Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Интенсификация процесса биодеструкции углеводородов актинобактериями в модельных системах и полевых условиях

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Интенсификация процесса биодеструкции углеводородов актинобактериями в модельных системах и полевых условиях"

На правах рукописи

ХУДОКОРМОВ Александр Александрович

ИНТЕНСИФИКАЦИЯ ПРОЦЕССА БИОДЕСТРУКЦИИ УГЛЕВОДОРОДОВ АКТИНОБАКТЕРИЯМИ В МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМАХ И ПОЛЕВЫХ УСЛОВИЯХ

03.00.23 — биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Ставрополь — 2006

Работа выполнена в Кубанском государственном университете

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент

Карасёва Эмма Викторовна

Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор

Кунижев СМ.,

кандидат биологических наук, с.н.с. Наумов Г.Н.

Ведущая организация: ФГУ "Краснодарский биоцентр"

Защита состоится " июля 2006 г. в / ¿-часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.256.04 при Ставропольском государственном университете по адресу: Россия, 355009, г. Ставрополь, ул. Пушкина 1, корп 2., ауд 506

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ставропольского государственного университета

Автореферат разослан _[_ июня 2006 г.

Учёный секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

Джандарова Т.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Единственным экологически безопасным способом очистки нефтезагрязнённых земель является биоремедиация - применение нефтеокисляющих микроорганизмов, использующих углеводороды в качестве источника углерода. Согласно официальным данным, в настоящее время в России нуждается в биоремедиации 1,2 млн. га земель, пострадавших от различного рода загрязнений. Однако, несмотря на очевидные преимущества использования биоремедиации при реабилитации нефтезагрязнённых экосистем, этот способ имеет один серьёзный недостаток — полный цикл работ при массированном нефтяном загрязнении может составлять 9 и более месяцев. Поэтому основным требованием к современному биоремедиаци-онному процессу является сокращение сроков работ, что принесёт как экологическую, так и экономическую выгоду. Изучение свойств нефтеокисляющих микроорганизмов представляет значительный интерес для задач экобиотехно-логии, поскольку углеводородокисляющие актиномицеты, такие как Rhodococcus, Nocardia, Gordonia, вносят решающий вклад в процессы биоремедиации и восстановление природного биоразнообразия. Понятно, что физиологические свойства нефтеокисляющих актиномицетов зависят от целого ряда биотических и абиотических факторов, изучение которых необходимо проводить не только применительно к определённым штаммам микроорганизмов, но и к определённым углеводородным загрязнителям. Знание оптимальных количеств биогенных элементов позволит производить корректировку условий существования интродуциро ванных штаммов акганобакте-рий в процессе биоремедиации in situ, что предотвратит внесение избытка удобрений, особенно нитратов и сократит сроки работ.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение основных параметров роста культур нефтеокисляющих актинобак-терий в зависимости от условий культивирования и углеводородного загрязнения, с целью разработки системного подхода к биологической очистке нефтезагрязнённых почв и нефтешламов в производственных условиях и отбора штаммов нефтедеструкторов для создания на их основе биопрепарата для очистки уппеводородзагрязнённых экосистем. В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1) изучить особенности роста штаммов актинобактерий при использовании различных углеводородов;

2) выяснить показатели температуры и величины рН, позволяющие добиться максимальной деструкции различных углеводородов исследуемыми штаммами актинобактерий;

3) выбрать источник углерода, позволяющий получать наибольшее количество биомассы с высокой нефтеокисляющей активностью;

4) определить количественное потребление фосфора и различных источников азота при деструкции углеводородов в модельных системах;

5) изучить устойчивость к тяжелым металлам штаммов микроорганизмов при культивировании их на среде с различным источником углерода;

6) отобрать штаммы, на основе которых возможно создание биопрепарата для очистки объектов окружающей среды от нефтепродуктов;

7) оптимизировать метод очистки нефтешламов от углеводородов и определить его эффективность в модельном эксперименте и полевых испытаниях;

Научная новизна. На основании анализа роста исследуемых культур на различных источниках углерода предлагается использовать в качестве источника углерода для получения большого количества высокоактивной биомассы актинобактерий растительное масло. Впервые показана взаимосвязь между источником углерода и устойчивостью к тяжелым металлам используемых штаммов микроорганизмов. Установлено, что ускорение утилизации различных фракций углеводородов требует внесения различных источников азотного питания. Определено количественное потребление азота и фосфора при деструкции углеводородов исследуемыми штаммами актинобактерий в модельных системах. Намечены пути корректировки физико-химических характеристик нефтешлама в полевых условиях, что позволило сократить сроки очистки с 9 до 4-6 месяцев. Часть исследований проведена в рамках гранта ШТАБ 01 -2150.

Практическая ценность работы. В результате научных исследований установлены индивидуальные особенности нефтеокисляющих штаммов актинобактерий, определены оптимальные источники азотного питания и их минимально необходимы количества, что позволило отобрать наиболее активный штамм-деструктор нефтепродуктов ЫосагсПа эр. 12, подходящий в качестве основы для создания биопрепарата. Предложенный подход к очистке нефтешлама применялся сотрудниками центра "Биотехнология" Кубанского госуниверситета при проведении работ по микробиологической очистке нефтешламов на территориях ЦДНГ-2 площадь Смоленская и площадь Зыбза ОАО "НК"Роснефть-Краснодарнефтегаз" (договора №№. 57Ц/03,58Ц/03). В процессе работ на площади Смоленская удалось сократить срок очистки нефтешлама от углеводородов с 9 до 4 месяцев, что позволило провести три цикла работ на одной площадке в течение календарного года. На площади Зыбза удалось сократить сроки очистки

нефтешламов длительного хранения, содержащих тяжёлые металлы с 9 до 6 месяцев. Благодаря дозированному внесению азотно-фосфорных удобрений содержание нитратов в получившемся после очистки шлама фунте не превысило фоновых значений, характерных для данной местности. Эффективность очистки превысила 90%.

Основные положения диссертации, выносимые tf А защиту.

1. исследование штаммов актинобактерий коллекции КубГУ на способность к ассимиляции нефтепродуктов в различных условиях;

2. исследование интенсивности биодеструкции углеводородов в зависимости от их качественного и количественного состава;

3. определение оптимальных параметров для биодеструкции нефтепродуктов в полевых условиях;

4. использование системного подхода к очистке нефтешламов от углеводородов, позволяет сократить сроки проведения работ.

Апробация работы и публикации. Основные результаты исследования были представлены на следующих конференциях: I Международная межвузовская школа — семинар "Экология -2000" (Москва, 2000); XIII межреспубликанская научно-практическая конференция "Актуальные вопросы экологии и охраны природы экосистем южных регионов России и сопредельных территорий" (Краснодар, 2000); "Экологические проблемы Кубани" (Краснодар, 2001); международная школа-конференция "Биология — наука XXI века" (Пущино, 2002); всероссийская конференция "Биоповреждения - 2002. Современные проблемы биологических повреждений материалов" (Пенза, 2002); международная конференция РАН "Проблемы рекультивации нарушенных земель промышленностью на рубеже 21 века" (Санкт-Петербург, 2002); 1st European microbiological congress (Slovenia, 2003); материалы II Московского международного конгресса "Биотехнология состояние и перспективы развития" (Москва, 2003); 2-й съезд общества биотехнологов России (Москва, 2004); международная конференция "Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды" (Саратов, 2005); 2nd European microbiological congress (Spain, 2006). По материалам диссертации опубликовано 17 работ.

Объём и структура работы. Диссертация состоит из введения, глав обзора литературы, материалов и методов, собственных исследований, заключения. Работа изложена на 152 листах машинописного текста, содержит 20 рисунков 18 таблиц и 13 приложений. Список цитируемой литературы включает 184 наименования, в том числе 127 зарубежных источников.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. Объектом исследований послужили 6 наиболее активных штаммов нефтеокисляющих актинобактерий, 3 из которых относились к S-формам (Nocardia sp. J2, Rhodococcus erythropolis B2, Rhodococcus erythropolis Fl), оставшиеся (Gordonia sp. Z7, Dietzia maris Jl, Rhodococcus sp. J8) к R-формам. Штаммы были выделены из нефтезаг-рязнённых объектов на территории Краснодарского края.

Питательные среды и субстраты, условия культивирования бактерий. Бактерии культивировали на питательном агаре, питательном бульоне, м инеральной среде следующего состава (г/л): KNQ, - 4 (NH4C1—2,2; КС1 - 2,5); Na2HP04-12Нр -1,4; КН2Р04 - 0,6; MgS04-7fl20 - 0,8; стандартный раствор микроэлементов (из 10 элементов) — 1 мл на 1 л среды. В экспериментах использовали отличающиеся варианты этой среды. В качестве источника углерода вносили стерильное растительное масло или углеводороды в количестве 0.1, 1, 5, 10% об. Культивирование проводили при комнатной температуре в условиях аэрации на орбитальных качалках или ферментёре АК 210 до достижения культурой ранней стационарной фазы, либо до потребления 50% субстрата, либо до его полного исчерпания.

Оценка эффективности биоремедиации нефтезагрязнённых субстратов. В модельных экспериментах определяли, убыль нефтепродуктов и биогенных элементов как показатели, свидетельствующие о протекании процесса биоремедиации. Концентрацию нефтепродуктов определяли гравиметрически, концентрацию биогенных элементов - флуориметрически.

Математическая обработка результатов. Статистическая обработку данных осуществляли средствами программы STATIST1CA 6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Особенности роста исследуемых штаммов при использовании различных источников углерода.

Знание закономерностей роста исследуемых штаммов актинобактерий позволяет интродуцировать в нефтезагрязнённый объект, а также использовать в процессе биоремедиации микроорганизмы, находящиеся в ранней стационарной фазе роста, как оптимальной для наибольшей деградации углеводородного загрязнителя. Наблюдения за ростом вели не только для понимания смены условий и реакции на них клеток, но и в связи с

деградацией того или иного углеводорода. Сравнение удельных скоростей роста (рис. 1) показало, что при любом источнике углеводородного субстрата Б-формы бактерий проявляют более высокую скорость роста по сравнению с Я-формами. Для всех исследуемых культур максимальная уцельная скорость роста была отмечена на среде с дизельным топливом, наименьшая удельная скорость роста отмечена на среде с мазутом. Исключение составляет штамм Шюс!ососсш егу&гороИв В2, для которого удельные скорости роста при культивировании на среде с нефтью и мазутом были одинаковы, а также культура Т^осагсНа ер. 52, для которой удельная скорость роста на среде с мазутом была выше, чем в аналогичной среде с нефтью.

0,3 ■ 0,25

я

" 0,1

0,05

шшлш

л4

л"-

<5*

о*

□ днзтогошво В нефть ■ мазут ]

Рисунок 1 — Максимальные удельные скорости роста культур актинобактерий при культивировании на различных субстратах.

В процессе культивирования было отмечено, что у Э-форм была выше максимальная удельная скорость роста, для них характерна более короткая фаза логарифмического роста и более продолжительное пребывание клеток в стационарном состоянии. В опытах с использованием в качестве субстрата нефти и мазута Б-формы актинобактерий быстрее адаптирова-. лись к условиям среды, что проявлялось в уменьшении продолжительности фазы задержки роста.

В связи со сходными метаболическими путями расщепления микроорганизмами углеводородов и растительного масла, последнее было выбрано нами в качестве возможного субстрата для выращивания накопительной культуры.

При культивировании микроорганизмов на богатой среде, такой как питательный бульон, для всех используемых в эксперименте штаммов удается получить максимальное количество биомассы, без существенных различий между Б и Л-формами (табл. 1). В варианте, когда в качестве единственного источника углерода и энергии используется гекса-декан количество клеток значительно ниже, чем в варианте с питательным бульоном.

