Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ион-транспортирующие системы в эритроцитах и культуре гладкомышечных клеток крыс со спонтанной гипертензией

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Ион-транспортирующие системы в эритроцитах и культуре гладкомышечных клеток крыс со спонтанной гипертензией"

1! л п

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК —Институт физиологии им. И.П. Павлова

На правах рукописи

КУЗНЕЦОВ СЕРГЕЙ РЭМИРОВИЧ

ИОН-ТРАНСПОРТИРУЮЩИЕ СИСТЕМЫ В ЭРИТРОЦИТАХ И КУЛЬТУРЕ ГЛАДКОМЫШЕЧНЫХ КЛЕТОК КРЫС

СО СПОНТАННОЙ ГИПЕРТЕНЗИЕЙ

Специальности: 03.00.04 - Биохимия

03.00.13 - Физиология человека и жибстных

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1995

Работа выполнена в Институте физиологии им. И.П. Павлова РАН.

Научный руководитель: д.м.н. С.К. Чурина

Официальные оппоненты: д.б.н. А.М. Казеннов

чл.-корр. РАЕН, профессор В.Г. Кассиль

Ведущее учреждение: С.-Петербургский Государственный Универ-

в _ часов на заседании Диссертационного совета К 002.36.01

по присуждению ученой степени кандидата наук при Институте физиологии им. И.П. Павлова РАН по адресу: 199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова б.

С диссертацией можно ознакокиться в библиотеке института.

Автореферат разослан " " 1995 Г-

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат биологических наук Э.А. Конза

ситет, биологический факультет.

Защита диссертации состоится

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Обнаруженные при первичной

гипертензии нарушения функционирования ион-транспортирующих систем, таких как Na+/Na+- и На+/Н*-обменники (Canessa et al., 1988), Na~,K+,C1~-котранспортер (Canessa et al . , 1981), Na+,К*- насос (Edmondson et al., 1975), а также систем, участвующих в регулгцин концентрации внутриклеточного Саг*: Са2''-насос (Wehling et al., 1983) и На*/Саг*-обменник (Blaustein, 1977) дают веские основания полагать, что данное заболевание развивается на основе нарушения структуры и катион-транспортных функций клеточных мембран различных клеток (Postnov, Orlov, 1985).

Наиболее адекватной экспериментальной моделью, имеющей большую патогенетическую общность с гипертонической болезнью человека, является линия крыс со спонтанной гипертензией SHR (spontaneously hypertensive rats- Okamoto-Aoki strain). Судя по ион-транспортным характеристикам различных клеток, эта модель имеет много общего с клинической эссенциальной гипертензией, и обе формы гипертензии как у крыс, так и у людей рассматриваются как первичная гипертензия.

В середине 80-х гг. была оС аружена положительная корреляция между величиной артериального давления и активностью Na*,К +,С1"-котранспортера в эритроцитах у гибридов второго поколения F2(MHS*MNS) (Bianchi et al., 1985) и F2(SHR*WKY) (Котелевцев и др., 1987), свидетельствующая о существовании генетической связи между этими параметрами. И ген, кодирующий Na*,К*,С1"-котранспортер, стали рассматривать в качестве маркера гипертензии. В настоящее время в список возможных генетических маркеров гипертензии включены гены Na+/H+-обменника (Hasstedt et al., 1988) и ген Otj-изоформы Na+,К+-АТРазы (Herrera, Ruiz-Opazo,

1990).

Несмотря на обаирный экспериментальный материал,

свидетельствующий о нару-ении транспорта ионов в различных клетках у БНЕ по сравнению с соответствующим нормотензивным контролем (МКУ), практически отсутствуют работы, посвященные исследованию кинетических и термодинамических характеристик различных ион-трансп-ртируюгих систе». Учитывая вышеизложенное, были сформулированы цель и задачи настоящего исследования.

Цель и задачи исследования■ Цалью настоящей работы было исследование состояния ион-транспортирующих систем в эритроцитах и гладкомышечных клетках крыс ЗНИ и *"КУ, а также изучение влияния диетического натрия и кальция на артериальное давление и транспорт одновалентных ионов и яальция в эритроцитах БНИ. Реализация цели предусматривала решение следующих задач:

1) Исследовать кинетические и теркединамические характеристики N3*,К*,С1~-котранспорта в эритроцитах и гладкомышечных клетках крыс ЭИИ и »»КУ.

2) Исследовать кинетические характеристики амилорид-резистентного Ыа*/Н+-обмена в эритроцитах 5НИ и ККV.

3) Изучить характер наследования ве-гичины артериального давления и активности Ыа*,К*,С1~-котранспорта и амилорид-резистентного Ыа^/Н*'-обмена в эритроцитах у гибридов второго поколения ?г(5Ш?*ИКУ).

4) Изучить влияние высоко- и низконатриевой диет на артериальное давление и активность Ыа*,К",С1"-котранспорта и Ыа*,К*-насоса в эритроцитах соль-чувствительных (55; и соль-резистентных (БИ) спонтанно-гипертензивных крыс.

5) Изучить влияние высоко- и низкока-тьциевой диет на артериальное

давление и активность ион-транспортируюлих систем б эритроцитах крыс SHR и WKY.

