Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Индуцированные сверхспирализацией протонированные структуры ДНК

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Индуцированные сверхспирализацией протонированные структуры ДНК"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ♦ИЗИКО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

БелоцерковскиЦ Борис Павлович

ИНДУЦИРОВАННЫЕ СВЕРХСПИРАЛИЗАЦИЕИ ПРОТОНИРОВАНННЕ СТРУКТУРЫ ДНК

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

ЫОСКВА 1992

Работа выполнена в Институте молекулярной генетики РАН.

Научный руководитель: доктор фазкхо-матеыатических наук профессор М. Д. Франк-Каненецкий

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук профессор Иванов В. И.

доктор химических наук профессор Будовский Э. И.

Ведущая организация: Институт Ледка РАН.

Эацита состоится • (УиЯ?-^ ]992г. и /д ^ часов на васеда* Специализированного совета К ОвЗ. 61. 10 при Московся физико-техническом институте по адресу: 141700, Московся облаоть, г. Долгопрудный, Институтский пер., в, МФТИ.

С диосертацией можно ознакомиться в библиотеке Московскс физико-технического института.

Автореферат разослан 1992г.

Ученый секретарь Специализированного совета

кандидат физико-матеыатических наук В. Б. Киреев

СПИСКА:?

i

Актуальность темы. Протежированные неканонические структуры ДНК. индуцируемые отрицательной сверхспирализацией, интересны по двум причинам:

1): При достаточно большой сверхспирализации эти структуры могут существовать при физиологических условиях, что позволяет Думать об их биологической роли. Надежда обнаружить неканонические структуры in vivo возросла после открытия "волн сверхспирализации- - локальных сгущений положительной и отрицательной сверхспирализации, возникающих в ходе транскрипции (Wu, Н. - Y. i Shyy, J. С., Wang, J. С and Liu, L. F. (1988) Cell 53, 433-450). Информация, получаемая при нследооанип неканонических структур in vitro, позволяет оценить возможность возникновения данных структур в живой клетке.

2). Многие (если не все) протонированные некаконические структуры, .. индуцируемые сверхспирализацией, содержат " тройную спираль, т. е. являются внутримолекулярными триплексауи. Многие данные по энергетике этих триплексов можно экстраполировать на межмолекулярные триплексы того же состава. Параметры межмолекулярных триплексов представляют большой интерес в связи с проблемой специфического узнавания участков двойной спирали ДНК олигонуклеотидом при физическом картировании и рестрикции. Простота и корректность экспериментального измерения сверхспирализации делают такой метод исследования триплексов перспективным.

Цель и задачи работы. Целью работы является определение ряда энергетических параметров протонированных неканонических структур, возникающих в отрицательно сверхспирализованной ДНК. При этом внимание сосредоточенно на структурах, более или менее отличных от классической Н-формы. В работе решались следующие задачи:

1. Влияние точечных замен на энергию образования Н-формы.

2. Определение энергии нуклеации протонированной структуры, возникающей в теломерной последовательности Тетрахимены.

3. Регистрация новой рН-зависимой структуры, возникающей в теломерной последовательности человека.

4. Стабилизация рН-зависимых структур . при связывании с

одноценоч^ЧпйМ o.!Ílfr9liy'k.>U'0,rii.t!iM<

Научная Н1)Ц|К''1|П рабп-fíJ. !|Í :i,r.oil! работе пригешни. .itamiue, позволяющие определить :)iw[i|4í(i различит искажешЮ m тгрнплексе /¡-фирм», что полно.шит oucillivi. св^рхспнралыпчо 'плотность R-H перехода для различным Uicn;ítoji(fhíiTо-íi.HocTfM'i 'Кроме Tono, ш данной работе продеМто'трИронано. Что анергия нуклсании иротонировапноП структуры Чю'жот быть в дна» риза меньше знергии пуклеанип чллссичейкоП Ч|-1формы. позникаюшоП п иолиТС последовательности. Это наблюдение. и также обнаружение pll-зависимого перехода п теломерноП последовательности человека. которая лиш. на Полосину является зерки.-ц.'По-аИММе'ТриЧШЛ! Томопурпн-гомопирпмилиповыч партером, сильно расширяет круг Последог.птелыюгтеП. в которых могно ожидать возникновение гротоннрованннх структур. В данном рабо-'е впервые исследовалось соотношение между двумя конкурирующими , способами пзанмодсПствия

гоишгурин-гомомиримидшмвого j чаи гка двупеггочечноп ЛШ; и соответствующего гомон при мн.чин оного ол и г пн> к л сит и да: образованием межмолекулярпого триплекса 'И стабилизированной ||-форми.

