Использование люминесцирующих микроорганизмов для биотестирования минеральных вод

Алешина, Елена Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Использование люминесцирующих микроорганизмов для биотестирования минеральных вод
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Использование люминесцирующих микроорганизмов для биотестирования минеральных вод"

На правах рукопиа

0034487Э8

АЛЕШИНА Елена Сергеевна

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЛЮМИНЕСЦИРУЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ БИОТЕСТИРОВАНИЯ МИНЕРАЛЬНЫХ ВОД

03 00 07 - Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 5 °!'Т2СЩ]

Пермь - 2008

003448798

Работа выполнена на кафедре микробиологии ГОУ ВПО «Оренбургский государственный университет», Оренбург

Научный руководитель

член-корреспондент РАЕН, доктор медицинских наук, профессор Дерябин Дмитрий Геннадьевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Куюкина Мария Станиславовна доктор биологических наук, профессор Карпунина Тамара Исаковна

Ведущая организация:

Институт биофизики СО РАН, Красноярск

диссертационного совета ДМ004 019 01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу 614081, Пермь, ул Голева, д 13 Факс (342)2446711

Автореферат диссертации размещен на сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН ИНрУ/угаш ^т ги

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН

Автореферат разослан « (?> » 2008 г.

Защита состоится

часов на заседании

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Максимова Ю Г

Общая характеристика работы

Актуальность темы

Бактериальные люминесцирующие биосенсоры в настоящее время стали одним из распространенных инструментов оценки качества питьевых, поверхностных, грунтовых и сточных вод (Данилов и др , 2007, Belkin, 2003) В основу их практического использования положен анализ активности люминесцентной системы, находящейся на пересечении основных энергетических потоков микробной клетки и потому интегрально отвечающей на всю совокупность присутствующих в среде поллютантов СКудряшова и др , 2002, Nunes-Halldorson, 2003)

В отличие от методов химического анализа, ориентированных на количественную оценку присутствия в исследуемых водах отдельных веществ с последующим сравнением выявляемых концентраций с нормативными значениями - предельно допустимыми концентрациями (ПДК), биолюминесцентный анализ не позволяет оценить природу загрязнения, но дает возможность получить комплексное представление о степени его биологической опасности, характеризуемой понятием «биотоксичность» (Пшеничнов и др, 2005, Kaiser et al, 1991) При этом наряду с относительной дешевизной, быстродействием и высокой чувствительностью, важным достоинством микробных люминесцирующих биосенсоров является хорошая корреляция получаемых результатов с реальной степенью опасности для здоровья человека (Kaiser, 1998), а также возможность оценки веществ и соединений, для которых методы выявления и значения ПДК пока не разработаны (Strachan et al, 2001)

Одним из перспективных направлений расширения сферы биолюминесцентного анализа является его использование для оценки качества питьевых минеральных вод, традиционно используемых в качестве компонента лечебно-профилактического питания А в настоящее время получающих все большее распространение в качестве альтернативы централизованному водоснабжению Однако, накапливающиеся данные о возможном влиянии на бактериальную биолюминесценцию не только токсических, но и нормальных компонентов минеральных вод -растворенных газов, катионов (Витухновская и др , 2001, О'Shea et al, 2005) и анионов (Боядин и др , 2001, Newman et al, 1996), делают прямой перенос существующих технологий биотестирования на подобные объекты неочевидным

Таким образом, приведенные выше данные определили актуальность изучения возможностей и ограничений биолюминесцентного анализа при проведении биотестирования минеральных вод, а также разработки модернизированной технологии его проведения, адаптированной к особенностям исследуемых объектов

Цель настоящего исследования - исследование влияния компонентного состава минеральных вод на люминесцирующие микроорганизмы и разработка на этой основе адаптированной технологии оценки качества минеральных вод с использованием бактериальных люминесцирующих биосенсоров

Основные задачи исследования

1 Изучить возможности и ограничения биолюминесцентного анализа при проведении биотестирования питьевых минеральных вод

2 Определить основные присутствующие в составе питьевых минеральных вод факторы, способные оказать влияние на уровень свечения бактериальных биосенсоров

3 Разработать адаптированный метод биолюминесцентного биотестирования минеральных вод, позволяющий исключить влияние их нормального компонентного состава на результаты исследования

Научная новизна исследования

Установлена невозможность использования традиционных подходов к проведению биолюминесцентного анализа для оценки качества (биотоксичности) минеральных вод В качестве основной причины подобной ситуации идентифицирован газовый и солевой компонентный состав минеральных вод, способный оказать на уровень свечения бактериальных биосенсоров выраженное ингибирующее действие, имитирующее эффект химических поллютантов

При изучении эффекта основных солей, входящих в состав минеральных вод, продемонстрированы особенности реагирования бактериальных биосенсоров в присутствии различных катионов и анионов При этом для катионов показан двухфазный (индукция/ингибирование) дозозависимый эффект, в рамках которого по способности к подавлению свечения они формировали ряд Са2+ > Na+ > Mg2+ > К+ Установлено, что абсолютные значения концентраций солей, вызывающих стимуляцию или ингибирование свечения, зависят от экологических особенностей используемых люминесцирующих микроорганизмов и оказываются выше для природного морского штамма Photobacterium phosphoreum («Микробиосенсор В-17 677f») по сравнению с рекомбинантным штаммом Escherichia coli с клонированным /их-опероном Photobacterium leiognathi («Эколюм-9») На этом фоне эффекты анионов, также оказывающих на интенсивность бактериальной биолюминесценции разнонаправленные дозозависимые эффекты, определяются их химической природой и реализовываются через взаимодействие с ферментной системой генерации свечения (галогениды), влияние на растворимость солей (сульфаты) или изменение уровня рН среды (карбонаты и гидрокарбонаты)

Построена математическая модель, описывающая зависимость результатов биолюминесцентного анализа минеральных вод от их компонентного состава, которая после устранения мультиколлинеарности приобретала вид БЛИ = 3 82 -О 02[Мин] - 0 37рН, где БЛИ - значения регистрируемого биолюминесцентного индекса, Мин - уровень общей минерализации в г/л, а рН в отн ед

Практическая значимость работы

Полученные результаты позволили обосновать подходы к проведению биотестирования минеральных вод с использованием люминесцирующих микроорганизмов, исключающие влияние их нормального компонентного состава на результаты исследования Предложенная пробоподготовка включает последовательную дегазацию, дифференцированную (зависящую от исходного солевого состава) минерализацию и нормализацию рН исследуемых вод, что позволяет восстановить уровень свечения бактериальных биосенсоров с сохранением их чувствительности к действию химических поллютантов Приоритет подобного подхода закреплен «Способом определения биотоксичности питьевых минеральных вод» (положительное решение формальной экспертизы ФИПС по заявке на изобретение № 32007129999/13 от 06 08 2007г)

На данной основе разработаны и внедрены методические рекомендации «Методика экспрессного определения токсичности питьевых бутилированных минеральных вод с помощью люминесцентных бактериальных биосенсоров» (утверждены 27 08 2007 г), предназначенные для использования специалистами ФГУЗ «Центра гигиены и эпидемиологии» и ТУ Роспотребнадзора, решающими вопросы оценки качества продуктов питания с целью выявления их потенциальной опасности для здоровья человека

Реализация предложенного алгоритма биолюминесцентного тестирования питьевых минеральных вод заключена в компьютерной программе «Прогнозирование результатов биолюминесцентного тестирования питьевых минеральных вод с использованием бактериального биосенсора «Эколюм» (свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2008611380 от 19 03 2008 г)

Основные положения, выносимые на защиту:

1 Установлена невозможность использования традиционного варианта биолюминесцентного анализа для оценки качества минеральных вод, определяемая выраженным влиянием их нормального компонентного состава на уровень свечения бактериальных биосенсоров

2 В качестве основных факторов, оказывающих негативное влияние на результаты биолюминесцентного биотестирования, идентифицированы газовый и солевой компонентный состав исследуемых минеральных вод, а также определяемый этим уровень минерализации и рН

3 Разработана адаптированная процедура проведения биолюминесцентного биотестирования минеральных вод, позволяющая восстановить интенсивность свечения бактериальных биосенсоров с сохранением их чувствительности к истинным химическим поллютантам

Связь с научными программами и собственный вклад автора

Исследования выполнены в рамках ГБ НИР № 01200407020 «Использование природных и генно-инженерных люминесцирующих бактерий для тестирования абиотических сред и биологических жидкостей», а также при поддержке гранта РГНФ № 07-06-81603 а/У «Оценка качества питьевых минеральных вод методом биолюминесцентного анализа»

Научные положения и выводы диссертации полностью базируются на результатах собственных исследований автора

Апробация работы

Отдельные фрагменты работы доложены и обсуждены на IV Международной научной конференции «Биотехнология - охране окружающей среды» (Москва, 2006), II Международной научно-практической конференции «Биоэлементы» (Оренбург, 2007), Всероссийской электронной конференции «Информационно-вычислительные технологии в науке» (Москва, 2007), Международной научной конференции «Modern problems of microbiology and biotechnology» (Одесса, 2007), III Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы экологии Южного Урала» (Оренбург, 2007), 11-ой международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2007), Региональной научной конференции молодых ученых «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии» (Пермь, 2007)

Основные результаты проведенных исследований опубликованы в 13 печатных работах, в числе которых 5 статей в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК РФ для публикации материалов диссертационных исследований на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 181 странице машинописного текста и состоит из введения, пяти глав, включая обзор литературы, описание материалов и методов исследования, трех глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы, содержащего 186 наименований, в том числе 137 - на иностранных языках, и приложения Диссертация иллюстрирована 9 таблицами и 33 рисунками

Содержание работы

Материалы и методы исследований

При проведении исследований использовали лиофилизированные препараты природного изолята морской люминесцирующей бактерии Photobactermm phosphoreum, выпускаемого Институтом биофизики СО РАН под коммерческим названием «Микробиосенсор В-17 677f», а также рекомбинантный штамм Escherichia coli К12 TGI, содержащий гибридную плазмиду pUC19 с клонированными luxCDABE генами морской светящейся бактерии Р leiognathi 54D10, выпускаемый МГУ им MB Ломоносова под коммерческим названием «Эколюм-9» Для воспроизведения люминесцентной реакции in vitro использовали «Комплект реактивов для биолюминесцентного анализа», выпускаемый Институтом биофизики СО РАН и включающий смесь лиофильно высушенных ферментов - люциферазы и NAD(P)H FMN-оксидоредуктазы Р leiognathi В качестве субстратов для реакции свечения использовали миристиновый (С]4) альдегид (Merck, ФРГ), флавинмононуклеотид (Sigma, США) и восстановленный никотинамиддинуклеотид (ApphChem, Германия)

Изученные образцы бутилированных природных минеральных вод включали 23 наименования В соответствии с градацией, приведенной в СанПиН 2 1 4 111602 данные воды были разделены на группы слабоминерализованных (до 1 г/л)

Aqua Minerale, BonAqua (США), Evian, Perrier (Франция), San Pellegrino (Италия), Святой источник, Живая вода, Архыз, Рамено (Россия), среднеминерализованных (1-10 г/л) Apollinaris (Германия), Vichy Celestins (Франция), Боржоми (Грузия), Нарзан, Ессентуки-2, Красноглинская, Мензелинская, Славяновская, Волжанка, Сулак, Яик (Россия), и сильноминерализованных (10-15 г/л) вод - Donat (Словения), Ессентуки-4, Ессентуки-17 (Россия) При проведении исследований с использованием «Микробиосенсора В-17 677f» в данные воды вносили дополнительные навески NaCl из расчета 30 г/л, при проведении исследований с использованием «Эколюм-9» пробы исследовали в исходном состоянии

Процесс дегазации исследуемых вод осуществляли отстаиванием в плоскодонных сосудах в течение 3 - 4 ч при интенсивном перемешивании 300 об/мин на шейкере ST-3 («Elim», Латвия) Уровень общей минерализации, а также количественное содержание отдельных катионов и анионов определяли с использованием системы капиллярного электрофореза «Капель» (ООО «Люмекс», Санкт-Петербург) Значения pH определяли с использованием анализатора жидкости «Эксперт-001» (ООО «Эконикс-эксперт», Москва)

При проведении отдельных фрагментов исследований также использовали соли NaCl, KCl, СаС12, MgCl2, Na2S04, K2S04, MgS04, NaHC03, KHC03, Na2C03, K2C03, KBr и KI категории x ч, KF синтезировали из эквимолярных количеств KF HF и КОН Указанные вещества растворяли в дистиллированной воде до концентраций 0 01,0 025, 0 05, 0 1, 0 25, 0 5 и 1 0 М, в некоторых случаях готовили дополнительные разведения

Перед проведением биолюминесцентного анализа лиофилизированные клетки бактериальных биосенсоров регидратировали добавлением 1 5 %-ного раствора NaCl (при использовании «Микробиосенсора В-17 677f») или холодной дистиллированной воды (при использовании «Эколюм-9») до исходного объема и выдерживали в течение 30 мин для стабилизации биолюминесценции Биосенсоры в объеме 50 - 100 мкл вносили в кюветы, содержащие по 900 - 950 мкл исследуемого материала, смеси выдерживали при + 22° - 24°С в течение 30 мин Остаточную биолюминесценцию регистрировали на приборе биохемилюминометр «БЛМ-8820» (СКТБ «Наука», Красноярск) Результат исследования выражали величинами биолюминесцентного индекса по формуле БЛИ = I0 / Ik, где 10 -интенсивность свечения бактерий в опытной кювете, Ik - интенсивность свечения бактерий в контрольной кювете В отдельных сериях проб проводили расчет значений ЕС20 и ЕС50 (снижение интенсивности свечения до 20 % и 50 % от контрольных значений) с использованием графического метода, используя двойную логарифмическую систему координат

Исследование значимости процессов трансмембранного переноса катионов проводили с использованием протонофора хлоркарбонилцианидфенилгидразона -ХКФ (Sigma, США) Измерение массовых концентраций NADH выполняли с использованием спектрофлюориметра «Флюорат-02 Панорама» (НПФ «Люмекс», Россия)

Полученные результаты обработаны методами вариационной статистики с использованием компьютерной программы «SPSS» При оценке отдельных результатов исследования использовались многомерные статистические методы множественного корреляционного, регрессионного, дисперсионного и факторного анализа

Результаты собственных исследований.