Научная новизна исследования. впервые показано, что б эритроцитах и гладкохылечных клетках крыс SHR и WKY N'a* , К* ,С1~ - хот-" ранспортер функционирует в режиме вторичноактинного транспорта Na* . Причем, скорость вторичноактивного транспорта N'a* достоверно Бы^е в эритроцитах и гладкомышечных клетках крыс SHR по сравнению с соответствующими клетками крыс WKY . В эритроцитах крысу впервые показано существование амилорид-резистентного Na* H*-обмена, активность которого достоверно выше в эритроцитах крыс SHR по сравнению с WKY. В эритроцитах соль-чувствительных сг.снтанногилертен-зивкых крыс обнаружено нарушение стехиометрии К*0/Na*j-обмена, осуществляемого Na*,К*-АТРазой.

Практическая значимость работы. Полученные экспериментальные данные вносят вклад в понимание механизмов функционирования ионных переносчиков з эритроцитах и гладкомышечньх клетках крыс SHR и WKY и объясняют особенности водносолевого баланса nD;t первичной и соль-индуцированной гипертензии.

Апробация работы. Результаты исследования долотекы на

14 Международном конгрессе по гипертензии (Уадрид, Испания,

1992), на 6 Европейском конгрессе по гипертензии 'Уилан. Италия,

1993), на 23 Конференции ФЕБО (Базель, Швейцария, 19S5), на межлабораторных заседаниях И-та физиологии им. И. П. Павлова РАН и И-та эволюционной физиологии и биохимии им. И. У. Сеченова РАН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания цели и задач исследования, списания методов и объектов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой

литературы, включас^его 315 ссылок. Работа изложена -на 1! страницах машинописного текста и содержит 2 таблицы и 31 рисуно!

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В работе использовали крыс-самцов в возрасте 12-14 неде: следующих линий: сг.онтанно-гипертензивные крысы (SHR), нормоте! эивные крысы (WKV), соль-чувствительные спонтанно-гипертеноивш крысы (SS) , соль-резистентные спонтакно-гипертензивные кры< (SR). Кроме того, в работе были использованы крысы-самцы гибри'д< второго поколения (з возрасте 14 недель), полученные при скрещ1 вании крыс SHR и WKV ((F2(SHR*WKY)). Систолическое кровяное да] ление у животных измеряли в хвостовой артерии при помощи возду! ной резиновой манжеты и пьезоэлектрического датчика, соединены! с пульсовым преобразователем и самописцем.

Соль-резистентные (SRL) и соль-чувствительные (SSL) спонта) но-гипертензивные крысы находились в течение 8 недель на низкое левой (0,2% NaCl) ;иете. SRH, SSH- животные тех же линий наход; лись в течение тоге яе времени на высокосолевой (5X NaCl) диет< Нормотензивные (WKVL} и гипертенэивные (SHRL) крысы находились течение s недель на низкокальциевой (0,02% СаС03) диете. WKYH SHRH- животные тех ?.е линий находились в течение того же време на высококальциевой [2% СаС03) диете. Крыс помещали на различи диеты в возрасте 5 недель.

Объем внеклеточной жидкости у крыс определяли при помо [1 311]альбумина (Cnspell et al., 1950). Диализ плазмы и опред ление гипергензивно;; активности диализованной плазмы проводили методу, предложенноху Леванчуком и др. (Lewanczuk et al., 1989) В работе использовали свежевыделенные эритроциты и культу

непролиферирующих гладкомызечных клеток (ГМК) крысы. Концентрации Na* и К* в эритроцитах^ варьировали-при помощи_нистатинового метода (Freedman, Hoffman, 1979). Для варьирования концентраций Na* и К* в ГМК использовали нигерицин-конензиновый метод (Creen et al., 1988).

Активность Na*,К*- и Са~*-АТРаз в обработанных сапонином эритроцитах определяли по накоплению (Petrunyaka et al., 1990).

Концентрацию ионизированного внутриклеточного Са?* в эритроцитах определяли при помощи флуоресцентного зонда Fura-2AM (David-Dufilho et al., 1988). Содержание Na* и К* в сыворотке крови и в цитоплазме эритроцитов определяли методом пламенной фотометрии.

Активность Na*,К*-насоса в эритроцитах оценивали по уаба-

ин(1мМ)-ингибируемым компонентам входного потока *°Rb* или выход-

2 2 +■

ного потока Na в среде, содержащей (мМ): 145 NaCl, 3 КС1, 1 MgCl2, 1 СаС12, 1 К2НР04, 10 глюкозы, 10 HEPES-TRIS, рН 7,4 ( 37° С) . Скорость Na* ,К* ,С1~-котранспорта в эритроцитах и ГМК определяли по уабаин(1мМ)-резистентным, буметанид(20мкМ)-ингибируе-мым компонентам входных и выходных потоков 86Rb* и ггИа*. Об активности амилорид-чувствительного Na*/Н*-обмена (NHE-1 иэоформа) в эритроцитах крысы судили по амилорид(1мМ)-ингибируемой компоненте входного потока 22Na*, индуцированного гиперосмотическим (бЗОмОсм) сжатием клеток. Скорость амилорид-резистентного Na*/H*-обмена определяли как не чувствительную к амилориду(1мМ) компоненту Д]1н+-индуцированного входного потока 22Na* (Escóbales, Canessa, 1986). Пассивную проницаемость эритроцитов для кальция определяли по накоплению 45Са2* в (2и1п2-нагруженных клетках (McNamara,Wi1еу, 1986).