Стабилизированная П-'форча. образование котсроП било продемонстрировано в настоящей >работе. i;o разрушается длительное время при тех условиях', npli 'которых обычная ll-¡l>opvu быстро исчезает. R работе обсужйас'тся 'возможная биологическая роль таких структур.

Практическая ценность. Определение анергии точечных замен в триплексе позволяет оценить специфичность узнавания участка двуспиральноА ДНК триплекс-образующим олигенуклеотидом. что имеет прямое отношение 'к проблемме мскупс'твепноИ .редкои.епящеп рестриктазы.

Апробация. Материалы работы докладывались i:a семинарах Отдела экспрессии генома И\1Г РАН, на конференциях -Нуклеиновые кислоты и терапия- (Флорида, 1991 ), -Структура ДНК и белковое узнавание-(Мадрид, 1992г).

Публикации. По томе диссертации имеется С публккшнл. Материалы и методы. ОсновноП метод. нсподъзуемиЯ с настоящей работе - двумерны!! электрофорез топоизомеров ДНК в агароьном геле. Широкий набор топоизомеров плаэмид, изиользуемьт для атих нелеп, получали обработкой с верх спиральных плагмид топоизомирагой I при различных соотношениях количества ДНК и бромистого этидия.

i. солм'жлш'.е рапоти.

Данная работа посвящена структурным переходам, которые происходят в ДНК при НИЗКИХ pli ll/ИЛИ иод ВОЗДСЙСТВИСМ отрицательной сверхепиралнзацип.

Первая глава работы является обзором ■литературы, затрагивающей ;)ту тому.

Глава 1. Литературный обзор. Плотность отрицательной сверхсиирализаыин, при которой происходит структурный переход, и, изменение количества сперхвнгков в ке.п,цепей замкнутой, ДНК. при, структурной перекода HücjT информацию об энергетических и. топологических характеристиках структ> pu. в перцам разделе литературного обзора кратко излагается теория, ног.воляк.щая извлечь ату информации из экспериментальных данных :

Кольцевая замкнутал диушпочечная ДНК обладает топологическим инвариантом, порядком зацепления (Lk), которнП невозможно изменить без разрыва одной из цепей. По определению, порядок эыл»-член¡1(1 •• это число прохождений одной из Цепей через uooöpлжачлч*»» iiuec-pwiocrrf,. границей которой является другая, цопь. Если on, ли .')с;жн1 в плоскости, порядок зацепления четь

щюдю чаол«» витков двойной -спирали. ¡1 общем случае порядок зацепл<-ш я зависит « от конфигурации, принимаемой ось*) молекулы в пространстве. ДИК без токологических ограничений ( например, линейна« ) содержит s/r витков, где N - число пар основания ДНК, у - период двотюи спирали при данных условиях. Если порядок зацепления Кольцевой замкнутой ДНК отличен от N/г. ТО днк находится в напряженном состоянии, называемом сверхепнральным. Если 1,1; > \/г, сверхспирализация считается положительной, в противном случае - отрицательной. Мерой сверхопирализашш является число оверхвптков:

Т = I к - К/г (1 )

или плотность снерм'пиралпзацни:

с = т/о;/?) (2)

Молекулы, отличающиеся лишь количеством оноршггке». напшарто^

з

топонзомерами. Энергия растет как квадрат сверхспиральной плотности:

О =10 N И Т о1 (3 )

Здесь К Т произведение газовой постоянной на абсолютную температуру. Образование неканонической структутуры на участке длиной ш пар оснований можно формально представить как изменение периода спирали ДНК на этом участке. При этом для изменения сверхспиральной плотности До к энергии сверхспирализации ДС имеем:

Да = шкА (4)

ДО = 10 N К Т ((о + До )2 - а2 ) (5)

Коэффициент к характеризует топологию структуры, и определяется из формулы:

где гв и ,г8 - число пар оснований, приходящееся на один виток спирали в В-форме и в неканонической структуре соответственно, причем последнее считается положительным, если спираль правая, и отрицательным, если спираль левая.