На первом этапе исследования с использованием традиционной процедуры биолюминесцентного анализа проведено исследование 23 образцов наиболее широко представленных на российском рынке отечественных и зарубежных природных минеральных бутилированных вод

Установлено, что все изученные образцы оказывали на уровень свечения как морского люминесцирующего микроорганизма Р рИозрИогеит «Микробиосенсор В-17 6775>, так и рекомбинантного штамма Е сок «Эколюм-9» выраженное ингибирующее воздействие (таблица 1), что в соответствии с действующими критериями заставляло оценивать данные воды как «токсичные» Выполнение процедуры дегазации позволило частично нормализовать определяемые значения биолюминесцентных индексов до величин ±20 % от контрольных значений для 8 вод при использовании «Микробиосенсора В-17 6776) и для 6 вод при использовании «Эколюма-9», а до значений БЛИ ± 20 -50 % у 10 из 23 исследуемых минеральных вод при использовании обоих биосенсоров (таблица 1) Полученные результаты свидетельствовали о важности удаления из анализируемых вод С02, находящегося в растворенном состоянии в виде соединения Н2С03, и способного оказать на бактериальные люминесцирующие биосенсоры прямое бактерицидное действие

Вместе с тем, и после проведения дегазации большинство изученных вод продолжали вызывать выраженное подавление свечения, что вступало в противоречие с результатами химического анализа (в соответствии с СанПиН 2 14 1116-02), свидетельствующего об отсутствии в их составе превышения ПДК наиболее значимых поллютантов

Одновременно обращал на себя внимание тот факт, что после дегазации развитие выраженной ингибиции в отношении биолюминесценции использованных бактериальных биосенсоров преимущественно регистрировалось в группе сильноминерализованных (10 - 15 г/л) и среднеминерализованных (1 - 10 г/л) минеральных вод при отсутствии подобных эффектов в группе слабоминерализованных вод При этом данные, полученные с использованием двух биосенсоров, хорошо коррелировали между собой (г = 0 79, Р < 0 01), что свидетельствовало в пользу универсальности причин, ведущих к формированию подобного люминесцентного отклика двух различных биосенсоров

Полученные данные свидетельствовали о неприменимости традиционного варианта биолюминесцентного анализа для биотестирования минеральных вод, основные ограничения которого связаны с получением ошибочных результатов при исследовании средне- и сильноминерализованных вариантов, что, вероятно, обусловлено особенностями их нормального компонентного состава

Эти результаты явились обоснованием для анализа влияния катионов К+, Иа+, Г^2+,Са2+ и анионов СГ, БОД НСОэ', СОэ2", I, Р, Вг на уровень свечения микробных люминесцирующих биосенсоров При проведении исследований в этом направлении установлены закономерности изменения уровня биолюминесценции в зависимости от используемых катионов и анионов, их концентраций в растворе, а также существование индивидуальных особенностей реагирования природного и рекомбинантного биосенсоров, определяемых экологическими особенностями последних

Таблица 1

Результаты биотестирования минеральных вод с использованием Рpliosphoreum «Микробноссисора В-17 6'77f» н Е coli «Эколюм-9» при различных вариантах пробоподготовки__

Значения биолюминесцентных индексов

при использовании Р phosphoreum «Микробиосенсор В-17 677f» при использовании Е coli «Эколюм-9»

Исследованные минеральные воды исходный вариант после дегазации после нормирования минерализации после нормирования pH < 7 5 после нормирования минерализации и pH < 7 5 исходный вариаш после дегазации после Ik нормирования рН<7 5

Aqua minerale 0,32 ± 0,29** 0,94 ± 0,07 0,98 ± 0,05 1,10 ±0,08 1,13 ±0,03 0,02 ±0,01** 1,03 ±0,12 1,03 ±0,07

Apollinaris 0,21 ±0,07** 0,70 ± 0,06* 1,06 ±0,03 0,82 ± 0,06 1,03 ±0,05 0,07 ±0,01** 0,17 ±0,03** 0,97 ±0,11

Bonaqua 0,33 ±0,3** 1,06 ± 0,10 0,99 ± 0,04 0,84 ± 0,30 1,11 ±0,02 0,02 ±0,01** 1,12 ± 0,19 1,12 ± 0,16

Donat 0,26 ±0,15** 0,26 ±0,03** 0,69 ± 0,04* 0,77 ± 0,02* 0,86 ±0,07 0,13 ±0,01** 0,04 ±0,01** 0,85 ±0,12

Evian 0,29 ±0,03** 0,51 ±0,21* 1,07 ±0,05 0,85 ± 0,29 1,05 ±0,10 0,36 ±0,03** 1,13 ±0,29 1,09 ±0,20

Perrier 0,22 ±0,07** 0,85 ± 0,08 1,03 ±0,04 0,95 ± 0,06 1,02 ±0,03 0,02 ±0,01** 0,61 ±0,11* 0,85 ±0,13

San Pellegnno 0,10 ±0,02** 1,02 ±0,06 0,55 ± 0,03* 1,05 ±0,03 0,98 ± 0,03 0,11 ± 0,02** 0,77 ±0,05* 1,02 ±0,20

Vichy Celestina 0,14 ±0,01** 0,68 ±0,01* 1,04 ±0,02 0,84 ±0,01 1,02 ±0,04 0,18 ±0,02** 0,25 ±0,09** 0,87 ± 0,02

Архыз 0,06 ± 0,02** 0,71 ±0,11* 0,98 ± 0,03 0,84 ±0,01 0,94 ± 0,02 0,09 ±0,02** 0,56 ±0,14* 0,83 ± 0,03

Боржоми 0,07 ±0,05** 0,27 ±0,05** 0,09 ±0,08** 0,28 ±0,01** 0,30 ±0,05** 0,13 ±0,01** 0,11 ±0,09** 0,26 ±0,03**

Волжанка 0,21 ±0,01** 1,00 ±0,22 0,75 ±0,01* 1,05 ±0,03 0,99 ± 0,02 0,14 ±0,02** 0,82 ± 0,02 0,92 ±0,01

Ессентуки-2 0,17 ±0,14** 0,44 ±0,07** 0,83 ± 0,02 1,03 ±0,03 0,96 ± 0,04 0,42 ±0,02** 0,36 ±0,48** 1,16 ± 0,12

Ессентуки-4 0,08 ±0,03** 0,38 ±0,06** 0,74 ± 0,06* 0,81 ±0,01 0,88 ± 0,02 0,31 ±0,01.** 0,30 ±0,07** 1,13 ±0,18

Ессентуки-17 0,16 ±0,07** 0,24 ±0,05** 0,64 ± 0,08* 0,79 ± 0,02* 0,85 ± 0,01 0,25 ±0,01** 0,12 ±0,05** 0,87 ±0,10

Живая вода 0,24 ±0,21** 0,79 ±0,12* 0,80 ±0,11 0,85 ±0,11 0,87 ± 0,01 0,03 ±0,01** 0,78 ±0,13* 0,90 ±0,13

Красноглинская 0,11 ± 0,04** 1,06 ±0,05 1,11 ±0,05 1,08 ±0,05 1,1 ±0,14 0,19 ± 0,01** 0,69 ± 0,02* 0,70 ± 0,06*

Мензелинская 0,15 ±0,07** 0,71 ±0,05* 1,13 ±0,03 0,84 ± 0,02 1,06 ±0,09 0,14 ±0,02** 0,83 ± 0,29 0,86 ± 0,04

Нарзан 0,31 ±0,28** 0,76 ± 0,07* 0,82 ± 0,06 1,04 ±0,06 1,07 ±0,02 0,28 ± 0,02** 0,83 ±0,16 1,18 ± 0,17

Рамено 0,39 ± 0,36** 0,82 ± 0,09 0,91 ±0,07 0,91 ±0,10 0,93 ± 0,01 0,05 ±0,01** 0,75 ±0,14* 0,84 ± 0,29

Святой источник 0,24 ±0,21** 0,80 ± 0,07 0,81 ±0,08 0,99 ± 0,03 1,03 ±0,05 0,14 ±0,02** 0,73 ±0,19* 0,86 ± 0,06

Славяновская 0,09 ±0,02** 0,76 ±0,17* 0,79 ± 0,02* 0,90 ±0,01 0,98 ± 0,02 0,19 ±0,03** 0,55 ± 0,07* 0,73 ± 0,02*

Сулак 0,34 ±0,20** 0,79 ± 0,07* 0,83 ± 0,07 0,95 ± 0,08 0,98 ±0,01 0,22 ± 0,04** 0,69 ± 0,08* 1,01 ±0,23

Яик 0,42 ± 0,20** 0,68 ±0,11* 0,79 ± 0,06* 0,97 ± 0,02 0,99 ± 0,01 0,26 ±0,02** 0,76 ± 0,06* 0,98 ±0,01

Примечание ** - вода оценивается как сильно токсичная, * - вода оценивается как токсичная, без обозначений - ьода оценивается как нетоксичная

При помещении Р.рковркогеит «Микробиосенсор В-17 677Б> в дистиллированную воду уровень его свечения стремится к фоновому, что определяется экологическими особенностями данного морского микроорганизма и может объясняться процессом плазмопсиса в гипотонической среде. В свою очередь при пошаговом насыщении среды хлоридами К+, М§2+ или Са2+ происходит увеличение уровня свечения Р.ркозркогеит, интенсивность которого зависит от природы используемых катионов (рисунок 1а). Так наибольшее стимулирующее воздействие на уровень биолюминесценции зафиксировано при использовании ионов Ыа+, увеличение концентрации которого от 0 до 0.50 ± 0.01 М вело к пропорциональному росту интенсивности свечения Р.ркозркогеит, в последней точке указанного диапазона соответствующего контрольным значениям. На этом фоне стимулирующий эффект хлоридов Са2+ и М§2+, максимум которого регистрировался при молярных концентрациях 0.25 ± 0.01 и 0.60 ± 0.06 М, соответственно, был существенно ниже и обеспечивал интенсивность свечения микробного биосенсора на уровне 75 - 80 % от максимального. В присутствии же хлорида К+ интенсивность биолюминесценции имела наименее выраженную тенденцию к увеличению, так что при наибольшей использованной концентрации данной соли 1.0 М достигала лишь 31.58 ± 1.92 % от контрольных значений.

БЛИ БЛИ БЛИ

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Концентрация, М Концентрация, М Концентрация, М

Рисунок 1. Влияние различных концентраций хлоридов К+ (1), Mg2+ (2), Na+ (3) и Са2+ (4) на биолюминесценцию целых клеток P.phosphoreum "Микробиосенсор B-17 677f" (а) и Е.соЧ «Эколюм-9» (б) и ферментной системы генерации свечения (в) после 30 мин контакта

При изучении люминесценции рекомбинантного штамма E.coli «Эколюм-9» установлено, что при помещении в дистиллированную воду он демонстрировал уровень свечения, более чем в 100 раз превышающий фоновый.

Данный факт соответствует представлениям об этом микроорганизме как о пресноводном (негалофильном) и, тем самым, подтверждает целесообразность использования химически чистой дистиллированной воды в качестве контрольной среды при осуществлении процедуры биотестирования с использованием биосенсора «Эколюм-9» В свою очередь исследование характера влияния тех же катионов на уровень свечения Ecoli позволило констатировать определенные сходства с их эффектами, установленными для Р phosphoreum Так ступенчатое повышение концентраций К+, Na+, Mg2+ или Са2+ первоначально результировалось в увеличении уровня свечения (рисунок 16) При этом выявленные эффекты демонстрировали прямую взаимосвязь между величиной оптимальной концентрации катиона и достигаемой при ней интенсивности свечения, будучи наибольшей в присутствии хлорида К+ (оптимальная концентрация 0 14 ± 0 05 М, относительная интенсивность свечения 1=2 64 ± 0 16) и наименьшей в присутствии хлорида Са2+ (0 05 ± 0 01 М, 1=1 25 ± 0 10)

После достижения оптимума биолюминесценции как в отношении природного, так и рекомбинантного биосенсора дальнейшее увеличение концентрации Са2+, Na\ Mg2+ или К сменялось ингибированием, характеризуемым величиной ЕС50 При этом обращает на себя внимание тот факт, что если по относительной силе ингибирующего эффекта изученные катионы формировали «ряды подобия» Ca2+>Na+>Mg2+>K+, то абсолютные значения их концентраций, вызывающих снижение интенсивности свечения морского люминесцирующего микроорганизма Р phosphoreum до 50 % от контрольных значений, оказывались значительно выше, чем аналогичные величины, определенные с использованием рекомбинантного штамма Ecoli (таблица 2)

Таблица 2

Молярные концентрации катионов*, вызывающие 50% ингнбицию свечения микробных люминесцирующих биосенсоров_

Концентрация катиона, М - Значения ЕС», определенные для биосенсоров

Е coli «Эколюм-9» Р phosphoreum «Микробиосенсор В-17 677f»

Са2+ 0 33±0 06 0 38±0 02

Na+ 0 49±0 02 1 00±0 03

Mg2+ 0 67±0 09 >1 00

к+ 0 80±0 05 >1 00

* Примечание в виде солей С1

При изучении эффектов хлоридов К+ и на ферментную систему генерации свечения установлено развивающееся во времени и дозозависимое подавление интенсивности биолюминесценции до уровня 5 % от исходного (рисунок 1в) При этом достоверные различия в эффектах одновалентных катионов отсутствовали, что свидетельствует в пользу их неспецифического эффекта на параметры ферментативной реакции, предположительно определяемого изменением ионной силы раствора На этом фоне биолюминесценция ферментной системы в присутствии хлоридов Гу^ и Са2+ имела принципиально иной характер, уже не описываемый простыми линейными зависимостями Использование первой из названных солей вело к

стимуляции интенсивности свечения в относительно широком диапазоне концентраций с максимумом при 0 025 М С другой стороны, для Са2+ сходный эффект мог быть продемонстрирован только при 0 01 М, а все более высокие концентрации данного катиона вызывали быстрое и интенсивное подавление свечения В этом контексте эффекты ионов Mg2+ и Са2+ на ферментную систему должны рассматриваться как более специфичные, определяемые прямым взаимодействием катионов данных щелочноземельных металлов с молекулами фермента

