Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Интенсификация технологии получения сычужного фермента

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Интенсификация технологии получения сычужного фермента"

РГЗ о л

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ПО ВЫСШЕМУ ОБРАЗОВАНИЮ МОСКОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЬННАЯ АКАДЕМИЯ ПИЩЕШХ ПРОИЗВОДСТВ

На правах рукописи УДК 577.156.5.66.01

КРЮЧКОВА Юлия Борисовна

ИНТЕНСИФИКАЦИЯ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ СЫЧУЖНОГО ФЕРМЕНТА

Специальность 03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва. 1995

Работа выполнена на кафедре "Биотехнология, экология и сертификг ция пищевых продуктов" Московской государственной академий пищевь производств и на Московском заводе сычужного фермента.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор технических наук, профессор

МОСИЧЕВ Марк Самуилович

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор химических наук, профессор

ЯМСКОВ Игорь Александрович

доктор технических наук НУГМАНОВА Татьяна Алексеевна

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Всероссийский научно-исследовательский

институт мясной промышленности

Защита состоится 1995 г. в. часов на заседг

нии Диссертационного Совета К 063.51.04 Московской государственж академии пищевых производств по адресу: 125080. г.Москва. Волоколам< кое шоссе. 11.

Просим Вас принять участие в заседании Диссертационного Сове' или прислать отзыв в двух экземплярах, заверенных печатью учреждение в Ученый Совет Академии на имя Ученого секретаря Диссертационного С< вета К 063.51.04.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГАПП.

Автореферат разослан 1995 года.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, к.т.н.. доцент

О.И.Тихомирова

....------ --" "" " - 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. В последние годы вопросы производства и применения молокосвертыеакмцих ферментов - необходимого средства при изготовлении сыра, творога и казеина - опять оказались в центре внимания мировой науки'и технологии. Мировое производство сыра неизменно растет и за последний 20 лет ежегодно увеличивается приблизительно на 20%. По мере роста выпуска сыров возрастает спрос и Яа сычужный Фермент. Практически во зсех странах с развитым сыроделием ощущается недостаток классического сычужного фермента. Главным образом, это связано с уменьшением сырьевых источников для его получения - сычужков телят и ягнят в возрасте от трех Дней до четырех месяцев, питавшихся исключительно молоком. Заготовка желудков молочных телят ежегодно снижается, так как в современном животноводстве преобладает тенденция увеличения массы забиваемых животных, в том числе засчет сокращения убоя телят, подсосного периода жизни. Наряду с проблемой количества сычужного ¡кр-ыента возникает и проблема его качества. Желудки более взрослых животных характеризуются пониженным содержанием реннина, повышенным содер-яанием пепсина и нежелательных балластных вещесте . Сычужный фермент, вырабатываемый из таких желудков; менее пригоден для нужд сыроделия, так как не обеспечивает достаточного выхода сыра и требуемых вкуса и консистенции. Кроме того, вместо традиционного способа консервирования сычужков сушкой при 35*С все чаще применяют более быстрый метод - замораживание. В России в условиях вкладывающихся 'рыночных отношений для. небольших мясокомбинатов и убойных пунктов этот способ консервирования сычужков становится единственно приемлемым. Однако, для сохранения активности в замороженных сычугах необходимо строгое соблюдение специальных условий хранения и транспортировки. Существующая технология, сложившаяся еще в 30-е года, не позволяет стабильно обеспечивать установленный выход стандартных препаратов из сычугов такого качества. Все это требует внесения корректировки в сложившуюся технологию получения сычужного фермента с учетом качества поставляемого сырья.

Целью работы явился анализ влияния способа заготовки сырья на выход и качество получаемых препаратов сычужного фермента, а такяе поиск путей интенсификации технологии производства сычужного фермента с учетом реального качества сырья. / Лля достижения поставленной цели решались следующие задачи: х - сравнительный анализ основного сырья для производства сычужнг го фермента, заготовленного способом высушивания и способом за»'' вания: " /

- изучение условий подготовки сырья к экстракции и возможностей его предобработки для облегчения выхода фермента в жидкую фазу;

- исследование влияния технологических параметров процесса экстракции сычужного' фермента на выход и характеристики препарата:

- определение • оптимальных условий выделения реннша из экстрактов сычугов телят и получения готового препарата сычужйого- фермента;

- анализ микробиологического состояния производства препарата сы-' чужного фермента и поиск пут^й снижения бактериальной обсемененности' препаратов из замороженных сычугов.

Научная новизна. Проведен комплексный анализ состояния производства на Московском заводе сычужного фермента (МЗСФ). Предложены научно обоснованные пути интенсификации получения реннина из высушенных и замороженных сычугов. Впервые опробованы варианты предобработки сырья, приводящие к увеличению выхода стандартного препарата: низкотемпературная выдержка в жидком азоте замороженных сычугов. С0Л -обработка высушенных сычугов, введение в экстрагент ауторегуляторного фактора d¡. Экспериментально обосновано уточнение технологических параметров отдельных стадий производства сычужного порошка. Показана эффективность метода рН-активации солеБых экстрактов. Исследованы характеристики готовых препаратов и предложены пути повышения их качества. Для уменьшения бактериальной обсемененности рекомендовано применять кислотный режим экстракции, в состав солевого экстрагента вводить борную кислоту, использовать .замороженные сычуги без дефростации. Изучение состава и 'свойств нерастворимого осадка позволило снизить его долю в готовом препарате засчет осветления экстрактов центрифугированием или ультрафильтрацией через мембрану с порогом отсечения 10000 Д.