Эти соотношения служат основой для всех расчетов, проводимых в данной работе.

Во втором разделе литературного обзора рассказывается о методах экспериментального измерения сверхспиральной плотности: одномерном и двумерном гель-электрофорезе ДНК.

Третий раздел' литературного обзора посвящен неканоническим структурам, зависящим от сверхспирализации и близким к исследованным в' настоящей работе. Это прежд^ всего внутримолекулярные триплексы: Н- и Н";-формы ДНК. Четвертый раздел обзора связан с неканоническими структурами, образуемыми олигонуклеотидами: межмолекулярными трпплексами', а также четэерниыи ц двойными шпильками. Информация о подобьых структурах чоДОТ служить основой для выбора моделей структур, возникающих в еверхспиралышй ДНК.

В пятом разделе обзора кратко обсуждается возможная биологическая

роль неканонических, структур.

Глава 2. Результаты и их обсуждения. Раздел 1. Структурны!! переход в последовательностях с (точечными заменами.

Первый раздел работы содержит данные о структурных переходах в последовательностях, в которых лишь две из тридцати двух нуклеотидных пар нарушают Н-палиндром, что приводит ik образованию Н-форми с одной неканонической (т.е. отличной от здт и CGC*) триадой.

В работе исследовался набор плаэмид рХУ32 (производных pUCl9 ), содержащих последовательность:-

5'-aagggagaaxggggtataggggyaagagggaa-3', где X и Y - любое основание ДНК (приведена пурин-богатая-нить вставки) На рис.il приведена Н-форма, образуемая такой последовательностью.

Рис.t. H-форма, образуемая вставкой в плазмице pXY32.. Закрашенный квадрат

обозначает уотсон-криковское спаривание: пустой квадрат -хугстеновское спаривание между аденином и тимнном. а также возможную овячь <в неканонической триаде; ¡плюй - хугстеновское опдриьаниэ между гуанинам и

протонированнмм ¡иитоаиноы.

Видно, что такая Н-форма содержит триаду \TVïX irsie YiJ rfl vXc -основания, комплементарные Y и X соответственно, (в'-случае JC == Y =, А или G такая триада является канонической, гв противном . слуаде -неканонической.

Для каждой плазмиды получали .широкий табор ттолоиэомеров :(см. материалы и методы) и .проводили двумерный гель-электрофороз |При одних и тех же условиях.

На рис.2 приведены примеры двумерных форезов этих,плазмид.

• ■ а • а ■ ■ •••••••••••« я

НИМНИН«») ГХ1

j-T-c-c-c-T-c-T-wy:-c-c-r \ iÎ^ft-ft-G-B-H-G-fl-fl-ï-H-fiV

и

I I

II

Т'Й

i'5*

Г-П'У

-..г ...

¡Ш • ••

"Ч'.:

■

„да.-.'!-.;к-

Ь

1 !■ к,^-^-"-V'!1,'' ' ■ ; 'С'-*? ' ' !"

М» •

¡1 ■■ ¡гГ~

1!' ' ,"

Рис.2. Двумерные гсль-электрофорчзы плазмпд

a) рАА32 (слева) н рАС32 (справа)

b) рТОЗг (слепа) и рТЛ32 (справа) Условия разделения в первом направлении: натрий-цитратиый буфер (200тМ Иа*), рН 4.17.

На картинах четко виден структурный переход, происходящий при различной сверхспирализацни для различных плазмпд. Результаты измерения числа сверхвитков, при котором происходит структурны:! -переход в плазмидах рХУ32 сведены в таблицу 1.

Таблица 1. Значения лтхг для раэличмих плазмид рхузг.