Полученные результаты представлены•в виде М ± т, где М-ср-ед-нее арифметическое, а т- стандартная ошибка. Статистическая обработка результатов проводилась с помощью t-критерия Стьсаента. За достоверные принимались различия на уровне 95% и выще (р<0,05}.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Sa' .СГ-котранспорт в эривроцитах и ГМК крыс S=R и К XX В назих экспериментах мы изучали зависимость стационарно! скорости буметанид-ингибируемого входа К* в эритроциты и ГМК ги-пертенэивных (SHR) и нормотензивных (WKY) крыс от кснцентранш внешнего К*. Поскольку эритроциты и ГМК SHR характеризуются болег высокими значениями концентрации внутриклеточного Na' по сравке нию с WKY (Postnov, Orlov, 1985), а, как известно, внутриклеточ ный Na* активирует переносчик (Canessa et al. , 1986), мы исполь зовали клетки, в которых внутриклеточные концентрации натрия калия были заданы при помощи нистатинового метода (эритроцит [На*][=10мМ, [К*]j=135mM) или нигерицин-монензинового иетода (ГМ [Na'' 'и =20мМ, [К+ ] 1 =140мМ) . Этот методический подхс~ поззоли уравнять внутриклеточные концентрации Na* в эритроцитах и ГКК WK и SHR, исключив тем самым возможность более сильного активируете го влияния внутриклеточного Na+ на Na+,К+,С1"-котракспортер клетках SHR по сравнению с WKY. Как видно на рис.1, зависикост буметанид-ингибируемого входного потока К+ в эритроцита (а) и Г* (б) WKV и SHR от концентрации внешнего К* линеризуется в коорду натах Иди-Хофсти. Подчинение зависимости буметанид-ингибируемог входного потока К* от концентрации внешнего К+ кинетике Михаэл> са-Нентен согласуется с моделью переносчика, имеющего один транс

Рис. 1. Зависимость стационарной скорости буметанид-чувствитель-ного входа К+ в эритроциты (а) и ГМК (б) крыс БН!* и ИКУ от концентрации К+ в среде инкубации в координатах Иди-Хофсти. Представлены средние значения для трех параллельных измерений и их стандартные ошибки.

портный сайт для К* на внелней стороне мембраны (Brugnara et al., 1985). Для эритроцитов (рис.1а) значения К0 5 (угол наклона прямых) достоверно не отличаются в случае WKY (7,5i0,6 мм) и SHF (8,3±о,5 мМ), в то время, как максимальная скорость входа К* (мколь/л. клеток в час) почти в два раза выае в эритроцитах SH? (2,5±0,4) по сравнению с WKY (1,4=0,2). Для ГМК (рис.16) значение К0 ; также достоверно не отличаются в случае WKY (6,2±0,8 мМ) v SHR (7 , 4i0, 6 мМ), в то время, как максимальная скорость бумета-нид-ингибируемого входа К* (мкмоль/мг белка в час) ~ в 1,5 раз; выше в ГМК SHR (0,68±0,05) по сравнению с ГНК WKY (0,49±0,05) Полученные результаты позволяют сделать вывод, что эритроциты i ГМК SHR по сравнению с WKY характеризуются либо более высоким содержанием молекул когранспортера в мембране, либо более высоко! скоростью транслокации переносчиков через мембрану.

Поскольку Na+,К+,С1~-котранспортер имеет транспортные сайт! для всех трех типов ионов как на внешней, так и на внутренне! стороне мембраны (Geck, Heinz, 1986), переносчик формирует ка: входные, так и выходные потоки Na*, К* и С1~ через клеточну! мембрану (Brugnara et al., 1986), причем котранспортер может ис пользовать энергию электрохимического градиента одного из симпор тируемых ионов для активного транспорта одного или двух други ионов. В связи с этим мы исследовали буметанид-ингибируемые вход ные и выходные потоки Na* и К* в эритроцитах и ГМК крыс WKY SHR. На рис.2 представлены величины входных и выходных потоко Na+ и К*, формируемых Na*,К*,С1"-котранспортером в эритроцита (а) и ГМК (б) крыс обеих линий. Положительные величины соответс твуют потокам ионов,направленных в клетку, а отрицательные- пото как из клетки. На рисунке видно, что переносчик формирует входны

I I-5

z °-5

ч = 0.0

3. -0.5

I -1.0

S.-1.D

к -2.0

рис. 2. Буметанид-чувствительные потоки Na+ и К* в эритроцитах (а) и ГМК (б) крыс SHR и WKY. Представлены средние значения для пяти параллельных измерений и их стандартные ошибки.