Таблица 1 - Влияние источника углерода на выход биомассы актинобактерий, клеток/г.

Штаммы С реда культивирования

Питательный бульон Минеральная с гексацеканом Минеральная с растительным маслом

Rhodococcus erythropolis F1 5,0* 10" 7,3 »108 3,0*109

Rhodococcus erythropolis B2 4,2* 10® 8,4* 10s 5,5*109

Nocardia sp. J2 4,5« 10" 6,3* 10s 3,8*109

Dietzia maris J1 5,2« 109 3,7*107 8,6* 10s

Gordonia sp. Z7 6,3*108 6,8*107 9,3*108

Rhodococcus sp. J8 3,0* 109 5,4*106 1,0*109

При переносе микроорганизмов из среды с питательным бульоном на среду с нефтью у представителей S-форм (Rhodococcus erythropolis Fl, Rhodococcus eiythropolis B2 и Nocardia sp. 32) снижение нефтеокисляю-щей активности не превышало 15%, в то время как у R-форм деструкция углеводородного субстрата снижалась не менее чем на 25%.

Использование в качестве источника углеродного питания растительного масла позволяет получать такое же количество биомассы, как и в варианте с питательным бульоном, причём нефтеокисляющая активность культуры остается неизменно высокой. При использовании растительного масла также значительно снижается риск заражения культуры посторонней микрофлорой, что немаловажно при промышленном производстве биопрепаратов, основанных на нефтеокисляющих микроорганизмах, а также при активации естественной нефтеокисляющей микрофлоры в условиях биоремедиации in situ.

ИЗУЧЕНИЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ШТАММОВ НЕФТЕОКИСЛЯЮЩИХ АКТИНОБАКТЕРИЙ

Определение спектра потребляемых углеводородов.

В качестве единственного источника углерода использовали наиболее распространённые полтотанты, такие как сырая российская нефть, топочный мазут М40, дизельное топливо, авиационный керосин, минеральные масла марок М8 и М10 и эмульсол, представляющий собой смесь веретенного масла и высокомолекулярных жирных кислот. При деградации нефтепродуктов с превалирующим содержанием легких фракций (нефть, дизельное топливо и керосин), наблюдается одинаково высокая нефтеокис-ляющая активность у всех исследуемых штаммов актинобактерий (табл. 2).

Таблица 2 — Степень утилизации (%) нефтепродуктов и минеральных масел, исследуемыми штаммами актинобактерий

Штамм . Углеводородный субстрат 0.1%

Керосин Дизто-пливо Нефть Масло М8 Масло М10 Эмульсол Мазут

Rh. erythropolis F1 88 97 93 81 80 80 93

Rh. erythropolis B2 85 97 96 57 59 73 84

Nocardia sp. J2 79 84 91 83 78 85 92

Dietzia maris J1 76 89 92 45 39 59 77

Gordonia sp. Z1 76 88 82 47 44 63 83

Rhodococcus sp. J8 78 94 94 39 42 64 73

контроль 5 6 9 5 8 2 3

Углеводородный субстрат 1 %

Rh. erythropolis F1 87 95 96 84 87 82 86

Rh. erythropolis B2 89 90 92 59 63 65 82

Nocardia sp. J2 79 88 86 78 84 80 91

Dietzia maris J1 69 73 78 50 41 45 ■ 68 ■

Gordonia sp. Z7 79 86 72 37 42 29 61

Rhodococcus sp. J8 55 71 75 43 41 50 73

контроль 3 5 2 2 5 4 3

Углеводородный субстрат 10%

Rh. erythropolis Fi 63 76 63 56 51 56 59

Rh. erythropolis B2 49 51 48 47 43 34 45

Nocardia sp. J2 50 59 65 52 57 51 52

Dietzia maris J1 36 . 44 31 32 34 19 22

Gordonia sp. Z7 33 39 34 30 22 14 26

Rhodococcus sp. J 8 34 36 34 35 29 18 29

контроль 2 2 3 3 4 2 2

Степень деструкции исследуемых субстратов колеблется у разных штаммов от 76 до 96%: При переходе к минеральным маслам или нефтепродуктам, содержащим большее количество высокомолекулярных углеводородов (эмульсол и мазут), более высокую активность показывают штаммы, выделяющие поверхностно-активные вещества. Наиболее показательны в этом плане штаммы ЫосагсНа ер .12 и Юю<!осоСси8 егуЙггороНз П, проявляющие способность к продукции бйосурфактантов, чем объясняется наивысшая степень деградации ими всех высокомолекулярных углеводородов.

При однопроцентной концентрации углеводородов в среде, происходит разделение штаммов на две четко обособленные группы. У актинобактерий П, В2,12, выделяющих экзополисахариды (Б-формы) нефтеокисляющая активность по отношению ко всем используемым в эксперименте углеводородам существенно выше, чем у не выделяющих экзополисахариды микроорганизмов Л, 7Л, 18 (Я формы). Обособленность в нефтеокисляющей активности Б- и Я-культур сохраняется и при 10% концентрации углеводородов в среде. В особенности большая разница была между штаммами, выращенными на труднодеградируемых субстратах, содержащих высокомолекулярные углеводороды. Самым труднопотребляемым субстратом оказались минеральные масла вне зависимости от их марки. К активной деструкции минеральных масел оказались способны лишь два штамма Шюскюоссш егуйгороНэ П и ЫосагсНа ер. 32, что даёт возможность эффективного использования данных культур как индивидуально, так и в составе консорциумов при ликвидации загрязнения субстрата минеральными маслами или их компонентами.

Определение оптимальных температур и величин рН.

Температура и величина рН в объекте, подвергаемом биоремедиации, может значительно колебаться в течение сроков проведения работ; что требует постоянного контроля и своевременного внесения корректив в процесс биоремедиации. Культуры актинобактерий исследовали на предмет способности разрушать дизельное топливо, нефть и мазут при температуре +4 ,+23, +42°С. В результате эксперимента нами было установлено, что при 23 °С углеводороды разрушают все культуры микроорганизмов, участвующие в эксперименте. Термотолерантных микроорганизмов обнаружено не было. При пониженных температурных значениях способность к потреблению углеводородов сохранили только штаммы Шюёососсиэ егуЛгороШ Р1 и Шюскэсоссш егуЙ1 городе В2.

Зависимость степени деградации углеводородов от величины рН у исследуемых штаммов актинобактерий была определена методом острых опытов. В зависимости от варианта опыта в среду добавляли один из трёх углеводородных субстратов: дизельное топливо, нефть или мазут.

В результате серии проведенных экспериментов установлено, что потребление углеводородов всеми изучаемыми штаммами актинобактерий воз-

можно в диапазоне рН от 4,5 до 9,0. Наибольший процент деструкции дизельного топлива отмечается при нейтральной или слабощелочной величине рН. Максимальная степень деструкции была отмечена при нейтральной величине рН у штамма Rhodococcus erythropolis F1 и составляла 96%. При кислом и щелочном значении рН, равном 4,5 и 9,0 единиц соответственно, три штамма исследуемых актинобактерий (Rhodococcus sp. J8, Dietzia maris Ли Gordonia sp. Z7) прекратили потребление субстрата из среды. Культуры Rhodococcus erythropolis Fl, Rhodococcus erythropolis B2 wNocardia sp. J2 существенно снизили, но не прекратили потребление углеводородов. Утилизация ими нефтепродукта колебалась от 16-18% в щелочной среде до 21-26% в кислой. Характерно сохранение высоких уровней деградации дизельного топлива всеми исследуемыми штаммами актинобактерий при подкислении среды до 5,5 единиц рН. Таким образом, значительные колебания кислотно-щелочного равновесия среды от 5,5 до 7,5 единиц, не оказывают существенного ингибиругощего эффекта на потребление дизельного топлива культурами исследуемых актинобактерий, что делает возможным их применение при проведении процессов биоремеди-ации в различных почвенных условиях. При определении активности нефтеокис-ляющих актинобактерий в отношении деградации нефти установлено, что потребление углеводородного субстрата идёт с меньшей интенсивностью по абсолютным величинам, чем дизельного топлива, но основные закономерности потребления субстрата при различной величине рН сохраняются. Ушеводоро-докисляющая способность в отношении мазута была ниже, чем в отношении более легко деградабельных субстратов (дизельное топливо, нефть), что объясняется сложностью потребления тяжелых углеводородных фракций, входящих в состав мазута и их токсическим действием на микроорганизмы. Потребление мазута в качестве источника углерода и энергии при различных величинах рН характеризуется резким спадом нефтеокисляющей активности при переходе от слабокислых к кислым значениям рН (табл. 3).

Таблица 3 — Влияние рН среды на деструкцию (%) мазута штаммами актинобактерий

Штамм величина рН

4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5

Rhodococcus erythrop. Fl 2 2 19 25 34 48 57 78 80 53 21 3

Rhodococcus erythrop. B2 2 3 17 19 35 49 55 79 79 57 20 2

Nocardia sp J2 2 1 10 26 39 46 55 78 81 51 18 2

Dietzia maris J1 1 3 2 10 17 32 40 68 71 37 11 1

Gordonia sp. Z7 1 2 5 9 19 31 42 61 76 37 9 1

Rhodococcus sp. J8 3 2 2 7 19 37 42 73 78 42 9 3

контроль 2 2 3 1 1 3 1 3 1 1 2 2

Следует отметить штаммы Шюсккоссш егуЛгоро]^ и !ЫосагсНа Бр. 12, сохраняющие способность к деградации почти 20% исходного углеводородного субстрата при рН равной 5,5 единицам. Подщелачивание среды до рН 8,0 приводило к увеличению деградации мазута, что вероятно связано с лучшей его эмульгацией на первых этапах культивирования. При проведении работ по биоремедиации с использованием исследуемых штаммов нокардиоморфных актиномицетов, наибольшая нефтеокисляющая активность в отношении дизельного топлива и сырой нефти наблюдается в диапазоне рН от 6,5 до 7,5, а наилучших результатов при деградации мазута удаётся добиться, подщелачивая среду до рН равной 8 — 8,5 единицам.

Определение потребления азота и фосфора при деградации углеводородов.

Зная потребности микроорганизма в биогенных элементах можно вносить эти элементы в объект, подвергаемый биоремедиации, в строго необходимых количествах, что позволит избежать накопления в среде избыточных количеств компонентов удобрения, особенно нитратов. В качестве элементов азотного питания были выбраны нитраты и соли аммония как наиболее часто встречающиеся компоненты стандартных промышленных образцов минеральных удобрений (аммофос, аммиачная и калийная селитры). Сопоставив количества азота и фосфора, необходимые для потребления 1 г углеводорода, нами выявлены некоторые закономерности в соотношении этих элементов (табл. 4).

Таблица 4 — Соотношение между С:№Р при потреблении углеводородов исследуемыми штаммами актинобактерий

Дизтопливо Нес] )ТЬ Мазут

Штамм 1% 5% 1% 5% 1% 5%

нитратный источник азота

Р1 100:3:1 30:4:1 100:3:1 30:4:1 100:3:1 30:4:1

В2 30:3:1 20:4:1 30:3:1 20:4:1 30:3:1 20:4:1

12 100:3:1 100:3:1 100:3:1 50:2:1 100:2:1 50:2:1

Л 100:7:1 20:4:1 50:4:1 20:4:1 100:7:1 20:4:1

¿7 50:2:1 15:2:1 50:2:1 30:4:1 50:2:1 20:2:1

.18 100:10:1 20:4:1 100:10:1 20:4:1 100:10:1 20:4:1

аммиачный источник азота

Р1 100:2:1 30:6:1 100:2:1 30:6:1 100:2:1 30:6:1

В2 30:6:1 20:8:1 30:6:1 20:8:1 30:6:1 20:8:1

п 100:4:1 50:10:1 100:4:1 50:10:1 100:4:1 50:10:1

Л 100:5:1 20:4:1 100:5:1 20:4:1 100:5:1 20:4:1

7.1 50:3:1 20:6:1 50:3:1 20:6:1 50:3:1 20:6:1

18 100:4:1 20:6:1 100:4:1 20:6:1 100:4:1 20:6:1

Эти результаты позволили выделить из общей группы два штамма Rhodococcus erythropolis Fl, Nocardia sp. J2, обладающие наименьшими потребностями в азоте (как аммонийном так и нитратном) и фосфоре, что делает их использование в процессах биоремедиации экосистем наиболее эффективным и экономически оправданным. Так, руководствуясь рекомендациями Morgan и Walkinson (1989), для ассимиляции 1 грамма нефти в очищаемый субстрат необходимо добавить 111 мг азота, Ильинского (1991) — 80 мг, в нашем же случае при условии использовании штамма Nocardia sp. J2 всего 30 мг.

Влияние источника углерода на устойчивость штаммов актинобактерий к тяжёлым металлам.

Перспективы возможного использования исследуемых штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов в процессах очистки нефтешла-мов, предопределили необходимость исследования устойчивости коллекционных штаммов к тяжелым металлам. Было изучено действие на развитие бактерий ионов меди, свинца, цинка, ртути, хрома и кобальта, как наиболее часто встречающихся в нефтешламах. При использовании в качестве источника углерода дизельного топлива для S-форм исследуемых микроорганизмов (Rhodococcus erythropolis Fl, Rhodococcus erythropolis B2, Nocardia sp. J2) отмечалось снижение устойчивости к большинству. используемых металлов по сравнению с опытом, где в качестве'источника углерода использовалась сахароза. Устойчивость оставшихся штаммов сохранялась на прежнем уровне. При культивировании бактерий в среде, содержащей сырую нефть, наблюдалось практически двукратное увеличение чувствительности к тяжёлым металлам R-форм актинобактерий (Dietzia maris Jl, Gordoiia sp. Z7, Rhodococcus sp J8), в то время как S-формы, наоборот, стали проявлять нефтеокисляющую активность при более высоких концентрациях металлов в среде. В вариантах сред с мазутом резистентность к солям тяжёлых металлов снижалась у всех исследуемых культур актинобактерий, что объясняется дополнительным негативным воздействием на клетки высокомолекулярных углеводородных фракций. Но, несмотря на это, штаммы Rhodococcus erythropolis Fl, Rhodococcus erythropolis B2, Nocardia sp. J2 при культивировании на среде с мазутом обладали более высокой устойчивостью к солям тяжёлых металлов, чем при культивировании на среде с сахарозой. Возможно, это связано с ненаправленным протектирующим действием экзополисахаридов, в больших количествах продуцируемых S-формами. Вне зависимости от используемого источника углерода для всех исследуемых штаммов наиболее токсичным металлом оказалась медь.

Биодеструкция углеводородов в модельных системах и полевых условиях

В качестве модельных систем выступали чернозём и нефтешлам. В первом варианте эксперимента в пгиняные ёмкости объемом 3000 см3 поместили 1500 см3 кубанского чернозёма, искусственно загрязнённого сырой российской нефтью и мазутом М40 в концентрациях 5%, а во втором — 1500 см3 нефтешлам а, смешанного с минеральным грунтом в соотношении 1:1. В качестве интродуцента использовали штамм >1осагсНа ер. 12. Результаты работы по моделированию процесса биоремедиации почвы представлены на рисунке 2.

мд»лн

Д ■ опыт нефть ■ - — контроль нефть —А— опыт мазут —л— контрогъ мазут |

Рисунок 2 — Динамика содержания нефтепродуктов в почве , в процессе моделирования процесса биоремедиации.

В экспериментальных вариантах скорость деградации нефтепродуктов штаммом ТЧосагсКа 12 выше, чем в контрольных, что подтверждается статистически. В экспериментальных модельных системах уже к 7 неделе удалось добиться результатов, полученных к 12 неделе контрольного эксперимента. А к моменту окончания опыта по моделированию процесса биоремедиации степень деградации углеводородов была выше на 20% по сравнению с контролем.

При моделировании процесса очистки нефтешламов от углеводородов начальная концентрация нефтепродуктов в среде составила 147 г/кг. В данном варианте на основании предыдущих исследований начальная величи-

на рН была сдвинута относительно контроля в щелочную облаёть и составляла 8,0 единиц. В связи с высокой токсичностью субстрата процесс деградации углеводородов в нефтешламе протекал более медленно, чем в вариантах с почвой (рис. 3). К окончанию опыта эффективность очистки в экспериментальном варианте составила 63% против 36% в контроле. Таким образом, применение системного подхода к деградации углеводородов позволило повысить эффективность и скорость процессов микробиологической очистки нефтезагрязнённых субстратов в модельных экспериментах.

недели

^—»—опыт нефташлам ■■■■—контроль нефташлам [

Рисунок 3 — Динамика содержания нефтепродуктов в нефтешламе в процессе моделирования процесса биоочистки.

Полученные в лабораторных и модельных экспериментах данные были опробованы на практике при проведении полевого эксперимента, который осуществляли в рамках договора № 57Ц/03, заключенного между ОАО "НК"Роснефть-Краснодарнефтегаз" и центром "Биотехнология" КубГУ, на территории ЦДНГ-2 площадь Зыбза. Объектом послужили нефтешламы с начальным содержанием углеводородов — 454,0 г\кг образца. Нефтешлам распределили слоем 0,4 м и разделили на два контрольных участка и один экспериментальный. Экспериментальный участок обрабатывался биомассой >ГосагсНа 12 и удобрениями согласно ранее проведённым исследованиям. Первый контрольный участок регулярно обрабатывали биомассой. Во второй контрольный участок вносили только минеральные удобрения.

На экспериментальном участке была проведена корректировка начальной величины рН с 6,7 до 8,0 единиц.

Динамика снижения концентрации нефтепродуктов в составе не фте шлама представлена на рисунке 4. На экспериментальном участке процесс очистки нефтешлама протекал гораздо интенсивнее, чем на двух контрольных. Через месяц после начала эксперимента на этом участке было утилизировано углеводородов на 20% больше, чем в контрольных условиях, а к концу эксперимента разница составила около 80%.

месяцы

- - контршъ 1 - ку/ьтура ЫосагсНа ¿2 ■ Контроль г -карбамид и аммофос

—*—оптмлиэированм>|в условия

Рисунок 4 — Динамика процесса микробиологической очистки нефтешлама на полигоне НГДП-2 площадь Зыбза. .

В сентябре, спустя 6 месяцев после начала работ, концентрация углеводородов на экспериментальном участке была снижена до 9 г/кг, в то время как на контрольных участках 1 и 2 содержание нефтепродуктов составляла 69 и 51 г/кг соответственно. В связи с приближением сроков окончания договора 57Ц/03 в октябре было решено объединить экспериментальный участок с контрольными и проводить очистку всего объёма в оптимизированных условиях. После объединения содержание углеводородов в усреднённой пробе составило 29г/кг. Количество нефтепродуктов по окончании работ в усреднённой пробе составило 8,48 г/кг. Это позволило рекомендовать использовать полученный грунт для технико-хозяйственных нужд на территории предприятия.

В рамках договора № 58Ц/03, заключенного между ОАО "НЮ'Роснефть-Краснодарнефтегаз" и центром "Биотехнология" КубГУ, на территории ЦДНГ-2 площадь Смоленская, бьши проведены дальнейшие исследования. Начальная концентрация углеводородов в нефтешламе составляла 192 г/кг. В связи с ограниченностью территории была заложена одна экспериментальная площадка, на которой нефтешлам обрабатывался, согласно исследованиям, проведённым на предыдущих этапах работ. Уже к концу девятой недели эксперимента концентрация нефтепродуктов составляла 16 г/кг, что позволило использовать очищенный грунт для технических целей на территории предприятия, а на освободившееся место завезти вторую порцию нефтешламов с концентрацией нефтепродуктов 127 г/кг, очистка которых осуществлялась уже по отработанной схеме (рис. 5). К концу 12 недели остаточное содержание углеводородов составило 20 г/кг. Мягкие климатические условия в осенне-зимний период позволили провести очистку третьей порции нефтешлама, с концентрацией нефтепродуктов 186 г/ кг. Процесс очистки протекал более интенсивно в начальной стадии и несколько замедлился в последние две недели работ, что объясняется не только увеличением в очищаемом грунте доли тяжёлых углеводородных фракций, но и существенным снижением температуры окружающей среды. По окончании 12 недели работ концентрация нефтепродуктов в очищенном фунте не превышала 14 г/кг. Весь полученный после очистки нефтешла-ма грунт использовался в технических целях на территории предприятия.

недели

•—"— первый завоз нефте шлам а —х- - ■ третий завоз нефте шлама

второй завоз нефте шлама

Рисунок 5 — Динамика процесса микробиологической очистки нефтешлама на полигоне НГДП-2 площадь Смоленская.

Использование предлагаемого подхода к очистке нефтешлама на территории НГДП-2 площадь Зыбза позволило сократить, на территории НГДП-2 площадь Смоленская срок очистки сократился с 9 до 4 календарных месяцев, что дало возможность провести на одной площадке биоочистки три цикла работ в течение одного календарного года.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что при использовании в качестве субстрата углеводородов для Э-форм актинобактерий характерны более короткая фаза логарифмического роста и более длительное пребывание клеток в стационарном состоянии по сравнению с Я-формами.

2. Показано, что при выращивании инокулята максимальная численность и высокая степень деструкции углеводородов актинобактериями родов ИюсЗососсш, №>саг(Иа, Согс1оша, В1еЫа проявляется при использовании в качестве источника углерода растительного масла.

3 - Доказано, что в ходе биоочистки от нефтепродуктов грунтов и неф-тешламов, содержащих тяжёлые фракции углеводородов, необходимо увеличивать начальную величину рН до 8 единиц.

4. При обеспечении элементами азотного питания в процессе биологической очистки субстратов от нефтепродуктов необходимо учитывать тип загрязнителя. В субстраты, загрязнённые легкими фракциями углеводородов необходимо вносить аммонийный азот, загрязнённые тяжелыми фракциями углеводородов — нитратный.

5. Установлено, что устойчивость культур актинобактерий к тяжёлым металлам определяется источником углерода, физиологическими особенностями штамма и морфотипом колоний. Доказано, что медь является наиболее токсичным из обычно встречающихся в нефтешламах и нефте-за грязнённых почвогрунтах металлов.

6. Штамм Т\ГосагсИа ер. Л рекомендован в качестве основного агента биопрепарата ввиду высокой нефтеокисляющей активности, его использование в биоремедиации позволяет снизить затраты на азотно-фосфор-ные удобрения и их внесение в 2,7 раза.

7. Разработан системный подход к очистке нефтешламов от углеводородов, использование которого позволило сократить сроки проведения работ на территории НГДП-2 площадь Зыбза с 9 до 6 календарных месяцев, а на территории НГДП-2 площадь Смоленская с 9 до 4 календарных месяцев.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Худокормов A.A. Физиологические особенности микрооргантмов, разрушающих мазут / A.A. Худокормов // Сборник тезисов I Международной межвузовской школы - семинара "Экология -2000". — Москва, 2000.-С 40-41.

. 2. Гирич И.Е. Отбор штаммов микроорганизмов, способных к утилизации тяжелых фракций углеводородов / Т.Ю. Нечитайло, A.A. Худокормов, Д.А. Мельников // Сборник тезисов I Международной межвузовской школы - семинара "Экология -2000". - Москва, 2000. - С. 12-13

3. Худокормов A.A. Влияние форм вносимого азота на утилизацию углеводородного субстрата нефтеокисляющими бактериями рода Rhodococcus / H.H. Волченко, Э.В. Карасева // Экологические проблемы Кубани: материалы межрегион, начно-пракич. конф. / Кубанский госагро-университет. -Краснодар, 2001. -С. 111-115. »

4. Карасева Э.В. Опыт биологической очистки почвогрунтов и шла-мов с различным типом нефтяного загрязнения в Краснодарском крае / A.A. Худокормов, Т.Ю. Нечитайло // Экобиотехнология: борьба с нефтяным загрязнением окружающей среды. — Пущино, 2001. - С. 61-63.

5. Худокормов A.A. Влияние источника азота на биодеструкцию нефти некоторыми штаммами акгинобактерий / А А. Худокормов // Вестник ОНУ. — Т6. №4.2001.-С. 335-338

6. Волченко H.H. Влияние состава питательной среды на накопление биомассы и синтез биосурфактантов штаммом Rhodococcus erythropolis 33 / A.A. Худокормов // Экобиотехнология: борьба с нефтяным загрязнением окружающей среды. — Пущино, 2001. - С.24-27.

7. Нечитайло Т.Ю. Использование различных марок кристаллона при биодеградации углеводородов суспензиями почвенных микроорганизмов в модельных экспериментах / A.A. Худокормов // Экологические проблемы Кубани: материалы межрегион, начно-пракич. конф. / Кубанский го-сагроуниверситет. — Краснодар, 2001. — С. 116-119.

8. Худокормов A.A. Влияние pH среды на деструкцию тяжёлых фракций углеводородов нефтеокисляющими актиномицетами / A.A. Худокормов // Биоповреждения — 2002: Матер, конф. Современные проблемы биологических повреждений материалов. Пенза, 2002. — С. 46-48.

9. Карасев С.Г. Новые подходы к биоремедиации нефтезагрязненных почв и нефтешламов в условиях Юга России / Э.В. Карасева, И.Е. Гирич, Д.А. Мельников, A.A. Худокормов // Проблемы рекультивации нарушенных земель промышленностью на рубеже 21 века: Сб. научн. трудов, межд. конф. РАН. - С.-Птб, 2002. - С. 21-23.

10. Хуцокормов A.A. Влияние pH на деструкцию углеводородов некоторыми нокардиоморфными актиномицетами / Худокормов A.A. // Сборник тезисов 6-ой Путинской школы конференции молодых ученых. — Пу-щино, 2002. С. 72-73

11. Karaseva E.V. Environmental structure and fermentation conditions influence on physiological features of the oil-öxidizing aktinobacteria / A.A. Khudokormov, D.A. Melnikov, N.N. Volchenko // The report book of the Is' European microbiological congress. Elsever publishing house. — Lubljana, 2003. — P. 334.

12. Карасёва Э.В. Экспериментально-практический опыт ликвидации нефтешламов и нефтяных загрязнений / НЕ. Гирич, С Л Карасёв, Д. А. Мельников, A.A. Худокормов // Биотехнология состояние и перспективы развития: Матер. II Московского межд. конгресса. — Москва, 2003. — С 21.

13. Карасева Э.В. Биологическая детоксикация нефтешламов и биореме-диация природных экосистем в условиях юга России / С.Г. Карасев, И.Е. Гирич, A.A. Худокормов // Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды: Матер, межд. конф. — Саратов, 2005. — С 74-75.

14. Карасева Э.В. Опыт биоремедиации земель, загрязненных Тенгизс-кой нефтью в результате несанкционированного доступа в нефтепровод КТК-Р/ И.Е. Гирич, С.Г. Карасев, А. А Худокормов // Защита окружающей среды в нефтегазовом комплексе. №2,2005. - С. 29-37.

15. Карасева Э.В. Биоремедиация черноземной почвы, загрязненной нефтью / И.Е. Гирич, A.A. Худокормов, Н.Ю. Алешина, С.Г. Карасев // Биотехнология. №2,2005. - С. 67-72.

16. Карасева Э.В. Стратегия биоремедиации объектов, загрязненных нефтепродуктами / A.A. Худокормов, И.Е. Гирич, С.Г. Карасев, И.Б. Ившина, М.С. Куюкина, J. Philp // Биотехнология состояние и перспективы развития: Материалы III Московского межд. конгресса. — Москва, 2005. — С. 15.

17. Худокормов A.A. Фиторемедиация как этап биологической очистки нефтесодержагцих субстратов / С.А. Мнацеканова, И.Е. Гирич, Э.В. Карасева // Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: Фундаментальные и прикладные аспекты: Материалы Веер. конф. — Саратов, 2005. - С. 65-67.

Подписано в печать 30.05.2006 Формат 60x84 1/16 Усл.печ.л. 1,22 Уч.-изд.л. 1,0

Бумага офсетная Тираж 100 экз. Заказ 238

Отпечатано в Издательско-полиграфическом комплексе Ставропольского государственного университета. 355009, Ставрополь, ул.Пушкина, 1.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Худокормов, Александр Александрович

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Физиологические особенности углеводородокисляющих актино-бактерий.

1.2. Влияние условий среды на потребление углеводородов актино-бактериями.

1.3. Использование углеводородокисляющих актинобактерий для очистки нефтезагрязнённых экосистем.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объект исследования.

2.2. Питательные среды, используемые для культивирования микроорганизмов

2.3. Культивирование и количественный учёт микроорганизмов.

2.4. Определение содержания биогенных элементов в среде.

2.4.1. Определение содержания фосфора в среде.

2.4.2. Определение содержания аммонийного азота.

2.4.3. Определение содержания нитратного азота.

2.5. Определение нефтепродуктов.

2.6. Определение устойчивости актинобактерий к тяжёлым металлам на минеральной среде с различными источниками углерода.

2.7. Статистическая обработка результатов.

Глава 3 ОСОБЕННОСТИ РОСТА ИССЛЕДУЕМЫХ ШТАММОВ ПРИ

ИСПОЛЬЗОВАНИИ РАЗЛИЧНЫХ ИСТОЧНИКОВ УГЛЕРОДА.

Глава 4. ИЗУЧЕНИЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ШТАММОВ НЕФТЕОКИСЛЯЮЩИХ АКТИНОБАКТЕРИЙ.

4.1. Определение оптимального источника углерода для выращивания накопительных культур штаммов - интродуцентов.

4.2. Определение спектра потребляемых углеводородов.

4.3. Определение оптимальных температур и величин рН.

4.4. Определение потребления углерода, азота и фосфора в модельных системах.

4.5. Определение оптимального источника азота.

4.6. Влияние источника углерода на устойчивость штаммов актино-бактерий к тяжёлым металлам.

Глава 5 ДЕГРАДАЦИЯ УГЛЕВОДОРОДОВ В МОДЕЛЬНЫХ

СИСТЕМАХ.

• Глава 6 ПРОВЕДЕНИЕ ПОЛЕВЫХ ИСПЫТАНИЙ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Интенсификация процесса биодеструкции углеводородов актинобактериями в модельных системах и полевых условиях"

Актуальность проблемы. Развитие нефтяной промышленности приводит к росту нагрузок на окружающую среду посредством различного рода аварийных ситуаций, возникающих при добыче, хранении и транспортировке нефтепродуктов. Единственным экологически безопасным способом очистки загрязнённых земель является биоремедиация - применение нефтеокисляю-щих микроорганизмов, использующих углеводороды в качестве источника углерода. Биоремедиация уже длительное время с успехом используется на практике, однако её теоретические подходы слабо разработаны. Нефтеокис-ляющие актинобактерии широко используются в процессах биоремедиации. Это обусловлено их высокой углеводородокисляющей активность и устойчивостью к изменению факторов внешней среды. К этому следует добавить, что согласно официальным данным, в настоящее время в России нуждается в рекультивации 1,2 млн. га земель, пострадавших от различного рода загрязнений (Барышникова JI.M. с соавт., 2001), что определяет значительную потребность в использовании таких микроорганизмов и необходимости выявления их физиологических свойств. Однако, несмотря на очевидные преимущества использования биоремедиации при реабилитации нефтезагряз-нённых экосистем, этот способ имеет один серьёзный недостаток - полный цикл работ при массированном нефтяном загрязнении может составлять 12 и более месяцев. Поэтому основным требованием к современному биореме-диационному процессу является сокращение сроков работ, что принесёт как экологическую, так и экономическую выгоду.

Углеводородокисляющие актинобактерии применяются также для создания комплексных биопрепаратов, с целью интенсификации процессов биоремедиации и изучения взаимоотношений между различными группами микроорганизмов, входящих в состав этих препаратов (Korda A. et al., 1997; Va-radaraj R. et al., 1997). Это даёт возможность моделировать процессы биоре-медиации в лабораторных условиях для исследования их влияния на экологическую обстановку нефтезагрязнённых территорий.

Изучение свойств нефтеокисляющих микроорганизмов представляет значительный интерес для задач микробиологии и биотехнологии, поскольку углеводородокисляющие актиномицеты, такие как Rhodococcus, Nocardia, Gordonia, в значительной степени определяют как характер взаимоотношений между микроорганизмами внутри микробиоценоза, так и вносят решающий вклад в процессы биоремедиации и восстановление природного биоразнообразия (Hanson et al., 1997; Oliveira et al., 1997; MacNaughton SJ. et al., 1999). Понятно, что физиологические свойства нефтеокисляющих актиноми-цетов зависят от целого ряда биотических и абиотических факторов, таких как температура, водный и газовый режимы, содержание в среде биогенных элементов, ингибиторов, факторов роста и, наконец, от источника углерода и энергии.

В связи с тем, что углеводородокисляющие актинобактерии практически не изучены, в настоящее время в России и за рубежом создана сеть лабораторий, занимающихся изучением их физиологических свойств и возможностей их использования в процессах биоремедиации.

В настоящее время в виду возросшего интереса к очистке нефтешла-мов, всесторонне изучается влияние тяжёлых металлов на физиологические свойства углеводородокисляющих актинобактерий (Baath Е., 1989; Chander P., Brookes P.S., 1991; Hattori Н., 1992; Doelman P. et al., 1994; Wuertz S., Mer-geay M., 1997; Giller K.E. et al., 1998;). Для уменьшения их токсического воздействия разрабатываются специальные методы биоремедиации (Tan H.et al., 1994; Malakul P. et al., 1998; Torrens J.L. et al., 1998; Todd R.S., Cheh, 2000). Они сводятся обычно к удалению или связыванию металлов в среде, и лишь после этого начинается процесс биоремедиации (Volesky В., Holan Z.S., 1995;

Lovley D.R., Coates J.D., 1997; Veglio F. et al., 1997). Поэтому особо важным является изучение нефтеокисляющих штаммов актинобактерий, устойчивых к солям тяжёлых металлов для ускорения процесса биоремедиации.

Для сокращения сроков накопления биомассы и повышения углеводо-родокисляющей активности применяются методы оптимизации условий жизнедеятельности микроорганизмов (Carberry J.B., Benzing Т.М., 1991; Rainwater К. et al., 1993; Sugiura К. et al., 1997; Xu R., Obbard J.P, 2003). Увеличения выхода биомассы нефтеокисляющих актинобактерий удается достигнуть при использовании углеводов в качестве единственного источника углерода.

Накопление биомассы актинобактерий в среде культивирования возможно также за счет пента- и гексадекана (Бердичевская М.В. с соавт., 1989), однако в первом случае значительно снижается углеводородокисляющая активность, а во втором случае, из-за дороговизны гексадекана, снижается экономическая эффективность (Morgan P., Watkinson R.J., 1989). В связи с этим приобретает актуальность поиск альтернативных источников углерода, обладающих невысокой стоимостью и не снижающих нефтеокисляющую активность актинобактерий в процессе культивирования.

Вопросам оптимизации условий среды посвящены многочисленные исследования отечественных и зарубежных авторов в самых различных направлениях. Так, большое внимание уделяется изучению влияния качественного и количественного состава вносимого источника углерода на рост актинобактерий (Atlas R.M., 1975; Bartha R., 1986; Atlas R.M., Bartha R, 1992; Loser C. et al., 1998; Eriksson M. et al., 1999). Работы ряда авторов (Wright A.L.et al., 1997; Graham D.W. et al., 1999; Johnson C.R., Scow K.M., 1999) посвящены определению оптимальных количеств азота и фосфора в среде. Но потребление актинобактериями источников азотно-фосфорного питания в зависимости от условий среды и типа углеводородного субстрата практически не изучено.

Знание оптимальных количеств биогенных элементов позволит производить корректировку условий существования интродуцированных штаммов актинобактерий в процессе биоремедиации in situ, что предотвратит внесение избытка удобрений, особенно нитратов и сократит сроки работ.

Цель исследования. Изучение основных параметров роста культур нефтеокисляющих актинобактерий в зависимости от условий культивирования и углеводородного загрязнения, с целью разработки системного подхода к биологической очистке нефтезагрязнённых почв и нефтешламов в производственных условиях и отбора штаммов нефтедеструкторов для создания на их основе биопрепарата для очистки углеводородзагрязнённых экосистем.

Диссертационная работа направлена на отбор штаммов актинобактерий служащих основой биопрепарата, а также на повышение эффективности процессов биоремедиации, за счет использования дифференцированных подходов к различным типам нефтяных загрязнений. Задачи исследования:

- изучить особенности роста штаммов актинобактерий при использовании различных углеводородов;

- определить спектр потребления углеводородов штаммами актинобактерий;

- выяснить оптимальные температуры и величины рН, позволяющие добиться максимальной деструкции различных углеводородов исследуемыми штаммами актинобактерий;

- выбрать источник углерода, позволяющий получать наибольшее количество биомассы с высокой нефтеокисляющей активностью;

- определить количественное потребление фосфора и различных источников азота при деструкции углеводородов в модельных системах;

- определить эффективность процессов биоремедиации с использованием оптимизации условий среды in situ в модельном эксперименте и полевых испытаниях;

- разработать системный подход к очистке нефтешламов от углеводородов;

- изучить устойчивость к тяжелым металлам штаммов микроорганизмов при культивировании их на среде с различным источником углерода;

- определить штаммы нефтеокисляющих актинобактерий, на основе которых возможно создание биопрепарата для очистки объектов окружающей среды от нефтепродуктов;

Научная новизна. На основании анализа роста исследуемых культур на различных источниках углерода впервые предлагается использовать в качестве источника углерода для получения большого количества высокоактивной биомассы актинобактерий растительное масло. Впервые показана взаимосвязь между источником углерода и устойчивостью к тяжелым металлам используемых штаммов микроорганизмов. Установлено, что утилизация различных углеводородов требует различных источников азотно-фосфорного питания. Определено количественное потребление азота и фосфора при деструкции углеводородов исследуемыми штаммами актинобактерий в модельных системах. Намечены пути корректировки физико-химических характеристик нефтешлама в полевых условиях, что позволит сократить сроки очистки. Часть исследований проведена в рамках работы по гранту INTAS 01-2150. Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

• исследование штаммов актинобактерий коллекции КубГУ на способность к ассимиляции нефтепродуктов в различных условиях;

• исследование интенсивности биодеструкции углеводородов в зависимости от их качественного и количественного состава;

• оптимальные параметры для биодеструкции нефтепродуктов в полевых условиях;

• использование системного подхода к очистке нефтешламов от углеводородов, позволяет сократить сроки проведения работ.

Практическая значимость. В результате научных исследований разработан системный подход к очистке нефтешламов, установлены индивидуальные особенности нефтеокисляющих штаммов актинобактерий, определены оптимальные источники азотного питания и их минимально необходимы количества, что позволило отобрать наиболее активный штамм-деструктор нефтепродуктов Nocardia sp. J2, подходящий в качестве основы для создания биопрепарата. Предлагаемые новые подходы к очистке нефтешлама применялись сотрудниками центра "Биотехнология" Кубанского госуниверситета при проведении работ по микробиологической очистке нефтешламов на территориях ЦЦНГ-2 площадь Смоленская и площадь Зыбза ОАО "НК"Роснефть-Краснодарнефтегаз". В процессе работ на площади Смоленская срок очистки нефтешлама от углеводородов был сокращен с 9 до 4 месяцев, эффективность очистки превысила 90%. На площади Зыбза удалось сократить сроки очистки нефтешламов длительного хранения, содержащих тяжёлые металлы с 9 до 6 месяцев. Концентрация углеводородов была снижена с 454 до 8 г/кг. Благодаря дозированному внесению азотно-фосфорных удобрений содержание нитратов в получившемся после очистки шлама грунте не превысило фоновых значений, характерных для данной местности.

Апробация работы. Основные положения и результаты работы докладывались и обсуждались на конференциях "Экология 2000: эстафета поколений" (Москва), "Биология" (Одесса) "Экологические проблемы Кубани" (Краснодар), "Экобиотехнология: борьба с нефтяным загрязнением окружающей среды" (Пущино), "Биоповреждения - 2002. Современные проблемы биологических повреждений материалов" (Пенза), международная конференция РАН "Проблемы рекультивации нарушенных земель промышленностью на рубеже 21 века" (Санкт-Петербург), "Биология - наука XXI века" (Пущино), 1-ый съезд биотехнологов России (Москва), первый конгресс Европейского общества микробиологов (Любляна), 2-ой международный конгресс "Биотехнология состояние и перспективы развития" (Москва).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 работ.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Худокормов, Александр Александрович

выводы

1. Установлено, что при использовании в качестве субстрата углеводородов для S-форм актинобактерий характерны более короткая фаза логарифмического роста и более длительное пребывание клеток в стационарном состоянии по сравнению с R-формами.

2. Показано, что при выращивании инокулята максимальная численность и высокая степень деструкции углеводородов актинобактериями родов Rhodococcus, Nocardia, Gordonia, Dietzia проявляется при использовании в качестве источника углерода растительного масла.

3. Доказано, что в ходе биоочистки от нефтепродуктов грунтов и нефтешламов, содержащих тяжёлые фракции углеводородов, необходимо увеличивать начальную величину рН до 8 единиц.

4. При обеспечении элементами азотного питания в процессе биологической очистки субстратов от нефтепродуктов необходимо учитывать тип загрязнителя. В субстраты, загрязнённые легкими фракциями углеводородов необходимо вносить аммонийный азот, загрязнённые тяжелыми фракциями углеводородов - нитратный.

5. Установлено, что устойчивость культур актинобактерий к тяжёлым металлам определяется источником углерода, физиологическими особенностями штамма и мор-фотипом колоний. Доказано, что медь является наиболее токсичным из обычно встречающихся в нефтешламах и нефтезагрязнённых почвогрунтах металлов.

6. Штамм Nocardia sp. J2 рекомендован в качестве основного агента биопрепарата ввиду высокой нефтеокисляющей активности, его использование в биоремедиации позволяет снизить затраты на азотно-фосфорные удобрения и их внесение в 2,7 раза.

7. Разработан системный подход к очистке нефтешламов от углеводородов, использование которого позволило сократить сроки проведения работ на территории НГДП-2 площадь Зыбза с 9 до 6 календарных месяцев, а на территории НГДП-2 площадь Смоленская с 9 до 4 календарных месяцев.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе выполнен системный анализ отечественных и зарубежных подходов к процессам очистки нефтезагрязнённых субстратов от углеводородов нефти. Показано, что единственно возможным экологически безопасным способом борьбы с нефтяными загрязнениями является использование нефтеокисляющих микроорганизмов. Используемые способы оптимизации среды и условий культивирования позволяют существенно поднять эффективность использования аборигенных и интро-дуцируемых штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов при проведении работ по биоремедиации углеводородзагрязненных экосистем и очистке нефтешламов.

Для решения задачи по повышению эффективности очистки субстратов от углеводородов представлен ряд лабораторных исследований, позволяющих системно подойти к процессу индивидуальной оптимизации условий среды. Впервые представлены теоретические положения по определению оптимальных условий и минимизации доз вносимых удобрений на базе комплексного расчета потребляемых источников азота и фосфора в зависимости от типа углеводородного субстрата и его концентрации в среде, а также оптимизации параметров предварительного культивирования и наращивания биомассы. Впервые показана зависимость степени устойчивости штаммов актинобактерий к солям некоторых тяжёлых металлов от концентрации и типа углеводородного сырья, а также от морфотипа колоний. Впервые приведены результаты модельных экспериментов, на основании которых можно заключить о возможности проведения в условиях Юга России за один календарный год двух циклов работ по микробиологической очистке нефтезагрязнённых субстратов.

Проведение микробиологических лабораторных исследований и повышение на их основе эффективности использования нефтеокисляющих микроорганизмов в процессах очистки экосистем и нефтешламов от углеводородов стало возможным благодаря комплексному использованию теоретических и экспериментальных методов исследования. Решение ряда новых задач экологии, микробиологии и биотехнологии поставленных в работе, стало возможным благодаря известным достижениям указанных научных дисциплин и не противоречит их положениям, базируется на строго доказанных выводах фундаментальных и прикладных наук, таких как математический анализ, математическая статистика, теория оптимизации и планирование эксперимента. Разработанные теоретические положения и новые биотехнологические приёмы опробованы экспериментально. Экспериментальные исследования метрологически обеспечены и проводились на экспериментальной базе кафедры генетики и микробиологии Кубанского государственного университета. Результаты экспериментов и модельных испытаний анализировались и сопоставлялись с известными экспериментальными данными, а также результатами исследований проводимыми на кафедре генетики и микробиологии в рамках выполнения договоров по биоремедиации нефтезагрязнённых почв и очистке грунтов и нефтешламов от углеводородов.

Показанные в диссертационной работе новые способы оптимизации, позволяют повысить эффективность проведения работ по очистке различных субстратов от нефтепродуктов, в том числе и субстратов, загрязнённых тяжёлыми металлами. Полученные решения позволяют существенно сократить срок очистки и вносить в субстрат строго необходимое количество элементов азотно-фосфорного питания, что дает возможность значительно снизить затраты материальных ресурсов, денежных средств и времени на проведение одного цикла работ по микробиологической очистке. Кроме этого отдельные теоретические результаты являются определенным вкладом в общую теорию таких наук как микробиология, экология и биотехнология. Результаты экспериментальных исследований процессов, приведенные в работе, представляют практический интерес при создании новых и модернизации известных способов очистки окружающей среды от углеводородов, позволяют уточнить представление о механизмах устойчивости к тяжёлым металлам в углеводородных средах.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Худокормов, Александр Александрович, Ставрополь

1. Александров В.Я. Клетки, макромолекулы и температура. Л.: Наука, 1975. 256 с.

2. Анисимова Л.А., Сиунова Т.В., Воронин A.M. Устойчивость к металлам грамот-рицательных бактерий, изолированных из почв и сточных вод промышленных районов // Микробиология. 1993. Т. 62. №5. С. 843-848.

3. Барышникова Л.М., Грищенко В.Г., Аринобасаров М.У., Шкидченко А.Н., Воронин A.M. Биодеградация нефтепродуктов штаммами деструкторами и их ассоциациями в жидкой среде // Прикладная биохимия и микробиология. 2001. Т. 37. №5. С. 542-548.

4. Бердичевская М.В. Особенности физиологии родококков разрабатываемых нефтяных залежей // Микробиология. 1989. Т. 58. № 1. С. 60-65.

5. Бердичевская М.В., Козырева Г.И., Благиных А.В. Видовой состав углеводородо-кисляющих бактерий акваторий Урала и Сибири // Микробиология. 1991. Т. 60. №6. С. 122-128.

6. Боровиков В.П., Боровиков И.П. Statistica статистический анализ и обработка данных в среде Windows. М.: Филинъ, 1997. 608 с.

7. Волченко Н.Н. Влияние состава питательной среды на интенсивность роста и продукцию биосурфактантов некоторыми штаммами нефтеокисляющих актинобактерий // Сборник тезисов "Биология наука 21 века". Пущино, 2003. С 269.

8. Ю.Глазочёва Л.Е., Ившина И.Е., Оборин А.А. Клеточные приспособления Rhodococcus rhodochrous и Rhodococcus ruber, усваивающих пропан и бутан // Микробиология. 1990. Т. 59. №2. С. 225-229.

9. Голодяев Г.П. Биодеградация нефтепродуктов в почвах и почвогрунтах // VII Делегат. съезд Всесоюзн. общ-ва почвоведов. Ташкент, 1985. С. 137-150

10. Гузев B.C., Халимов Э. М., Волде М.И., Куличевская И.С. Регуляторное действие глюкозы на активность углеводородокисляющих микроорганизмов в почве // Микробиология. 1997. Т.66. №2. С. 154-159.

11. Демиденко А.Я., Демурджан В.М. Пути восстановления нефтезагрязнённых почв чернозёмной зоны Украины. М.: Наука, 1988. 197 с.

12. Н.Елисеев С.А., Кучер Р.В. Поверхностно-активные вещества и биотехнология. Киев: Наукова думка. 1991. 115 с.

13. Ермоленко З.М., Чугунов В.А., Герасимов В.Н., Мартовецкая И.И. Использование органических удобрений в очистке от нефти дерново-подзолистых почв // Биотехнология. 1997. №5. С. 33-38.

14. Иванов А.Ю., Гаврюшкин А.В., Слунова Т.В., Хасанова Л.А., Хасанова З.М. Устойчивость некоторых штаммов бактерий рода Pseudomonas к повреждающему действию ионов тяжелых металлов // Микробиология. 1999. Т. 68, №3. С. 366374.

15. Ившина И.Б. Пропанокисляющие родококки. М.: Наука 1987. 118 с.

16. Ившина И.Б., Бердичевская М.В., Зверева Л.В., Рыбалка Л.В. Фенотипическая характеристика алканотрофных родококков из различных экосистем // Микробиология. 1995. Т.64. №4. С. 507-513.

17. Ильинский В.В., Семяняко М.Н., Юферова С.Г., Трошина Н.Н., Коронелли Т.В. Азотно-фосфорные удобрения для стимуляции биодеградации нефтяных углеводородов в морской среде // Вестник МГУ. Биология. 1991. С. 19-26.

18. Казакова Е.Н., Калачникова И.Г., Масливец Т.А. Биодеградация углеводородов в нефтезагрязненной почве // Микробиология. 1984. Т. 52. №6. С. 1003-1007.

19. Калачникова И.Г., Масливец Т.А., Базенкова Е.И., Колесникова Н.М. Влияние нефтяного загрязнения на экологию почв и почвенных микроорганизмов // Экология и популяционная генетика микроорганизмов. 1987. №51. С. 23-26.

20. Капотина Л.Н., Морщакова Г.Н. Биологическая деструкция нефти и нефтепродуктов, загрязняющих почву и воду // Биотехнология. 1998. №1. С. 85-92.

21. Карасев С.Г., Бойченко Д.М. Нефтеокисляющие нокардиоподобные микроорганизмы различных экониш // Региональная науч. конф. Современные проблемы экологии: Краснодар-Анапа, 1996. С. 74-75.

22. Карасева Э.В., Малахов А.А., Гирич И.Е. Биоремедиация почв и грунта с различным характером нефтяных загрязнений // Российско-германский семинар по экологической биотехнологии. Москва, 1998. С 42.

23. Карасева Э.В., Малахов А.А., Гирич И.Е., Нечитайло Т.Ю. Роль нефтеокисляющей микрофлоры в биоремедиации почв и почвогрунтов, загрязненных нефтью // Международная межвузовская школа-семинар Экология-2000. С 22-23.

24. Карасева Э.В., Худокормов А.А., Нечитайло Т.Ю. Опыт очистки почвогрунтов и шламов с различным типом нефтяного загрязнения в Краснодарском крае // Эко-биотехнология: борьба с нефтяным загрязнением окружающей среды. Пущино, 2001. С. 24-27

25. Квасников Е.И., Клюшникова Т.М. Микроорганизмы-деструкторы нефти в водных бассейнах. Киев: Наукова Думка, 1981. 108 с.

26. Квасников Е.И., Смирнова Г.Ф., Клюшникова Т.М. Влияние факторов внешней среды на деструкцию нефтепродуктов ассоциативными культурами микроорганизмов // Микробиологический журнал. 1987. Т. 49. №3. С. 33-37.

27. Киреева Н.А., Юмагузина Х.А., Кузяхметов Г.Г. Рост и развитие растений овса на почвах, загрязненных нефтью // Сельская биология. 1996. № 5. С. 48-54.

28. Киреева Н.А. Микробиологические процессы в нефтезагрязненных почвах. Уфа: Издательство БашГУ, 1999. 171с.

29. Кобзев Е.Н., Петрикевич С.Б., Шкидченко А.Н. Исследования устойчивости ассоциации микроорганизмов нефтедеструкторов в открытой системе // Прикладная биохимия и микробиология. 2001. Т. 37. №4. С. 413-417

30. Комарова Т.И., Поршнева О.В., Коронелли Т.В. Образование трегалозы клетками S и R вариантов Rhodococcus erythropolis II Микробиология. 1998. Т. 67. №3. С. 428-431.

31. Коронелли Т.В., Дермичева С.Г., Ильинский В.В., Комарова Т.Н., Поршнева О.В. Видовая структура углеводородокисляющих бактериоценозов водных экосистем разных климатических зон // Микробиология. 1994. Т. 63, № 5. С. 917-922.

32. Коронелли Т.В., Дермичева С.Г., Семененко М.Н. Особенности мутагенеза после ультрафиолетового облучения у метилотрофной бактерии Pseudomonas methano-litica II Микробиология. 1986. Т. 55. №3. С. 683-686.

33. Коронелли Т.В., Ильинский В.В., Янушка В.А. Углеводородокисляющая микрофлора акватории Балтийского моря и Куршского залива, загрязнённых при разливе мазута // Микробиология. 1987. Т. 56. №3. С. 472-478.

34. Коронелли Т.В., Комарова Т.И., Юферова С.Г., Ильинский В.В., Чивкунова О.Б., Розников Б.В. Полярные липиды углеводородокисляющих бактерий // Прикладная биохимия и микробиология. 1993. Т. 62. №2. С. 235-238.

35. Коронелли Т.В., Нестерова Е.Д. Экологическая стратегия бактерий, использующих гидрофобный субстрат // Микробиология. 1990. Т. 59. №6. С. 993-997.

36. Кузнецов В.Д., Зайцева Т.А., Вакуленко JI.B., Филиппова С.Н. Streptomyces albi-axialis Sp. Nov новый вид термо- и галотолерантного стрептомицета, разлагающего углеводороды нефти // Микробиология. 1992. №1. С. 84-90.

37. Куличевская И.С., Милехина Е.И., Борзенков И.А., Звягинцева И.С., Беляев С.С. Окисление углеводорода в нефти экстремально галофильными архебактериями // Микробиология. 1991. Т. 60. № 5. С. 860-866.

38. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высш. школа, 1990. 352 с.

39. Малахов А.А., Гирич И.Е., Нечитайло Т.Ю., Карасева Э.В. Роль нефтеокисляю-щей микрофлоры в биоремедиации почв и почвогрунтов, загрязненных нефтью // Экология-2000: Мат. межд. научно-практич. конф. Москва, 2000. С. 23-24

40. Методы общей бактериологии / под ред. Ф. Герхардта и др. М., 1983. Т.1. 536с.

41. Милехина Е.И., Борзенков И.А., Звягинцева И.С., Кострикина Н.А., Беляев С.С. Эколого-физиологические особенности аэробных эубактерий из нефтяных месторождений Татарстана // Микробиология. 1998. Т. 67. №2. С. 208-214.

42. Милехина Е.И., Борзенков И.А., Миллер Ю.М. Углеводородокисляющие бактерии пластовых вод // Микробиология. 1991. Т. 60. №4. С. 747-755.

43. Московченко М.В., Стабникова Е.В., Москаленко Н.В. Химический состав поверхностно-активных веществ, стимулирующих микробную деградацию нефти // Микробиологический журнал. 1995. Т. 57. №1. С. 92-96.

44. Нестеренко О.А., Квасников Е.И., Ногина Т.М. Нокардиоподобные и коринепо-добные бактерии. Киев: Наукова дкумка, 1985. 336 с.

45. Носов В.Н. Компьютерная биометрика. М.: Изд-во Московского ун-та, 1990. 232 с.

46. Практикум по микробиологии / Под ред. А.И. Нетрусова. М.: МГУ, 2005. 608с

47. Семёнов A.M., Ховрычев М.П. Ингибирование роста Candida utulis некоторыми тяжёлыми металлами // Микробиология. 1979. Т.48. №6. С.1120.

48. Стабникова Е.В., Селезнева М.В, Рява О.Н., Иванов В.Н. Выбор активного микроорганизма деструктора углеводородов для очистки нефтезагрязненных почв //Прикладная биохимия и микробиология. 1995. Т. 31. №5. С. 54-59.

49. Суржко Л.Ф., Финкельштейн З.И., Баскунов Б.П., Яковлев В.И., Головлева Л.А. Утилизация нефти в почве и воде микробными клетками // Микробиология. 1995. Т64. №3. С. 393-398.

50. Суровцева Э.Г., Ивойлов B.C., Беляев С.С. Разрушение ароматических фракций нефти ассоциацией грамоположительных и грамоотрицательных микроорганизмов // Микробиология. 1997. Т. 65. № 1. С. 78-82.

51. Халимов Э.М., Левин С.В., Гузев B.C. Нефть и почва // Вестник МГУ. Почвоведение. 1996. №2. С. 59-64.

52. Черняева И.И., Аксёнов М.С., Туев Н.А. Влияние форм азотных удобрений на свойства почвенных микроорганизмов // Вестник Ленинградского университета. 1988. №24. С. 118-121

53. Шульга А.Н., Карпенко Е.В., Елисеев С.А. и др. Внеклеточные липиды и поверхностно-активные свойства бактерий Rhodococcus erythropolis II Микробиология. 1990. Т. 59. №3. С. 443-447.

54. Aislabie J.M., Fraser R. Potential for biodegradation of hydrocarbons in soil from the Ross Dependency, Antarctica // Appl. microbiol. biotechnol. 1998. V. 49. P. 210-214.

55. A1-Hadhrami H., Lappin-Scott M., Fisher P.J. Studies on the biodegradation of three groups of pure n-alkanes in the presence of molasses and mineral fertilizer by Pseudo-monas aeruginosa II Mar. Pollut. Bull. 1997. V 11. P. 969-974.

56. Angehrn D., Galli R., Zeyer J. Physicochemical characterization of residual mineral oil contaminants in bioremediated soil // Envir. Toxicol. Chem. 1998. V. 17. P. 2168— 2175.

57. Appanna V.D., Gazso L.G., Pierre M.S. Multiple-metal tolerance in Pseudomonas fluoresceins and its biotechnological significance // Biotechnol. 1996. V. 52. № 2. P. 75-80.

58. Atlas R.M. Effects of temperature and crude oil composition on petroleum biodegradation//Appl. Microbiol. 1975. V. 30. P. 396-403.

59. Atlas R.M. Microbial degradation of petroleum hydrocarbons: an environmental perspective // Microbiol. 1981. V. 45. P. 180-209.

60. Atlas R. M., Bartha R. Hydrocarbon biodegradation and oil spill bioremediation // Adv. Microb. Ecol. 1992. V. 12. P. 287-338.

61. Baath E. Effects of heavy metals in soils on microbial processes and populations // Water Air and Soil Pollution. 1989. V. 47. P. 335-379.

62. Banat I.M., Biosurfactant production and possible uses in microbial enhanced oil recovery and oil pollution remediation: a review // Bioresource Technol. 1995. V. 51. P. 1-12.

63. Barbeau C., Deschenes L., Karamanev D., Comeau Y., Samson R. Bioremediation of pentachlorophenol-contaminated soil by bioaugmentation using activated soil // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. V. 48. P. 745-752.

64. Bartha R. Biotechnology of petroleum pollutant biodegradation // Microb. Ecol. 1986. V. 12. P. 155-172.

65. Belfroid A., Van Den Berg M., Seinen W., Hermens J., Van Gestel K. Uptake, bioavailability and elimination of hydrophobic compounds in fuel-contaminated soil // Environmental Toxicology and Chemistry 1995. V. 14. P. 605-612.

66. Boronin A.M., Grishchenkov V.G., Karpov A.V., Seleznev S.G., Tokarev V.G., Arin-basarov M.U., Gajazov R.R., Kuzmin N.P. Degradation of mazut by selected microbial strains in model systems // Process-Biochem. 1997. V. 32. №1. P. 13-19.

67. Bouchez M., Blanchet D., Vandecasteele J.P. An interfacial uptake mechanism for the degradation of pyrene by a Rhodococcus strain // Microbiology. 1997. V. 143. №4. P. 1087-1093.

68. Braddock J.F., Ruth M.L., Walworth J.L., McCarthy K.A. Enhancement and inhibition of microbial activity in hydrocarbon-contaminated arctic soils: implications for nutrient-amended bioremediation // Environ. Sci. Technol. 1997. V. 31. P. 2078-2084.

69. Bragg J.R., Prince R.C., Wilkinson J.В., Atlas R.M. Effectiveness of bioremediation for the Exxon Valdez oil spill // Nature. 1994. V. 368. P. 413-418.

70. Brans K., Dahleman G., Theobald N., Gun Kel W. Influences of nitrates and trace elements on the degradation of mineral oils by marine bacteria // Frum Microbiol. 1989. V. 12. №1-2. P. 106-112.

71. Bredholt H., Josefsen K., Vatland A., Brunheim P., Eimhjellen K. Emulsification of crude oil by an alkane-oxidizing Rhodococcus species isolated from seawater // Can. J. Microbiol. 1998. V. 44. P. 330-340.

72. Bruheim P., Bredholt H., Eimhjellen K. Bacterial degradation of emulsified crude oil and the effect of various surfactants // Can. J. Microbiol. 1997. V. 43. №1. P. 17-22.

73. Calvo-Ortega J.J., Lahlou M., Siaz-Jimenez C. Effect of the organic matter and clays on the biodegradation of phenanthrene in soils // Int. Biodeterior. Biodegrad. 1997. V. 40. P. 101-106.

74. Carberry J.B., Benzing T.M. Peroxide preoxidation of recalcitrant toxic-waste to enhance biodegradation // Water Science and Technology 1991. V. 23. № 1-3. P. 367376.

75. Cerniglia C.E. Microbial degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons // Adv. Appl. Microbiol. 1984. V. 30. P. 31-71.

76. Chander K., Brookes P.C. Effects of heavy metals from past applications of sewage sludge on microbial biomass and organic matter accumulation in a sandy loam and silty loam U.K. soil // Soil Biol. Biochem. 1991. V. 23. P. 927-932.

77. Cho B.H., Chino H., Tsuji H., Kunito Т., Nagaoka K., Otsuka S., Yamashita K., Ma-tsumoto S., Oyaizu H. Laboratory-scale bioremediation of oil-contaminated soil of Kuwait with soil amendment materials // Chemosphere. 1997. V. 35. P. 1599-1611.

78. Christel K., Schumann P., Stackebrandt E. Gordonia alkanivorans sp. nov. isolated from tar-contaminated soil // International Journal of Systematic Bacteriology 1999. V. 49. P. 1513-1522.

79. Claxton L.D., Houk V.S., Williams R., Kremer F. Effect of bioremediation on the mutagenicity of oil spilled in Prince-William-Sound, Alaska // Chemosphere. 1991. V. 23. №5. P. 643-650.

80. Dibble J.T., Bartha R. The effect of environmental parameters on the biodegradation of oily sludge // Appl. Environ. Microbiol. 1989. V.37. P. 729-739.

81. Duncan K., Levetin E., Wells H., Jennings E., Hettenbach S., Bailey S., Lawlor K., Sublette K., Fisher J.B. Managed bioremediation of soil contaminated with crude oil // Appl. Biochem. Biotechnol. 1997. V. 63-65. P. 879-889.

82. Eriksson M., Dalhammar G., Borg-Karlson A.K. Aerobic degradation of a hydrocarbon mixture in natural uncontaminated potting soil by indigenous microorganisms at 20°C and 6°C // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. V. 51. P. 532-535.

83. Falatko D.M., Novak J.T. Effect of biologically produced surfactants on the mobility and biodegradation of petroleum hydrocarbons // Water Environ. 1992. V. 64. P. 163169.

84. Finnerty W.R. The biology and genetics of the genus Rhodococcus // Microbiol. 1992. V. 46. P. 193-218.

85. Giller K.E., Witter E., McGrath S.P. Toxicity of heavy metals to microorganisms and microbial processes in agricultural soils // Soil Biol. Biochem. 1998. V. 30. P. 13891414

86. Graham D.W., Smith V.H., Cleand D.L. Effects of nitrogen and phosphorus supply on hexadecane biodegradation in soil systems // Water Air and Soil Pollution. 1999. V. 111.P. 1-18.

87. Grundmann R., Rehm H.J. Biodegradation of diesel fuel use of free and immobilized mixed cultures in soils // Erdol & Kohle Erdgas Petrochemie. 1991. V. 44. №4. P. 149150.

88. Hanson K.G., Kale V.C., Desai A.J. The possible involvement of cell surface and other membrane proteins of Acinetobacter sp. in crude oil degradation // FEMS Microbiol. Lett. 1991. V. 122. №3. P. 275-280.

89. Hanson K.G., Nigam A., Kapadia M., Desai A.J. Crude oil degradation by Acinetobacter sp. A3 as influenced by nitrogen, phosphorous and surfactants // Indian J. Exp. Biol. 1996. V. 34. №12. P. 1276-1278.

90. Hanson, K. G., A. Nigam, M. Kapadia, and A. J. Desai Bioremediation of crude oil contamination with Acinetobacter sp. A3. 1997. Curr. Microbiol. 35:191-193

91. Harder H., Kurzelseidel В., Hopner T. Hydrocarbon biodegradation in sediments and soils // Erdol & Kohle Erdgas Petrochemie. 1991. V. 44. №2. P. 59-62.

92. Hattori H., Influence of heavy metals on soil microbial activities // Soil Science and Plant Nutrition. 1992. V. 38. P. 93-100.

93. Heider J., Spormann A.M., Beller H.R., Widdel F. Anaerobic bacterial metabolism of hydrocarbons // FEMS Microbiology Reviews. 1999. V. 22. P. 459-473.

94. Herman D.C., Lenhard R.J., Miller R.M. Formation and removal of hydrocarbon residual in porous media: Effects of attached bacteria and biosurfactants // Environ. Sci. Technol. 1997. V. 63. №5. P. 1290-1294.

95. Hinchee R.E., Arthur M. Bench scale studies of the soil aeration process for biore-mediation of petroleum-hydrocarbons // Appl. Biochem. and Biotechnol. 1991. V. 2829. P. 901-906.

96. Holliger C., Zehnder A.J. Anaerobic biodegradation of hydrocarbons // Curr. Opin. Biotechnol. 1996. V. 7. P. 326-330.

97. Hughes M.N, Pool R.K. Metals and microorganisms N.Y. 1986. 304 p.

98. Ivshina I.B., Kuyukina M.S., Philp J.C., Christophi N. Oil desorption from mineral and organic materials using biosurfactant complexes produced by Rhodococcus species // World J. of Microbiology and Biotechnology. 1998. V. 14. P. 111-117.

99. Johnson C.R., Scow K.M. Effect of nitrogen and phosphorus addition on phenan-threne biodegradation in four soils // Biodegradation. 1999. V. 10. P. 43-50.

100. Jamroz T. Degradation of petroleum in soil by biological methods // Int. Biodeterior. Biodegrad. 1996. V. 37. №3-4. P. 250-251.

101. Jose L.R., Gallegol J.L., Llamas J.F., Vazquez F. Bioremediation of diesel-contaminated soils: Evaluation of potential in situ techniques by study of bacterial degradation // Biodegradation. 2001. V. 12. P. 325-335.

102. Kabata-Pendias A. Behavioural properties of trace metals in soils. Applied Geochemistry 1993. №2. P.3-9

103. Kenji K., Hasta P., Ando T. Minimum available N requirement for microbial bio-mass P formation in a regosol // Soil Biology and Biochemistry. 1999. V. 31. P. 797802.

104. Knight B.P., McGrath S.P., Chaudri A.M. Biomass carbon measurements and substrate utilization patterns of microbial populations from soils amended with cadmium, copper, or zinc // Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 63. P. 39-43.

105. Korda A., Santas P., Tenete A., Santas R. Petroleum hydrocarbon bioremediation: sampling and analytical techniques, in situ treatments and commercial microorganisms currently used//Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. V. 48. P. 677-686.

106. Lai В., Khanna S. Degradation of crude oil by Acinetobacter calcoaceticus and Al-caligenes odorans II J. Appl. Bacteriol. 1996. V. 81. P. 355-362.

107. Laousse A. Use waterproof fertilizers at bioremediation the petropolluted territories // Oceanorama. 1990. №4. P. 27-31.

108. Leahy J.G., Col well R.R. Microbial degradation of hydrocarbons in the environment //Microbiol. Rev. 1990. V. 54. P. 305-315.

109. Lee E.S., Banks M.K. Bioremediation of petroleum-contaminated soil using vegetation // J. of Env. Science and Health. Part A- Env. Science and Engineering. 1993. V. 28. №10. P. 2187-2198.

110. Loser C., Seidel H., Hoffmann P., Zehnsdorf A. Bioavailability of hydrocarbons during microbial remediation of a sandy soil // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. V. 51.P. 105-111.

111. Loser C., Seidel H., Zehnsdarf A., Stoltmeister U. Microbial degradation of hydrocarbons in soil during aerobic/anaerobic changes and under purely aerobic conditions // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1998. V. 49. P. 631-636.

112. Lovley D.R., Coates J.D. Bioremediation of metal contamination // Biotechnol. 1997. V. 8. P. 285-289.

113. MacNaughton S.J., Stephen J.R., Venosa A.D., Davis G.A., Chang Y.J., White D.C. Microbial population changes during bioremediation of an experimental oil spill // Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. P. 3566-3574.

114. Madsen Т., Kristensen P. Effects of bacterial inoculation and nonionic surfactants on degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in soil // Environ. Toxicol. Chem. 1997. V. 16. №4. P. 631-637.

115. Madsen E.L., Sinclair J.L., Ghiorse W.C. Insitu biodegradation microbiological patterns in a contaminated aquifer// Science. 1991. V. 252. №5007. P. 830-833.

116. Maitz I., Esanola M.V., Millan E. Evaluation of heavy metal availability in contaminated soils // The science of the total environ. 1997. V. 206. P. 107-115,

117. Makula R., Finnerty W.R. Microbial assimilation of hydrocarbons, fatty acids derived from normal alkanes // J. Bacteriol. 1986. V. 95. P. 2102-2107.

118. Malakul P., Srinivasan K.R., Wang H.Y. Metal toxicity reduction in naphthalene biodegradation//Applied Environ. Microbiology 1998. V. 64. P. 4610-4613.

119. Margesin R., Schinner F. Bioremediation of diesel-oil contaminated alpine soils at low temperatures // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. V. 47. P. 462-468.

120. Margesin R., Schinner F. A feasibility study for the in situ remediation of a former tank farm // World J. Microbiol. Biotechnol. 1999. V. 15. P. 615-622.

121. Margesin R., Walder G., Schinner F. The impact of hydrocarbon remediation (diesel oil and polycyclic aromatic hydrocarbons) on enzyme activities and microbial properties of soil // Acta Biotechnol. 2000. V. 20. P. 313-333.

122. Margesin R., Zimmerbauer A., Schinner F. Monitoring of bioremediation by soil biological activities // Chemosphere. 2000. V. 40. P. 339-346.

123. Michaelsen M., Hulsch R., Hopner Т., Berthecorti L. Hexadecane mineralization in oxygen-controlled sediment-seawater cultivations with autochthonous microorganisms //Appl. and Environmental Microbiology. 1992. V. 58. №9. P. 3072-3077.

124. Mohn W.W., Stewart G.R. Limiting factors for hydrocarbon biodegradation at low temperature in Arctic soils // Soil Biol. Biochem. 2000. V. 32. P. 1161-1172.

125. Morgan P., Watkinson R.J. Hydrocarbon degradation in soils and methods for soil biotreatment // Crit. Rev. Biotechnol. 1989. V. 8. P. 305-333.

126. Muller A.K., Westergaard K., Christensen S., Sorensen S.J. The effect of long term mercury pollution on the soil microbial community // FEMS Microbiol. Ecol. 2001. V. 36. P. 11-19.

127. Oberbremer A., Muller-Hurtig R. Aerobic stepwise hydrocarbon degradation and formation of biosurfactants by an original soil population in a stirred reactor // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1989. V. 31. P. 582-586.

128. Olivera N.L., Esteves J.L., Commendatore M.G. Alkane biodegradation by a microbial community from contaminated sediments in Patagonia, Argentina // Int. Biodete-rior. Biodegrad. 1997. V. 40. P. 75-79.

129. Olivieri R., Bacchin P., Robetriello A. Use the fertilizers covered with a paraffin capsule at bioremediation process // Appl. And Environ. Micrbiol. 1985. V. 51. №5. P. 629-634.

130. Palittapongarnpim M., Pokethitiyook P., Upatham E.S., Tangbanluekal L. Biodegradation of crude oil by soil microorganisms in the tropic // Biodegradation. 1998. V. 9. P. 83-90.

131. Pometto A.L., Oulman C.S., Dispirito A.A., Johnson K.E., Baranow S. Potential of agricultural by-products in the bioremediation of fuel spills // J. Ind. Microbiol. Bio-technol. 1998. V. 20. P. 369-372.

132. Prince R.C., Bioremediation of marine oil spills // Trends Biotechnol. 1997. V. 15. №5. P. 158-159.

133. Pritchard P.H., Costa F. EPAs Alaska oil-spill bioremediation project // Environmental Science and Technology. 1991. V. 25. №3. P. 372-379.

134. Rabus R., Widdel F. Anaerobic degradation of ethylbenzene and other aromatic hydrocarbons by new denitrifying bacteria//Microbiol. 1995. V. 163. P. 96-103.

135. Rainwater K., Mayfield M.P., Heintz C., Claborn B.J. Enhanced in-situ biodegradation of diesel fuel by cyclic vertical water-table movement preliminary studies // Water Environment Research. 1993. V. 65. №6. P. 717-725.

136. Rehm H.J., Reiff I. Mechanisms and occurrence of microbial oxidation of long-chain alkanes//Adv. Biochem. Eng. 1981. V. 19. P. 175-215.

137. Reid B.J., Jones K.C., Semple K.T. Bioavailability of persistent organic pollutants in soils // Environmental Pollution. 2000. V. 108. P. 103-112

138. Rosenberg E., Legman R., Kushmaro A., Adler E., Abir H., Ron E.Z. Oil bioremediation using insoluble nitrogen source // Biotechnol. 1996. V. 51. №3. P. 273-278.

139. Salanitro J.P., Dorn P.B., Huesemann M.H., Moore K.O., Rhodes I.A., Jackson L.M., Vipond Т.Е., Western M.M., Wisniewwski H.L. Crude oil hydrocarbon bioremediation and soil ecotoxicity assessment // Environ. Sci. Technol. 1997. V. 31. P. 1769-1776.

140. Scanlon P.F. Effects of highway pollutants upon terrestrial ecosystems. High way pollution//Elsevier. 1991. P. 281-338.

141. Schinner F., Margesin R. Efficiency of indigenous and inoculated cold-adapted soil microorganisms for biodegradation of diesel oil in alpine soils // Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 63. P. 2660-2664.

142. Scott-Fordsmund J.J. Toxicity of nickel to soil organisms in Denmark. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology. 1997. V.148. P.l-34

143. Shukla O.P. Biodegradation for Environmental Management // Everymans Sci. 1990. V. 25. №2. P.46-50.

144. Segal D.S. Cleanup under at oil storage site in Netherlands // Oil and Gas. 1996. V. 99. №11. P. 44-45.

145. Siegmund L., Philp J.C. Surface-active lipids in rhodococci // Antonie van Leeu-wenhoek. 1998. V. 74. P. 59-70.

146. Smith M.J., Lethbridge G., Burns R.G. Bioavailability and biodegradation of poly-cyclic aromatic hydrocarbons in soils // FEMS-Microbiol. Lett. 1997. VI52. №1. P. 141-147.

147. Song H.G., Bartha R. Effects of jet fuel on the microbial community of soil // Appl. Environ. Microbiol. 1990. V. 56. P. 646-651.

148. Song H.G., Wang X., Bartha R. Bioremediation potential of terrestrial fuel spills // Appl. Environ. Microbiol. 1990. V. 56. P. 652-656.

149. Sorkhoh N.A., Ghannoum M.A., Ibrahim A.S., Stretton R.J., Radwan S.S. Crude-oil and hydrocarbon-degrading strains of Rhodococcus rhodochrous isolated from soil and marine environments in Kuwait // Environ. Pollut. 1990. V. 65. P. 1-17.

150. Sousa С., Cebola A., Lorenzo V. Enhanced metallosorption of bacterial cells displaying polypeptides//Nat. Biotechnol. 1996. V. 14. P. 1017-1020.

151. Sugiura K., Ishihara M., Shimauchi Т., Harayama S. Physicochemical properties and biodegradability of crude oil // Environ. Sci. Technol. 1997.V. 31. P. 45-51.

152. Tan H., Champion J.T., Artiola J.F., Brusseau M.L. Complexation of cadmium by a rhamnolipid biosurfactant//Environ. Sci. Technol. 1994. V. 28. P. 2402-2406

153. Todd R.S., Cheh A.M. A rhamnolipid biosurfactant reduces cadmium toxicity during naphthalene biodegradation // Appl. Environ. Microbiol 2000. V. 66. №10. P. 4585-4588.

154. Torrens J.L., Herman D.C., Miller-Maier R.M. Biosurfactant (rhamnolipid) sorption and the impact on rhamnolipid-facilitated removal of cadmium from various soils under saturated flow conditions // Environ. Sci. Technol. 1998. V. 32. P. 776-781.

155. Tramier В., Sirvins A. Enhanced oil biodegradation: a new operational tool to control oil spills // Proc. Oil Spill. Conf.: Prev. Behav. Washington, D.C., 1983. P. 115119.

156. Vandyke M.I., Lee H., Trevors J.T. Applications of microbial surfactants // Biotechnology Advances. 1991. V. 9. №2. P. 241-252.

157. Varadaraj R., Bock J., Robbins M.L. Bioremediation of hydrocarbon-contaminated water with indigenous microorganisms // Environmental Biotechnology. 1992. V. 1. P. 28-23.

158. Varadaraj R., Savage D.W. Bioremediation of hydrocarbon-contaminated soil // Environ. Sci. Technol. 1997. V. 31. № 7. P. 2012-2019.

159. Veglio F., Beolchini F., Gasbarro A. Biosorption of toxic metals: an equilibrium study using free cells of Arthrobacter sp. II Process Biochem. 1997. V. 32. №2. P. 99105.

160. Venkateswaran K., Iwabuchi Т., Matsui Y., Toki H., Hamada E., Tanaka H. Distribution and biodegradation potential of oil-degrading bacteria in North Eastern Japanese coastal waters // FEMS Microbiology Ecology. 1991. V. 86. №2. P. 113-121.

161. Venosa A.D., Haines J.R., Allen D.M. Efficacy of commercial inocula in enhancing biodegradation of weathered crude oil contaminating a Prince William Sound beach // J. Ind. Microbiol. 1992. V. 10. P. 1-11.

162. Volesky В., Holan Z.S. Biosorption of heavy metals // Biotechnol. 1995. V. 11. P. 235-250.

163. Volkering F., Breure A.M., Rulkens W.H. Microbiological aspects of surfactant use for biological soil remediation // Biodegradation. 1998. V. 8. P. 401-417.

164. Walker J.D. Chemical fate of toxic substances: biodegradation of petroleum // Mar. Technol. Soc. J. 1985. V. 18. №3. P. 73-86.

165. Wang J., Jia C. R., Wong C.K., Wong P. K. Characterization of polycyclic aromatic hydrocarbons created in lubricating oils // Water, Air, and Soil Pollution. 2000. V. 120. P. 381-396

166. Wang X., Bartha R. Effects of bioremediation on residues, activity and toxicity in soil contaminated by fuel spills // Soil Biol. Biochem. 1990. V. 22. P. 501-505.

167. Wang Y., Zhang Z., Ruan J., Wang Y., Ali S. Investigations of actinomycete diversity in the tropical rainforests of Singapore // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 1999. V. 23. P. 178-187.

168. Wardell L.J. Potential for bioremediation of fuel-contaminated soil in Antarctica // J. Soil Contam. 1995. V. 4. P. 111-121.

169. Warhurst A.M., Fewson C.A. Biotransformations catalyzed by the genus Rhodococcus II Crit. Rev. Biotechnol. 1994. V. 14. P. 29-73.

170. Whyte L.G., Bourbonniere L., Bellerose C., Greer C.W. Bioremediation assessment of hydrocarbon-contaminated soils from the High Arctic // Bioremed. J. 1999. V. 3. P. 69-79.

171. Whyte L.G., Hawari J., Zhou E., Bourbonniere L., Inniss W.E., Greer C.W. Biodeg-radation of variable-chain-length alkanes at low temperatures by a psychrotrophic Rhodococcus sp. II Appl. Environ. Microbiol. 1998. V. 64. P. 2578-2584.

172. Wright A.L., Weaver R.W., Webb J.W. Oil bioremediation in salt marsh mesocosms as influenced by n and p fertilization, flooding, and season // Water Air and Soil Pollution. 1997. V. 95. P. 179-191.

173. Wuertz S.S., Mergeay M. The impact of heavy metals on soil microbial communities and their activities // Soil Microbiology. 1997. V. 20. P. 607-642.

174. Xu R., Obbard J.P. Optimization of slow-release fertilizer dosage for bioremediation of oil-contaminated beach sediment in a tropical environment // World Journal of Microbiology & Biotechnology 2003. V. 19. P. 719-725.

175. Zhang Y.M., Miller R.M. Effect of rhamnolipid (biosurfactant) structure on solubilization and biodegradation of n-alkanes // Appl. Environ. Microbiol. 1995. V. 61. P. 2247-2251.