Определенный параллелизм эффектов К+, Na+, Mg2+ и Са2+ в клеточных и бесклеточных системах явился основанием для постановки вопроса о значимости прямого воздействия катионов на ферментную систему генерации свечения в определении итогового уровня бактериальной биолюминесценции Проведенный с этой целью дисперсионный анализ позволил констатировать высокую значимость подобного воздействия для рекомбинантного штамма Е coli При этом сила влияния К+, Na+, Mg2+ и Са2+ на уровень свечения клеток данного микроорганизма через изменение активности его ферментной системы варьировала в диапазоне 37 24 - 57 73 % С другой стороны, значимость обсуждаемых факторов в определении уровня биолюминесценции природного изолята Р phosphoreum была существенно ниже (2 02 - 24 06 %), будучи наибольшей для Na+, что согласуется с представлениями о важной роли этого иона в экологии морских люминесцирующих микроорганизмов рода Photobacterium

Таким образом, полученные результаты, свидетельствующие о возможности прямого воздействия К+, Na+, Mg2+ и Са2+ на активность ферментной системы генерации свечения, одновременно не позволяют свести эффекты использованных катионов на биолюминесценцию целых бактериальных клеток только к этому механизму Для доказательства данного предположения нами были проведены дополнительные эксперименты с использованием хлоркарбонилцианидфенилгидразона (ХКФ) - протонофора, эффективно нарушающего процессы трансмембранного переноса протонов через цитоплазматическую мембрану, их накопление в цитоплазме бактериальной клетки и, как следствие, существенное нарушение энергетического обеспечения люминесцентной системы

Эффект ХКФ на природный морской микроорганизм Р phoshporeum заключался в быстрой и выраженной ингибиции свечения до 1 - 2 % от исходного В противоположность этому выраженность эффекта ХКФ на стимулированное солями свечение рекомбинантного штамма Е coli имело значительные отличия остаточное свечение составило около 30 % для клеток, нагруженных СаС12, 20 % для MgCl2 и KCl, 5 % для NaCl Таким образом, подавление биолюминесценции рекомбинантного микроорганизма Е coli в присутствии ХКФ оказывалась более чем в 10 раз менее выраженным, чем в отношении природного микроорганизма

Выявленные различия могут объясняться тем, что у природных микроорганизмов типичным считается мембранная локализация люминесцентной системы, что обеспечивает ее тесную сопряженность со всеми процессами, происходящими на цитоплазматической мембране С другой

стороны у рекомбинантных микроорганизмов вероятной является цитоплазматическая локализация ферментной системы, что может объяснять преимущественно прямой характер воздействия катионов на ее активность

При исследовании влияния галогенидов (в виде солей К+) на биолюминесценцию как Р phosphoreum, так и Е coli дозозависимый двухфазный эффект, заключающийся в стимулировании интенсивности свечения при низких концентрациях действующих агентов и ее ингибировании при их дальнейшем увеличении, также был продемонстрирован. При этом по степени убывания стимулирующего и возрастанию ингибирующего эффектов исследуемые анионы формировали ряд СГ —► Вг" —» Г На этом фоне некоторой особенностью характеризовались эффекты F", которые в системах in vivo могли быть сведены только к быстрому и выраженному подавлению биолюминесценции В то же время при проведении подобного исследования в системе in vitro по степени убывания стимулирующего и возрастанию ингибирующего эффектов исследуемые анионы формировали полный ряд F" —» СГ —> Вг' —> Г, демонстрирующий существовании зависимости результата действия галогенидов на биолюминесценцию от их атомной массы

При исследовании эффектов сульфатов на биолюминесценцию Р phosphoreum «Микробиосенсор B-17 677f» и Е coli «Эколюм-9» двухфазный характер люминесцентного отклика люминесцирующих биосенсоров также сохранялся, однако параметры стимулирования и ингибирования свечения имели ряд количественных различий Последние заключались в росте значений молярных концентраций солей, при которых регистрировался максимум биолюминесценции, что, сопровождалось соответствующим увеличением концентрации сульфатов, вызывающей снижение интенсивности свечения до 50 % от контрольных значений В частности, по сравнению с MgCl2 значения концентрации MgS04, при которой регистрировался максимум свечения, сдвигались с 0 60 ± 0 03 до > 1 00 М при использовании Р phosphoreum и с 0 05 ± 0 01 до 0 08 ± 0 01 М при использовании Е coli В качестве же основной причины меньшего активирующего и ингибирующего эффекта сульфатов по сравнению с хлоридами мы склонны рассматривать более низкие константы их диссоциации в водных растворах, в результате чего достижение идентичной активности катионов оказывается возможным при больших абсолютных молярных концентрациях

Особенностью эффекта карбонатов и гидрокарбонатов Na+ и К+ явился их выраженный ингибирующий эффект на уровень биолюминесценции обоих использованных биосенсоров, формируемый уже при низких молярных концентрациях подобных солей При этом если Р phosphoreum реагировал падением свечения до уровня фона во всем диапазоне исследованных концентраций, то использование рекомбинантного штамма Е coli позволило зафиксировать некоторые детали подобного воздействия, заключающиеся в том, что аналогичные по аниону соли Na+ характеризовались более низкими значениями ЕС50, чем соли К+, а карбонаты оказывали на уровень биолюминесценции более выраженный ингибирующий эффект, чем гидрокарбонаты В свою очередь более быстрое и полное по сравнению с Е coli ингибирование свечения Р phosphoreum в экспериментальных условиях может

объясняться отсутствием в среде достаточного количества ионов Иа+, являющегося ключевым в поддержании рН-гомеостаза у морских микроорганизмов в щелочных условиях

В качестве основного механизма, обусловливающего столь драматическое падение интенсивности свечения микробных биосенсоров, нами предполагается выраженный сдвиг внеклеточного рН в сторону высоких значений, ведущий к резкому падению значения трансмембранного электрохимического градиента Однако проведенные спектрофлуориметрические измерения не позволили связать регистрируемые изменения свечения с истощением внутриклеточного пула ИАБН Более того, содержание ЫАБН возрастало в клетках, обработанных высокими концентрациями ЫаС1 и №НС03, что может объясняться его невостребованностью в энергетическом обеспечении люминесцентной системы в подобных экспериментальных условиях

При интегральной оценке всего комплекса причин, способных оказать влияние на уровень бактериальной биолюминесценции в присутствии минеральных вод, с использованием процедуры факторного анализа была оценена зависимость данного параметра от особенностей их компонентного состава, определяемого присутствием катионов Иа+, К+, М§2+, Са2+ и анионов СГ, 8042", НС03", а также уровнями общей минерализации и рН

При этом наиболее значимым, определяющим 56 42 % дисперсии анализируемой выборки, явился фактор, интегрирующий в себе высокие значения всех названых характеристик, демонстрирующих в этом случае высокие положительные значения факторных нагрузок В структуру данного фактора входили как общий уровень минерализации исследуемых вод (значение факторной нагрузки ФН = + 0 99), так и лежащее в его основе абсолютное содержание отдельных анализируемых катионов и анионов (ФН от + 0 39 до + О 93) Высокое значение факторной нагрузки было продемонстрировано и для показателя, численно характеризующего рН исследуемых вод (ФН = + 0 89) С другой стороны, структура данного фактора дополнялась выраженными отрицательными значениями ФН для биолюминесцентных индексов, зарегистрированных как с использованием «Микробиосенсора В-17 6776> (ФН = - О 53), так и «Эколюм-9» (ФН = - 0 95)

Рассчитанная на данной основе зависимость значения биолюминесцентного индекса (БЛИ) от особенностей компонентного состава исследуемых вод могла быть выражена уравнением вида

БЛИ = 2 59 - 0 56[Мин] - 0 22рН + О 43[НС03'] + 0 48[8042+] + 0 44[СГ] + О 80[Са2+] + О 99[М£2+] + О 70[К++№+], (1)

где уровень общей минерализации и абсолютные концентрации отдельных катионов и анионов приведены в г/л, а уровень рН в отн ед

Однако, оценка матрицы парных коэффициентов корреляции заставила констатировать существование множества значимых взаимосвязей между анализируемыми параметрами, по абсолютной величине превосходящих 0 7-0 8 и свидетельствующих о существовании феномена мультиколлинеарности и предположительно определяемой взаимозависимостями миграции солей в

раствор при формировании природной минерализации вод Следствием этого стало снижение точности модели, численная неустойчивость оценок к незначительным изменениям исходных данных, что, в целом, свидетельствовало

0 ее неадекватности

После устранения мультиколлинеарности уравнение принимало вид

БЛИ = 3 82 - 0 02[Мин] - 0 37рН, (2)

что позволило существенно упростить математическую модель, зафиксировав значимое влияние на уровень биолюминесценции бактериального биосенсора только для параметров общей минерализации и рН, при общем обратном характере зависимости уровня свечения от указанных параметров При этом последующий расчет коэффициента детерминации подтвердил адекватность описанной выше регрессии, объясняющей 79 % вариаций уровня свечения бактериальных биосенсоров (вероятность незначимости модели - критерий Б =

1 19 * 10'7) при сохранении 21 % за неучтенными в модели параметрами

В свете полученных данных причинно-следственные связи, ведущие к выраженному ингибирующему эффекту ряда минеральных вод на уровень биолюминесценции природного и рекомбинантного микробных биосенсоров, определяются двумя основными факторами Первый из них обеспечивается присутствием в них гидрокарбонатов, определяющих высокие (щелочные) значения рН и нарушающих биоэнергетику бактериальных клеток Второй связан с высокой минерализацией ряда исследованных вод, по содержанию некоторых катионов превышающих определенные нами значения ЕС50

Полученные результаты открывают возможности для обоснования подходов к адаптации процедуры биолюминесцентного анализа для целей биотестирования минеральных вод При этом ключевым моментом представляется необходимость проведения определенной подготовки анализируемых проб с учетом условий, способных оказать влияние на результат анализа

Решение подобной задачи было начато нами с коррекции параметра общего содержания солей, способных оказать влияние на результат биотестирования При этом последнее оказывалось возможным в рамках технологии с использованием «Микробиосенсора В-17 6776>, предусматривающей создание в пробе 3 % концентрации ИаС! безотносительно ее исходной минерализации Предлагаемый же подход заключался в дифференцированном внесении данной соли, так чтобы аналогичное содержание минеральных веществ 30 г/л в анализируемых пробах формировалось и за счет их исходного солевого состава

Проведение исследований в этом направлении позволило констатировать возможность частичной коррекции результатов биолюминесцентного анализа с ростом значений определяемых индексов, что позволило снизить определяемые значения БЛИ до величин ± 20 % от контрольных значенийу 15 из 23 исследуемых минеральных вод и до значений БЛИ ± 20 - 50 % от контрольных значений у 7 из 23 исследуемых минеральных вод (таблица 1) Однако, наибольший эффект в данном случае был достигнут в отношении слабо- и

некоторых среднеминерализованных вод, тогда как высокоминерализованные воды продолжали оказывать на уровень свечения микробных люминесцирующих биосенсоров ингибирующее воздействие. В результате график, описывающий характер регрессионной зависимости «исходная минерализация -биолюминесценция» имел общую тенденцию к подъему в зону «допустимых» значений (рисунок 2).

БЛИ

Рисунок 2. Графики регрессионных зависимостей биолюминесцентного индекса (БЛИ) «Микробиоеенсора В-17 (>77Ь> от уровня общей минерализации (г/л) исследуемых вод

1 - тестированные по обычной методике (Ж);

2 - тестированные с внесением дополнительных количеств ]МаС1 дифференцированно от исходной минерализации до конечного значения 30 г/л (■).

адаптации процедуры целей заключалось в

0 2 4 6 8 10 12 14 Концентрация, г/л

Второе возможное решение задачи биолюминесцентного анализа для заявленных нормализации значений pH исследуемых минеральных вод со смещением последних в зону нейтральных значений. При этом подобный подход, применимый как при использовании «Микробиоеенсора В-17 677f», так и «Эколюма-9», был реализован путем контролируемого добавления к исследуемым образцам 0.01 н раствора HCl с пошаговым повышением регистрируемого значения pH на 0.5 ед.

Полученные в этом случае результаты позволили констатировать, что использование подобного подхода в первую очередь сказывается на результатах биолюминесцентного тестирования средне- и сильноминерализованных вод. В частности снижение pH до 8.0 поднимало значения биолюминесцентных индексов большинства сильноминерализованных вод до уровня > 0.5, что позволяло снять их оценку как «сильно токсичных», а дальнейшая коррекция pH до 7.5 переводила БЛИ в полосу значений ± 20 % от контроля, соответствующую критерию отсутствия биотоксичности (таблица 1). Сходная тенденция изменения биолюминесцентных индексов была зарегистрирована и при исследовании среднеминерализованных вод Apollinaris, Vichy Celestins, Ессентуки-2, отличающаяся лишь тем, что восстановление интенсивности свечения используемых бактериальных биосенсоров происходило при менее значимой

коррекции рН (в среднем на 0.5 ед). Дальнейшее же снижение рН до нейтральных значений результировалась в подъеме значений биолюминесцентных индексов до уровня > 1.2, что было избыточным по отношению к поставленной цели (Рисунок 3).

БЛИ

2 -

1,6 -1,4 1,2 1

0,8 0,6 0,4 0,2 0

-Y

(а)

6,5 7 7,5 8

,5 9 9,5

рн

7 7.5 8 8,5 9 9,5

рн

Рисунок 3. Влияние pH на биолюминесценцию биосенсора «Эколюм-9» при анализе некоторых слабоминерализованных (а), среднсминерализованных (б) и сильноминерализованных (в) минеральных вод

1 - Архыз, 2 - Perrier, 3 - Святой источник, 4 - San Pellegrino, 5 - Evian, 6 - Боржоми. 7 -Apollinaris, 8 - Vichy Celestins, 9 - Ессентуки-2, 10 - Нарзан, 11 - Donat, 12 - Ессентуки-17. 13 -Ессентуки-4.