;; выходное потоки К" '.-егье столбцы), причем величины выходных потоков превышают величина пс:::-.:в, направленных в клетку. Что касается транспорта N'a" лразье столбцы) , то нам удалось заре-гистрирсвзть только бумета.чиг-икгибируемый компонент потока иона, направленный из клетки з с:еду инкубации, т.е. против градиента концентрации Na* (;Na';.=14i мН, эритроциты-[Na*]г=10; ГМК-iNa" ; . =2СмМ) . Таким с;раз;-. в эритроцитах и ГМК крыс WKY и SHR при физиологических ус„-.э=у..-.х Na*,К*,С1~-котранспортер функционирует б режиме Na"- нас:са . ~ричем скорость вторичноактивного транспорта На" вьиге в эри" зиитгх и ГМК SHR по сравнению с WKY. Поскольку направление бупетаннд-ингибируемого нетто-потока Na* совпадает с направлением суметакид-ингибируемого нетто-потока К*, MO/SHO предположить, чте з ;-?итр;цитах и ГМК крысы активный транспорт Na* через переносчик ;спря?ен с пассивным транспортом К*, т.е. Na" ,К* ,С1~-котрансг.ортар использует энергию концентрационного градиента К* для активного транспорта Na". Чтобы проверить это предположение мы провели z~~.ezyczий эксперимент. Внутриклеточные концентрации Na* и К* б эрхтраиитах WKY были заданы при помощи нистатинового метода и с;ста=."."ли 20 и 130 мМ, соответственно. Концентрация На* в среде инкубации была 10 мМ, С1"- 150 мМ, г концентрации К* варьирсна--.;; г диапазоне 5-140 мМ.. Учитывая тот факт, что з эритроцитах млакеггитаощих хлорид анион распределяете; термодинамически равнозес:-:: у.= «ду цитозолем клетки и окружающей средой (Freednan, Hoffr.an, . а величина мембранного потенци-

ала в эритроцитах крысы г среднем составляет ~ -14 MB (Postnov, Orlov, 1935), рассчитанная г.с уравнению Нернста концентрацю внутриклеточного ' С1~ раБН.-.ласъ 38 мМ. Движущую силу нетто-кот-ранспорта (Д/1-ес) рассчитыгали г.: уравнению, предложенному Xaacoi

и др. (Haas et al. , 1982). На рис.3 представлена зависимость бу-Метанид-ингибируемого нетто-потока Na!^в эритроцитах_ИКУ от величины движущей силы котранспорта. Отрицательные значения нетто-по-тока Na+ соответствуют направлению потока из клетки в среду инкубации. Отрицательные значения ДДпе1 соответствуют движущей силе котранспорта, направленной из клетки в среду инкубации, а положительные- обратному направлению. Как видно на рисунке, по мере уменьшения абсолютной величины движущей силы (при увеличении концентрации К+ в среде инкубации от 5 до 90 мМ) буметанид-чувстви-тельный нетто-поток Na* из клетки уменьшается и приближается к нулю, когда Д/1пе(;=0 ([К+ ]о~90 мМ) . Однако, обращение направления движущей силы котранспорта при дальнейшем увеличении концентрации внешнего К* от 90 до 140 мМ не приводило к возникновению нетто-потока Na*, направленного из среды инкубации в клетку. Таким образом, в отличие от К*,С1"-котранспортера, который может формировать нетто-потоки К* в обоих направлениях в зависимости от направления движущей силы котранспорта (Brugnara et al., 1989), для

0.4

0.2 0.0 -0.2-1 -0.1 -0.6 -0.8 -1.0

1 1

Т

т / X

/х

т -f -

Рис.3. Зависимость буме-танид-чувствительного нетто-потока Ыа+ в эритроцитах крысы от величины движущей силы котранспорта . Движущую силу котранспорта (ДМле!) рассчитывали по уравнению :

[N3* ]0 [К* }0 [СГ ДМпе:=КТ1п ----

[Иа ] 1 [К ] { [ С1 ~ ] 1 Представлены средние значения для трех параллельных измерений и их стандартные ошибки.

V

-8 -6 -4-2 0 2

Движущая сила котранспорта СкДж/моль)

Ма*,К*,С1~-котранспортера в эритроцитах :-:рысы характерна асимметрия, заключающаяся в том, что переносчик формирует неттс-поток На* из клетки и не способен генерировать нетто-поток катиона в обратном направлении.

При изучении характера наследования величины артериального давления и активности Иа* ,К*,С1~-котранспортера в эритроцитах у гибридов второго поколения Г^'БНЕ'МКУ) была обнаружена достоверная линейная положительная корреляция между этими параметрами (г=0,"1; р<0,005) ■ Об активности ;;а",К*,С!"-котранспортера судили по буметанид-чувствительной компоненте выходного потока ^Ыа*. Наши данные подтверждают результаты более ранней работы (Котелев-цев и др., 1987), в которой скорость Ка*,К+,С1~-котранспорта в эритроцитах Г^ (5НН*1"7КУ) оценивали по фуросемид-чувствительной компоненте входного потока~36ЕЬ" . Наличие подобной корреляции указывает на существование генетической связи между величиной артериального давления и активностью .Ча+ , К' , С1"-котранспортера .