Плазмида триада ат*>

рдлзг т- А»Т 0

рС032 с- а»с 0

рлезг* С' с«т 2

ртезг с- 0»А г

рАС32 С' с»т 2.5

рстзг л- т»с 2.5

рСС32 С' с*г 3

реезг Г' ■с*а 3

рСТ32 А' 7*С. 3.5

рД'1'32 Л' т*г 3.6

рТЛ32 т- А* Л 3.5

рТ'1 32 А' Т*А 3.5

1>ГС32 а- С»С 3.5

рОА32 Т' Л»С 3.5

РСЛ32 т 3.5

ртезг в' •с*л *»

Примечания. Точка перехода определялась как моме(. тьпоизомера. соответствующего середин.: перехода. Так как шщиша перехода соответствует одному сверхвитку, точность значеннП Ат»> оценивается как 10,5 сверхиктка. Лашше для плазмпди рАвзг ваяти из работы (М1 гк! п еС п1..\ы1иге 330. 495-497 (1987)) И соответствуют' 0.2м >а+ и рН 4.3. В триадах точка обозначает уотсон-криковскоо спаривание, звездочка -присоединение третьего ооновашиг.

1<пдж>. что мшима.и-нал, свор.\ спиральная плстнооть структурного перехода ноЯчюдоЮтсся в случао канонических триад. Кро.мо того, различные неканонические триады оказываются омерготически неравношгнлшы.

С помощью формул (2) - (6) можно: втваатвь разность свободных энергий неканонической триады; a pXV3:2 » «атонической триады а. рААЭ£: "

¿Е = 20 R Т m у ЛТ^ /N- (17)1

Здесь значения Лт1т взчты из таблицы 1. Подставляя числа, можно получить:

V

АЕ х 1,45 »тхг (ккал/моль) (8)

Таким образом, разность энергий между различными триадами» составляет 3-6'ккал/ноль. Как уже упоминалось, эти данные можно экстраполировать на межмолекулярные триплекса, что обуславливает возможное практическое применение этих результатов. Кроме того, полученные результаты можно использовать для оцонки условий образования Н-формы. в последовательностях, содержащих большее количество неканонических триад.

Раздел 2. pli-завизимый структурный переход в теломерных последовательностях тетрахимены н человека.

Во втором разделе приводятся данные о структурных переходах в теломерной последовательности тетрахимени и человека, происходящих при кислых рН под воздействием отрицательной сверхспиралмэации, и обсуждаются модели этих структир.

Ранее Лямичевш! с соавторами (Nature (19ЁЭ), 339, G34 -637) был обнаружен рН зависимый структурный переход, происходящий в теломерной последовательности тетрахммены (с I ) . В настоящей работе была определена энергия нуклеаиии этой структуры.

Согласно теории зависящих от сперхспирализации структурных переходов, изложенной в первом разделе литературного обзора, сверхспиральная плотность перехода (здесь и далее, если особо не оговорено, под сверхспиральной плотностью подразумеваете., модуль отрицательной сверх спиральной плотности) уменьшается с увеличением длины участка, образующего неканоническую структуру (имеются в ЬМду участки с одинаковой последовательностью).

Это уменьшение будет продолжаться, пока длина вставки не нрониоит никоторой критической величины. Прг. дальнейшем увеличении длины нотавки овирхшшральная плотность перехода не Меняется, Но картине двумерного фореза при длинах, больших

в

критической, появляется! плато- (¡рис. 3:):.

Рис.3. Двумерные гель-эле трофорезы плазмид, содержащих вставки С4 (1 С4 )7 (слева) и

сз<т,°. >7а,'тЛ >, (справа). Условия разделения: натрий-нитратный буфер (50юМ К» ), рИ4.11. Слева вверху - димери соответст ующих плазмид.

Можно покааать, что скачок ;верхспирализации, предшествующий плато, и энергия нуклеации (с) марная энергия границ) структуры связаны соотношением:

р. = ( 10 я т г2 (аты . ) )/к (9 )

исходя иэ которого, можно вычислить энергию нуклеации исследуемой структуры. ■ -

-Здесь ^ - энергия нуклеации структуры, АТ"ор1 - скачок сверхспирализации, предшествующий плато.

Энергия нукл(!,шш1, вычисленная таким образом, составила 7,411,4 (ккал/моль).

Эта величина » 2 - 2,5 раз мс'.1ьша энергии нуклеации Н-фпрми в поли) ТС) последонательностп,- Расчеты, иополмующиа получоииув величину, а также данные об анергии неканонических триад,

полученные в предыдущем разделе, позволяют предположить, что рН-зависимая структура. возникающая в ' теломорноИ

последовательности тетрахимены, содержит внутримолекулярный триплекс, который на две трети состоит из канонических триал CGC*, к на одну треть -из неканонических триад лТЛ.

В связи со структурным переходом в последовательное™ 'G«Ti рассматривается подавление pli-зависимых структурны» переходов ионами чинка. Дело в том , что для анализ; неканонических структур широко применяется зондирование нуклеаэо! si, для работы которо.. нужны иены пинка. Поэтому npi использовании этой нуклеази необходимо знать, при какш количествах ионов цинка структурный переход заметно подавляется.

Методом двумерного гель-электрофореза был обнаружен структурный переход в человеческой толомерной последоиато;;ыюст1 '°3Tja'i>' происходящий при кислых рН и отрицательно! сверхспирализаиин (рис. А).

Рис.4. Двумерны!) голь электрофорез плазнид pllTELl, содержаще иотпнку ('г,Ан3)1а (слова) и исходной плазмиды рисчэ (справа) Слива внерху - димори соответствующих нлазмид. Условия разделен!: и нервом направлении: Натрий-цитратный буфер (БОшМ N'a+), pin. 15.

Дополнительная информация об эгоЛ структуре была получена ютодом кгщигрании с мечеидом ояигоиуклеотидом (рис. 5). Было {оказано, что олягояукдеотжд, комплементарный гуанин-богатой нити (ставки, связывается со сверх с«жралыюй плазмидой, несущей данную ютавку при рН 4,2, «о ме яр* р®5,<0. При обоих значениях рН не <аблюдалось связиаакия того же олигонуклеотида о линейной 1лазмидой. Так же отсутствовало связывание олигонуклеотида, комплементарного к цитозин-ботата* «иг«. На основании данных по связыванию был сделан вывод, что эта структура содержит достаточно длинные неспаренные участки в гуанин-богатой цепи, но не в цитозин-богатой цепи. Детальная «¡одель данной структуры была построена по результатам . химической модификации и S1-зондирования, полученных А. Г. Веселкояым и 0. Н. Волошиным (Voloshin et al, J. fliomol. Struct.. ©yin. 9, 643 - 652).

G-RICH + C-RICH -Lanes: 1

- ffr

^ Рис.5. Комиграция

7 Я олигонуклеотидов я

плаз миды рИТЕТЫ.

Слева: агарозкый гель, прокрашенный бромистым этидием, справа:

радиоавтограф того же геля. Дорожки

1,2,5,6 соответствуют сверхспиральной ДНК (СС), дорожки 3,4,7,8

________________________________ _________ - линейной ДНК (Ю.

Символ "+" означает наличие данного нуклеотида, - отсутствие „данного олигонуклеотида.. в-шсн обозначен олигонуклеотид, (комплементарный к С богатой нити вставки, с-шсн - к с-богатой ¡нити вставки. Буфер: Натрий-цитрат (50иМ Иа*), рН4.15.

Ф

Раздел 3. Устойчивые комплексы между рН-эависимыми неканоническими структурами и олигонуклеотидами.

Существуют два комплекса, которые могут образовываться между зеркально-симметричным гомопурин-гомопиримидиновым участком ДНК и олигонуклеотидом, комплементарным 5*-половине пуриновой нити участка - I) межмолекулярный триплекс (в этом случае 1Гомопурин-гомопиридиновый участок' остается двуслиральннм, а олигонуклеотид образует третью нить триплекса; " .2)

стабилизированная Н-форма (>в «том 'случае

гомопурин-гомопнрииидиновый участок образует 1Н-фар«у, а олигонуклеотид связывается с деструктурированноп шолсшиной пуриновой нити Н-фории). Оба эти случая 'Изображены на |рис. 'б для последовательности 5'АлооодсААСсосстАТАсасосАлслааслАЗ' и олигонуклеотида б'ссстАТАССсссТТстсссттсз •.