Таким образом, оптимальным значением рН, при достижении которого нивелируется отрицательное влияние данного фактора на уровень биолюминесценции бактериальных биосенсоров, является значение рН = 7.5. В результате коррекции данного параметра 22 из 23 изученных вод (таблица 1) были оценены как нетоксичные, что приводит данные биолюминесцентного биотестирования в соответствие с результатами их химического анализа (в соответствии с СанПиН 2.1.4.1116-02).

На этом фоне существенными особенностями характеризовались результаты биолюминесцентного тестирования среднеминерализованной воды Боржоми (рисунок 36), в исходном варианте также как и прочие подобные минеральные воды вызывающей выраженное тушение свечения бактериальных биосенсоров. Однако, в отличие от них, пошаговое снижение рН не сопровождалось описанным выше ростом биолюминесцентных индексов, во всем исследованном диапазоне сохранявшихся на уровне 0.26 ± 0.03. Соответственно, подобный результат заставляет оценивать изученный образец минеральной воды Боржоми как сильно токсичный, что согласуется с

имеющимися у Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека РФ претензиями по ее качеству Одновременно подобное наблюдение свидетельствует в пользу возможности выявления истинных токсикантов в составе минеральных вод после предлагаемой пробоподготовки

С целью получения другого доказательства адекватности предлагаемого подхода, направленного на исключение ингибирующих эффектов нормального компонентного состава минеральных вод на люминесцирующие биосенсоры с сохранением чувствительности последних к воздействию истинных поллютантов, на нами было проведено тестирование образцов сильноминерализованной воды Ессентуки-17, в которые предварительно были внесены органическое соединение бензол или соль тяжелого металла Сг6+

В частности, определенные для бензола параметры ЕС2о и ЕС50 составили 3 10 ± 0 32 и 5 20 ± 0 54 г/л (Таблица 3) В то же время при проведении аналогичных экспериментов с растворами бензола в минеральной воде Ессентуки-17 названные расчетные параметры оказывались значительно ниже, что объяснялось тушением люминесценции бактериальных биосенсоров не только как результата воздействия поллютанта, но и вследствие эффекта нормальных компонентов данной минеральной воды В свою очередь пошаговое снижение значений рН результировалось в синхронном повышении значений определяемых параметров, из которых ЕС50 достигал нормативных величин при рН = 8 0, а ЕС20 при рН = 7 5

Таблица 3

Результаты биолюминесцентного тестирования минеральной воды Ессентуки-17 с экзогенно внесенными поллютантами (бензол и Сг6^, проведенные в при различных значениях рН_

В минеральной воде Ессентуки-17 с различным уровнем рН

Полютант Параметр Контроль Исходный = 95 90 85 80 75 70

Бензол, г/л ЕСго 3 10 ±0 32 0 15 ±0 02 *** 0 20 ± 0 02 0 65 ±0 07 *** *** 2 00 ± 0 28 5 20 ± 0 60 „ Л ¿3 ± 0 .30

ЕС50 5 20 ± 0 54 030±003 *** 0 50± 0 04 2 70 ± 0 31 *** ** 3 70± 0 41 5 50 ± 0 56 6 75±072

К.2Сг207, мг/л ЕС20 0 25 ± 0 03 - 4 15 ±0 50 2 90 ±0 40 *** *** 235Д032 030±030 02^002

ЕС50 0 50 ± 0 06 - 4 70 ±0 45 3 30 ±0 42 *** *** 2 29 о 65 ± 0 70 0 45 ± 0 05

* - Р < 0 05, ** - Р < 0 01, *** - Р < 0 001 от нормативных значений

Особенностью воздействия Сг6+ (в виде соли К2Сг207) на биосенсор «Эколюм-9» являлась выраженная стимуляция его свечения, в результате чего определяемые параметры ЕС20 и ЕС50 были зафиксированы на уровне 0 25 ± 0 03 и 0 50 ± 0 06 мг/л соответственно (Таблица 3) На этом фоне испытание раствора бихромата калия в минеральной воде Ессентуки-17 вело к развитию альтернативных эффектов, заключающихся не в стимуляции, но в выраженном тушении свечения, определяемых действием не поллютанта, а растворителя В свою очередь пошаговое снижение значений рН результировалось в нормализации первично завышенных величин ЕС20 и ЕС50, достигающих контрольных значений ЕС20 и ЕС50 при уровне рН = 7 5

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют в пользу возможности адаптации рутинной процедуры биолюминесцентного анализа для биотестирования минеральных вод, заключающейся в проведении определенной подготовки анализируемых проб, направленной на устранение основных причин, способных исказить результаты исследования с одновременным сохранением чувствительности к «истинным» токсикантам

Предлагаемый алгоритм действий (рисунок 4) включает первичную дегазацию исследуемых вод с последующим определением их минерального состава и уровня рН В зависимости от полученных результатов принимается решение о не проведении (вариант 1) или проведении (вариант 2) дополнительной пробоподготовки

Рисунок 4 - Алгоритм проведения исследования биотоксичности питьевых минеральных вод с помощью люминесцирующих биосенсоров

При выполнении действий по второму варианту наиболее универсальным и эффективным действием является контролируемое снижение значений рН в анализируемых пробах до уровня = 7 5, что позволяет устранить негативное влияние данного параметра на уровень биолюминесценции как природного люминесцирующего микроорганизма «Микробиосенсор В-17 6776>, так и рекомбинантного биосенсора «Эколюм-9» В случае же использования «Микробиосенсора В-17 6776> предпочтительным представляется сочетание подобного подхода с дифференцированным (в зависимости от исходной минерализации) внесением в анализируемые пробы дополнительных количеств №С1 до конечной концентрации 30 г/л, что обеспечивает наибольшую

стандартизацию процедуры биотестирования, а также нивелирует солевой эффект, способный оказать дополнительное воздействие на уровень рН

Предложенный алгоритм биотестирования минеральных вод поддерживается разработанной нами компьютерной программой «Прогнозирование результатов биолюминесцентного тестирования питьевых минеральных вод с использованием бактериального биосенсора «Эколюм»

При этом значение последней заключается в том, что она 1) позволяет прогнозировать значения биолюминесцентного индекса в зависимости от индивидуального солевого состава и рН исследуемых вод, 2) в случае прогноза выраженного влияния нормального компонентного состава минеральной воды на результат ее биолюминесцентного биотестирования выдавать рекомендации по проведению пробоподготовки, позволяющей снизить эффект подобного воздействия, 3) осуществляет расчет ожидаемых после проведения пробоподготовки значений биолюминесцентного индекса

Кроме того, в эту программу интегрированы методические рекомендации «Методика экспрессного определения токсичности питьевых минеральных бутилированных вод с помощью люминесцентных бактериальных биосенсоров» (утверждены 27 08 2007г ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Оренбургской области») Данные методические рекомендации содержат подробное описание адаптированной технологии биолюминесцентного анализа минеральных вод и предназначены для использования специалистами ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» и ТУ Роспотребнадзора, при решении вопросов оценки качества продуктов питания с целью выявления их потенциальной опасности для здоровья человека, а также в Программах производственного контроля на предприятиях-изготовителях, осуществляющих внутренний контроль качества питьевых минеральных вод

Выводы:

1 При соответствии санитарным нормам минеральные воды оказывают на уровень свечения люминесцирующих бактериальных биосенсоров выраженное ингибирующее воздействие, имитирующее эффект химических поллютантов и возрастающее в ряду «слабоминерализованные воды —> среднеминерализованные воды —> сильноминерализованные воды»

2 Для основных входящих в состав минеральных вод катионов продемонстрирован двухфазный дозозависимый эффект на интенсивность бактериальной биолюминесценции, заключающийся в ее стимуляции в присутствии малых и ингибиции в присутствии высоких концентраций По способности к подавлению свечения, характеризуемой величиной ЕС50, катионы формируют ряд Са2+ > Na+ > Mg2+ > К+ Абсолютные значения ЕС50 зависят от экологических особенностей люминесцирующих бактерий и оказываются выше для природного морского микроорганизма Photobacterium phosphoreum «Микробиосенсор В-17 677f» по сравнению с рекомбинантным штаммом Escherichia coh «Эколюм-9», несущим гены свечения Photobacterium leiognathi

3 Эффект основных входящих в состав минеральных вод анионов зависит от их химической природы у галогенидов связан с молекулярной массой и изменяется в ряду СГ —> Br" —* I", у сульфатов реализуется через влияние на уровень диссоциации солей, у карбонатов и гидрокарбонатов определяется сдвигом рН среды в зону высоких (щелочных) значений

4 В качестве основных механизмов влияния ионов на уровень бактериальной люминесценции идентифицированы прямое воздействие на активность ферментной системы генерации свечения, а также на процессы трансмембранного переноса катионов

5 Разработана математическая модель, описывающая зависимость результатов биолюминесцентного биотестирования минеральных вод от их компонентного состава, в соответствии с которой основными причинами, способными оказать искажающее влияние на результаты исследования, являются высокий уровень минерализации и высокие (щелочные) значения рН

6 Для устранения эффекта минерализации предложено дифференцированное (зависящее от исходного содержания солей) внесение в анализируемые пробы дополнительных количеств NaCl до конечной концентрации 30 г/л, реализуемое при использовании «Микробиосенсора В-17 677f» и позволяющее достичь восстановления свечения в случае тестирования слабо- и среднеминерализованных вод

7 Контролируемый сдвиг значений рН исследуемых минеральных вод до значений = 75 является наиболее универсальным действием, позволяющем восстановить интенсивность свечения люминесцентных биосенсоров при сохранении их чувствительности к действию истинных химических поллютантов

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1 Алешина Е С Особенности люминесцентного биотестирования минеральны вод // Докл Московского общества испытателей природы Т 39 Биотехнология охране окружающей среды -М,2006 - С 201

2. Дерябин Д.Г., Алешина Е.С. Влияние катионов К+, Na+, Mg2+, Са2+ п активность бактериальных биолюминесцентных систем in vitro и in vivo II Вестни Оренбургского гос. ун-та. - 2006. - № 62. - С. 77-82.

3 Алешина Е С Оценка влияния минеральных солей на уровень бактериально биолюминесценции построение регрессионной модели в условия мультиколлинеарности // Матер электр конференции «Информационн вычислительные технологии в науке» - М, 2007 - С 1 (http //www ívtn ru/2007/biomedchem/enter/paper php9p=657)

4 Aleshina E Various effects of protonophore - carbonyl cyanide chlorophenylhydrazone on natural and recombinant luminescent bacteria // The youn scientists' and students' international scientific conference «Modern problems of microbiolo and biotechnology» - Odesa Astropnnt, 2007 -P 14

5 Дерябин Д.Г., Алешина E.C. Влияние галогенидов на интенсивност бактериальной биолюминесценции in vitro и in vivo II Вестник Оренбургского го ун-та. - 2007. - № 75. - С. 111-114.

6 Алешина ЕС Особенности использования люминесцирующих биосенсоро для оценки качества минеральных вод // Матер 11-ой междунар школы-конференци молодых ученых «Биология - наука XXI века» -Пущино, 2007 - С 180

7 Алешина Е С Биотестирование минеральных вод с использование люминесцентных микроорганизмов // Матер региональной научной конференци молодых ученых «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии» Пермь, 2007 - С 33-34

8. Дерябин Д.Г., Алешина Е.С. Способ определения биотоксичност питьевых минеральных вод // Положительное решение формальной экспертиз ФИПС по заявке на изобретение № 2007129999/13 от 06.08.2007г.

9 Дерябин ДГ, Алешина Е С Методика экспрессного определения токсичност питьевых минеральных бутилированных вод с помощью люминесцентны бактериальных биосенсоров // Методические рекомендации ФГУЗ «Центр гигиены эпидемиологии в Оренбургской области» от 27 08 2007 - 24с

10. Дерябин Д.Г., Алешина Е.С. Влияние солей на уровень свечени природных и рекомбинантных люминесцирующих бактериальных биосенсоров Прикл. биохим. и микробиол. - 2008. - Т. 44.-JY» 3. - С. 324-329.

11. Дерябин Д.Г., Алешина Е.С. Применение природных и рекомбинантны люминесцирующих микроорганизмов для биотестирования минеральных вод Прикл. биохим. и микробиол. - 2008. - Т. 44. - № 4. - С. 417-421.

12. Дерябин Д.Г., Алешина Е.С. Адаптация биолюминесцентного анализа дл оценки биотоксичности минеральных вод // Гигиена и санитария. - 2008. - № 4. С. 83-87.

13. Дерябин Д.Г., Алешина Е.С., Болодурина И.П., Корнейченко Д. Универсальная компьютерная программа «Прогнозирование результате биолюминесцентного тестирования питьевых минеральных вод с использование бактериального биосенсора «Эколюм» // Свидетельство о гос. регистраци программы для ЭВМ № 2008611380 от 19.03.2008г.

Лицензия № ЛР020716 от 02 11 98 Формат 60x84 '/16 Бумага офисная Уел печ листов 1,2 Тираж 100 Заказ 505

ИПК ГОУ ОГУ 460352, г Оренбург, ГСП, пр Победы, 13 Государственное образовательное учреждение «Оренбургский государственный университет»

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Алешина, Елена Сергеевна

Введение.

Глава 1 - Обзор литературы.

1.1 - Люминесцирующие бактерии: систематика, экология, молекулярно-генетическая характеристика.

1.2 - Прикладные аспекты использования бактериальной биолюминесценции.

Глава 2 - Материалы и методы исследований.

2.1 - Используемые биолюминесцентные системы.

2.1.1 — Природный и рекомбинантный люминесцирующие бактериальные биосенсоры.

2.1.2 - Ферментная система генерации свечения.

2.2 - Исследованные минеральные воды.

2.2.1 - Общая характеристика минеральных вод.

2.2.2 - Методы исследования ионного состава минеральных вод

2.3 - Методы биолюминесцентного биотестирования.

2.3.1 — Биотестирование с использованием бактериального биосенсора «Микробиосенсор В-17 677f».

2.3.2 — Биотестирование с использованием бактериального биосенсора «Эколюм-9».

2.3.3 — Исследование с использованием комплекта реактивов для биолюминесцентного анализа (КРАБ).

2.3.4 - Регистрация биолюминесценции используемых бактериальных биосенсоров и ферментной системы генерации свечения.

2.3.5 - Обработка, оценка и оформление результатов.