2. Nа*/Н'-обмен в эритроцитах крыс вНЯ и ЫКУ

На рис.4 видно, что скорость амилорид-чувствительного Ыа*/Н'-обмена (светлая штрихсзка) примерно одинакова в эритроцитах крыс ИКУ и БНР!. Таким образом, нас:и результаты подтверждают данные Лифтона и др. (1л51:оп et а1., 1951) о том, что ген, кодирующий чувствительную к амилориду изоформу Ыа*/Н*-обменника (ЛНЕ-1), не связан с патогенезом эссенциальной гипертензии. В отличие от амилорид-чувствительного Иа*/Нг-обмена, скорость амило-рид-резистентного +-индуинрованного Ма+/Н"-обмена (темная

штриховка) ~ в 1,5 раза выше з эритроцитах крыс БНИ по сравнению с ИКУ (рис.4). Поскольку в литературе отсутствует информация о

С.к.—.:-

3<->~. vvr-:-:* e-

JU-

¡1 I

I ätl i

1

f Щ

WKY

Ä

SHR

I i СзК ЛЛ1*

3iKi! :.тенн-

Рис. 4. Амилорил--:увст2>!Г5.:ьный (сжатие) и амилсри^-резистенгный (зачисление) Na* Н*-ссмэяе s г?итроц;;тзх 5HR и "я"КУ. Представлены сселние значения лля гезти ".араллельнах измерений и их стандартные ошибки.

Рис. 5. Зависимость стз-игнарясй сксгзсти ин-уг:лрснанного зачислением, амилорид-рэзистгктнзгэ входа Ма* з эритрЬциты крыс SKR и WKV от концентрации Na" н —=~е инкубации в ксзрЬякатах Лайнуиве-ра-=ерка. Представлены гзе-;-:ие значения для трех параллельных измерений и их стандартные zxy.iza.

кинетических свойствах изоформ Ма+/Н+-обменника (ЫНЕ-2, 3, 4), не ингибируемых амилоридом, мы изучили зависимость стационарной скорости не ингибируемого амилоридом Д/1н+-индуцированного входа Ыа+ в эритроциты крыс ИКУ и БНИ от концентрации внешнего Иа*. Полученные зависимости подчиняются кинетике Михаэлиса-Ментен и спрямляются в координатах Лайнуивера-Берка (рис.5), что согласуется с моделью переносчика, имеющего один транспортный сайт для Ыа+ на внешней стороне мембраны (Grinstein, 1986). Значения

К0 5 достоверно не отличаются в случае эритроцитов ШУ (0,28±0,05 М) и БНИ (0,30+0,04 М), в то время, как максимальная скорость входа Иа* (моль/л. клеток в час) ~ в 1,5 раза выше в эритроцитах БН!* (0,81±0,07) по сравнению с ЫКУ (0,51±0,04). Полученные результаты позволяют сделать вывод, что эритроциты БНИ по сравнению с УЖУ характеризуются либо более высоким содержанием молекул Иа+/Н*-обменника в мембране, либо более высокой скоростью транслокации переносчиков через мембрану.

Известно, что ЫНЕ-1 изоформа -обменника кроме транс-

портных сайтов для и Н+ имеет цитоплазматический регуляторный сайт, связываясь с которым Н+ аллостерически активируют переносчик (Gr.inste.in, Rothsteiп, 1986). Зависимости амилорид-резистент-ного Д^н+-индуцированного входа Иа* в эритроциты БНИ и ИКУ от величины рН! имели сигмоидный характер и спрямлялись в координатах Хилла (рис.6). В случае эритроцитов крыс ИКУ коэффициент Хил-ла (п=3,4±0,4) был в 2 раза выше по.сравнению с эритроцитами БНИ (п=1,7±0',2) . Значения п>1 указывают либо на более высокую, чем 1Ма+0:1Н+1 стехиометрию обмена (больше одного транспортного сайта для Ма+0), либо на аллостерический характер активации (Диксон, Уэбб, 1966). Однако данные, представленные на (рис.5), свидетель-

-1.0 -:u; -:U! --'.8

1<I I!H\',IMV

зме-тан-

ствуют о существовании единственного "а.:-:ортного сайга сл.- Na* на внешней поверхности ме-браны. То есть . так же как :-: Z-'.я NHE-1 изоформы Na*/Н*-обменника . для перексс-~!:{ а не ингибису^у.гтс ами-лорицом характерно сущестгзвание цитсг_-.г з.«.= тическогз с~гу.".~тзрно-го сайта, связываясь с кстсрым, Н* активи^ту-от Na*/Н~^ ■=.-:. 3 настоящее время не извести;, какие не вительнъ;е -. грису изоформы переносчика (МНЕ-;, NHE-3 яли viIE-4) экспр=г;>"р;эаны е эритроцитах крысы. ГТоскс.-.ьху характер тивации ах;'--.:сис-резистентного AflH+-индуцированк;го Na" /Н*-сбх=.-== внутриклет-счку-и Н* существенно отличается в эритроцитах г-"=ргензиБНЬх - нзр-зтен-зивных животных (рис.б), не«но предпслг.жтя, что s з-ритрсиитах крыс SHR и WKY экспрессированы разнье -:-гоформы ау.и_-.з?ис-р=зис-тентного На+/Н+-обменника.

В наших экспериментах величина сисгслическогз са=---гняя у F2(SHR*WKY) положительно коррелировала г=3,41; р <: . 15 зс скоростью амилорид-резистентк;го Afly--иксуогрсзанного Na" Н" -семена в эритроцитах животных, "сдобная корре.т.г^:»я указывает -га зубаст-

вование генетической связи между этими параметрами.