Рис.6, (а), н-форма в рсозг. $

(b). Стабилизированная 'Н-фориа.Ц

(c). Межмолекулярный триплекс. ц,

Б'-атсшагтсшш^в

мдвш

гатаЗтЧ

ттшштши^

[^мсвшак/

.. I ИЦЦИИЯ11"

я

М

шшгяшшп-А

>

3'-ж

I

711| 111М1ПГПДМ

паШаштам'

1-й \

ТА

З'Б'

М З'Б*

» гд*кИИШГ,г

*в '|||щм1цш>>я11штацццц|1га

З'^Шй^шзйтяташтшШк'

Для исследований »комплексов, которые образуются при взаимодействии плазыидь >И 'олигонуклеотида, проводили два типа экспериментов:

1. Широкий 'набар ггопомзомеров плазмиды инкубировали с олигонукяеотидом 'При одной фиксированном значении рН, а затем наносИлибь На в&орвъ (при (раяшчпих значениях 1рН Форезного буфера. Параллельно на тот Ч№ <1фор№ 'наносился такой же образец топоизомеров, но Проинкубированный без олигонуклеотида. Оказалось, что в случае образца, проинкубированного без олигонуклеотида, сверхспиральНая 'плотность перехода сильно возрастала с ростом рН форезного бУфора, 'как и должно быть для рН-эавиримого структурного перехода. 'Напротив, в случае комплекса плазмиды с олигонуклеотидом до некоторого критического значения рН сверхспиральная плотность перехода вообще от рН'ие зависила, и лишь с этого значения рН начинала возрастать. Примеры(различного поведения свободной плазмиды и комплекса с олигонуклеотидом приведены на рис. 7.

2. Во втором типе экспериментов инкубаиию с олигонуклехгтыдом

проводили при различных рН, а рН форезного буфера, напротив, во всех случаях был один и тот же. Было показано, что зависимость сверхспиралыюй плотности перехода комплекса от рН инкубационного буфера приблизительно такая же, как аналогичная зависимость от рН форезного' буфера для свободной плазмиды. График на рис. 8 обобщает полученные результаты.

Все эти данные указывают на то, что олигонуклеотид в широком интервале рН форезного буфера замораживает то состояние, которое было в инкубационной смеси: в тех топонзомерах, в которые при условиях инкубационной смеси гомопурпн-гомопиримидиновий участок находился в В-форме, этот участок образовывал с олигонуклеотидон межмолекулярный триплекс, который предотвращал образование Н-формы при понижении рН. В тех топоизомерах, в которых в условиях инкубационной смеси происходит В-Н переход, олигонуклеотид присоединяется к деструктуриронрнной половине пуриновой нити, образуя стабилизированную Н-форму. Согласно оценкам, проведенным в работе, присоединение олнгонуклеотида резко увеличивает время разрушения Н-формы при повышении рН. Это время растет о увеличением отрицательной сверхспиральной

Рис.7. Двумерный гель-электрофорез плазмиды рСС32.

(a). Разделение в первом направлении проводилось при рН4.2.

(b). Разделение в первом направлении проводилось при рН4.8 . Слева нанесен образец, проинкубированный с

олигонуклеотидом, изображенным на рис.6.. при рН4.1 , справа - в те* же условиях без

олнгонуклеотида.

плотности и уменьшением рН форезного буфера.

13 11

е

7

Рис.8. рН

зависимость числа сверхвитков, при котором происходив структурный переход в рСС32 от рН. ' Пустыс

. квадраты и кроен

6" рН соответствуют

4 ь

инкубации с олигинуклеотидом, закрашенные квадиати - бе: олигонуклеотида. В случае сплошных линий зависимость строится oí рН форезного буфера, а рН буфера инкубации для всех точек рлве| 4.1. В случае пунктирной линии зависимость от рН инкубации, a pi форезного буфера во всех случаях равен 4.6. Сверхспиральна] плотность перехода о и число сверхьитков т связаны соотношением ( = 0.004т.