2.4 - Дополнительные методы исследования.

2.5 - Методы статистической обработки результатов и математического моделирования.

Глава 3 - Исследование биотоксичности бутилированных минеральных вод с использованием традиционных методов биолюминесцентного анализа.

Глава 4 - Экспериментальное изучение влияния основных, входящих в состав минеральных вод, катионов и анионов на уровень свечения люминесцирующих микроорганизмов и ферментной системы генерации свечения.

4.1 — Исследование эффектов катионов К+, Na+, Mg2+ или Са2+ на бактериальную биолюминесценцию in vivo и in vitro.

4.2 — Изучение влияния галогенидов, сульфатов, гидрокарбонатов и карбонатов на биолюминесценцию in vitro и in vivo.

Глава 5 - Разработка подходов к адаптации биолюминесцентного анализа для оценки биотоксичности минеральных вод.

5.1 - Идентификация причин, определяющих эффекты минеральных вод в отношении люминесцирующих бактериальных биосенсоров.

5.2 - Адаптация биолюминесцентного анализа для оценки биотоксичности минеральных вод.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Использование люминесцирующих микроорганизмов для биотестирования минеральных вод"

Общая характеристика работы

Актуальность темы исследования

Бактериальные люминесцирующие биосенсоры в настоящее время стали одним из распространенных инструментов оценки качества питьевых, поверхностных, грунтовых и сточных вод [1,2]. В основу их практического использования положен анализ активности люминесцентной системы, находящейся на пересечении основных энергетических потоков микробной клетки и потому интегрально отвечающей на всю совокупность присутствующих в среде поллютантов [3,4].

В отличие от методов химического анализа, ориентированных на количественную оценку присутствия в исследуемых водах отдельных веществ с последующим сравнением выявляемых концентраций с нормативными значениями - предельно допустимыми концентрациями (ПДК), биолюминесцентный анализ не позволяет оценить природу загрязнения, но дает возможность получить комплексное представление о степени его биологической опасности, характеризуемой понятием «биотоксичность» [5,6]. При этом наряду с относительной дешевизной, быстродействием и высокой чувствительностью, важным достоинством микробных люминесцирующих биосенсоров является хорошая корреляция получаемых результатов с реальной степенью опасности для здоровья человека [7], а также возможность оценки веществ и соединений, для которых методы выявления и значения ПДК пока не разработаны [8].

Одним из перспективных направлений расширения сферы биолюминесцентного анализа является его использование для оценки качества питьевых минеральных вод, традиционно используемых в качестве компонента лечебно-профилактического питания. А в настоящее время получающих все большее распространение в качестве альтернативы централизованному водоснабжению. Однако, накапливающиеся данные о возможном влиянии на бактериальную биолюминесценцию не только токсических, но и нормальных компонентов минеральных вод -растворенных газов, катионов [9,10] и анионов [11,12], делают прямой перенос существующих технологий биотестирования на подобные объекты неочевидным.

Основные задачи исследования

1. Изучить возможности и ограничения биолюминесцентного анализа при проведении биотестирования питьевых минеральных вод.

2. Определить основные присутствующие в составе питьевых минеральных вод факторы, способные оказать влияние на уровень свечения бактериальных биосенсоров.

3. Разработать адаптированный метод биолюминесцентного биотестирования минеральных вод, позволяющий исключить влияние их нормального компонентного состава на результаты исследования.

Научная новизна исследования

Установлена невозможность использования традиционных подходов к проведению биолюминесцентного анализа для оценки качества биотоксичности) минеральных вод. В качестве основной причины подобной ситуации идентифицирован газовый и солевой компонентный состав минеральных вод, способный оказать на уровень свечения бактериальных биосенсоров выраженное ингибирующее действие, имитирующее эффект химических поллютантов.

При изучении эффекта основных солей, входящих в состав минеральных вод, продемонстрированы особенности реагирования бактериальных биосенсоров в присутствии различных катионов и анионов. При этом для катионов показан двухфазный (индукция/ингибирование) дозозависимый эффект, в рамках которого по способности к подавлению свечения они формировали ряд Са2+ > Na+ > Mg2+ > К+. Установлено, что абсолютные значения концентраций солей, вызывающих стимуляцию или ингибирование свечения, зависят от экологических особенностей используемых люминесцирующих микроорганизмов и оказываются выше для природного морского штамма Photobacterium phosphoreum («Микробиосенсор В-17 677f») по сравнению с рекомбинантным штаммом Escherichia coli с клонированным /г/х-опероном Photobacterium leiognathi («Эколюм-9»). На этом фоне эффекты анионов, также оказывающих на интенсивность бактериальной биолюминесценции разнонаправленные дозозависимые эффекты, определяются их химической природой и реализовываются через взаимодействие с ферментной системой генерации свечения (галогениды), влияние на растворимость солей (сульфаты) или изменение уровня рН среды (карбонаты и гидрокарбонаты).

Построена математическая модель, описывающая зависимость результатов биолюминесцентного анализа минеральных вод от их компонентного состава, которая после устранения мультиколлинеарности приобретала вид Б ЛИ = 3.82 - 0.02[Мин] - 0.3 7рН, где Б ЛИ - значения регистрируемого биолюминесцентного индекса, Мин - уровень общей минерализации в г/л, а рН в отн.ед.

Практическая значимость работы

Полученные результаты позволили обосновать подходы к проведению биотестирования минеральных вод с использованием люминесцирующих микроорганизмов, исключающие влияние их нормального компонентного состава на результаты исследования. Предложенная пробоподготовка включает последовательную дегазацию, дифференцированную (зависящую от исходного солевого состава) минерализацию и нормализацию рН исследуемых вод, что позволяет восстановить уровень свечения бактериальных биосенсоров с сохранением их чувствительности к действию химических поллютантов. Приоритет подобного подхода закреплен «Способом определения биотоксичности питьевых минеральных вод» (положительное решение формальной экспертизы ФИПС по заявке на изобретение № 32007129999/13 от 06.08.2007г.).

На данной основе разработаны и внедрены методические рекомендации «Методика экспрессного определения токсичности питьевых бутилированных минеральных вод с помощью люминесцентных бактериальных биосенсоров» (утверждены 27.08.2007 г.), предназначенные для использования специалистами ФГУЗ «Центра гигиены и эпидемиологии» и ТУ Роспотребнадзора, решающими вопросы оценки качества продуктов питания с целью выявления их потенциальной опасности для здоровья человека.

Реализация предложенного алгоритма результатов биолюминесцентного тестирования питьевых минеральных вод заключена в компьютерной программе «Прогнозирование результатов биолюминесцентного тестирования питьевых минеральных вод с использованием бактериального биосенсора «Эколюм» (свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2008611380 от 19.03.2008 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Установлена невозможность использования традиционного варианта биолюминесцентного анализа для оценки качества минеральных вод, определяемая выраженным влиянием их нормального компонентного состава на уровень свечения бактериальных биосенсоров.

2. В качестве основных факторов, оказывающих негативное влияние на результаты биолюминесцентного биотестирования, идентифицированы газовый и солевой компонентный состав исследуемых минеральных вод, а также определяемый этим уровень минерализации и рН.

Разработана адаптированная процедура проведения биолюминесцентного биотестирования минеральных вод, позволяющая восстановить интенсивность свечения бактериальных биосенсоров с сохранением их чувствительности к истинным химическим поллютантам.

Связь автора с научными программами и собственный вклад автора в исследования

Научные положения диссертации и выводы полностью базируются па результатах собственных исследований автора.

Апробация работы

Отдельные фрагменты работы доложены и обсуждены на IV Международной научной конференции «Биотехнология - охране окружающей среды» (Москва, 2006), II Международной научно-практической конференции «Биоэлементы» (Оренбург, 2007), Всероссийской электронной конференции «Информационно-вычислительные технологии в науке» (Москва, 2007), Международной научной конференции «Modern problems of microbiology and biotechnology» (Одесса, 2007), III Всероссийской научно- практической конференции «Проблемы экологии Южного Урала» (Оренбург, 2007), 11-ой международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2007), Региональной научной конференции молодых ученых «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии» (Пермь, 2007).

Структура и объем диссертации

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Алешина, Елена Сергеевна

Выводы:

1. При соответствии санитарным нормам минеральные воды оказывают на уровень свечения люминесцирующих бактериальных биосенсоров выраженное ингибирующее воздействие, имитирующее эффект химических поллютантов и возрастающее в ряду «слабоминерализованные воды —> среднеминерализованные воды —> сильноминерализованные воды».

2. Для основных входящих в состав минеральных вод катионов продемонстрирован двухфазный дозозависимый эффект на интенсивность бактериальной биолюминесценции, заключающийся в ее стимуляции в присутствии малых и ингибиции в присутствии высоких концентраций. По способности к подавлению свечения, характеризуемой величиной ЕС50, катионы формируют ряд Са2+ > Na+ > Mg2+ > К+. Абсолютные значения ЕС50 зависят от экологических особенностей люминесцирующих бактерий и оказываются выше для природного морского микроорганизма Photobacterium phosphoreum «Микробиосенсор В-17 677f» по сравнению с рекомбинантным штаммом Escherichia coli «Эколюм-9», несущим гены свечения Photobacterium leiognathi.

3. Эффект основных входящих в состав минеральных вод анионов зависит от их химической природы: у галогенидов связан с молекулярной массой и изменяется в ряду СГ —> Br" —> I", у сульфатов реализуется через влияние на уровень диссоциации солей, у карбонатов и гидрокарбонатов определяется сдвигом рН среды в зону высоких (щелочных) значений.

4. В качестве основных механизмов влияния ионов на уровень бактериальной люминесценции идентифицированы прямое воздействие на активность ферментной системы генерации свечения, а также на процессы трансмембранного переноса катионов.

5. Разработана математическая модель, описывающая зависимость результатов биолюминесцентного биотестирования минеральных вод от их компонентного состава, в соответствии с которой основными причинами, способными оказать искажающее влияние на результаты исследования, являются высокий уровень минерализации и высокие (щелочные) значения рН.

6. Для устранения эффекта минерализации предложено дифференцированное (зависящее от исходного содержания солей) внесение в анализируемые пробы дополнительных количеств NaCl до конечной концентрации 30 г/л, реализуемое при использовании «Микробиосенсора В-17 677f» и позволяющее достичь восстановления свечения в случае тестирования слабо- и среднеминерализованных вод.

7. Контролируемый сдвиг значений рН исследуемых минеральных вод до значений = 7.5 является наиболее универсальным действием, позволяющем восстановить интенсивность свечения люминесцентных биосенсоров при сохранении их чувствительности к действию истинных химических поллютантов.

Заключение

Биолюминесценция - одно из достаточно интересных и интенсивно разрабатываемых направлений в микробиологии. Многолетние исследования этого феномена позволили детально охарактеризовать систематику люминесцирующих бактерий, молекулярную организацию и генетический контроль бактериального свечения, а также значительный прогресс достигнут и в практическом использовании люминесцирующих бактерий при проведении биотестирования различных абиотических сред. При этом в основу подобных исследований положен анализ активности люминесцентной системы, отвечающей изменением интенсивности свечения, пропорциональным суммарному воздействию всей совокупности присутствующих химических поллютантов.

Биотестирование, основанное на микробиолюминесценции, применяется для определения качества (биотоксичности) различных сред: воздуха, почвы, поверхностных, грунтовых, сточных и пресных питьевых вод, фармацевтических препаратов, вновь создаваемых химических соединений. При этом данный метод отличается быстродействием, точностью, чувствительностью и простотой, позволяет контролировать одновременно значительное число токсикантов, а также позволяет сформировать интегральное представление об общем уровне опасности с возможностью прямой экстраполяции полученных данных на здоровье человека.

Однако попытки расширения спектра объектов для биолюминесцентного анализа за счет включения в него минеральных (не пресных) вод наталкиваются на существенные препятствия. Основным из них является выраженное влияние на бактериальную биолюминесценцию нормальных компонентов минеральных вод - катионов и анионов, способных имитировать эффекты химических токсикантов и, тем самым, искажать результаты биотестирования.

Приведенные данные определили актуальность изучения возможностей и ограничений биолюминесцентного анализа при проведении биотестирования минеральных вод, а также разработки модернизированной технологии его проведения, адаптированной к особенностям исследуемых объектов.

При проведении первого этапа исследования нами было протестировано 23 природных минеральных бутилированных вод, наиболее широко представленных на мировом и российском рынках. Установлено, что при соответствии действующим санитарным нормам по содержанию токсичных веществ и соединений изученные воды оказывали на уровень свечения как морского люминесцирующего микроорганизма P.phosphoreum («Микробиосенсор В-17 677f»), так и рекомбинантного штамма E.coli («Эколюм-9») выраженное ингибирующее действие, что в соответствии с действующими критериями заставляло оценивать данные воды как «токсичные».

Выполнение процедуры дегазации исследуемых минеральных вод позволило частично снизить определяемые значения их токсичности, что свидетельствовало о важности удаления из анализируемых вод С02, находящегося в растворенном состоянии в виде соединения Н2СОз.

В свою очередь после проведения процедуры дегазации развитие выраженных ингибирующих эффектов в отношении биолюминесценции использованных бактериальных биосенсоров преимущественно регистрировалось в группе средне- и среднеминерализованных минеральных вод при их отсутствии в группе слабоминерализованных вод, что ставит вопрос о природе подобной зависимости. При этом данные, полученные с использованием двух биосенсоров, хорошо коррелировали между собой, что свидетельствует в пользу универсальности причин, ведущих к формированию подобного люминесцентного отклика двух различных биосенсоров.

Полученные данные явились предпосылкой для анализа влияния

I | 2+ 2 катионов К , Na , Mg , Са и анионов СГ, S04 НСО3", I", F", Вг", на результаты биолюминесценетного тестирования с использованием двух биосенсоров P.phosphoreum «Микробиосенсор В-17 677f» и Е. coli «Эколюм-9» и выделенных из них ферментных систем генерации свечения.