3. Транспорт Na* и К* в эритроцитах крыс SS и SR

В наших экспериментах высоконатриевая диета не влияла на кровяное давление у соль-резистентных крыс SR и вызывала достоверное увеличение систолического давления у соль-чувствительных крыс SS. У SS, находящихся на аысоконатриевой диете (SSH), было зарегистрировано почти двукратное увеличение объема внеклеточной жидкости по сравнению с SS, получавших низконатриевую диету (SSL). Однако, несмотря на увеличение объема внеклеточной жидкости у SSH, концентрации Na* и К* в плазме и в клетках у этих животных не отличались достоверно от концентраций этих ионов в плазме и эритроцитах SSL.

Высоконатриевая диета не влияла на активность

Na* ,К* , С1~ -котранспортера в эритроцитах SR и SS.

Высоконатриевая диета не влияла также на активность Na*,К*-насоса в эритроцитах SR и SS (рис.7). На рисунке видно, что уабаин-ингибируемые компоненты входного потока К* в эритроцитах крыс SR и SS (светлая штриховка) примерно одинаковы. В тс время, как уабаин-ингибируемые компоненты выходного потока Na* (темная штриховка) в 2 с лишним раза выше в эритроцитах крыс S£ по сравнению с SR. Стехиометрия противотранспорта катионов е эритроцитах SR примерно равна 1 K*0:l,7 Na*!, что хорошо согласуется с основной модой функционирования Na*,К*-АТРазы, осуществляющей 2К*0/3Na+j-обмен в различных типах клеток (Sarkadi, Toste-son, 1979). Поскольку известно, что Na*,К*-АТРаза может осуществлять ингибируемый уабаинои Na+0/Na+1-обмен (Kaplan, 1985), можно было бы предположить, что более высокая скорость выхода Na* и:

' 5<o.aot sh -<. JRH

1 <f :<iaOI £='_ " SFl

$RL -5RH SL S5H

Въпсд Na*

J ^

- 7 —Уабаин-ингибируе-:-:оу.г.онеп1ы входного г:-:а К* и выходного г.о-а. Na" в эритроцитах =-чувствительных (S3* и =-резиотектнкх 'SН)

танк с - гипертенэивкьх : . кахозя-ихся на высо-■¡атрнезой (ъ% SaCi) SSK и низко-натсие-0,2% NaCl) (SSL, SSL) ~ = х. Представлены сред-;наче:-:ия для ггести' нагельных измерений и их ;-арткав осибки.

г~:= гок гс.:ь-ч>-ест5ят5-:ь:-:ых крас обуслсз-т^ла. тек, что мембраны эс>-т-=с_иг :з HS сс:=сиат ослад-ге количестзс ,К" -АТРазы, причем

-агть »C--5KV.: фас» = :-:та гсуде;тзляет наря~_-

/3Na . -сс.ченом

= " -ссяэн. -Д>:нал не удалое: зарегистрировать уаоа-о ксяпгнзкту «медного потока .Ча" в эритроцитах крыс -гс гз/дегелагтзуег претив сущестзсз.а--?;яя моды Ыа*0 Ма^-сб-3 ГЗЯ2И с с-г-нл »гянс ~едположигь . что в эритроцитах 5Б :ъ .X"-АТгазы зункционируат з режиу.е не сопряжен к его

Пгзьзанкая сгггсг^нгсть >= ,К -АТ.-аз^ активно транспортировать Ха~ «з.к-зт быть гснгззй нения у.эх—изма формирования нет-Nа" г эн^.та..-;-ал=>-:=»:( клетках нс-~->-ых канальцев, обус-лазлиг-ал ГИ-Ч у2е-тхч€-.х= кана.:ьцевой реасссрсции этого катисна, ктос-а з сзсс у.снет привести г "сбъеу.ной экспансия",

гост-.' сэсмзчнэго з-ьсссса и "гышению аргес^а-лькогз давления. ~с-аеа«хт будет грегзлятъ" тем отчет-Г««е, чем высе уровень -еггеб-такад с ггхлей. Т^сим образех, гсЕаруженноё нами насу-

шение стехиометрии функционирования Иа*,К+-насоса у крыс ББ может быть молекулярной основой такого признака, как соль-чувствительность.

4. Влияние диетического кальция на артериальное давление и ионный транспорт в эритроцитах у крыс вНН и ИКУ Известно, что высококальциевая диета предотвращает развитие гипертензии у крыс БН!* (МсСаггоп е! а1., 1981). В наших экспериментах высококальциевая диета не влияла на величину систолического давления у УЖУ и препятствовала развитию гипертензии у БНИ (декремент ~ 40 мм рт. ст.). Как у крыс БНИ, так и у МКУ, находящихся на диетах с высоким содержанием кальция, было обнаружено увеличение концентрации общего Са2+ в плазме, что согласуется с результатами более ранних работ (На^оп, МсСаггоп, 1994). У крыс

вНЯ, находящихся на высококальциевой диете (БШН). было обнаруже-

р +

но достоверное снижение концентрации цитозольного Са£ в эритроцитах по сравнению с животными, находящимися на низкокальциевой диете (БНЯЬ). Этот эффект, по-видимому, обусловлен снижением пас-

р +

сивной проницаемости мембран эритроцитов для Са у ЭШШ по сравнению с ЗНЯЬ (рис.8).

