Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИНОКУЛЯЦИЯ НЕБОБОВЫХ РАСТЕНИЙ АВОТФИКСИРУШЦИМИ БАКТЕРИЯМИ РОДА PSEUDOMONAS И МУТАНТАМИ РОДА BAOTLLUS

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ИНОКУЛЯЦИЯ НЕБОБОВЫХ РАСТЕНИЙ АВОТФИКСИРУШЦИМИ БАКТЕРИЯМИ РОДА PSEUDOMONAS И МУТАНТАМИ РОДА BAOTLLUS"

МОСКОВСКИ* ОРДЕНА ДОШЛ. ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ X ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫ*

университет имени и. а Ломоносова ФАКУЛЬТЕТ ПОЧВОВЕДЕНИЯ

На правах рукописи

БУРЛУЦКАЯ Галина Рубеновна

Инокуляция небобових растений ааотфнксируицими бактериями рода Pseudomonas и мутантаыи рода Bacillus

Специальность 03.00.0У - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1990г.

РаОота выполнена на кафедре био^гии почв факультета почвоведения МГУ

Научный руководитель : Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор ИМ. Умаров доктор биологических наук, профессор В. Т. Емцев кандидат биологических наук Д Г. Курачова

Вэдудая организация: Институт микробиологии АН СССР

Защита диссертации состоится 1991

в 15 часов 30 минут в аудитории М-2 на населении специализированного совета К. 053.06.06 по микробиологии и агрохимии в МГУ им. IL R Ломоносова; Н9399, Москва, Ленинские горы, МГУ, ф-т почвоведения. Ученый совет.

О диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета почвоведения МГУ.

Автореферат равослан 1991г.

Приглашаем Вас принять на заседании специализирован рат в двух экземплярах прос Моекпа. Ленинские горы, МГУ

-««^кпении диссертации

Ученый секретарь j специализированного сове доцент /

МОСКОВСКИ* ОРДЕНА ЛЕНИНА. ОРДЕНА С«7ЯБРЬСКО* РЕВОЛСЦИМ X ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗИАЮИК 1ХХЗУДАРСТШИЫЯ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ Ы & ЛОМОНОСОВА

фАНУАт ПОЧВОВЕДЕНИЯ

На оравах рукописи

*

БУРЛУЦКАЯ Галина Рубеновна

Инокуляция небоСовьа растений ааотфиксируициим бактериями | ' рода Рзеискмгспаа и мутантами рода ВаоШиз

Специальность 03.00. 07 - иикробиаюгия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1990г.

Работе выполнена на кафедре бионик почв факультета, почвоведения МГУ

Научный руководитель : доктор биологических наук,

профессор ИМ. Ударов Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор В. Т. Бмцев кандидат биологических наук II Г. Курацопа

йедуцаи организация: Институт микробиологии АН СССР

Зашита диссертации состоится iegi

» 15 часов 30 минут в аудитории на заседании епеииаливиро-ьанпого совета К. 053.05.06 по микробиологии и агрохимии в МГУ ям. M. В. Ломоносова; И9899. Москва, Ленинские горы, МГУ« ф-т почвоведения. Ученый совет.

С диссертацией можно овнакомиться в библиотеке факультета почвоведения МГУ.

Автореферат разослан iimir.

Приглашаем Вас принять участие в обсуждений диссертации на заседании специализированного совета» а отзывы на авторе фе- . рат в двух экземплярах просим направлять по адресу: 119698, Уэсква. Ленинские горы, МГУ, ф-т почвоведения. Ученый сслет..

Ученый секретарь . саеидалиэироаатюго совета, fiddt Wi И. П. Бабьева

доцент У

Актуальность проблемы. Наличие доступного растениям азота является одним на главных лнмитируших факторов продуктивности агроэкосистем. Применение высоких доз азотных удобрений привело к возникновению многих экологических проблем. Одним иэ перспективных путей обеспечения сельскохозяйственных растений азотным питанием является фиксация атмосферного азота, в частности,' при шюкуляцли культурами диаэотрофных бактерий.

Имеются многочисленные данные о достоверном положительном влиянии па небобовые растения селекционных культур бактерий p.p. Aquaspir ilium, Arthrobacter, • Azoapirlllum, Baoillus,

Enterobacter, Flavobactertum (Еер^стецкиЙ и др., 1085; Ушров, Idas),причем увеличение урожая в прокаводствеинш условиях достигало 30®. Большой теоретический и практический интерес может представлять использование для этих целей высокоактивных мутантов и рекомбинантов азотфиксирующих бактерий. Пока имеются лищь единичные данные о действии таких культур па растения: неизвестно, сохраняют ли они свои жизнеспособность и активность азотфиксации в прикорневой зоне. Ыало сведений о влиянии на небобовые растения азтфиксирующкх псевдомонад, т.к. способность к азотфиксации у представителей этой группы бактерий до последнего времени отрицалась. Остается нерешенным вопрос о механизме положительного влияния инокуляции на небобовш растения (Воронин,Кочетков, 1S8Q; Kliiigmuller.lEtQO).

Целью работы явилась оценка шэзможости интродукции мутантов Baoillus polymyxa с измененной ааотфмксадией л аэотфикси-рущих втаммов Fseudomonas fluorescens в ризосферу небобовых растений,.оценка эффективности инокуляции и исследование механизмов их положительного в пиния на растения.

Задачи исследования

1. Получить коллекцию мутантов Baoillus polymyxa с измененной аэотфиксацией и азотфиксирующих штаммов Pseudomonas fluoresceins.

2. Изучить активность их нитрогеназы (ВТ) в чистых культурах и в ассоциации с растениями.

3. Иэуадть возможность интродукции мутантов Baoillus polymyxa с измененной аэотфиксацией и азотфиксирующих псевдомонад в почву и ризосферу. Исследовать выживаемость и динамику популяции мутантов в прикорневой воне растений.

ЦЕНТРАЛЬНАЯ

НАУЧНАЯ БиЬЛИОТЕКА Моск. овльскохоз. академии

им. Н. А, Тилиряаава.

Ине.№.......— - . ■

4. Изучить способность исследуемых штамшв квыделению физиологически активных веществ (ФАВ), фунги- и бактериостати-чески* соединений.

Научная новизна. Шервые установлено, что мутанты Bacillus polymyxa c повышенной активностью азотфиксации (пш мутанты й ауксотрофы по глутамину и глутамату) сохраняются и раэыножают-сл в прикорневой воне и достоверно повышают урожай рапса, редиса и тритикале. Выявлена синхронности пика численности му-* тактов с максимумом азотфиксации в ризосфере в фазе цветения растений. Нш мутанты характеризовались выделением ФАВ типа ауксинов и бэктерностатических веществ. тогда как ауксотрофы по глутамину и глутамату выделяли' только ФАВ типа гисберелля-нов, а максимум азотфиксации в ризосфере не совпадал с манси-' мумом численности этих мутантов. . Шаоды Pseudomonas fluorescens обладали весьма низкой активностью азотфиксации в-чистой культуре, но существенно, примерно в SO раз, увеличивали ее в ассоциации с растениями и в итоге повышали уролаЛ рапса и тритикале. Их положительный эффект обусловлен также выделением ФАВ типа ауксинов. 1

Результаты работы в опреленной степени раскрывают механизм действия аэотфиксируквдос микроорганизмов на растения: при инокуляции. ■ ." V -

Практическая ценность работы.- Полученные данные сведете льствуото перспективности исполдьаования мутантов и реком- . бивантов диаэотрофных т1кроорганиаюв для инокуляции небобовых .: растений. Коллекция ааогфиксирующих мутантов Bacillus polyinyxa и бактерий Pseudomonas.fluorescens может быть использована для; создании бактериальныхпрепаратов для инокуляции небобовых, растений. . .

Апробация работы. Результаты работы докдадывалиоь на YI. Международном симпозиуме по генетике азотфиксации i ВНР, 1937), Всесоюзной научной конференции "Ыикроорганиэмы - стимуляторы и ингибиторы роста растений и гшвотных** (Таткент,1989), Х ыежду-^ народном симпозиуме по почвенной биологии (ВНР,1989).Шждука-родной научной конференции "Изменение структуры и функций поч--

г 3 -

венных организмов под влиянием антропогенных воздействий" 1990) и на заседаниях кафедои биологии почв факультета почвоведения ЦГУ..

Публикации. По теме работы опубликовано ¿»статей, г сдано в печать.

ОБШСГЦ И МЕТОДЫ ИССЛЙД0СА]С1Я

Для инокуляции растений рапса; редиса и тритикале использовали ааотфгассируявдй шташ N28 Pseudomonas fluorescens, штамм 17 Baoillus poiymyxa (дикий тип) и 4 его мутанта с измененной азотфиксациеЯ Сауксотроф по глутаыину и глутамату» wf-ыутант и rnn мутанты). Культуры Рыли отобраны по результатам ■предварительных опытов, проведенных на коллекции из 16 штаммов азотфиксирушдх лсевдомонад, выделенных из ризосферы тритикале, a ïnorn 10 штаммов бацилл, выделенных из ризосферноЯ дерново- подзолистой почвы и 80 их мутантов с измененной ааотфик-сацкай. Мутагенез Bacillus polymyxa проводили на кафедре генетики и се декада биологического факультета МГУ под действием этилового эфира штансульфоновой кислоты; последующую селекции вели на средах с ограниченным обогащением ааотоы. В дальнейшей их поддерживали на среде 2едорова-Калмнинской (Калининская, 1967), а чистые культуры Pseudomonas fluorescens -на среде CS-? (Ванарцева, Шшинададэд.

Активность азотфиксацим в чистых культурах и в вегетационных опытах определяли ацетилановым методом в модификации кафедры биологии почв МГУ (Мгтоды... ,1960) на-гаэовом хроматографе CHRÛM-41 о пламенно-ионизационным детектором (длина колонки Ем, диаметр Змм. наполнитель Spberosil+lOX На^РО^,

давление rasa-носителя (Ar) - 2,5.атм, давление водорода - 0,8 ати, воздуха 0,4 атм).

Б модельных опытах изучали азотфиксацио в ассоциациях бактерий со стерильными растениями рапса (Brassica napus L.). В пробирку объемом 60 мл помещали слоем 3 см стеклянный дренах и б сы отмытого SX HCL кварцевого песка, приливали 5 мл смеси Гельригеля без азота и четырехкратно автоилавировали, Семена

стерилизовали концентрированной Н^О^в течение 20 минут, отмывали стерильной водой и проращивали иа чазках Петри с агари- . зовонной средой Федорова-Калининской. Через одни сутки отбирали стерильные проростки, переносили в пробирки и икокулнровали г мл суспензии микроорганизмов, отмытых от среды роста и стандартизированных путем разведения до конечной

концентрации ю6кл/мл. Культивирование растений вели в климатической камере тина РоеЬгоп 3001-01 при температуре днем

25сС, иочь» - 18°0, влажности 60%, освещенности 20 кЛкс. На 28еутки измеряли активность ацетилен редукции и учитывали зеленую массу растений. № результатам этих опытов проводили отбор культур СшггериЛ для дальнейших исследований.

Вегетационные опиты по инокуляций растений рапса, редиса; и тритикале проводили в фитотроне марки Рое1гоп, совместно с* Институтом почвоведения и фотосинтеза АН СССР, а также иа открытых площадная кафедры агрохимли ф-та почвоведения МГУ. Схема опытов приведена в табл. 1. Для инокуляции использовали 3 су-, точные культуры бактерий,, обмытые от среды роста и ресуспеиди-ровадшые в сте р иль ноя„водопррвсДной воде. Се не на перед посевом взмачивали на час ;в суспензии микроорганизмов, кроме того, во время посева ' ь ' почву дополнительно вносили эту: суспензию из расчета 1мл/семя. Повторвость всех опытов'Трехкратная.

Определение активности деиитрификации про&одши .по накоплению закиси азота. Для этого свсжеотобранные из вегетационного сосуда растения с корнями и почвой вокруг корней помещали во фдатон обьемом 500 мд, закрывали резиновой пробкой и дважды, с интервалом в один час, определяли количество эакиси азота в газовой пробе. Газы анализировали на газовом хроматографе СЪгот—12 с детектором по теплопроводности. Длина колонки 2,2 м, диаметр 3 мм, наполнитель Рагорао 0 (60-100 меш), ток пита* кия катарометра.70 ыА, температура испарителя 25 С, давление гава-носителя (гелий) 1,6 атм.

Динамику популяций клеток дикого типа; мутантов ВаоШиз ро!ушуха и РгеЫогяопаз Ииогезсепз в прикорневой зоне рапсЛ изучали, испольвуя: маркированные устойчивость» к стрептомицин^ втащи;. полученные методом градиентного агара (Гертардт,1б84),

- 5 - Таблица 1

Схема опытов оо инокуляции растеиий -■вдиса, рапса и трнтикало

Вариант опыта

удобрения, г/сосуд

юм-во п-ви кг/еосуд

растение «т/сооуд

тип

«Оработки

Модельный > климатической камере

Са( МО)^ 0.1 РйОх О.Зв

о о.зе

Р,Ол- О.Зв

к/) о, за

4,6

рало, 10

С/1Ш0иух дикий Тип 6 ¿тип ' Рз. Пиог.

<.8

редин, в

С/иноку*, дикий тип Ё4гип

Вагвта-киоыйШ на открытых пло-

ру^ГКП V

о.е ка о,в

1,06 СаС^ГО,)^-0.8

ка - о.© '

Са^ГО,^-0.8

ка - о,э

Са(НАР^>А-0,6

УО. - о,»

32

рМШ, 00

О/иноку а. дикиЛ тип Рз. Пиог. б4щц "-17пп £Э«1и

32

ра;Ш, 60

0/ИИОКУЛ. дикий тип Рз, Пиог. 64гил 17пт 23д1и

32

тритикала, во

б/иноку*, дикий тип Ра, Пиог. ■ Б4пя 17пт £Эц1и

32

Тритикале, 60

С/кнокух дикий тип Рз. Пиог. &4гап 17м» £Э«1и

- в -

а также методом сканируюсь ß электронной микроскопии.

Способность исследуемых бактерий' выделять 1>ЛВ определяли по методике Инситута физиологии растений АН СССР: калиброванию по размеру семена рапса и редиса эаыачивави в суспензии микроорганизмов (опыт) и в стерильной воде (контроль), проращивали в течение б суток и затем измеряли длк.у стеблей, корней и массу проростков. Наличие ауксинов и гиооерелдинов в культуральной жидкости определяли при немощи биотестов с эпи-копиями фасоли сорта "Секс** и гипокотшими caiara сорта "Еер-линксий" (Кефали с соавт. ,1332).

фуиги- и бактериоетатическое действие культур определяли методом агаровых блоков и радиального штриха (Eropos, 1665).

РЕЗУЛЬТАТЫ НОСЛЕДСХШМЯ

Характеристика чистых культур бацилл и лсевдомонад На первом этапе работы была выделена коллекция аэотфикси~ р)тиш бактерий р. Pseudomonas я Bacillus , широко распространенных в ризосфере растений, но сравнительно мало изученных в отловаН4Ш ассоциативной азотфиксоции. Bacillus polymyra - микроаэроб, активный ааотфиксатор, хорошо адаптирован к условиям низкого парциального давления кмеорода в ризосфере; выделяет антибиотик подимиксин, образует споры, что способствует высокая конкурентоспособности при колонизации корней. Бактерии рода Pseudomonas могут оказывать разносторонне действие на растения посредством продуцирования сидерофоров,' антибиотиков, регуляторов роста растений. Относительно недавно у псьвдомокад открыта способность к азотфиксации как в чистых культурах, так И В ассоциации с растениями.

Коллекция Вашиus polyroyxa с высокой активностью ааот-фиксации была выделена из риаосферной дерново-подзолистой легкосуглинистой среднемощной сдабоокультуренной почвы. Для дальнейших исследования бш выбран штаыы N17 с наиболее высокой нитрогенаэной аетивностыо. Химической мутагеигаацией была получена коллекция иа 80 мутантов с измененной аэот$в..<ссацией. № характеру мутацкй коллекция была разделена на 4 группы (тайд. 2):

1. Мут&нты с нарушение« азотного метаболизма, не способные расти на беэазотной среде, ко обладающие активной нягроге-иааой. (пга мутанты)

2. 1&такты с нарушенным азотным метаболизмом, не способные расти на беаазотной средо и не обладащие активной кктрогеназой <nlf-)

3. Ауксотрофы по глутамину и глутамату, характе риэуицнеея повышенной активностью нитрогенаэы (flu)

4. Мутанты с дерелресеировашгой в присутствии ионов аммония нитрогеназой (dr)

Таблица 2

Характеристиклчисткх культур лмато типа, мутантов ,

Bacillus и Pseudomonas fluorescens

1 | Штамм I 1 Способность использовать соединения азота (5мЫ) | Активность КГ <нН | этилена/мг Оелка/мкн) • I * рввер-1 I сий л

] < 1 1 1 ГН 1 ГТ * — | глутамат (M^SO, 1 I

1 ЯЯЮА ТИП 1 ♦ t ++ 1 1 »+ 1 t. 1 ++ 16 ■ , , . , . 0

I I 23glu 1 EßgiU 1 г 1 | 4+ t t ++ I I ( 4+ 4+ | 48 1 16 0 0 t i

I I 54nm I 17nm 1 19nm I ISrai i - I 1 ++ j ++ 1 ++ I ++ • t ++ l 1 ++ 1 \ ++ l I +4 - t 1 t +4 +4 ++ 44 1 I 41 | 20 | 18 1 21 0 0 о Ч 0. i * -г | 1-4*10 |

i I «lf-2 1 mr-ao t mr-91 1 * 1 t ++ | +4 I ++ 1 1 [ 4+ t 1 44 i f ++ t 44 44 1 1 0 1 0 i 0 0 . 0 0 } l

i I <tr64 I dr«9 I dree I dr<» i | 1 ++ | 4+ ¡44 ¡44 1 1 1 ++ 1 1 ++ l 1 44 i i ++ 1 1 1 +4 4+ 4+ 44 1 S.4 1 7.14 1 в,64 1 в.2 1 0,12 , 0,08 0,07 0,3 I I более ■ | Ю^ I

i-------------- | Ps. fluor. 1 +4 * 1 1 1 4+ t 1 t 44 1 0,75 . 0 ■

- б -

Четвертая группа мутантов представляла особый интерес для применения в качестве инокулята на фоне азотных удобрений. Однако все мутант» ив атой группы были нестабильны, к через несколько пересевов ревертировалн к дикочу типу. В свяеи с этим для инокуляции использовали мутанты рз других групп, обладавших наименьшим процентом реверсий и имевших стабильное превышение активности ИТ над ее уровнем у дикого типа. Наибольшей активность» НГ обладали ауксотрофные мутанты . причем они Примерно в 6 раз преЕогходили дикий тип по этому показателю. Кутанты из группы гея, имевшие нарушенный азотный метаболизм, также обладали значительным превышением активности ааотфикса-цин над диким типом: пи 54 примерно в 7 рае, пл> 17 » в 3 раэд. М1Г- мутант, не имевший активной НГ, как и следовало ¿.лдаи, яе проявил в чистой культуре способности к азотфиксации и был : нспольооваи в опытах в качестве отрицательного контроля.

Таблица 3

Инокуляция стерильных растений рапса диким типом, му-■ тактами ВаоШиз ро1утуха и Рэеийодопаз Пиогегсепг

1 Штамм ! I | V Активность HT, t н11этилеяа/оробирка*час I Вес надземной части | ' растений, мг |

I Контроль Ces 1 1 инокуляции 1 ■ ...... f .. . 1 0 I 103 £5,2. |

| ДИКИЙ ТИП I 10,5 | 112,6iat7 - |

1 1 1 Sir- 2 | 1 а 0,2 | 90,126,0 1.

I 1 I 23glO | ■ » 15,4 | .....1 120,317,2 Г

1 —| _ I 17nm ' I | S4nm t ( 13nm I I ISrun 1 t ■ 1 Ml * 15,9 | 11.0 | 14,0 I 15,0 | t 134,2*8,1 | 123.8Î3,4 | 112,013,в | 111.4Î5.7 ■ .......t

I ■ I.1 I Рз. fluorescein I 2,0 | 123,8i7,6 ...t.

Коллекция бактерий Pseudomonas fluorescens была выделена из ризосферы тритикале. Изучение морфологических, физиологических и биохимических признаков позволила отнести эти микроорганизмы к биотипу 2. Активность аэотфиксации в чистых культурах была весьма низкой и колебалась в пределах 0,015-0,075 км зтклена/иг белка/мин, что примерно в 100 раа ниже активности штамма N17 Bacillus polymyxa, Для инокуляции растений был выбран штамм N28, отличавшийся наиболее высокой активность» НГ, '

На втором этапе работы научали азотфиксацию у выделенных культур при инокуляции стерильных растений ' рапса (табл. 3). Повторность опытов 12 кратная. Согласно полученным данным, в ассоциации со стерильными растениями мутанты сникают активность ааотфиксацки по сравнению с диким типом Bacillus polymyxa. Так, если в чистой культуре ауксотроф 23glu был в 8 раа активнее дикого типа, то в асеоциаци активность его НГ выше лишь в.1,5 раза. То же наблюдается и в отношении пт мутантов. Штамм H2ß Pseudomonas fluorescens, напротив, в ассоциации со стерильными растениями рапса проявил высокую активность НГ, сравнимую с диким типом Bacillus polymvxa. Это подтвверждает известное положение от более тесной ассоциативной связи псевдо-шнад с растениями, в результате которой они получаю; из кор-невх экссудатов такие вещества, как гдутаминовая кислота, изо-лейщш, тирозин, триптофан, повышающие активность азотфиксации у этих микроорганизмов (Watanabe, Barraquo, 1979).

При инокуляции стерильных растений мутантами Bacillus polymyxa и псевдомонадами было отмечено увеличение массы надземной части растений на 20-30Х.

Таким образом, опыты с инокуляцией стерильных растений позволили сделать вывод, что и при интродукции в естественную природную среду.преимущество мутантов перед диким типом будат сохраняться«

Дня оценки влияния ФАВ, выделяемых микроорганизмами, в предварительных опытах изучали действие коллекционных культур Bacillus polymyxa и Pseudomonas fluorescens на прорастание семян рапса и редиса. По полученным данным, дикий тип, tu» мутанты и ауксотрофные мутанты Bacillus polymyxa, а . тшуяэ

Pseudomonas fluorescens оказывали стимулирующее действие на прорастание семян: длина коркя увеличивалась в 1,5-2 раза, длина стебля - в 1,2-1,5 раза, масса проростков - ita 2Q-303L Лишь nlf- мутант, не обладавший активной HP, не оказал стимулирующего действия на проростки рапса и редиса.

По результатам определения активности азотфиксации в чистой культуре, в ризосфере стерильных растений, изучения влияния микроорганизмов на прорастание семян, для инокуляции растений в вегетационных опытах били отобраны следующие куль-турьс дикий тип Bacillus polymyxa, пп> мутанты N54 и К17,аук-сотрофный мутант 23?lu, nlf- 2 Ii штамм 28 Pseudomonas fluorescens. '

Вегетационные опыты по инокуляции растений рапса, редиса и тритикале культурами 'Bacillus polymyxa и Pseudomonas fluorescens В качестве испытуемых растений для вегетационных опытов ' были выбрани рапс, редис и тритикале. Рапс - ценная масличная и кордовая культура, широко районированная на территории СССР. Она быстро проходит первые фазы своего развития и проявляет при этом высокую потребность к азоту. Тритикале - новая кормо- ■ вая культура, хорошо растущая на бедных агрофонах, что позволяет предполагать налчие у нее высокого уровня ассоциативной , азотфиксации. Редис - овощная культура, при возделывании кото' рой нередко применяются минеральные азотные удобрения, и поэтому снижение содержания нитратов в корнеплодах за счет усиде- -ния азотфиксации представляется актуальным.

Активность азотфиксации в ризосфере рапса» редиса и . тритикале измеряли в вегетационных опытах, используя различные Фоны удобрений (табл. 1). В варианте опыта с редисом, где были кспользованы высокие дозы азотных удобрений ( 16 мг/кг почвы), азотфиксации обнаружено не было, что хорош согласуется с известными данными (Степанов, 1965, Бэлкогон, 1987) . В вегетационных опытах с рапсом ( табл. 4) было обнаружено, что дозы азотных удобрений 20-30 мг/кг почвы не подавляют полностью ак- ■ ' тивность азотфиксации в ризосфере этого растения, хотя примерно в 3 раза снижают ее. Однако именно этот фон минеральных . азотных удобрений позволил выявить различия в азотфиксации . между разными культурами бактерий, интродушровгнными в ризос-■ феру. Так, если на вариантах бег применения азотных удобрений '

. _ Ii -

' увеличение активности аэотфиксации при инокуляции диким типом Bacillus polymyxa и пш мутантами невелико - 14-10Х , го на вариантах с применением азотных удобрений разница между "нокули-рованнши и контрольными вариантами более существенно - в 1,53 раза., Это хорошо объясняется эффектом т. н., "стартового** азота (Умаров,19&6). Из приведенных в таблице 4 данных, характеризующих активность ацетиденредукции в вариантах опытов с применением минеральных азотных удобрений, следует, что по сравнен»» с контролем инокуляция диким типом и пш мутантами Bacillus polymyxa, а также штаммом-N28 Pseudomonas fluorescens во всех опигах повышала азотфмксаци» в ризосфере рапса: дикий

■ тип Bacillus polymyxa - в 1,6-1,8 раза, мутант 17пш - в 2,8 раза, 54nm - в 2,8-3 раза, Pseudomonas fluorescens -в 1,5- 3 раза. Ауксотроф 23glu не повышал азотфиксацкю по сравнении с контролем, хотя ■ в чистой .культуре он проявлял саму» высокую

• активность НГ.

В таблице 4 приведены абсолютные значения активности аэотфиксации разных штаммов при развитии в ризосфере растений. По этому показатели :nm мутанты в ризосфере превышают дикий

. тип Bacillus polymyxa , хотя по сравнению с нитрогеназной активностью чистых культур их преимущество уменьшается. Так, в чистой культуре б4шп превосходил дикий - тип в 6,8 раз, а в ве-

■ гетационном опыте в 2 раза; 17пш в чистой культуре в 3,3 раза, а в ризосфере в 1,5 раза активнее дикого типа.

Противоположную тенденцию проявил штамм N28 Pseudomonas fluorescens, активность НГ у которого в чистой культуре составляла лишь 12 от дикого типа Bacillus polymyxa. При взаимодействии с растениями эта культура повысила активность азот-фиксации примерно в 30 раз по сравнении с чистой культурой. *

; Резкое возрастание активности аэотфиксации бактерий рода Pseudomonas в присутствии аминокислот, таких как глутаминосая, изолейцин, т**розин и т.д. отмечалось и в других работах (Watanabe et al., 1979, Barraquto et al,. 19S6). Эти вещества постоянно присутствуют в составе растительных экссудатов { Либ-берт,198б, Полевой,1989). Известно также, что псевдомонады используют корневые выделения на 73-92Х (VanCura, 1980) и, следовательно, прикорневая зона особенно благоприятна для этих бактерий, вследствие чего они повышают активность азотфикса-

Таблица 4

Активность азотфиксации в ризосфере рапса (моль Н7*10~7/сосул/иин)

(Вариант 1 30 дней, . бутонизация V 9 I 35 дней, | I цветение | -, 45 дней,конец| цветения I

I PK. б/инок. | 1 1 1 1 ■ 1,311,7 I 19.9*4.4 | 2,7210,39 I

1 1 1 PK,д. тип | 1 1 2,9311,64 1 1 I 22,8¿3,08 | ■ 1 1 ■ 1 1,0310,71 |

1 PK, 64nm | ■ I 3.4*2,08 . |. —— 1 I 23,77Ï7,8 | ■ ¡il 3,24t 1,2 |

1 PK, 17nm I ■ ■ 2,210,09 1 1 1 I 19,0218,2 | I 1 5,8811,5 |

1 PK. 23glu | t ■ 1.56 ¡1,3 I 2,83*2,36 | 1 1 2.9211,3 |

1 l 1 PK,Ps fluor. 1 • • 4,&tl,03 1 18,8217,49 | l i 6,7014,0 |

i i 1 NPK. б/инок. | t 1 0.012,5 I 4,4212,2 | 6,34^0,86 |

l l I HPK, Д. ТИП | 1 1 i, 060,4 1 1 1 7.0215,76 | ■ а 2,55*0,42 |

1 NPK. 54nm, | ■ • 0,76±0,30 I 13,7313,6 | 5,6бЮ,99 1

1 NPK. 17nm | 0,S6±Ü,44 I D I 10,7503,7 i 4,0611,17 1

1 NPK, Z3glu | ■ t 2,Sil,33 I 4.3S4.0 | t t 3,094,21 (

1 1 1 HPK; Ps. fluor. | 0,7310,11 ■I ........... ..........— 1 1 5,7&î2,18 I 6,0211,06 |

1 . - | ! о/инокуляции | ■ t ' (8,3t2,7)M0's —i I (2,S4i0,55>*10 | t t : l

1 дикий тип | ■ 1 1 ■ (13,Bir,6)*10T4 I <5.113,0)*10"5 Ii I

1 1 1 1 I S4nm . 1 (23,0i2,0)*10"* 1 "1 I <2,&a,6)*io"s | I

1 1 1 Ps. fluoresoens) "---------«- (26tl3,2)*10~s i i I (3,8il,6)*10-J | JL—------------1.

цик. При измерении ацетилен редукции в ризосфере тритикале наблюдалась аналогичная картина: четкие различия между инокуляро-вапными и неинокулированными вариантами проявились при внесении "стартового" азота. При инокуляции диким типом Bacillus polyrnyxa активность аз от фиксации в ризосфере повысилась на 791, мутантом 54nir - на 03Z, 17пт и в Э раза. Инокуляция ауксотрофным мутантом не увеличивала ааотфиксацию в ризосфере тритикале.

Так как многие активные аэотфиксаторы могут осуществлять и деннтрификацип, необходимо было установить, не способствует ли инокуляция увеличению потерь азота в виде его окислов, что было бы весьма нежелательным ее последствием. Проведенные ИЗ7 мерения активности денитрификации по эмиссии закиси азота в вегетационном опте по инокуляции тритикале показали отсутствие достоверных различий между инокулированными и контрольны-, ми вариантами.

Влияние инокуляции на урожай рьпса, редиса и тритикале отражено в табл. б и 6, За исключением дикого типа- Bacillus polymyxa, все штаммы дали прибавку урожая: Pseudomonas fluorescens - 17Z для рапса н SOX для тритикале; S4nm - 13Х для рапса и 10% для тритикале. Характерно, что культуры, которые проявили максимальную ааотфиксацгао в ризосфере, дали к наибольшее увеличение урожая. Иутаят £3glu, который не повывал ааотфиксацию в ризосфере, способствовал и наименьшеЯ прибавке урожая (65 для оапса и 14% для тритикале). Инокуляция диким типом и 54пш мутантом редиса была еще - результативнее. Урожай корнеплодов увеличился на ЗОХ при инокуляции диким типом и на БОХ при инокуляции мутантом. Это позволяет предполагать, что 'основную роль в увеличении урожая играет именно усиление азот-фиксации в ризосфере, хотя имеются и другие механизмы стимуля- , 'ции, действующие параллельно и позволяющие ауксотрофу положи- }. те ль но влиять на развитие растений..

Таблица б

Влияние инокуляции на урожай рапса, тритикале и редиса в вегетационных опигах (г сух. в-ьа, среда.- дзя 3 сосудов) .

1 Вариант -1—......Г 1 рапс 1 тритикале 1 1 1 редис|

1 без инокуляиии I 20,77 | ■ | 24,78 1 3.341

1 1 дикий тип . 1 20.01 | I I 23,51 1 1 1 4,50| ■.....'. 1

I 54пп I 23,40 | 29,50 1. .; 1 1 5,30! ) 1!

11 1 I 17ПГО 1 1 23.75 | V 22,85 1 ,. . I 1 н/о | 1 1

1 23е1и . 1 21,98 | 28,19 1..... 1 | н/о | 1 ■

1 I Рэ. Пиогезсепз 1 24.29 | 29,75 \ 1. - 1 1 ;н/о 1 ■||-|..||.| II»

.:■ Таблица б ■

Влияние инокуляции па содержание, общего. азота в растениях и почве в вегетационных опытах (мгМ/100г) -

I'"' ' ■■ ■ I Вариант (растение; I ВЫНОС 0 I урожае« | содержание |. в почве 1-— -----1 | N1- нитратный! | в корнеплодах!

I без инокуляции.: 1 ; 133. | 128,6' | 1

I дикиа тип' | рапс.' ' I 151 1 132,8 1 ■>■'■' .'■■ 1

I 54пт ■ • ■* ' 1 145 ^ 1 133,2 1 1

1 Рз. Пиогеэсепз 1 1 173. | 136,7 1 - ■■■'.. 1

| без инокуляции 1 115 | 1 112 ; 1

I дикий ТИП 1 редис | * 13? I' — 1 .119 II

I 54пт 1 | 166 | » I 35 I --1

- 15 -

Для понимания механизма действия инокуляции иа растг iwe важным было и то, что в опытных растениях увеличивалось содержание общего азота: при инокуляции растений рапса диким типом на 13S, редиса на 192: при инокуляции 54лт мутантом - на . 44Х в растениях редиса и на lCBt в растениях рапса. При инокуляции псевдомонадой содержание общего азота в растениях рапса увеличилось на 301, а в почве вегетационных сосудов - на 4 - б мг/100 г почвы. Это еще раз подтверждает первостепенную роль азотфшссации в действии инокуляции на иебобовые растения.

Дгоамта численности дккага типа, мутантов Bacillus pelynyxa и РзеисЗояооая fluorescens » рюс эфере рапса.

• Изучение поведения культур в ризосфере инокулироваиншс растений является неблщимым этапом после проведения инокуляции. Поскольку поведение мутантов с повышенной способностью к аэотфиксации до сих пор практически не изучалось, то было важно выяснить их выживаемость в ризосфере, определить дккзкику . численности' мутантов из разных групп и понять причину различий в аэотфиксации, обнаруженных в вегетационных опытах. Кроме того, исследование динамики внесенных популяций может помочь раскрытию особенностей взаимодействия растений и микроорганизмов (Звягинцев, 1987).

Изменение численности дикого типа, мутантов 54nm,23&lu, Bacillus polymyxa и Pseudomonas fluorescens в ризосфере рапса в вегетационных опытах представлено иа рисунках 1-4. Все внесенные в ризосферу культуры успешно приливались и. колонизировали корни растений, достигая к концу, наблюдений (50суток) плотности популяции lu кд/r корней, однако только пш мутант и Pseudomonas fluorescens достигали максимума адслекности к 30 суткам, что соответствовало фазе цветения растений и пику ак-* тивности аэотфиксации. Именно эти культуры существенно, примерно в 3 раза увеличивали активность ацетиленредукции в ризосфере. ■

Численность дикого • типа Bacillus polymyxa начинала возрастать несколько поэме периода цветения и, вероятно позто-■ му, влияние дайной культуры на азотфиксацию и урожай было ека- . чительно меньше. Численность клеток мутанта E3glu возрастала а . риэоплане лишь к 40 даю наблюдений, когда максимум аэотфикса-

Ч* ' ■»-

Pao. 3. Дакашка численности цртанта 23^ в рнзосфзре рапса

I - ргзошава; 2 - ризосфера; 3- почва 4 - актгваость НГ 'Сшль ' *10/сро/кш

il

mz. довгрнг. интервал

ti

1 в 11 1в 81 гв 31 30 41 49: 81 5в

Рас. 4. Динамзгса 'чисягааоста ц^таэта ;

54fw в разорфзре разез

I' - ризоизаза; 2 - ртззофера; 3 - почза

à — ТТЛ /»с."т *тfT^fnr-f* /"-»"Y

I - разрезана ; 2 - рзззс£ара 3 - почва 4 - активность НГ (моль ¡оайфх*. Рас* I. Динаквка чгсле^остл ft./lwí-Zaum pcsoci эре рал ca.;

fiai, доверит, интервал-4q

.в

s ■

Q| Il , I I И I Ч.| I I 1 I II Ij 1 I I I 11 t 1 H I I m I I ll| I I ■ Q

1 8 в 13 1Í a Î5 í> » S' 41 46

I - разошшг ; 2 - ризосфера; 3 - почва-4 - активность ET *10"усос./ша. )

Psv, 2. jjumma численности дккоги тша '. Ы, plynyx^ b ризосфере радса. -

дои сш уже пройден. Характерно, что влияние этого штамма на ааотфикеашп и урожай било минимальным.

Следовательно, еще одно важное ааклшенме состоит в том, что культуры, повышавшие при иноодлции аэотфиксацию и урожай, например 54пш И Pseudomonas fluorescehs, развивается синхронно с развитием растений и максимум их численности совпадает с пи- ■ ком активности азотфиксации в ризосфере. Штаммы, влияние когорт на азогфмкацш и урожай невелико или отсутствует, достигаю максимума численности » ризосфере после прохождения максимума аз от фиксации.

Приживаемость внесенных игаммов на корнях ииокулированных растений была исследована на сканирующем электронном микроскопе. Было обнаружено, что клетки мутаиткых культур дикого типа Bacillus polymyxa и Psetrfofnonas fluorescerts колонизируют корень, располагаясь с наибольшей плотностью в базальной его части, что согласуется с имеющимися данными (Берестецкий, lfiS2). -

Возможные механизмы положительного влияния микроорганизмов на растения при инокуляция

Как отмечалось, положительное действие микроорганиз-»«юь-вгатймксеяороь иа растения при инокуляции состоит не только в интенсификации процесса аготфиксации. Многие активные аасгтфиксаторы выделят 4ДВ типа ауксинов, гиббереллинов, цито-OiHvtKOB, а также сидерофоры и другие соединения, подавляющие рост фитспатогекных бактерий и микроммцетов (Кравченко, 1088, ВэрОИЯНД«89, Cacolart el al., 1989).

С lie лью выяснения действия этих факторов, помимо измерения азотфикеации, в культуральной жидкости исследованных наш гтаммо» определяли присутствие MB типа ауксинов и г и&бередлиной с помошью биотестов.

Согласно полученным Данным, дикий тип Bail Низ polymyxa, его мутант гж64 и Pseudomonas fluoresceins выделяют в культу-ральиую жидкость ФАВ тина ауксинов, причем для дикого типа и nnt мутанта действие этих веществ ва эпикотили фасоли соответствовало действие 0,6 жг/ил ИУК. ФДВ из культуральной жидкости 28 штах&е Pseudfomonas fluorescein стимулировали рост зпикоти-лей фасоли примерно в 3 раза больше, чем контрольный раствор. Много полаготв, что в культуральяав жкиоеп* дикого тша и

Б 4m мутанта присутствует около 0,5 инг/ил КУК, а Pseudomonas fluorescens - 1,5 нкг/мл КУК, что соответствует данным, получении» другими авторами <£ороиииг Кочетков, 1989).

В культура«)ной жидкости wy-ганта 23eJu обнаружены ФАВ типа гиббереллинов, причем их действие на гнпокотили салата соответствовало действию раствора _ гнбберелловой кис.иатц - в концентрации 0,5 мкг/мл. В культуральной жидкости ntf- мутанта не обнаружено ни ауксиноггадобных, ни гиббередлиноподобных ФАЕ В последнее время опубликованы данные (Barfcierl et al., 1V90), что nif- мутанты teospirlllum brasilenso могут обладать как повышенной, так и пониженной продукцией ПУК, причем ке обнаружено корреляции )иедцу способностью к ызотфиксации и продукцией ФАВ. Hanta работа показывает, что штаммы, дающие максимальную прибавку урожая (tw64 и Pseudomonas fluorescens), обеспечивают ее как благодаря повышенно азотфиксаци, так н выделению ФАВ.

Третий тип воздействия инокуляции на растения связан с подавлением роста фитгатогекных мищюорганнзмоа В ошлал ПО определению фунги- и С5актериостатического аффекта изученных культур было обнаружено (табл.?), что дикий тнл и um мутанты Bacillus polymyxa проявляют антагонизм в отношении Ervinta carotovora и Pseudononas aeruginosa, Антагонизма в отношении фитопатогенкых грибов не проявила ни одна из исследованных нами культур»

4 , ' Таблица ?

Влияние штаммов Bacillus polymyxa и Pseudomonas fluorescens на рост фитолатогеяных грибов и бактерий

«-Г" | тест-организм I 1 I 1 иггамиы | 1 1 1 1 > T--T--1-V Ii 2| 3| 4j 5| 6) 7f 8t 9 I 1 1 1 1 1 ! 1 1 1 t t 1 1 1 1 1 1 1

f Ps. fluorescens | t • t -1 -l -1 -1 -1 -f -) -f i i i i i i i i »

I .....— — 1 | ДИКИЙ тип | ■ 1 -Ii ll l l l -I -I -1 -J -Г -I -1 " 1 > 1

|- - ■ — ......I - | 54nnt 1 1 1 l l l 1 [ i l « -1 -l -1 -I -1 -1 -1 +1 i i i i i i i i 1 + | ■

1 1 I l?nm | » ■ I I I I 1 Г 1 J -1 -1 -! -1 -1 -1 -1 +f ........ I * I _1

» i j t ( t » i i i i 1 ¡¡sgiu i-i-l -l -f -l -l -l -l - l

i » | 2Ыf- I i-«— < 1 i i г f i I I -1 -1 -1 -1 -1 -I -l _t__J-1-L_-1_1__1_1- 1 - 1 _L

- 20 -

- отсутствие лизиса тест-организма

+ лизис тест-организма

1 - Fusarium oxysporum 2 - Fusarium solant - 3 - Fuz. solani-аегШаовШй 4 - PenictIlium funtou}№um

6 - PenjcllHum veruiculatum 6 - Aspergillus ustua

7 - Solerooia solerooiosua 8 - Erwinia carotovora

9 - Pseudomonas aeruginosa

ШИЮДИ

1. Шка ана возможность успешной интродукции мутантов Bacillus polymyxa с измененной ьзотфиксацией в псчву и ризосферу растений рапса, редиса и трикале.

2. Hm иутанты Bacillus polywxa сохраняют повышенную активность шггрогенааы и р&гмножаются в ризосфере синхронно о развитием растений, причем мэксимум аэотфиксадаи соответствует фазе цветения. ' Помимо этого они выделяю? ауксины и Сактерио-статическиь вещества, что в целом способствует повышению урожая и улучшению егс. качества. "

а Ауксотрофнш мутанты Bacillus polymyxa при ¿несении в ризосферу не' сохраняют повышенной активности аэотфиксации, размножаются а ризосфере после . прохождении растениями фазы цветения. Положительный эффект таких мутантов связан о выделением гиббереллииов.

4. Pseudomonas fluoresceins а чистой культуре обладает низко» активностью НГ, но значительно повышает ее в ассоциации с растениями.

б, извинение урожая при ш:ж?дяцш гтчяааио главный образом с усилением аэотфиксации в ризосфере, а меньшей степени с выделением GAB и Оактериостэтическмм действием.

6. Культура N28 Pseudomonas fluorescens и 5-tiim Bacillus ■ polymyxa могут , быть рекомендованы для испытаний в производственных условиях.

По материалам диссертации опубликованы следующие рас яьс .

1. В.Д. 4ролс,ъа, Г.Р. Бургуцкая. Н.й Белавина, Т.Н. Ыит-роиова, U. к Умаров. Стимуляция кебобовых растений мутантами Bacillus polymyxa с измененной агатииксациай//Чнкрооргани9мы -стимуляторы и ингибиторы роста растений и животных; Tea. докл. Всес. научя. конф. Ташкент, 3-6 октября 1980. - с. 207.

2. Умароп К М., «ролова В. Д., Бурлуцкая Г. Р., Ыитрошва f. 1L , Вэдавима Н. В. Инокуляция рапса активными штаммами почвенных дказотрофов и их мутантами с измененной аэотфиксаци-еА//Вестн. Мэск. ун-та, сер. Почвоведение.-1990. - N3. -с. 45-51.

3. М.Ы.Умаров, Г. Р. Еурлуцкая, 3. КуАицова. Инокуляция небобовых растений микроорганизмами из рода Pseudomonas//№3 ме ке-иие структуры и функция почвенных организмов под влиянием антропогенных воздействия: Матер. Мездунар. ЗЮиф. Чешские Будейо-вицн, 3-7 июля 1990. - с, 130.

4. Бурлуцкая Г. Р., Кубицова 3.,Умаров U.IL Влияние азотфикснрундего штамма Fseudomonas. fluorescens на развитие вебсбовых растений //Вэстн. Маек, ун-та. , сер. Почвоведение. -1Q91.-N1, в печати.

5. M.U. Умаров, В.Д. Фролова, Г. Р. Еурлуцкая, 1L В. Бз лавина, Т. IL Митроиова. Инокуляция яеСобовых растений азотфиксирущими

• мутантами p.p. Bacillus и PseufJomonas/ZB св.: Иикробиологичес-кий синтез физиологически активных веществ. - Иэд-во МГУ, в печати.

6. Shabaev V, Р., SmolIn V. Yu., Burlutskaya GL R., Umarov M. M. Nitrogen balance in soil cropped by non-lffu/zo plants Inoculated with nitrogeiv-f ixinp microortranlsms//10 International . Synposlum on Soil Byology, Keszthely, 27-31 august 1009. -

******* [«J^f