Для основных входящих в состав минеральных вод катионов продемонстрирован двухфазный дозозависимый эффект на интенсивность бактериальной биолюминесценции, заключающийся в ее стимуляции в присутствии малых концентраций и ингибиции в присутствии высоких концентраций. По способности к подавлению свечения, характеризуемой величиной ЕС50, катионы формировали ряд Са2+ > Na+ > Mg2+ > К+. Абсолютные значения ЕС50 зависели от экологических особенностей люминесцирующих бактерий и были выше при использовании природного морского микроорганизма P.phosphoreum «Микробиосенсор В-17 677f» по сравнению с рекомбинантным штаммом E.coli «Эколюм-9», несущим гены свечения P.leiognathi.

Эффект основных входящих в состав минеральных вод анионов зависел от их химической природы: у галогенидов был связан с молекулярной массой и изменялся в ряду СГ> Br" > I", у сульфатов реализовывался через влияние на уровень диссоциации солей, у карбонатов и гидрокарбонатов определялся сдвигом рН среды в зону высоких значений.

В качестве основных механизмов влияния солей на уровень бактериальной люминесценции идентифицированы прямое воздействие на ферментную систему генерации свечения, а также на процессы трансмембранного переноса ионов, первое из которых наиболее значимо для «Эколюм-9», а второе для «Микробиосенсора В-17 677f».

Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о важном значении солевого состава минеральных вод в определении их эффекта на уровень свечения природных и рекомбинантных люминесцирующих биосенсоров, что в ряде случаев может вести к имитации эффектов химических поллютаитов. Соответственно, задача расширения сферы биолюминесцентного анализа на тестирование минеральных вод требует адаптации рутинной процедуры биотестирования с учетом условий, способных оказать влияние на результат анализа.

С помощью группы методов статистического анализа идентифицированы причины ингибирующего воздействия на люминесценцию использованных биосенсоров на основе P.phosphoreum «Микробиосенсор В-17 677f» и E.coli с клонированными генами люминесцентной системы P.leiognathi «Эколюм-9».

Установлено, что наиболее значимым является фактор, интегрирующий в себе высокие значения всех характеристик минеральных вод, при этом констатирован целый ряд достоверных связей «БЛИ - общая минерализация» и «БЛИ - рН». Результаты проведенного исследования позволили определить, что интенсивность тушения свечения биосенсора «Микробиосенсор В-17 677f» в большей степени зависит от влияния данных факторов, чем биосенсора «Эколюм-9». Таким образом, выявлены две причины, определяющие ингибирующий эффект ряда минеральных вод па уровень биолюминесценции биосенсоров - высокая минерализация и высокие значения рН.

На данной основе разработана адаптированная процедура биолюминесцентного анализа для тестирования биотоксичности минеральных вод, включающая коррекцию параметра общей минерализации (при использовании «Микробиосенсора В-17 677f») и нормализацию значений рН со смещением последних в зону нейтральных значений (для «Микробиосенсора В-17 677f» и «Эколюм-9»), Коррекция рН до уровня = 7.5 оказывается наиболее универсальным подходом вне зависимости от происхождения и природы использованных биосенсоров. В случае использования «Микробиосенсора В-17 677f» предпочтительным является сочетание подобного подхода с коррекцией минерализации до конечной концентрации 30 г/л.

Предложенный алгоритм биотестирования минеральных вод закреплен в методических рекомендациях «Методика экспрессного определения токсичности питьевых минеральных бутилированных вод с помощью люминесцентных бактериальных биосенсоров» и поддерживается разработанной нами программой «Прогнозирование результатов биолюминесцентного тестирования питьевых минеральных вод с использованием бактериального биосенсора «Эколюм», позволяющей прогнозировать результат анализа и выдавать рекомендации в случае прогноза выраженного влияния нормального компонентного состава минеральной воды на результат ее биолюмипесцентного биотестирования.

Проверка разработанного алгоритма биотестирования проведена путем моделирования наличия токсикантов в минеральной воде, что позволило подтвердить адекватность предлагаемого подхода, направленного на исключение неспецифических ингибирующих эффектов минеральных вод на люминесцирующие биосенсоры с сохранением чувствительности последних к воздействию истинных токсикантов.

В целом, результаты проведенного исследования позволяют сформулировать следующие основные положения:

3. Разработана адаптированная процедура проведения биолюминесцентного биотестирования минеральных вод, позволяющая восстановить интенсивность свечения бактериальных биосенсоров с сохранением их чувствительности к истинным химическим поллютантам.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Алешина, Елена Сергеевна, Оренбург

1. Belkin, S. Microbial whole-cell sensing systems of environmental pollutants Текст. / S. Belkin // Curr. Opin. Microbiol. 2003. - Vol. 6. - № 3. -P. 206-212.

2. Пшеничнов, P.А. Микробиолюминесценция (оптимизация сенсоров и расширение сферы использования реакции) Текст. / Р.А. Пшеничнов, И.Л. Масленникова, Н.М. Никитина Пермь: Перм.гос.техн.ун-т., 2005. - 76 с.

3. Кудряшова, Н.С. Физико-химические основы биолюминесцентного анализа Текст. / Н.С. Кудряшева, В.А. Кратасюк, Е.Н. Есимбекова. -Красноярск: КГУ, 2000. 154 с.

4. Nunes Halldorson, V.S. Bioluminescent bacteria: lux genes as environmental biosesors Текст. / V.S. Nunes - Halldorson, N.L. Duran // Braz. J. Microbiol. - 2003. - Vol. 34. - №. 2. - P. 91-96.

5. Kaiser, K.L.E. Regression and cluster analysis of the acute toxicity of 267 chemicals to six species of biota and the octanol/water partition coefficient Текст. / K.L.E. Kaiser, S.R. Esterby // Sci. Total. Environ. 1991. - Vol. 109-110.-P. 499-514.

6. Данилов, B.C. Расширение возможностей люминесцентного бактериального теста для анализа токсичности химических соединений / B.C. Данилов, Т.П. Юдина, Е.В. Сорокина. // Вестник ОГУ. 2007. -Специальный выпуск № 75. - С. 102-104.

7. Kaiser, K.L.E. Correlation of Vibrio fischeri bacteria test data with bioassay data for other organisms Текст. / K.L.E. Kaiser // Environ Health Perspect. 1998. Vol. 106. No. 2. P. 583-591.

8. Strachan, G. Use of bacterial biosensors to interpret the toxicity and mixture toxicity of herbicides in freshwater Текст. / G. Strachan, S. Preston, H. Maciel, A.J.R. Porter, G.I. Paton // Wat. Res. 2001. - Vol. 35. - №. 14. - P. 3490-3495.

9. Витухновская, JI.A. Влияние ионов Na+ и К+ на люминесцентную активность инактивных клеток Vibrio harveyi при различных рН Текст. / J1.A. Витухновская, А.Д. Исмаилов // Микробиология. 2001. -Том 70. - № 4. -С. 525-530.

10. О'Shea, Т.М. Magnesium promotes of Vibrio fischeri Текст. / T.M. О'Shea, C.R. DcLoney-Marino, S. Shibata, S.-I. Aizawa, A.J. Woife, K.L. Visick // Bacteriology. 2005. - Vol. 187. - №. 6. - P. 2058-2065.

11. Newman, M.C. Predicting relative toxicity and interactions of divalent metal ions: Micritox bioluminescence assay Текст. / M.C. Newman, G.T. McCloskey // Environmental Toxicology and Chemistry. — 1996. Vol. 15. - №. 3.-P. 275-281.

12. Бояидин, A.H. Зависимое от минеральных солей ингибирование свечения люминесцентного микроорганизма Escherichia coli Z905 Текст. / A.H. Бояндин, Л.Ю. Попова // Биофизика. 2001. Том 46. - № 2. - С. 251-255.

13. Campbell, А.К. Bioluminescence and chemiluminescence: fundamental and applied aspects Текст. / А.К. Campbell, L.J. Kricka, PE. Stanley. Wiley, Chichester, 1994.-P. 680.

14. Nealson, K.H. Bacterial bioluminescence: its control and ecological significance Текст. / K.H. Nealson, J.W. Hastings // Microbiological Rewiews. -1979.-Vol. 43.- №4. P. 496-518.

15. Cavallo, R.A. Culturable vibrios biodiversity in the Northern Ionian sea (Italian coasts) Текст. / R.A. Cavallo, L. Stabili // Scientia Marina. 2004. - Vol. 68. P. 23-29.

16. Cohn F. Letter to J. Penn which describes Micrococcus phosphoreum. Versameling van stucken betreffende het geneeskundig staats toerzich. 1878. — P. 126-130.

17. Ruby, E.G. Planktonic marine luminous bacteria: species distribution in the water column Текст. / E.G. Ruby, E.P. Greenberg, J.W. Hastings // Appl. Environ. Microbiol. 1980. - Vol. 39. - № 2. - P.302 - 306.

18. Sado, P. N. Isolation of luminescent bacteria from cooked seafood products. Dairy Текст. / P. N. Sado // Food and Environmental Sanitation. -1991.-Vol. 11. P. 361-363.

19. Makemson, J.C. Luminous bacteria cultured from fish guts in the Gulf of Oman Текст. / J.C. Makemson, G.V. Jr. Hermosa // Luminescence. 1999. -Vol. 14. -№ 3.-P. 161-168.

20. Ramesh, A. Role of luminous bacteria in chitin degradation in the intestine of fish Текст. / A Ramesh., V. K. Venugopalan // World Journal of Microbiology and Biotechnology. 1989.-Vol. 5.-№ 1.-P.55-59.

21. Boisvert, H. fitude d'un Photobacterium isolM de l'organe lumineux de poissons Leiognathidae Текст. / H. Boisvert, R. Chatelain, J.M. Bassot // Annales de l'lnstitut Pasteur (Paris). 1967. - Vol.112. - P. 520-524.

22. Ast, J.C Phylogenetic resolution and habitat specificity of the Photobacterium phosphoreum species group Текст. / J.C. Ast, P.V. Dunlap // Environmental Microbiology. 2005. - Vol. 7. - P. 1641-1654.

23. Lapota, D. Observations and measurements of planktonic bioluminescence in and around a milky sea Текст. / D. Lapota, C. Gait, J.R. Losee, H.D. Huddell, J.K. Orzech, K.H. Nealson // J. Mar. Exp. Mar. Biol. Ecol. -1988.-Vol. 119.-P. 55-81.

24. Miller, S.D. Detection of a bioluminescent milky sea from space Текст. / S.D. Miller, S.H.D. Haddock, C. Elvidge, T. F. Lee // Proc. Nat. Acad. Sci. -2005.-Vol. 102.-№40.-P. 14181-14184.

25. Herring, P. Marine microlights: the luminous marine bacteria Текст. / P. Herring // Microbiol. Today. 2002. - Vol. 29. - P. 174-176.

26. Nealson, K.H. Quorum sensing on a global scale: massive numbers of bioluminescent bacteria make milky seas Текст. / K.H. Nealson, J.W. Hastings // Appl. Environ. Microbiol. 2006. - Vol. 72. - № 4. - P.2295-2297

27. Austin, B. Vibrio harveyi: a significant pathogen of marine vertebrates and invertebrates Текст. / В. Austin, X-H. Zhang // Lett.Appl.Microbiol. 2006. -Vol. 43.-№2.-P. 119-124.

28. Montgomery, M.K. Late postembryonic development of the symbiotic light organ of euprymna scolopes (Cephalopoda: Sepiolidae) Текст. / M.K. Montgomery, M.J. McFall-Ngai // The Biological Bulletin. 1998. - Vol. 195. -Is. 3.-P. 326-336.

29. Lemus, J.D. Alterations in the Proteome of the Euprymna scolopes Light Organ in Response to Symbiotic Vibrio fischeri Текст. / J.D. Lemus, M.J. McFall-Ngai // Applied and Environmental Microbiology. 2000. - Vol. 66. - № 9.-P. 4091-4097.

30. Jones, B.W. Counterillumination in the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes Berry (Mollusca: Cephalopoda) Текст. / B.W. Jones, M.K. Nishiguchi//Marine Biology.-2004.-Vol. 144.-P. 1151-1155.

31. Kimbell, J.R. The Squid-Vibrio symbioses: from demes to genes Текст. / J.R. Kimbell, M.J. McFall-Ngai // Integr. Сотр. Biol. 2003. - № 43. - P. 254260.

32. Fidopiastis, P.M. A new niche for Vibrio logei, the predominant light organ symbiont of squids in the genus Sepiola Текст. / P.M. Fidopiastis, S. von Boletzlcy, E.G. Ruby//J.Bacteriol. 1998. - Vol.180.-№ 1.-P.59-64.

33. Jensen, M.J. Characterization of Alteromonas hanedai (sp. nov.), a nonfermentative luminous species of marine origin Текст. / M.J. Jensen, B.M. Tebo, P. Baumann, M. Mandel, K.H. Nealson // Curr. Microbiol. 1980. - Vol.3. -P. 311-315.

34. Poinar, G.O.Jr. Characteristics of the specific bacterium associated with Heterorhabditis bacteriophora (Heterorhabditidae: Rhabditida) Текст. / G.O.Jr. Poinar, G.M. Thomas, R. Hess // Nematologica. 1977. - Vol. 23. - P. 97-102.

35. Forst, S. Molecular biology of the symbiotic-patogenic bacteria Xenorhabdus spp. and Photorhabdus spp. Текст. / S. Forst, K. Nealson // Microbial. Rev. 1996. - Vol. 60. - № 1. - P.21-43.

36. Richardson, W. H. Identification of an anthraquinone pigment and a hydroxystilbene antibiotic from Xenorhabdus luminescens Текст. / W. H. Richardson, T.M. Schmidt, К. H. Nealson // Appl. Environ. Microbiol. 1988. -Vol. 54.-P. 1602-1605.

37. Bergey's manual of systematic bacteriology / ed. G.M. Garrity et al. 2nd edition, 2000.

38. Hastings, J.W. Bacterial bioluminescence Текст. / J.W. Hastings, K.H. Nealson // Ann. Rev. Microbiol. 1977. - Vol.31. - P.549-595.

39. Wilson, T. Bioluminescence Текст. / Т. Wilson, J.W. Hastings // Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 1998. - Vol. 14. - P.197-230.