Нам не удалось обнаружить влияния диетического кальция на активность Ыа+,К+,С1"-котранспортера в эритроцитах крыс ЭИЙ и У/КУ. Так же не было обнаружено различий в активности Ма+,К+- и Са2+-АТРаз в эритроцитах крыс БИИН и ЭНВЬ.

Группой Панга (Ьеыапсгик et а1., 1989) было показано существование в плазме крыс БНИ, но не ИКУ паратиреоидного гипертензив-ного фактора (РНГ). Внутривенное введение крысам ШЧ диализован-ной плазмы крыс БН!* вызывало значительное повышение артериального

с 50

^ 40-

= 10

г з

Ер-^ся (часы!

Еп-?тьс 5НХЙ а БНК!.

Рис. 8. Кинетика накопления Сэ.~' б 0и1п-2-нзгруженных эритрс1штн:с крыс БИИН и ЭШЬ. ЭНИН - . находягиаг? на высоко-кальциаз:/!

диете (2% СаС03 ) ; БНИ!. - грьсн, находядиес.т на низко-кальциезей диете (0,02% СаСО; ) ■ ПрадстаЗ-'ены средние значения для пяти параллельных измерений и их ста^арткые огиок.».

Рис. 9. Влияние лиализозанкгй "азмы кры; и БНИ. на актив-

ность Ыа'1',К+-насоса и Ка* .К" . С1"-котра:-::--стера в эритроцита:« крыс ККУ. БНИН - хрысы, нахсдлзшеся на ныспг-кальциевой диета {2% СаС03 ); ЗШ?Ь - крысы, нахегясиеся на нязхо-кальциевой диета (0,02% СаС03). Представлены средние значение для пяти параллельных измерений и их стандартные гзпибхи.

давления у нормотензивных животных. Было показано, что высококальциевая диета устраняла гипертензивное действие диализованно! плазмы SHR. В связи с этим авторы предположили, что увеличена концентрации Са2* в плазме у SHR вследствие потребления высоко кальциевой диеты приводит к ослаблению синтеза и (или) секреци! PHF паращитовидными железами. В наших экспериментах внутривенно! введение диализованной плазмы SHRL крысам WKY приводило к повыше нию артериального давления у WKY ~ на 35 мм рт. ст. В то же врем диализованная плазма крыс SHRH не обладала гипертензивным дейс твием. Таким образом, наши результаты подтверждают данные, полу ченные ранее (Lewanczuk et al., 1990).

Известно, что инкубация тромбоцитов человека с плазмой ги пертензивных пациентов вызывает увеличение концентрации цитозоль

ного Са2+ в этих клетках (Zidek et al., 1988). Диализованна

? +

плазма SHR также стимулировала накопление Са в полосках хвосто

вой артерии крыс WKY (Lewanczuk et al., 1989). В наших экспери

ментах нам не удалось обнаружить влияния диализованной плазм

2 +

крыс SHRH и SHRL на пассивный транспорт Са в эритроцитах кры WKY. .

На рис.9 представлены данные о влиянии диализованной плазм крыс SHRH и SHRL на активность Na*,К+-насоса и Na+,К+,С1"-кот ранспортера в эритроцитах крыс WKY. На рисунке видно, что диалк заты SHRH и SHRL не влияли на активность Na+,К+-насоса в эритрс цитах WKY (ср. с контролем), что указывает на отсутствие "ouabc in-like" фактора в диализатах. Активность Na+,К+,С1~-котранспор тера в эритроцитах WKY, инкубировавшихся в присутствие диализе ванной плазмы крыс SHRL, была ~ в 1,5 раза выше по сравнению контролем, в то время, как плазма крыс SHRH не влияла на скорост

.На*.,К* ,С1'-котранспсрг2 г гр^ггссиггх лХУ. Таким обггзгм. ньсскс-" кальциевая- диета • устраняла_ ка:< гиг.ергензнБНое действие г.лгзху крыс ЭТО, так и == зуг-зирусдее влияние ::< греет ь

На*,К*,С1"-котранспсста ри;.г . Ус»нс предположить, чтс сс<а эффекта связаны с у.".ен;ггну.5у. :<;-.^ектраиии РНГ в пла2.».-= «игогккх, находящихся на высо-с:- гнете.

г '<■ ^

1. В эритроцитах я г.~е гладхомышечных 2_:=т;х Г.М>:; спонтанно-гипертензиз:-:->х >:рьс :Н?.) активность N3" .>.', -хэт-ранспортера достоверно зь^е г.с :гразкани:о с соответсгн;~сщи»н клетками нормотензивного контроля 'КОП , причем об актизнести гг-аре-носчика можно судить как пс зйлячнке однонаправленного 5ут«эта-нид-чувствительного вх:~г:;г; г:?:.-:а К', так и по ве.Г'--ина.ч направленных буметакн.д-'-'уз^тзигв.^къ.'-Ч захсдных потоке; Ма" я К" .