При повышении рН форезного буфера выше некоторого критическоп значения той свсрхсинральной плотности, при которой происходи1 струк'/урный переход в инкубационной . смеси, становитс: недостаточно для стабилизации Н-формы на время фореза, и скачо. подвижности смещается в область более высоких сверхспиралыш плотностей. С этого момента картина перехода в комплексе ллазмид с олигонуклеотидом начинает завис!,ть от рН форезного буфера. :>ти объясняется обрив плато на линии -пустых квадратов- на рис 8. Итак, при инкубации с олигонуклеотидом возникает дв стабильных комплекса: кежчолекулярный триплекс

стабилизированная Н-форма. В работе был сделан вывод, чт стационарное соотношение между этими структурами не являете равновесным, и предложена схема, наиболее согласующаяся экспериментами. Аналогичные эксперименты были проведены несколькими другими последовательностями. В частности, наличи стабилизированной Н-формы было показано для нолп(ТС последовательности (рис. 9), для которой ранее Лямнчевым соавторами ((1988) Nucl. Acids líes. 16, ÍÍ1C5 - 2)781 6llJI ii:>ua:iniii> "Притинопоюжисс" явление: подавление межмолекулярт. '¡ pllll.lt'UIOM lirtptlIHjllUlllül »'формы.

М

Гпс.0. ЛкуморныП голь чляктррфорез плазмиды

содержащей

пстяпку

С(ТС)21. На

нанесены две содержащие

широкое распределение

топочзоморсв

этой

тозмпды, проинкубированные нр.1 рази1« условиях: оба образна были эоннкубнрованм при рН 4.25 п течем.ш трех часов для того, чтобы Зеспочить образование Н-формч: затем к образцу, расположенному лева на фотографии, бил прибавлен олигонуклеотид (СТ . после его инкубация продолжалась ещо 3 часа. рН форопного буфера 5.9.

етодом стабилизации олигонуклеотидом был обнаружен pil-затюимий труктурный переход в дрожжевой теломерной последовательности САСАСССА)16- Этот структурный переход даже при высокой плотности всрхсппралиэацпи (0,05-0,06) происходит при рН. меньших 4. В ■тих условиях разрешение метода двумерного фореза несколько ■худшается, и переход при такой высокой плотности .'¿ерхсплрализаимм не пилен. Стабилизация олигонуклеотидом юэволяет провести форез при бопее высоких рН и детектировать :труктурный переход (ряс. 10).

В левом образке виден скачок- подвижности, отвечающий структурному переходу. Подобного эффекта не наблюдается без олигонуклеотида, а также в случае олигонуклеотида тстстспстстсгос-о.

Из полученных в работе результатов были сделаны следующие выводы: I. Точечные замены в Н-палиндроме, приводящие к образованию в триплексе Н-формы неканонических (отличных от cgc+ и tat) триад увеличивают сверхспиральную плотность, при которой происходит В -H переход, причем увеличение может быть различным для различных триад. Определение этого увеличения сверхспиральной плотности перехода позволило вычислить разность свободных энергий образования различных триад, что позволило судить о возможности образования Н-формы для различных последовательностей, а так же о стабильности межмолекулярных триплексов, включающих

неканонические триады. .

IX. Ряд теломерных последовательностей при кислых pH и отрицательной сверхспирализации образуют неканонические структуры. Проведенное в настоящее время исследование этих структур методом двумерного фореза и, комиграции с олигонуклеотидом, вместе с данными по зондированию на нуклеотидном уровне, полученными другими авторами, позволяют думать, что эти структуры во многом сходны с Н-формой. Вместе с •тем они обладают рядом особенностей (в частности, очень низкая по сравнению с Н-форной энергия нуклеации неканонической структуры, возникающей на последовательности (G т ) ).

4 3 п

■ III. Одноцепочечные олигонуклеотиды, связываясь с деструктурированной половиной пуриновой нити Н-формы, делают Н-форму стабильной при тех условиях, при которых В-Н переход не происходит. Такая стабилизация приближает условия суиествования Н-формы к физиологическим. Кроме того, оказалось, что стабилизация неканонической структуры олигонуклеотидом может служить методом ее регистрации.

Основные результаты опубликованы в следуюдих работах:

1. Voloshin, О. N. , Mirkin, S. M., Lyamichev, V. I., Belotserkovskii, В, P". and Frank-Kamenetskiii M. D. Chemical probing of homopurine-homopyrimidine mirror repeat in supercoiled DNA. Nature, 333, pp 475 - 476.

.2. B. P. Belotserkovskii, A. G. Veselkov, S. A. Filippov, V. N. Dobrynin, S. M. Hirkin and M. D. Frank-Kamenetskii. Formation of intramolecular triplex in homopurine-homopyrimidine mirror repeats with point substitutions.(1990 ) Nucleic Acids