40. Baldwin, Т.О. Structure of bacterial luciferase Текст. / Т.О. Baldwin, J.A. Christopher, F.M. Raushel, J.F. Sinclair, M.M. Ziegler, A.J. Fisher, I. Rayment//Curr. Opin. Struct. Biol. 1995. - V.5. -N6. -P.798-809

41. Hastings, J.W. Bacterial luciferase: FMNH2-aldehyde oxidase Текст. / J.W. Hastings, R.P. Presswood // Methods Enzymol. 1978. - Vol. 53. - P. 558570.

42. Baldwin, Т.О. Covalent structure of subunits of bacterial luciferase: NH2-terminal sequence demonstrates subunit homology Текст. / Т.О. Baldwin, M.M. Ziegler, D.A. Powers // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - Vol. 76. - № 10.-P. 4887-4889.

43. Cline, T.W. Mutationally altered bacterial luciferase. Implications for subunit functions Текст. / T.W. Cline, J.W. Hastings // Biochemistry. 1972. -Vol.11.-№ 18. - P.3359-3370.

44. Baldwin, Т. O. The biochemistry and molecular biology of bacterial bioluminescence / Т. O. Baldwin, M. M. Ziegler Текст. // Chemistry and Biochemistry of Flavoenzymes 1992. - Vol. 3. - P. 467-530.

45. Мажуль, M.M. Исследование свойств NAD(P)H:FMN-оксидоредуктазы из морских люминесцентных бактерий Vibrio fischeri Текст. / М.М. Мажуль, B.C. Данилов // Биохимия. 1994. - Том 59. - № 10. -С. 1608-1614.

46. Завильгельский, Г.Б. «Quorum Sensing», или как бактерии «разговаривают» друг с другом Текст. / Г.Б. Завильгельский, И.В. Манухов // Молекулярная биология. 2001. - Т. 35. - № 2. - С. 268-277.

47. Foran, D.R. Nucleotide sequence of the LuxA and LuxB genes of the bioluminescent marine bacterium Vibrio fischeri Текст. / D.R. Foran , W.M. Brown //Nucleic Acids Res. 1988.-Vol. 16. - № 2. - P. 111.

48. Illiarinov, B.A. Nucleotide sequence of part of Photobacterium leiognathi lux region Текст. / B.A. Illiarinov, M.V. Protopopova, V.A. Karginov // Nucleic Acids Res. 1988. - Vol. 16. P. 9855-9855.

49. Duchaud, E. The genome sequence of the entomopathogenic bacterium Photorhabdus luminescens Текст. / E. Duchaud , C. Rusniok , L. Frangeul, C. Buchrieser // Nat. Biotechnol. 2003. - Vol. 21. - P. 1307-1313.

50. Wall, L. Subunit structure of the fatty-acid reductase complex from Photobacterium phosphoreum Текст. / L. Wall, E.A. Meighen // Biochemistry.1986.-Vol. 25.-4315-4321.

51. Chao, Y.F. Sequence of the luxD gene encoding acyltransferase of the lux operon from Photobacterium leiognathi Текст. / Y.F. Chao, S.F. Weng, J.W. Lin//Gene. 1993.-Vol. 126.-№ l.-P. 155-156.

52. Miyamoto, C.M. Nucleotide sequence of the LuxC gene and the upstream DNA from the bioluminescent system of Vibrio harveyi Текст. / C.M.

53. Miyamoto, A.F. Graham, E.A. Meighen // Nucleic Acids Res. 1988. - Vol. 16. -P. 1551-1562.

54. Lin, J.W. Nucleotide sequence of the luxC gene encoding fatty acid reductase of the lux operon from Photobacterium leiognathi Текст. / J.W. Lin, Y.F. Chao, S.F. Weng // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. - Vol. 191. № 1.-P. 314-318.

55. Meighen, E.A. Multiple repetitive elements and organization of the lux operons of luminescent terrestrial bacteria Текст. / E.A. Meighen, R.B. Szittner // J. Bacteriol. 1992.-Vol. 174.-P. 5371-5381.

56. Baldwin, Т.О. The complete nucleotide sequence of the lux regulon of Vibrio fischeri and the luxABN region of Photobacterium leiognathi and the mechanism of control of bacterial bioluminescence Текст. / Т.О. Baldwin, J.H.

57. Devine, R.S. Heckel, J.-W. Lin, G.S. Shadel // J. Biolumin. Chemilumin. 1989. -Vol. 4.-P. 326-341.

58. Callahan, S.M. LuxR- and acyl-homoserine lactone controlled non-lux genes define a quorum-sensing regulon in Vibrio fischeri Текст. / S.M. Callahan, P.V. Dunlap // J. Bacteriol. 2000. - Vol. 182. - P. 2811-2822.

59. Lee, C.Y. Riboflavin synthesis genes are linked with the lux operon of Photobacterium phosphoreum Текст. / C.Y. Lee, D.J. O'Kane, E.A. Meighen // J. Bacteriol.- 1994.-Vol. 176. № 7. P. 2100-2104.

60. Lin, J.W. Riboflavin synthesis genes ribE, ribB, ribH, ribA reside in the lux operon of Photobacterium leiognathi Текст. / J.W. Lin, Y.F. Chao, S.F. Weng //Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. - Vol. 284. № 3. - P. 587-595.

61. Lin, J.W. The lumazine protein-encoding gene in Photobacterium leiognathi is linked to the lux operon Текст. / J.W. Lin, Y.F. Chao, S.F. Weng // Gene. 1993. -Vol. 126. -№ l.-P. 153-154.

62. Hastings, J.W. Quorum sensing: the explanation of a curious phenomenon reveals a common characteristic of bacteria Текст. / J.W. Hastings, E.P. Greenberg // J. Bacteriol. 1999. - Vol. 181. - P. 2667-2669.

63. Miller, M.B. Quorum sensing in bacteria Текст. / M.B. Miller, B.L. Bassler // Annu. Rev. Microbiol. 2001. - Vol. 55. P. 165-199.

64. Chen, X. Structural identification of a bacterial quorum-sensing signal containing boron Текст. / X. Chen, S. Schauder, N. Potier, A. Van Dorssclaer, I. Pelczer, B.L. Bassler, F.M. Hughson // Nature. 2002. - Vol. 415. - P. 545-549.

65. Bassler, B.L. Small talk: Cell-to-cell communication in bacteria Текст. / B.L. Bassler// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. - Vol. 99. P. 3129-3134.

66. Charu, G. Quorum-sensing: The phenomenon of microbial communication Текст. / G. Charu, S. Srivastava // Current Science. 2006. -Vol. 90. -№5.P. 666-676.

67. Showalter, R.E. Cloning and nucleotide sequence of luxR, a regulatory gene controlling bioluminescence in Vibrio harveyi Текст. / R.E. Showalter, M.O. Martin, M.R. Silverman // J. Bacteriol. 1990. - Vol. 172. - P. 2946-2954.

68. Жмур, H.C. Государственный и производственный контроль токсичности вод методами биотестирования в России / Н.С. Жмур. — М.: Международный Дом Сотрудничества, 1997. — 117с.

69. Ганшин, В.М. Клеточные сенсоры на основе бактериальной биолюминесценции Текст. / В.М. Ганшин, B.C. Данилов // Сенсорные системы. 1997. - Т. 11. - № 6. - С. 245-255.

70. Гительзон, И.И. Светящиеся бактерии Текст. / И.И. Гительзон, Э.К. Родичева, С.Е. Медведева, Г.А. Примакова, С.И. Барцев, Г.А. Кратасюк, В.Н. Петушков, В.В. Межевикин, Е.С. Высоцкий, В.В. Заворуев, В.А. Кратасюк — Новосибирск: Наука, 1984. 280 с.

71. Stom, D.I. Bioluminescent method in studying the complex effect of sewage components Текст. / D.I. Stom, T.A. Geel, A.E. Balayan, A.M. Kuznetsov, S.E. Medvedeva // Arch. Environ. Contam. Toxicol. 1992. - Vol. 22. -P. 203-208.

72. Gellert, G. Sensitivity and significance of luminescent bacteria in chronic toxicity testing based on growth and bioluminescence Текст. / G. Gellert // Ecotoxicol Environ Saf. 2000. - Vol. 45. - № 1. - P. 87-91.

73. Kuznetsov, A. Lyophilized luminous bacteria as a toxicity biotest Текст. / A. Kuznetsov, G. Primakova, A. Fish. // Biological Bioluminescence. In: B. Jezowska-Trzebiatowska, B. Kochel, J. Slawinski, W. Strek (Edts). World Scientific, 1990. P. 559-563.

74. Кудинова, И.Ю. Использование светящихся бактерий в экологическом биотестировании / И.Ю. Кудинова — Красноярск: Краснояр. гос. ун-т., 2001. 30 с.

75. Kuznetsov, A.M. Analysis of river water by bioluminescent biotests Текст. / A.M. Kuznetsov, E.K. Rodicheva, S.E. Medvedeva // Luminescence. -1999.-Vol. 14. -№ 5. P. 263-265.

76. Kratasyuk, V.A. The use of bioluminescent biotest for study of natural and laboratory aquatic ecosystems Текст. / V.A. Kratasyuk, E.N. Esimbekova, M.I. Gladyshev, E.B. Khromichek, A.M. Kuznetsov, E.A. Ivanova // Chemosphere. 2001. - № 42. - P. 909-915.

77. Wolska, L. Bacterial luminescence test screening of highly polluted areas in the Odra River Текст. / L. Wolska, Z. Polkowska // Bull. Environ. Contain. Toxicol.-2001.-Vol. 67.-№ l.-P. 52-58.

78. Bechor, O. Recombinant microorganisms as environmental biosensors pollutants detection by E.coli bearing fabA:lux fusion Текст. / О. Bechor, D.R. Smuski, Т.К. Van Dyk, R.A. LaRossa, S. Belkin // Biotechnology. 2002. - Vol. 94.-P. 125-132.

79. Ulitzur, S. A novel and sensitive test for rapid determination of water toxicity Текст. / S. Ulitzur, T. Lahav, N Ulitzur. // Environmental Toxicology.2002. Vol. 17. - Is. 3. - P. 291 - 296.

80. Doherty, F.G. A review of the Microtox toxicity test system for assessing the toxicity of sediments and soil Текст. / F.G. Doherty // Water quality research journal of Canada. 2001. - Vol. 36. - № 3. - P.475-518.

81. Kleinheiz, G. Sampling of air streams and incorporation of samples in the Microtox toxicity testing system Текст. / G. Kleinheiz, W.P. St. John // Environmental Toxicology and Chemistry. 1997. - Vol. 16. - № 10. - P. 20642066.

82. Roda, A. Bioluminescence and chemiluminescence in drug screening Текст. / A Roda, M. Guardigli, P. Pasini, M. Mirasoli // Anal. Bioanal. Chem.2003. Vol. 377. - № 5. - P. 826-859.

83. Danilov, V.S. The inhibition of bacterial bioluminescence by xenobiotics Текст. / V.S. Danilov, A.D. Ismailov, N.A. Baranova // Xenobiotica. 1985. -Vol. 15. №4.-P. 271-276.

84. Stom, D. I. A. Influence of mixtures of phenols and metals on luminous bacteria Текст. / D.I. Stom, T.A. Geel, G.V. Shahova, N.F. Aprelkova, S.E. Medvedeva, O.A. Menshikova // Acta Hydrochimica et Hydrobiologica. 2006. -Vol. 19.-Is. l.-P. 103- 120.

85. Solcolova, I. V. Analysis of the ratio of quantium yield and fatty acid formation of Photobacterium leiognathi Текст. / I.V. Solcolova, G.S. Kalacheva, N.A. Tyulkova // Vestnik moskovskogo universiteta. Khimia. 2000. - Vol. 41. -№ 6.-P. 118-120.

86. Elke, R. SOS-LUX and LAC-FLUORO-TEST for the quantification of genotoxic and/or cytotoxic effects of heavy metal salts Текст. / R. Elke, P. Rettberg, C. Baumstark-Khan, G. Horneck // Analytica Chimica Acta. 2002. -Vol. 456.-P. 31-39.

87. Минаев, Б.Д. Тушение люминесценции биосенсора «Эколюм-5» смесями солей тяжелых металлов, моделирующими загрязнение питьевой воды в г. Ставрополе Текст. / Б.Д. Минаев, М.Г. Гевандова // Токсикологический вестник. 2003. - №5. - С.37-38.

88. Bulich, A.A. Use of the luminescent bacterial system for the rapid assessment of aquatic toxicity / A.A. Bulich, D.L. Isenberg // ISA Trans. — 1981. — Vol. 20. № l.-P. 29-33.

89. Ribo, M.I. Photobacterium phosphoreum toxicity bioassay Текст. / M.I. Ribo, K.Z. Kaiser // Toxicity Assement and Interatioval Guarterty. 1987. - № 2. - P.305-323.

90. Blaise, С. A bacterial toxicity assay performed with microplates, microluminometry and Microtox reagent Текст. / С. Blaise, R. Forghani, R. Legault, J. Guzzo, M.S. Dubow // Biotechniques. 1994. - Vol. 16. - № 5. - P. 932-937.

91. Microtox acute toxicity basic test procedures. Carlsbad, CA: Azur Environmental, 1995. — 10 p.

92. Ruiz, M.J. Toxicity assessment of pesticides using the Microtox test: application to environmental samples Текст. / M.J. Ruiz, L. Lopez-Jaramillo, M.J. Redondo, G. Font // Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1997. - Vol. 59. № 4. - P.619-625.

93. Ганшин, B.M. Комплексные системы мониторинга токсикологической и экологической безопасности Текст. / В.М. Ганшин, А.В. Чебышев, А.В. Фесенко // Специальная техника. 1998. - № 4-5. - С. 2 -10.

94. Grabert, Е. Correcting absorptive inhibition in the luminescent bacteria test by means of a combined luminometric/photometric procedure / E. Grabert, B. Lange. Berlin: DRLANGE, info 13, 1998. - 6 p.

95. Liu, K. The acute toxicity of a-branched phenylsulfonyl acetates in Photobacterium phosphoreum test Текст. / К. Liu, С. Wu, S. Han, L. Wang, Z. Zhang // Ecotoxicology and Environmental Safety. Vol. 49. - № 3. - 2001. - P. 240-244.

96. Kovats, N. Assesment of soil contaminaition using ToxAlert test Текст. / N. Kovats, A. Reichel, T. G. Szalay, Bakonyi, P. Nagy // Journal of Hungarian Geomathematics. 2004. - Vol. 2. - P. 1-15.