2. В эритроцитах и туге Г УК крыс ;•£? и >ГК'; N8* ,К* , С1~-котранспортер -унк'^у.с пирует з режиме в тори-т-; 5-а у г И2 н э г э транспорта Ыа+ , испсльзу- знергис гралиента К*. :г:; = .ч:-:сг: N8* ,К* -насосом. Скорссть зтср^чнгау.тиЕНОгс тракггеста .ча" достоверно выше в зритссиитг;с и ГЧК крыс ЭНИ пс гчазнению з соответствующими клетка.».* :-:сыс «V: .

3. Положительная -сррел.гс/!.т .»е.*лу величиной си~?олячеслог з давления и активностьс >>'г" .К*.С1"-хсгранспоргера в эгитрсихга^ у гибридов второго поколе:-:*.? :-. ( 5Н7 т «К": ) звидетельствуе? ; генетической связи между эти ум "арамет-.ами.

4. В эритроцитах зс.-.ару-еен как амилорид-чуз;?2иге-:ькы>; (ННЕ-1), так и амилсрид-резигт=.-=гнь;й Ыа~/Н*-обмен. Ахгиенссть ЫНЕ-1 иэоформы переносчика з зскт-роцигэх 5НИ достоверго ке с тли-

чается от активности в эритроцитах МКУ. Активность амилорид-ре-зистентного На*/Н+-обмена примерно в 1,5 раза выше в эритроцитах 5НЯ по сравнению с ИКУ. Зависимость активности амилорид-резис-тентного Ма+/Н*-обмена в эритроцитах крыс БНИ и ИКУ от величины внутриклеточного рН имела сигмоидный характер, свидетельствующий об аллостерическом характере активации. В случае эритроцитов крыс ИКУ коэффициент Хилла (п=3,4±0,4) был в 2 раза выше по сравнению с эритроцитами БНИ (п=1,7±0,2).

5. Положительная корреляция между величиной систолического давления и активностью амилорид-резистентного Ыа^/Н*-обмена в эритроцитах у гибридов второго поколения Г2(5НЯ*ИКУ) свидетельствует о генетической связи между этими параметрами.

6. В эритроцитах соль-чувствительных спонтгчно-гипертензив-ных крыс (вб) обнаружено крушение стехиометрии транспорта К* и Иа+, осуществляемого На*,К+-насосом. В эритроцитах БЗ К0+/Ма1+=1/3,3, в то время как в эритроцитах соль-резистентных спонтанно-гипертензивных крыс (БЯ) К0 + /Ыа1+ =1/1,7 .

7. Высококальциевая диета (2% СаС03) препятствовала развитию гипертензии у крыс БШ и приводила к снижению концентрации цито-

О 4.

зольного Са в эритроцитах. При этом было обнаружено значительное снижение пассивной проницаемости эритроцитов для Са2*.

8. Высококальциевая диета устраняла как гипертензивное действие плазмы крыс БНИ, так и ее активирующее влияние на скорость Ма*,К+,С1"-котранспорта в эритроцитах крыс У)КУ.

ПЕРЕЧЕНЬ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кузнецов С. Р., Орлов С. Н., Чурина С. К. Влияние низких концентраций кальция и магния в питьевой воде на транспорт

одноваленткых катионов и кальпая б эритроцитах нсс.чотеиэивных — крыс,. Еолл. экспер. биол. и не;. 1551. T.CXI. S. :. С.4"1-4"2.

2. Орлов С. Н., Кузнецов С. ?., Колосова И. А.. У2кзсс= Б.Л.

кролика и крысы: Доказательства существования ;зух независимых ион-транспортирующих систем. Еи;хи.мия . 1534. Т.;?. N.f. С.-39-647.

3- Орлов С. Н., Кузнецсг С. Р., Скрябин Г. A.. 4 = z:-:: = a Т. Л., Покузин Н. И. Особенности сгъея-ззгисимо? гуляния ."стоков натрия и калия в эритроцитах кролика. Биол. мехссгна. 15;:. Г.9. N. 7. С-716-722.

4. Чурина С. К., Янушкене Т. С., Самойлов М. О., Се.-€кзв Д. Г., Кузнецов С. Р., диденко А. В., Пузько С. С. Параде-гз^ьное увеличение Са2 + -связывающей способности стенки ассты :-:рь.-; линии Вистар-Киото при низком содержании Са~ " в питьен:^ гог=. ?изиол. журнал СССР. 1991. Т.77. N.4. С.41-44.

5. Kuznetsov S . , Kolosova :., Orlcv S. Shr: -..-cage - = i Na* transport in rat red blood cells. 12tr. Annual »;гЬга-г Transport Workshop(1994). Montreal. Canada. 18a.

6. Kuznetsov S. R., Orlcv S. N., Tchurir.a 3. K. The effect of dietary calcium on the ion-transport systeas of erythrocytes of normotsnsive and hypertensive rats. Univers:~a csgli s-'jii di Milano. Ricerca Scientifica ed Educazione P-srnaner.te. 1993. Supplemento n.95. A 376.

7. Kuznetsov S. R., Orlcv S. N.. Tchurir.a К. Th= effect of dietary calcium on blood pressure and transport of pc.assium and Ca2* in erythrocytes of spontaneously hyper t=n_3:ve rats. The

possible role of PHF. 3.Cardiovascular Pharmacol. 1=34. V.23. (Suppl. 2). P.S42.

Na*/H*- и Na* ,'Na*-противотранспорт в эритсс_итах

екз