Практическая ценность. На основании проведенных исследований и апробации предложены пути интенсификации процесса получения натурального сычужного фермента с учетом реального качества поступающего от заготовителей сырья. Показано, что способ заготовки сычугов определяет особенности протекания процесса -экстракции фермента и характеристики готового препарата. Установлены возможности увеличения выхода стандартного препарата после низкотемпературной выдержки в жидком азоте замороженных сычугов на 20% и более, после С0Л-обработки высушенных сычугов - на 1555 и более, при введении в экстрагент ауторегуляторного фактора djj- на (14-43)55. Проведено сравнительное изучение кислотного и солевого режимов экстракции и выявлены предпочтительные области их применения. Установлено, что солевая экстракция обеспечивает больший -на (24-271 %- выход стандартного препарата. Кислотный режим позволяет

получать препарата с обсененешшстью ниже нормативного показателя. Подобраны значения концентрации н активной кислотности . экстрагекгоз, обеспечивающие наибольший выход фермента и ¡микробиологическую стабильность экстрактов и готовых препаратов. Поддержание значения рН солевого раствора в интервале 5,3-5,5 б течение всего Процесса экстракций увеличивает уровень МСА на (12-13)%. снижение значения -рН раствора соляной кислота до 1,4 приводит к возрастание алтиннпстя ?:?стра;лов 'в Н,'?-2Л) ЬаЗв. »!р*?длсзгно ьзесги е технологическуа схему получения "и,т:ого препарата стадию выдержки экстракта при низком значении рН, обеспечивающую увеличение' молокосвертывавщей активности на (27-37Ж. На основании изучения динамики отдельных стадий экстракции сычужного фермента установлена их оптимальная продолжительность. Обоснованы пути сокращения производственного цикла получения готового препарата засчет исключения' стадии дефростации замороженных сычугов, уменьшения длительности стадий экстракции и формирования осадка ¡Ьермрнт». ПодоЗ¡и условия осаадения Фермента, обеспечивающие наилучшее сохранение активности. Рекомендованы нзменонекня технологического процесса для обеспечения качества препаратов в соответствии с утверзденньик нормативами.

Адфоб&ция работы, результаты работу б или представлены на Кездунв-родной конференции "Научно-технический прогресс в перерабатывающих отраслях ЛПК" (Москьа, 1995) и Международной научно-технической конференции "Прикладная биотехнология на пороге XXI века" (Москва, 1995).

Публикации По материалам диссертационной работы опубликовано 7 работ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит иъ «ведения, обзора литературы, экспериментальной части, включагщеЯ главу о материалах и методах, выводов. списка использованной литературы. Работа изломана на 241 странице машинописного текста, включая 46 таблиц а 16 рисунков. В списке литературы указано 184 источника отечественных и зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Введение

Во введении обоснована актуальность работа и определены основные' задачи исследования.

2. Обзор литературы

В обзоре литературы дана характеристика сычужного фермента - ' состава, свойств и механизма действия. Приведено описание сыр»-' пользуемого для получения препаратов сычужного фермента, р'

способы его заготовки, консервирования, условия хранения и предъявляемые требования. Описаны стадии технологического процесса получения сычужного порошка И требования, предъявляемые к молокосвертывающим препаратам. используемым в сыроделии.

3. Материалы и методы исследований

Объектом исследования служили замороженные и высушенные сычуги телят, которые, используются в качестве сырья на Московском заводе сычужного фермента. Характеристика сычугов приведена в таблице 1.

Препараты сычужного фермента получали согласно технологии МЗСФ. Концентрирование экстрактов методом ультрафильтрации проводили через полиоульфоновый .мембранный Фильтр МБК УФ-120 типа полые волокна производства НПО "Химволокно" г. Мытищи (порог отсечения 30000 Д. поверхность фильтрации 0.025 кв. м. давление в системе 0,05 МПа). Осадок высоленного сычужного фермента отделяли от маточного раствора центрифугированием в течение 15 минут при 6 тыс.об/мин. Сушку отделенного осадка проводили в вакуумном шкафу при давлении -0,1 МПа в течение 20 часов. • '

Анализ сырья, экстрактов, маточных растворов, препаратов сычужного фермента, нерастворимого осадка в препаратах проводили в соответствии со следующими общепринятыми методами и их модификациями:

- определение молокосвертыващей активности по ГОСТ 18302-87 и ТУ 10-02-824-89;

- определение массовой концентрации растворимого белка методом Лоури (Ьо*гу е1 а1.. 1951):

- определение массовой доли общего и минерального азота методом Кьель-даля (ГОСТ 23327-78 И ГОСТ 26889-86);

- определение массовой доли общих липидов весовым методом (Кейтс, 1975);

- определение общего количества углеводов в реакции с фенолом (Гер-хардт. 1984);

- определение общего количества фосфора фотометрически по ГОСТ 9794-74;

- определение- массовой доли влаги методом высушивания до постоянной массы ПО ГОСТ 15113.4-77;

- определение массовой концентрации растворимых сухих веществ на рефрактометре марки РПЛ-3 по ГОСТ 28562-90;

- определение кинематической вязкости с помощью вискозиметра капиллярного стеклянного типа ВГШ-1 (Врио и др., 1962);

- определение величины рН потенциометрически на рН-метре "рН-12Г по ГОСТ 26781-85;

- л -

- определение массовой доли золы по ГОСТ 15113.8-77:

- определение массовой доли нерастворимого осадка и поваренной соли е стандартном препарате по ТУ 10-02-824-89:

- определение массовой доли говяжьего пепсина в стандартном препарате по Стрминскому и Черной (Теплы и др., 1980):

- микробиологические исследования по ГОСТ 9792-73. ГОСТ 9958-81, ГОСТ

20264.1-89.

Обработку экспериментальных данных проводили,с использованием сЗ-щепринятых методос математической статистики.

4. Результаты исследований и т обсуждение

4.1. Анализ сырья для производства сычужного фермента

Качественное сырье является главным условием успешного получения препаратов сычужного фермента. Его пригодность определяется количеством, составом и активностью ферментативного комплекса сычужков. Характеристики желудков существенно зависят от возраста животного к способа консервирования.

Проведенный согласно ГОСТ 10302, а таете по биохимическим и микробиологическим показателям анализ сырья для производства сычужного фермента показал (табл.1), что на МЗСФ поступают сычуги телят крайне разнородные по качеству. Значительную часть сырья - до (30-40) % - составляют нестандартные сычуги: в ферментативном комплексе которых преобладает пепсин. Нарушение условий транспортировки и хранения сычугов приводит к существенному их обсеменению микрофлорой,. которая особенно быстро развивается, на дефростированных желудках. - Это находит свое отражение в большом интервале варьирования показателя обсеменеккости замороженного сырья. Все это. безусловно, сказывается на выходе и качестве производимых препаратов и требует корректировки действующей технологии. •

4.2. Изучение способоа подготовки сырья к экстракции

.. Анализ сложившейся системы подготовки сычугов показал важность этого технологического этапа для сохранения имеющейся активности и успешного проведения экстракции фермента из низкосортного сырья. В первую очередь, это относится к замороженный сычугам. Лля сохранения их активного начала при дефростации и измельчении особенно важно предотвратить интенсивное развитие микрофлоры, приводящее к инактивации фер-/ мента. Полнота извлечения фермента, в конечном счете определяющая ^ ход препарата, зависит от способа подготовки сырья. к

Таблица 1

Биохимические и микробиологические показатели сычугов телят

NN I пп I

Наименование показателей

I Высушенные I сычуги

I Замороженные I сычуги

1. Содержание сухих веществ, • г/кг сырья

2. Содержание "сырого" протеина, г/кг сырья

3. Молокосвертыващая активность, мин

4. Иолокосвертывасщая активность засчет доли говяжьего пепсина, %

5 .Количество мезофильных аэробных и Факультативно-анаэробных микроорганизмов. 10* КОЕ/г сырья

900, 0+1 8.0 165,3+3.3

359.7+27,7 53.3+5.8

5.6+4,3 4,8+3,1

71+7 69+7

1,1-17,3 1,3-50.3

Рисунок 1. Влияние способа предобработки сычугов на выход стандартного ' препарата: из замороженных сычугов без обработки (1). после низкотемпературной выдержки в жидком азоте при -195,8* С (2). обработанных с!д-фактором (3) и высушенных сычугов без обработки (4). после С<\ - обработки (5), обработанных с^-фактором (6).

Изучено влияние степени измельчения сычугов на выход стандартного препарата. Установлено, что при подготовке замороженных сычугов к экстракции солевым раствором следует избегать измельчения как очень крупными частицами (до 1/4 сычугов), что замедляет скорость экстракции, так и мелкой кашицей, что приводит к механическим, потерям .и уменьшению удельной активности фермента. Наилучшим размером частиц можно считать - (1,0-1,5) X (1,0-3.5)см.

Увеличение выхода фермента в жидкую фазу может быть обеспечено дополнительным разрушением клеток тканей или увеличением проницаемости клеточных мембран (рис.1).

С точки зрения организации технологического процесса физическая дезинтеграция клеток представляется наиболее перспективной. Нами были рассмотрены те физические методы воздействия на сырье, которые применимы к клеткам животных тканей, с учетом использованного способа консервирования желудков - температурный шок и шок давлением.

С этой позиции рассматривали низкотемпературную обработку замороженного сырья и установили, что выход стандартного препарата из замороженных сычугов после их низкотемпературной выдержки в жидком, азсте при -195,8' С увеличивается на 20% и более, вероятно,, из-за разрыва клеточных стенок образующимися кристалликами льда.

Влияние предобработки сырья шоком давлением изучали на высушенных сычугах, подвергая их обработке в герметичном сосуде под давлением 6.5 МЛа в атмосфере С(\на опытной установке во ВНИИКОП. Нами установлено, что С0а -обработка облегчает процесс экстракции сычужного фермента, вероятно, вследствие механических разрывов клеток и разрыхления слизистой оболочки желудков. Это выражается в увеличении активности экстрактов на 3555 при солевом режиме и на 52% при кислотном режиме. Кроме того, С04 -обработка влияет на качество получаемых экстрактов засчет снижения содержания в них липидкых компонентов. В результате улучшаются условия выделения препарата. В готовом препарате снижается доля нерастворимого осадка - на (15-18)%. выход стандартного препарата возрастает на 15$ и более. Происходит дезодорация сырья, что обусловлено экстракцией и удалением жиросодержащих компонентов.

В основе биологических и эИзиматических методов обработки сырья лежит воздействие биологически активных веществ на компоненты мембран и клеточных стенок, приводящее к нарушению их целостности и облегчающее тем самым выход Фермента в растеор. В последнее время в биотехн' логии для этой цели широко используются ферментные препараты. О-опробованные нами препараты липазы, гидролизушей г.ложноэфир'

J

в липидах мембран, и лизоцима. воздействующего на пептидогликан клег-точной стенки, выбор которых был обусловлен рН-оптимумом их действия и индиферептностыо к целевому продукту,-" не привели к увеличению выхода стандартого препарата.

Более продуктивным оказался- другой биологический метод обработки сырья - ауторегуляторным фактором . являющимся мембраноактивным метаболитом. участвующим в механизме регулирования деструктивных процессов в клетке и влияющим на текучесть мембран клеток микроорганизмов. Показана возможность аналогичного воздействия с1д-фактора на, цитоплаз-матическую мембрану животных клеток, облегчающего выход сычужного фермента в экстракт. Нами установлено, что независимо от способа заготовки сычугов введение, в экстрагент фактора приводит к увеличению выхода стандартного препарата на (14 - 43)35. Причем эффект от обработки сырья фактором с!а при солевом режиме экстракции сычужного фермента больше, чем при кислотном режиме, а в случае использования замороженных сычугов достигает 14335 от контроля. Определены оптимальная концентрация ауторегуляторного фйктора й и продолжительность его воздействия на сырье: ауторегуляторный фактор необходимо добавлять как на первой, так и на второй стадии экстракции до конечной концентрации в экстрагенте 600 нмоль/куб. см: а концентрация вносимого раствора фактора в этиловом спирте может составлять 855.

4.3. Интенсификация процесса экстрахции сычужного фермента

Экстракция является определяющей стадией процесса получения препарата реннина. Анализ этой стадии показал, что переход фермента в жидкую фазу зависит от режима экстракции и способа заготовки сычугов. Возможные пути интенсификации процесса могут быть связаны как со снижением потерь при экстракции и отделении экстрактов, так и с увеличением выхода фермента в раствор засчет изменения технологических параметров процесса.

Динамика процесса, полнота экстракции и качество готового продукта во многом определяются природой, составом и концентрацией экстра. гента.

Сравнительная характеристика двух режимов экстракции - солевого и кислотного - представлена в табл.2.

Выход стандартного препарата из солевых экстрактов на (24-27)35 выше, чем из кислотных, что связано с частичной инактивацией фермента при длительном контакте с маточным раствором , (рН 1.5). Однако, при кислотном режиме сокращаются перерабатываемые объемы экстрактов - в

к

Таблица 2

Характеристика экстрактов и лрецаратов сычужного фермента, полученных при использовании разных экстрагирующих растворов

NM! Акали-1 пп!зируек.

Показатель

! Замороженные сычуги'.Высушенные сычуги

(Величина' ¡Единица' i f измерения 1 Солевая» !зкстр-л 1 Кислотная! Солевая * !эхстр-я Юкстр-я ¡Кислотная !экстр-я

Объем куб. дм/кг сырья ' 19.6 7.8 80,5 52.5

% от "К" 100 4.0 100 65,

МСА ед/куб. см 1020,1 3662-, 5 ' 1154.7; 3106.2

% от "К" 100 379 100 269 _

ри - 6. 8-7, 2 2.1-3,6 5.6-6.0 1.7-3, 1

Кол-во МАФАМ 10® КОЕ/ до 620000 куб. см. До 5. 2 ДО 20 ДО 4. 1

Масса г/кг сырья 99, 1 85,0 609,2 533.9

% от "К" 100 86 100 91

МСА 10* ед/г препарата 2,20 1,95 2,06 1.65

% от "К" 100 89 100 80

Кол-во нафам 101 КОЕ/г препарата ДО 24 ДО 13 ДО 2,4 ДО 2.2

Выход станд. преп-та г/кг сырья 217.9 165,7 1255.5 913.4

% от "К" 100 76 100 73

2.

Э к с т

Р а к

8.

1

6

7

- зи контроль принят солевой режим экстракции.

(1.5-2.5) раза. Происходит быстрая активация фермента при рН 1,7-3,6. Существенно - до пяти порядков в случае замороженных сычугов- снижается количество микрофлоры в экстрактах. По сумме показателей оба экстрагирующих раствора практически равноценны. Хотя в летнее время года, на наш взгляд, использование в качестве экстрагента раствора соляной кислоты предпочтительнее, так как стабильно позволяет'получать препараты с обсемененностью ниже нормативного показателя. .

Определены оптимальные концентрации экстрагирующих растворов (рис.2). Выявлено, что постепенное повышение концентрации ИаС1 с 5 до .10%, о необходимости которого сообщается в литературе, можно рекомендовать лишь для замороженного сырья. Все стадии экстракции высушенных сычугов следует проводить 10%-м раствором ИаС1. что обеспечивает высокий выход молокосвертывающей активности с единицы сырья и препятствует нарастанию посторонней микрофлоры. В случае кислотной экстракции максимальное извлечение сычужного фермента происходит при использовании в качестве экстрагента раствора соляной кислоты с рН 1,4. При этом значении рН происходит более быстрая активация прореннина, а также более . полный переход фермента в раствор, о чем свидетельствует существенно большее - на (70-80)% - содержание белка в экстрактах.

Вода, применяемая для приготовления экстрагирующего -раствора, должна быть микробиологически чистой и не содержать большого количест-

Рисунок'2. Динамика молокосвертывающей активности экстрактов из высушенных (а) и замороженных (б) сычугов телят: 1 - 5Я ИаС1: 2 - 10* НаС1: 3 - раствор НС1 рН 1.4: 4 - раствор НС1 рН 1.8; 5 - раствор НС1

а б

- 13 - .

ва кальция. Считается, что для это}* цели хорошо подходит дистиллированная вода. Однако, наш установлено, что замена водопроводной воды на дистиллированную практически не сказывается на эффективности процесса экстракции и выходе стандартного препарата с единицы сырья.

По принятой на МЗСФ технологии экстракцию сычужного фермента прч-водят солевым раствором без какой-либо корректировки значения рН. При этом активная кислотность экстрактов внсуЕсшшх сычугов находатсй л интервале рН 5,7-6,0. а замороженных сычугов - с интервале рН 5,37.3, выходящем за пределы области стабильности реннина (5.0-6.0). Нами установлено, что поддержание значения рН экстрагента в интервале 5.35.5 в течение всего процесса солевой экстракции облегчает выход фермента из замороженных сычугов в жидкую фазу и увеличивает уровень мо-локосвертывающей активности экстракта на (12-13)%.

На МЗСФ процесс солевой экстракции из высушенных сычугов ведут при +4.0*С, а из замороженных - при (30,0+2)*С. Нами показано, что как для высушенных, так и замороженных сычугов возможно ведение процесса солевой экстракции при комнатной температуре. Это позволяет упростить аппаратурное оформление процесса и снизить энергозатраты на его осуществление. Повышение температуры процесса экстракции высушенных сычугов до комнатной практически не приводит к возрастанию обсемененности экстрактов. В случае же замороженных сычугов количество микрофлоры в экстрактах даже несколько снижается (с 8,3 х 10¥ до 3,2 х 10*). что не может не отразиться на улучшении качества препаратов.

Существенное влияние на крепость и чистоту получаемых экстрактов оказывает соотношение массы сычугов и экстрагирующего раствора - гидромодуль. Оптимальными для замороженных сычугов следует считать принятые гидромодули 1:10 для солевой экстракции и 1:4 для кислотной экстракции; для высушенных сычугов - гидромодуль 1:30 как для кислотной, так и для солевой экстракции.