97. Набор BioTox. Инструкции к применению Текст. Pribori Оу, 1999.-5 с.

98. Kahru, A. In vitro toxicity testing using marine luminescent bacteria {Photobacterium phosphoreum): the BioTox test Текст. / A. Kahru // ATLA. -1993. Vol. 21. P. 210-215.

99. ISO 11348-3. Detrmination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test). International Organisation for Standardization. - 1999. - 13 p.

100. КНД 211.1.4.060-97. Методика визначення токсичност1 води на бактер1ях Photobacterium phosphoreum (Cohn) Ford. Затв. наказом Мшприроди Украши вщ, 1997.

101. MP № 01.019-07 Определение интегральной токсичности почв с помощью биотеста «Эколюм» // ФГУЗ "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2007. 22 с.

102. MP № 01.020-07 Определение токсичности воздушной среды с помощью биотеста «Эколюм» // ФГУЗ "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2007. 21 с.

103. Кратасюк, В.А. Использование светящихся бактерий в биолюминесцентном анализе Текст. / В.А. Кратасюк, И.И. Гительзон // Успехи микробиологии. 1987. -№ 21. - С. 3-30.

104. Kuznetsov, A.M. Biotest based on lyophilized bacteria Текст. / A.M. Kuznetsov, E.K. Rodicheva, E.V. Shilova // Biotekhnologia. 1996. - Vol. 9. - P. 57-61.

105. Kuznetsov, A.M. Biotesting of effluent and river water by lyophilized luminous bacteria biotest Текст. / A.M. Kuznetsov, E.K. Rodicheva, S.E. Medvedeva // Field Analytical Chemistry & Technology. 1998 - Vol. 2. - Is. 5. — P. 267-275.

106. Малыгина, И.Ю. Светящиеся бактерии Черного и Азовского морей Текст. / И.Ю. Малыгина, A.M. Кацев // Экология моря. 2003. - Вып. 64. С. 18-23.

107. Илларионов, Б.А. Клонирование и экспрессия генов люминесцентной системы Photobacterium leiognathi Текст. / Б.А.

108. Илларионов, М.В. Протопопова // Молекуляр. генет. микробиол. вирусол. -1987. -№ 8.-С. 41-46.

109. Jezowslca-Trzebiatowska, В. Biological Luminescence Текст. / В. Jezowska-Trzebiatowslca, В. Kochel, J. Slawinslci, W. Strelc. World Scientific Publ. Inc., Singapore, 1990 - P. 647.

110. Кузнецов, A.M. Использование генетически модифицированного штамма Escherichia coli в биотестировании Текст. / A.M. Кузнецов, С.Е. Медведева, Э.К. Родичева // Проблемы окружающей среды и природных ресурсов. 2000. - №10. - С. 67-73.

111. Манухов, И.В. Клонирование LuxAB-генов тсрмостабильной люциферазы Photorhabdus lumenescens ZM1 в Esherichia coli K12 Текст. / И.В. Манухов, Г.Б. Завильгельский, B.C. Данилов, Г.Е. Ерошников, А.Г1. Зарубина// Биотехнология. 1999. — № 1. — С. 40-43.

112. Масленникова, И.Л. Исследование общетоксикологических и мутагенных свойств поллютантов микробиолюминесцентным методом Текст. / И.Л. Масленникова, Н.В. Голясная // Прикладная биохимия и микробиология. 2007. - Т. 43. - № 4. - С. 455-461.

113. Belkin, S. A panel of stress-responsive luminous bacteria for toxicity detection Текст. / S. Belkin, D.R. Smulski, S. Dadon, A.C. Vollmer, Т.К. Van Dyk, R.A. LaRossa//Water Res. 1997.-Vol. 31.-P. 3009-3016.

114. Ben-Israel, O. Identification and quantification of toxic chemicals by use of Escherichia coli carrying lux genes fused to stress promoters Текст. / О. Ben-Israel, H. Ben-Israel, S. Ulitzur // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - Vol. 64. - P. 4346-4352.

115. Tauriainen, S. Luminescent bacterial sensor for cadmium and lead Текст. / S. Tauriainen, M. Karp, W. Chang, M. Virta // Biosensors and Bioelectronics. 1998. -Vol. 13. -№ 9. - P. 931-938.

116. Theis, T.L. The influence of aqueous copper speciation on Bioluminosity Текст. / T.L. Theis, D.A. Moye // Chemical Speciation and Bioavailability. -2000.-Vol. 12. -№ 1. P. 27-33.

117. Guzzo, A. A luxAB transcriptional fusion to the cryptic celF gene of Escherichia coli displays increased luminescence in the presence of nickel Текст. / A. Guzzo, M.S. DuBow // Mol. Gen. Genet. 1994. - Vol. 242. - № 4. - P. 455460.

118. Расторгуев, C.M. Lux-биосенсор для детекции ионов мышьяка Текст. / C.M. Расторгуев, Г.Б. Завильгельский // Биотехнология. 2001. - № 2. - С.77-82.

119. Abd-El-Haleem, D. A luxCDABE-based bioluminescent bioreporter for the detection of phenol Текст. / D. Abd-El-Haleem, S. Ripp, C. Scott, G.S. Sayler // Ind. Microbiol. Biotechnol. 2002. - Vol. 29. - № 5. - P. 233-237.

120. Kudryasheva, N. Bioluminescence assays: effects of quinones and phenols Текст. / N. Kudryasheva, E. Vetrova, A. Kuznetsov, V. Kratasyuk, D.

121. Stom // Ecotoxicology and Environmental Safety. 2002. Vol. 53. - № 3. - P. 198-203.

122. Кузнецов, A.M. Изучение характеристик реагентов для биолюминесцентных биотестов Текст. A.M. Кузнецов, И.А. Тюлькова, В.А. Кратасюк, В.В. Абакумова, Э.К Родичева // Сибирский экологический журнал. 1997. - Т.5. - С. 459-465.

123. Мешалкин, Ю.П. О тушении бактериальной люминесценции красителями Текст. / Ю.П. Мешалкин, Е.Е. Немцева, Е.Е. Алфимов, Н.С. Кудряшова//Биофизика. 1999.-Том 44.-Вып. 6.-С. 1083-1087.

124. Кудряшова, Н.С. Механизм действия солей металлов на бактериальную био люминесцентную систему in vitro Текст. / Н.С. Кудряшова, Е.В. Зюзикова, Г.В. Гутник // Биофизика. 1999. - Том 44. -Вып.2. - С. 244-250.

125. Кудряшова, Н.С. Действие хинонов на ферментативные биолюминесцентные НАДН-зависимые системы Текст. / Н.С. Кудряшова, Е.Н. Есимбекова, И.Ю. Кудинова, В.А. Кратасюк, Д.И. Стом // Прикладная биохимия и микробиология. -2000. Том 36. - № 4,- С. 474-478.

126. Nakamura, Т. Roles of К+ and Na+ in рН homeostasis and growth of the marine bacterium Vibrio alginolyticus Текст. / Т. Nakamura, S. Kawasaki, T. Unemoto//Gen. Microbiol.- 1992.-Vol. 138.- №. 6.-P. 1271-1276.

127. Watanabe, H. Effects of aldehyde and internal ions on bioluminescence expression of Photobacterium phosphoreum Текст. / H. Watanabe, I. Humio, W.J. Hastings // Arch. Microbiol. 1991. - Vol. 156.-P. 1-4.

128. Watanabe, H. Luminescence and respiratory activities of Photobacterium phosphoreum. Control by monovalent cations Текст. / H. Watanabe, A.

129. Takimoto, Т. Nakamura // J Biochem (Tokyo). 1977. - Vol. 82. - № 6. - P. 17071714.

130. Wada, M. Coupling between the respiratory chain and luminescent system of Vibrio harveyi Текст. / M. Wada, K. Kogure, K. Ohwada, U. Simidut // Journal of General Microbiology. 1992. -№ 138. - P. 1607-1611.

131. Stabb, E.V. Correlation between osmolarity and luminescence of symbiotic Vibrio fischeri strain ESI 14 Текст. / E.V. Stabb, M.S. Butler, D.M. Adin//J. Bacteriology. -2004.-Vol. 186. -№. 9.-P. 2906-2908.

132. Kashket, E.R. Effects of K+ and Na+ on the proton motive force of respiring Escherichia coli at alkaline рН Текст. / E.R. Kashket // J. Bacteriology -1985.-Vol. 163,-№2.-P. 423-429.

133. Каталог культур светящихся бактерий Текст. / Ред. Э.К. Родичева. -Новосибирск: Наука, СО РАН, 1997. 125 с.

134. Петушков, В.Н. Термоинактивация бактериальной люциферазы Текст. / В.Н. Петушков, Г.А. Кратасюк, В.А. Кратасюк, П.И. Белобров // Биохимия. 1982.-Том 47.-Вып. 11. - С. 1773-1777.

135. Методические рекомендации № 96/225. Контроль качества и безопасности минеральных вод по химическим и микробиологическим показателям Текст. М.: Федеральный центр госсанэпидемнадзора Минздрава России, 1997. - 12 с.

136. ГОСТ 13273-88 Воды минеральные питьевые лечебные и лечебно-столовые. Технические условия Текст. Изд-во стандартов, 1988. -47 с.

137. СанПиН 2.1.4.1116-02 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды, расфасованной в емкости. Контроль качества» Текст. М.: Федеральный центр госсанэпидемнадзора Минздрава России, 2002. - 16 с.

138. ГОСТ 18164-82 Вода питьевая. Метод определения содержания сухого остатка Текст. Изд-во стандартов, 1982. 4 с.

139. Система капиллярного электрофореза «Капель». Руководство по эксплуатации Текст. Санкт-Петербург, 2003. - 59 с.

140. Методические рекомендации. Методика экспрессного определения токсичности воды с помощью люминесцентного бактериального теста «Эколюм» Текст. М.: Федеральный центр госсанэпидемнадзора Минздрава России, 2000. - 19 с.

141. Попова, Л.Ю. Микробные тест-системы для оценки степени токсичности химических соединений Текст. / Л.Ю. Попова, Н.И. Луцкая, А.Г. Жуков. Красноярск, Ин-т биофизики СО РАН, Препринт. №163Б., 1991.-33 с.

142. Кратасюк В.А. Принципы люциферазного биотестирования Текст. / Кратасюк В.А. Красноярск, Ин-т биофизики СО РАН, Препр. №183Б., 1991. -26 с.

143. Kaiser K.L.E., Ribo J.M. Photobacterium phosphoreum toxicity bioassay Текст. // Toxicity Assessment: An International Journal. 1988. - Vol. 3. - № 4. -P. 195-237.

144. Held P. Determination of NADH concentrations with the synergy 2 multi-detection microplate reader using fluorescence or absorbance Электронный ресурс. / P. Held. http://www.biotek.com/resources/techresdetail.php?id=170. -.-2006.-2 кБ.

145. Евгеньев, М.И. Тест-методы и экология / М.И. Евгеньев // Соросовский образовательный журнал. — 1999. № 11. — С.29-34.

146. Vetrova, Е. A bioluminescent signal system detection of chemical toxicants in water / E. Vetrova, E. Esimbekov, N. Kemmel, S. Kotova, N. Beloskov, V. Kratasyuk, I. Gitelson // Luminescence. 2007. - Vol. 22. - № 3. -P. 206-214.

147. Waters, P. Salt, pH and temperature dependencies of growth and bioluminescence of three species of luminouse bacteria analysed on gradient plates

148. Текст. / P. Waters, D. Lloyd // J. Gen. Microbiol. 1985. - Vol. 11. P. 28652869.

149. Watanabe, H. Luminescence and respiratori activities of Photobacterium phosphoreum. Competition for cellular redused power Текст. / H. Watanabe, N. Mimura, A. Takimoto, T. Nacamura // J.Biochem. 1975. - Vol. 77. - № 6. - P. 1147-1115.

150. Kogure, K. Membrane bioenergetics of halophilic marine bacteria Текст. / К. Kogure, H. Tokuda // Proc. IV ISME. 1986. - P. 231-237.

151. Fisher, A J. The 1.5-E resolution crystal structure of bacterial luciferase in low salt conditions Текст. / A.J. Fisher, T.B. Thompson, J.B. Thoden, Т. O. Baldwin, I. Rayment // J. Biol. Chem. 1996. - Vol. 271. - № 36. - P.21956-21968.

152. Hamaide, F. Proton circulation in Vibrio costicola Текст. / F. Hamaide, D.J. Kushner, G.D. Sprott // J. Bacteriol. 1985. - Vol. 161. № 2. - P. 681-686.

153. Bona, M. Interaction of carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone with cytochrome с oxidase Текст. / M. Bona, M. Antalik, Z. Gazova., A. Kuchar, V. Dadak, D. Podhradsky // Gen. Physiol. Biophys. 1993. - Vol. 12. - № 6. - P. 533-542.

154. Mercer, N.A. Hymenolepis diminuta: catalysis of transmembrane proton translocation by mitochondrial NADPH—>NAD transhydrogenase Текст. / N.A. Mercer, J.R. McKelvey, C.F. Fioravanti // Exp Parasitol. 1999. - Vol. 91- № 1. -P. 52-58.

155. Angell, P. Localisation of luciferase in luminous marine bacteria by gold immunocytochemical laballing Текст. / P. Angell, D. Langley, A.H.L. Chamberlain //FEMS Microbiol. Lett. 1989. - Vol. 65. - P. 177-182.

156. Гаррелс, P.M. Растворы, минералы, равновесия Текст. / P.M. Гаррелс, 4.JI. Крайст М.: Мир, 1968. - 367 с.

157. Cook, S.V. Influence of salinity on Vibrio fischery and lux-modified Pseudomonas fluorescens toxicity bioassay / S.V. Cook , A. Chu, R.H. Goodman // Environ. Toxicol. Chem. 2000. - Vol.19. - № 10. - P. 2474-2477.

Информация о работе

Алешина, Елена Сергеевна
кандидата биологических наук
Оренбург, 2008
ВАК 03.00.07

Диссертация

Использование люминесцирующих микроорганизмов для биотестирования минеральных вод - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы