизмами синтетических органических соединений.

Существует мнение, что есть определенная зависимость качественного состава сообщества микроорганизмов от состава субстрата и условий культивирования. В условиях аэротенков сообщество представлено грамотрицательными палочковидными бактериями, среди которых преобладают псевдомонады, в биофильтрах - это бактерии и грибы, в метантенках - анаэробные гетеротрофные и метановые бактерии. Такая зависимость тем более должна проявляться при очистке промышленных сточных вод, содержащих

специфические, зачастую токсичные для большинства микроорганизмов вещества (Ротмистров и др., 1975).

Однако, бактериологический анализ зарастания поверхности мембран обратного осмоса, используемых в современных процессах очистки сточных вод, показал, что в биопленке преобладали культуры Acinetobacter и Flavobacterium, а с внутренней стороны фильтрующей поверхности мембран - Acinetobacter, Pseudomonas, Alcaligenes, Bacillus и Lactobacillus (Ridgway et. al., 1983). С применением стандартных и новых селективных сред проведен анализ популяций бактерий на трех биологических установках по очистке сточных вод химических производств. Анализы показали, что во всех установках качественный состав сообществ микроорганизмов был постоянен и состоял из следующих групп: Alcaligenes, Pseudomonas, Zoogloea (Hamer, 1985). Известно, что метаболическая активность псевдомонад в отношении ксенобиотиков вообще исключительно велика и они, как правило, составляют основу всех сообществ, осуществляющих деградацию этих соединений (Головлева, 1985; Рубан, 1986).

Таким образом, большинство бактерий, выделенных из активного ила, очищающего бытовые и промышленные стоки, это грамотрицательные палочки, среди которых доминирующими родами являются A leal i genes и Pseudomonas. Спектр ксенобиотиков, утилизируемых бактериями, принадлежащими к роду Alcaligenes, весьма широк (Ротмистров и др., 1978; Engesser et al., 1980; Taylor et al., 1981; Тарнопольская и др., 1986; Зайцев, 1988; Steffan et al., 1989; Burt et al., 1990; Таранова и др., 1991; Селифонов и др., 1993; Davison et al., 1994; Herman et al., 1994; Tett et al., 1994).

Для того, чтобы утилизировать синтетические органические соединения, микроорганизмы должны либо поглощать и усваивать их в качестве источника питания, либо вызывать ферментативную деструкцию, используя химическую энергию, освобождающуюся при упрощении строения органического соединения (Ротмистров и др., 1975). Таким образом, существует два основных направления микробиологической утилизации соединений: 1) полная деградация; 2) трансформация (НащгЫот, 1990).

2.1. Танс^ормгциг, как один ш путей использования

твдроорганигмами синтетические органических соединений.

Микробиологической трансформацией называется неполное превращение органических соединений ферментами микроорганизмов, сопровождающееся накоплением в среде продуктов этого превращения (Скрябин, Головлева, 1984).

Для большей части процессов микробиологической трансформации характерна незначительная перестройка молекулы субстрата, осуществляемая одним или несколькими ферментами. Она проявляется как в образовании соединений, которые далее не используются микроорганизмом (Скрябин, Головлева и др., 1972), так и во временном накоплении промежуточных продуктов в процессе использования различных органических соединений в качестве ростовых субстратов (Ьоскигоос!, 1954). Выделяют пять основных типов процессов микробиологической трансформации:

1) накопление продуктов действия отдельных ферментов или фрагментов метаболической системы нормально функционирующей микробной клетки, происходящее в связи со специфическими

особенностями регуляции ее обмена;

2) накопление продуктов превращения ферментами микробной клетки структурных аналогов их естественных субстратов;

3) накопление частично превращенного субстрата в результате действия специфических трансформирующих ферментных систем (модификация);

4) накопление продуктов действия отдельных ферментов или фрагментов метаболической системы микробной клетки как результат экспериментального нарушения ее нормального метаболизма;

5) превращения органических веществ ферментными препаратами микробного происхождения.

Классификация процессов микробиологической трансформации строится по типу возникновения и элиминирования функциональных групп: окисление, восстановление, декарбоксилирование, дезаминирование, образование гликозидов, гидролиз, метилирование, этерификация, дегидратация, диспропорционирование, конденсация, аминирование, ацетилирование, амидирование, деметоксилирование, нуклеотизация, галогенирование, деметилирование, аосиметризация, рацемизация, изомеризация (Скрябин, Головлева, 1976; Shoemer, Martin, 1980; Malik, 1982; Kieslich, 1984).

В настоящее время существуют следующие методы микробиологической трансформации органических соединений:

I. Использование ферментативных свойств интактных клеток:

1) трансформация растущей культурой в периодических условиях;

2) использование ферментативной активности определенных фаз развития: а) трансформация суспензиями неразмножающихся клеток;

б) транформация опорами; в) непрерывные процессы;

3) кометаболизм.

II. Методы, основанные на дезорганизации обменных процессов клетки:

1) применение в различной степени поврежденных и дезинтегрированных клеток;

2) ингибирование определенных участков метаболических путей;

3) применение мутантов с блокированным синтезом определенных ферментов.

III. Конструирование штаммов с повышенной способностью к трансформации органических соединений.

IV. Использование ферментных препаратов, иммобилизованных ферментов и клеток ( Fukui, Tanaka, 1980; Кощеенко, 1981).

V. Политрансформация.

Методы микробиологической трансформации имеют ряд преимуществ перед химическими реакциями. Энергия активации химических реакций значите