Полнота извлечения Фермента из сырья определяется продолжительностью экстракции: переход фермента в жидкую фазу продолжается до тех пор. пока не наступает насыщение экстракта. Скорость и особенности перехода фермента в раствор определяются способом заготовки сырья. Экстракция раствором поваренной соли из . замороженных сычугов протекает значительно быстрее, чем из высушенных (рис.2). Для максимального извлечения фермента экстракция высушенных сычугов солевым раствором на первой и второй стадиях должна продолжаться не менее 20-24 часов. Однако длительность этих стадий можно сократить на 4-6 часов по сравнению с принятой на МЗСФ. Одновременно возможно заменить третью стадию

кратковременной промывкой оставшихся в аппарате сычугов 101-м солевым раствором в объеме (1/3-1/2) от объема экстракта, так как доля фермента. экстрагированного на этой стадии не Превышает 4% от общего количества. Это позволит не только существенно сократить длительность производственного цикла, но и уменьшить перерабатываемые объемы экстрактов, снизить расход поваренной соли и соляной кислоты при осаждении фермента. Во всех остальных режимах экстракции насыщения не происходит при принятой продолжительности первой'стадии процесса (2,5-3.0) часа. Однако, увеличение длительности отдельных стадий экстракции не приводит к возрастании ПСА объединенных экстрактов.

Изучение параметров объединенных солевых экстрактов высушенных сычугов до и после 24-часовой выдержки при 4, О*С показало, что этот технологический прием приводит к. увеличению до 1535 определяемой МСЛ. При этом уменьшается кинематическая вязкость экстракта, облегчая дальнейший процесс выделения фермента. ' Значение рН и обйая бактериальная обсемененность экстракта не изменяются. Выход не стандартного препарата .возрастает на 15-20%. а доля нерастворимого осадка в нем снижается более, чем на 2535. То есть в процессе выдержки происходит "дозревание" экстракта - стабилизация состава, приводящая к увеличению выхода препарата и улучшению его характеристик.

4.4. Интенсификация процесса получения порошка сычужного ферчента

Проведенный анализ стадии получения сычужного порошка из экстрактов показал значимость этого этапа для сохранения активности. Уменьшение суммарной МСА в сухих препаратах по сравнению с влажными на (16-36)3! при снижении содержания белка на (4-24)% ^свидетельствует не только о механических потерях фермента при его сушке, измельчении и стандартизации, но и о частичной его инактивации на этой стадии.

Установлено (табл..З). что свойства экстрактов и. следовательно, параметры процесса осаждения из них фермента не зависят от способа заготовки сычугов, а определяются качеством сырья и режимом экстракции. Осаждение сычужного фермента из солевых экстрактов сопровождается его активацией. Об этом свидетельствует возрастание в препаратах суммарной МСА на (53-112)%. Производство препарата сычужного фермента в жидком виде требует 'специального введения в технологический процесс стадии рН-активации. Выдержка экстракта в течение 30 минут при рН 2,0 с последующим повышением значения рН до 5.2-5,4 обеспечивает увеличение его МСА на (27-37)%. Осаждение фермента из кислотных экстрактов сопровождается потерями активности - (13-33)%. Причиной является час-

Таблица 3*

Характеристика экстрактов сычугов телят

1 ЯН!-' ПП! . 1 Наименование . показателей ! Солевые ! экстракты I Кислотные экстракты

1 Высушенные!Заморожен-!Высушенные 1 Заморожен -! сычуги 1ные сычуги! сычуги !ныа сычуги

1 1 2 1 3 1 4 1 -5 1 6

1. Молокосвертывающая активность.ел/куб.см 1154,7 1020,1 3106,2 3862.5

2. Массовая концентрация белка.мг/куб.см 2,02 1.69 2.93 2.87

3, Активная кисл-ть (рН> 5,7-6,0 6,8-7,2 1,7-3.1 3. 1-3,6

9 4. Кинематическая вязкость, кв. мм/с 1.35 1,48 1,38 1.98

5. Кол- во ИАФАМ,10® КОЕ в 1 куб. см 0.62-20 330-620000 0.15-4.1 1,5-5,2 -

6. Массовая концентрация экстрактивных в-в, мг/куб. см 8.0 8.0 8.0 8,0

7. Массовая концентрация общего азота, мкг/куб.см 789.2 415,3 753.5 552.2

8. Массовая концентрация минерального азота,мкг/куб.ск • 48.3 51.7 21.4 33,3

9. Кассовая концентрация общего фосфора, мкг/куб.см 225,5 241.9 214.6 243,9.

Продолжение'табл. 3

1 1 2 ! 3 1 4 ! 5 1 6

10. Массовая концентра- 283.8 ция общих углеводов, мкг/куб. см 284.8 219.4 216.2

11. Массовая концентра- 185,9 ция лигшдов. мкг/куб. см 384.2 56.7 68,7

12. Массовая концентра- 80.0 ция золы, мкг/куб.см 70.5 1.1 0.8

тичная инактивация фермента вследствие автолиза в результате 'длительного пребывания в среде при рН ниже 2. Эти потери могут быть уменьшены засчет сокращения длительности процесса формирования осадка.

Определены оптимальные условия процесса осаждения ферментй: концентрация хлористого натрия - (18-22)%! рН - 1,3-1.7, температура -(18-22)* С. которые обеспечивают полное'отделение фермента от маточного раствора. Формирование осадка продолжается в течение 48 час. Однако, при этом активность получаемых препаратов падает из-за длительного контакта с маточным раствором (рН 1,5). Выход стандартного препарата практически одинаков при длительности высаливания от 12 до 48 час. Поэтому представляется целесообразным сократить время формирования осадка с 24 час. принятых на МЗСФ, до 12 час. Это приведет к уменьшению производственного цикла и снижению себестоимости препаратов.

Выход стандартного препрарата зависит от состава и свойств сухих веществ -. стракта. При получении препаратов из солевых экстрактов и их концентратов отмечено снижение массы и выхода стандартного препарата по мере разбавления концентрата. Выход же стандартного препарата из концентратов кислотного экстракта возрастает по мере- уменьшения концентрации ^¡активных сухих веществ.' С.разбавлением концентрата происходит более полное осаждение Фермента, что подтверждается увеличением выхода препарата по массе. Известно, что в отличие от изолированной частицы, скорость осаждения которой не зависит от концентрации, суспендированные твердые вещества осажх. штся тем медленнее, чем выше их концентрация в суспензии.

Сушка, -даже сублимационная, применяемая на МЗСФ,также влияет 'на

качество сычужного порошка. Показана возможность снижения до 143?' потерь "активности при суме препарата вследствие максимального удаления остатков маточного раствора и зашиты Фермента добавлением хорошо просушенного измельченного хлористого натрия в соответствии с активностью препарата.

4.5. Пути улучшения качества препаратов скчуягсго gepucwra

f."Tî!irî требовании*, предъявляемым к качеству сычуаного фермента в сыроделии, является его надежность. Она определяется стандартной активностью препарата, его способностью образовывать качественный сгусток, а также стабильность» препарата при хранении и использовании. Образование качественного сгустка при створаживании молока зависит от таких характеристик препарата, как молокосвертывастцая активность зас-чет доли говяжьего пепсина, массовая доля нерастворимого осадка, массовая доля поваренной соли. Стабильность препаратов сычужного фермента определяется прежде "сто их микробиологической чистотой, а также массовой лелей влаги, повышенное содержание которой способствует развитию микроорганизмов при хранении препаратов. Поэтому стабильное обеспечение стандартного качества сычужного порошка является не менее важным направлением интенсификации производства сычужного фермента, чем снижение потерь активности и увеличение выхода стандартного препарата.

Характеристика препаратов, получаемых по действующей на МЗСФ технологии. представлена в табл. 4.

Активность получаемых препаратов сычужного фермента в значительной степени зависит от качества используемого сырья, способа его консервирования и режима экстракции. При солевом режиме экстракции активность готовых препаратов на (11-20)% выше, чем при кислотном. Способ консервирования на активность препаратов влияет в меньшей степени: МСА препаратов из замороженного сырья не более, чем на 1535 превыиает активность препаратов из высушенного сырья. Выход стандартного препарата с единицы сухих веществ сырья и удельная активность препаратов практически не зависят от вида сычугов, однако, по качеству препараты из замороженных сычугов уступают препаратам из высушенного сырья. Доля нерастворимого осадка а них на (23-27)35 выше. Количество МАФАМ больше о (3-4) при кислотной экстракции и в (3-7) раз при солевой экстракции.

Получаемые по принятой на МЗСФ технологии препараты уступают основным техническим требованиям, предъявляемым к сычужному порошку.' Если высокая доля говяжьего пепсина - (60-80)55 - практически полностью определяется качеством используемого сырья, то доля нерастворимого

Таблица 4

Характеристика препаратов сычужного фермента

' ! Наименование ! Кислотная экстракция 1 Солевая экстракция

NN ! показателей

п'я 1 -J Высушенные! Заморожен- !Высушенные!Заморожен-

! ! сычуги !ные сычуги ! сычуги !ные сычуги

1. Выход стандартного препарата, г/кг сухих

веществ сырья 1014.9 1002,4 1395,0 1318,2

2. Удельная молокосвер-тывающая активность.

ед/г белка 1,92 1.80 1,46 1,35

3. МСА засчет доли го-

вяжьего пепсина. 35 75 56 71 69

4. Массовая доля нераст-

воримого осадка. $ 6.7 9.2 6,8 8.9

5. Количество МАФАМ. 101 КОЕ в 1 г препарата 0.3-2.0 1.1-2.0 0.5-2,2 1.7-15.0

осадка и содержание МАФАМ в препаратах могут быть снижены путем внесения в действующую технологию соответствующих изменений.

Основную долю сухих веществ нерастворимого осадка составляют белковые вещества, содержание которых особенно велико в экстратах из высушенных сычугов, - (54-59)%. Снизить долю нерастворимого осадка в препаратах возможно засчет удаления балластных веществ экстракта. Простейшим способом является осветление экстрактов центрифугированием. В резуль-■■те доля нерастворимого осадка в препаратах из кислотных экстрактов снижается нах(14-24при неизменном выходе стандартного препарата. Осветление солевых экстрактов центрифугированием нецелесообразно, так как доля нерастворимого осадка возрастает на (9-21)%.

На следующем этапе балластные вещества из экстрактов удаляли в процессе их ультрафильтрации через мембранный фильтр МБК УФ-120 типа полые волокна с порогом отсечения 30000 Д. Необратимые потери активности ня ::с^0ране составляли (14-15)% для кислотных экстрактов и ■,Ji-j3)S5 для солевых экстрактов. Fit юятно. значение рН экстракта влияет на формирование концентрационного слоя у поверхности мембраны. При практически равной степени концентрирования экстрактов по ебьему -около 5 раз - возрастание удельной активности в кислотных ультраконцентратах было в 1.5-1.6 раза выше, чем в солевых' Это свидетельствует о

более полном удалении балластных веществ и большей степени чистоты концентратов кислотных экстрактов. Потери активности с Фильтратом на этой мембране существенны и составляют (7-10)55 для солевых экстрактов и около 12% - для кислотных экстрактов. Вероятно.это связано с незначительным различием между порогом отсечения мембраны 30000 D и молекулярной массой реннина 30700. D.

На следующем - этапе''' ультрафильтрацию проводили на установке "Mini tan" пластинчатого типа Фирмы "MILLIP0R" через мембраны PLGC ЮООО. Установлено, что мембрана 10000 Д обеспечивает более полное отделение фермента от балластных веществ. В ультраконцентрат пере0Дит (81-91)% активности.в фильтрате МСА практически не обнаружено, а необратимые потери активности на мембране - (8-18)56 - сравнимы с потерями на мембране 30000 Д. Использование мембраны с порогом отсечения 10000 Д обеспечивает снижение массовой доли нерастворимого осадка в препаратах из кислотных экстрактов на(44-64)% при неизменном выходе стандартного препарата. Использование ультракониентратов для получения препаратов сычужного фермента уменьшает объемы перерабатываемых растворов, что сокращает расколы сырья и материалов на стадии осаждения фермента и получения готового препарата.

Источниками обсеменения микроорганизмами препаратов сычужного фермента могут быть сырье и вспомогательные материалы, а также неудовлетворительные санитарно-гигиенические условия производства фермента.

Проведенный микробиологический анализ состояния производства сычужного фермента показал, что общая бактериальная обсемененность высушенных и замороженных сычугов практически одинакова. Количество микрофлоры вспомогательных материалов - воды, хлористого натрия, соляной кислоты -на (3-4) порядка низе, чем основного сырья, и его влияние на обсемененность получаемых препаратов существенно меньше.

Поиск путей снижения общей бактериальной сбсеменености препаратов, сычужного фермента вели в двух направлениях: снижение исходной обсе-меиности сырья и вспомогательных материалов и изменение технологических параметров производства сычужного порошка, приводящее к снижению количества микрофлоры.

Процесс быстрого размножения бактериальной микрофлоры на поверхности сычугов при дефростации может быть успешно приостановлен сокращением длительности и изменением температурного режима размораживания. Возможно полностью исключить стадию дефростации. а проводить непосредственно измельчение замороженных сычугов. При этом обсемененность препаратов, сычужного фермента снижается в (1,4-1,6) раза . что имеет

существенное значение при получении сычужного порошка в летнее время года. .

. Выявлено, что кипячение в течение 20 мин водопроводной воды, используемой для приготовления экстрагента. снижает ее обсемененность почти на порядок и является простым и надежным способом ее обеззараживания. Замена водопроводной воды на свежеперегнанную дистиллированную, в которой отсутствует микрофлора, не оправдывает затраты на ее получение.

Солевые экстракты из замороженного сырья представляют собой полноценную питательную среду с оптимальным значением рН для развития бактериальной микрофлоры. Затормозить развитие микроорганизмов возможно, например, путем снижения рН экстрагента до 5.3-5,5 и понижения температуры процесса экстракции, что приводит к снижению обсемененности экстрактов на порядок. Возможно вводить в состав экстрагента консервирующие вещества, в частности,' борную кислоту, которая в концентрации 3.5Ж снижает количество микрофлоры в экстракте на 2 порядка. Кроме того, введение борной кислоты позволяет обеспечивать поддержание значения рИ в интервале 5,3-5,5 без дополнительной корректировки, что способствует увеличению выхода стандартного препарата. Необходимо подчеркнуть. что уменьшение обсемененности препаратов сычужного фермента имеет не только санитарно-гигиеническое значение. Оно необходимо и для сохранения активного начала препарата, представляющего собой доступам) субстрат для действия, протеаз микроорганизмов.

lía основе выработанных рекомендаций в лабораторных условиях были получены образцы препаратов сычужного фермента из высушенных и замороженных сычугов телят (табл.5 и 6). Выход стандартного препарата возрос во всех опытных образцах. Удалось снизить долю нерастворимого осадка и обсемененчость всех препаратов до уровня ниже нормативного показателя.

Таблица 5

Характеристики опытных препаратов сычужного фермента, полученных по измененному технологическому режиму (солевая экстракция)

NN! ПП! ! ! Показатели ¡Высушенные сычуги 1 Замороженные сычуги

!Наименование!Ед-ца измерения!Контроль 1 ОПЫТ (Контроль ! ! Omrr

1. МСА 10у ед/г пр-та 2,19 . 1.35 2.23 0.95

% от "К" 100 62 100 43

2. Выход по массе г/кг сырья 600,2 1254,4 109,7 321.4

55 от "К" . 100 209 111 293

3. Выход стандартного препарата г/кг сырья 1314,4 1695.6 244.6 • 305.8

55 от "К" 100 129 100 125

4. Массовая доля белка мг/г пр-та 150,8 95.0 165,2 70.4

55 от "К" 100 63 100 92

5. Доля говяжь- * 65,1 55,7 66,0 61,0.

в стандарт-- X от "К" ном препарате 100 101 100 92

6. Массовая до- % 10,8 U.4 12,0 12.4

римого осадка в стандар- % от "К" тном препарате 100 106 100 103

7. Количество МАФАМ 10S КОЕ/Г преп-та' 2.0 1.2 " 2.1 1.8

Таблица 6

Характеристчки/опытных препаратов сычужного фермента, полученных по измененному технологическому режиму (кислотная экстракция)

NN t Показатели 1 Высушенные сычуги ¡Замороженные сычуги

! Наименование! Ед-ца измерения! Контроль ! Опыт ¡Контроль 1 Опыт

1. МСА 10 5 ед/г пр-та 1.65 1.42 2.25 1.44

X от "К" 100 ' 8S 100 64

2. Выход по массе г/кг сырья 558.6 1016.7 73.8 145,4

Х от "К" 100 182 100 197

3. Выход стандартного препарата • г/кг сырья 921.7 1447.1 166.1 209.3

X от -"К" 100 157 100 126

4. Массовая доля белка мг/г пр-та 85.5 71.0. 118.9 71,3

X от "К" 100 ' 83 100 60

5, Доля говяжь- X 63.8 60.6 56.0 58.2

его пепсина -----------------------------------------------------

в стандарт- X от "К" 100 95 100 104

ном пп^парате

6. Массовая до- X 7.3 5.8' 9.8 8.2

ля нераство----------------------------------------.--------------

римого осадка в стандар- Ж от "К" 100 79 100 83 тном препарате

7. Количество 101 КОЕ/г 1.7 1.5 1.8 1.7

МАФАМ преп-та

_________ _ - 23 - -------

ВЫВОДЫ

!. Проведен анализ основного сырья для производства сычужного фермента. Выявлено, что (30-40)35 поставляемых на МЗСФ сычугов являются нестандартными, а-их молокосвертывающая активность засчет доли говяжьего пепсина достигает (62-15)%.

2. Изучены условия подготовки сырья к экстракции. Определена оптимальная степень измельчения замороженных сычугов до частип размере?' (1.0-1.х и.'3-3.5? см. Показана возможное!ь увеличения выхода сычужного фермента в жидкую фазу после низкотемпературной выдержки в жидком азоте замороженных сычугов на 2035 и более, после -обработки высушенных сычугов - на 1555 и более, при введениии в экстрагент ауто-реруляторного фактора в концентрации 600 нмоль/куб. см зкетрагента -на (14-43)55.

3. Проведено сравнение двух режимов экстракции. Установлено, что выход стандартного препарата при солевом режиме на (24-27)% больше, чем при кислотном. Выявлено, что использование кислотного режима позволяет на )-2 порядка снижать общую бактериальную обсемененность экстрактов. обеспечивая значение обсемененности готовых препаратов ниже нормативного показателя. Для кислотного режима экстракции отмечено уменьшение в (1.5-2.5) раза объемов перерабатываемых экстрактов и существенное - в 17.5 раз - сокращение продолжительности стадии экстракции фермента из высушенных сычугов.

4. Определены оптимальные значения концентрации и активной кислотности экстрагирующих растворов. Выявлено, что для экстракции из замороженных сычугов на первой стадии эффективнее использовать экстрагент с концентрацией поваренной соли 5%. на второй - 1035. Все стадии солевой экстракции высушенных сычугов следует проводить 1035-м раствором НаС1. Установлено оптимальное значение рН солевого раствора - 5.3-5,5, что является естественным значением рН при экстракции фермента из высушенных сычугов и обеспечивает увеличение на (12-13)55 выхода фермента в жидкую фазу при экстракции из замороженных сычугов. Показано, что в случае кислотной экстракции максимальное извлечение сычужного фермента происходит при использовании в качестве зкетрагента раствора соляной кислоты с рН 1,4.

5. Показана возможность ведения процесса экстракции при комнатной температруре (18-22)*С. что позволяет упростить аппаратурное оформление процесса и снизить энергозатраты на его проведение.

6. Изучена динамика экстракции сычужного фермента из высушенных и

/

замороженных сычугов различными экстрагирующими растворами. Определена оптимальная длительность каждой стадии экстракции. Предложено сократить длительность каждой стадии солевой экстракции из высушенных сычугов до (18-20) -час. Подтверждена необходимость "дозревания" объединен-" ного солевого экстракта высушенных сычугов.

7. Установлено, что pH-активация позволяет увеличить молокосверты-ващув активность солевых экстрактов на (27-37)%." Для достижения эффекта достаточно выдержки экстракта при pH 2,0 в течение 30 мин.

8. Подобраны оптимальные условия осаждения сычужного фермента из экстрактов: концентрация хлористого натрия (60-70)% от насыщения; значение pH среды 1,3-1.7; температура (18-22)'С; длительность 12 час.

9. Проведен анализ условий сушки препаратов сычужного фермента. Показано, что добавление к высолу перед сушкой измельченной поваренной соли улучшает характеристики препаратов, увеличивая выход стандартного препарата до 14%.

10. Исследованы пути повышения качества препаратов сычужного фермента. Показано, что для кислотных экстрактов возможно снижение доли нерастворимого осадка осветлением экстракта центрифугированием - на (14-24)%, ультрафильтрацией через мембрану с порогом отсечения 10000 Я - на (44-66)%. Установлено, что наряду с применением кислотного режима экстракции использование в составе экстрагента борной кислоти в концентрации 3,5% при солевой экстракции замороженных сычугов снижает об-семе! лность препаратов до нормативного значения.

11. На основании предложенных рекомендаций по изменению технологических параметров процесса получения сычужного порошка из высушенных и замороженных сычугов телят были получены препараты сычужного фермента с улучшенными хаоактеристикг.-"..

Cru;ок работ, опубликованных по материалам диссертации:

1. Крючкова D.Б., Карпова М.А.. Мосичев М.С. Изучение путей интенсификации процесса экстракции сычужного фермента из замороженных сычугов телят. Деп. в ВИНИТИ 01.07.94, H 1632-В94.

2. Крючкова Ю.Б., ГероеваТ.В., Карпова М.А.. Мосичев М.С. Пути интенсификации процесса экстракции сычужного фермента из сухих сычугоз телят. в ВИНИТИ 27.12.94, H 3062-в94.

3. Крючкова D.E.. Никулина О.Б.. Карпова М.А.. Мосичев М.С. Особенности выделения сычужного фермента из экстрактов. Деп. в ВИНИТИ 30.06.95, N 1940-В91.

4. Крючкова D.E., Карпова М.А.. Мосичев М.С. Влияние основного сырья

на качество сычугного фермента. -Хранение и переработка сельхозсырья. 1995, N 4. 49-52.

5. Крючкова В.Б., Никулина о.Б.. Карпова М.А.. Мосичев М.С. Пути по%ы-

шения качества сычужного фермента. .-Хранение и переработка сельхозсырья. 1995, N 5, 37.

6. Крючкова Ю. Б., Карпова М.А.. Мосичев Н. с. Интенсификация Процесса экстракции оычуиного фермента. -Тез. докл. Меня конф. "Нрупгс-тегякчсс-кий прогресс в перерабатывающих отраслях ЛПК".-М.: 1995, с. 96.

7. Крючкова Ю. Б., Карпова М.А., Мосичев М. С..Совершенствование технологии производства сычужного фернента. -Тез. докл. Мевд. конф. "Прикладная биотехнология на пороге XXI века".-Н.: 1995, с. 58.

SUMMARY

The sxlstlng technology of rennet production was thoroughly ftfialysed. The principal raw material - dryed and frozen calf abomsums - v?33 explored. The methods of It pre treatment with d^factor. deep freezing and CO? - treatment was offered. The optima] conditions 'of conduct of extraction, precipitation and drying of rennet enzymes was 'established. The ways of reduction of bacterial seeding of enzyme preparations and :nass quota of insoluble precipitate was offered. Recommended changes of parameters of enzyme obtaining was tested.