Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммунохимическое изучение аминоацил-тРНК-синтетаз высших эукариот

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Иммунохимическое изучение аминоацил-тРНК-синтетаз высших эукариот"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР институт молекулярной биологии

имени В. А. ЭНГЕЛЬГАРДТА

На правах рукописи

Ш 577.123

ФИЛОНЕНКО Валерий Викторович

ИММУНОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ АМИНОАЦИЛ-тРНК-СННТЕТАЗ ВЫСШИХ ЭУКАРИОТ

03.00.03— молекулярная биология 03.00.25 — клеточная биология

Автореферат на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1991

Работа выполнена в Институте молекулярной бполоПго АН" СССР имени В. А. Энгельгардта,

Научные руководители:

, член-корреспондент АН СССР

Л. Л. Киселев; кандидат биологических наук С. Ф. Берестень.

д. х. н. Кочетков С. Н.; к. х. н. Моторин Ю. А.

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

НПО «Биотехнология».

Защита состоится « » . 199"/" г. в часов

на заседании Специализированного совета Института молекулярной биологии АН СССР по адресу: Москва, ул, Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии АН СССР.

Автореферат разослан

199 X

г

»

Актуальность проблемы: Амшюаци '-тРИК-синтотавм (ЛРС, Кф г>. L 1. ) образуют самую многочисленную группу ферментов , участвуют« в реализации генетической информации, обеспечивая строго специфическое аминоацилирование тРКК на дорибосомном этапе биосинтеза белков.

Аминоацил-тРИК-еинтетазы высших эукариот характкризуются более сложной структурной организацией по сравнению с ферментами'из низших эукариот и прокариот. Некоторые из них функционируют в виде мульти-ферментчмх комплексов (см. Dang et. al., 1986), а те,<ж: обладают неспецифическим сродством к высокомолекулярным РЖ (Spirin et.al., 1980). Исследования последних лет показали, что аминсацил-тРНК-син-тетазы высших эукариот помимо реакции ами"оацилирования могут выполнять и другие нетрадиционные функции, возможно связанные с регуляцией синтеза ДШ и клеточной пролиферацией (Rapaport et al. , 197S; Mirande et al., 1985; Lambowitz et al., 1990), однако они изучены крайне недостаточно.

Иммунохимические методы исследования и, особенно, применение, мс-ноклональных антител расширяют возможности изучения как традиционных так, и нетрадиционных функций аминоацил-тРНК-синтетаз.

Цели и задачи исследования: Кммуноэлектронномикроскопическое изучение триптофанил-тРНК-синтетавы в. клетках высших эукариот (фиб-робласты крыс) и в прокариотических клетках (Е.coli). Получение мо-ноклональных антител к'компонентам высокомолекулярного комплекса синтетаз включающего аминоацил-тРНК-синтетазы специфичные к Glu, Kfet, Leu, Ile, Gin, Arg, Lys и белкам с мол. массой 37 и 43 кДа. йм-муноэлектронномикроскопи'-:эское изучение локализации мультиферментно-го комплекса в клеткак высших эукариот (клетки почек кролика) с помощью моноАТ к компонентам комплекса.

Научная новизна: впервые получены моноклональные антитела ь, компонентам высокомолекулярного аминоацил-тРНК-синтетазного комплекса из печени кролика, а именно к глютамил-тРНК-синтетаэе, аргинил-тРНК-еин'тетаэе и.к полипептидам с мол. массой 37 и 43 кДа. С их помощью, а также с помощью полиАТ и моноАТ к трицтофанил-тРНК-синте-тазе из поджелудочной жэлеаы быка, полученным ранее (Берестень и др., 1979) изучалась локализация синтетаз в клетках высших эукариот метолом маркирования ультратонких срезов клеток антителами, конъюги-рованными с частицами коллоидного золота. Оказалось, что существенных различий в распределении триптофанил-тРНК-синтетазы и синтета? в составе мультиферментного комплекса нет. С помощью моноАТ Ам1, анти-

генная детерминанта для которого находится на синтетазе из Е. col i i, l'avorova et al., 138S), изучали локализацию триптофан-ил -г?НК-еичтетагы в клетках F..coli. Ос-новнш отличием в распределении синтвтаэы в прокариотической клетке является ее почти полное отсутствие в области нуклеоида.

Йспользоввн метод радиоблоттинга для изучения белок-белковых вааимодействий. Установлено, что триптофанил-тРЖ-синтетаза в клеточном л'лзате взаимодействует с полипеитидом мол. массой 37 !:Да. Показано, что in vitro Trp-тРНК-синтетаза взаимодействует с глицераль-дегчд-3-фосфат дегидрогеназой (ГАФД, КФ 1.2.1.12) мол. массой 37 кДа, одним из ключевых ферментов гликолиза. В присутствии ГАФД трип-тофаяил-тРШтСинтетаза способна взаимодействовать с рРНК через образование тройного комплекса - Тгр-тРНК-синтетаза - ГАФД - рРНК. С пои'ощью моноАТ Ам1, Ам2 и АмЗ к разным эпитопам триптофанил-тРПК-скнтетазы устаковлно, что во взаимодействие с ГАОД вовлекается несущественный для ферментативной активновти N-концевой домен синтетазы. Показано, что с ГАФД способны взаимодействовать и другие зукариотические амиьоацил-тГПК-сннтбтазн специфичные к Ser, Туг, Phe и синтетазы мультиферментного комплекса.

Апробация работы: результаты исследований докладывали на 1.3-ом и 14-ом международных совещаниях по тРНК (Канада, 1989 и Польша 1991), на 2-ом советско-американском симпозиуме (Тбилиси, 1989). По материалам диссертации опубликовано 3 печатных работы.

Диссегация состоит из введения, обзора литературы, методической и экспериментальной частей и выводов. Работа изложена на стр.. содержит рис. и табл. Списс.с литературы включает

/■§ публикаций.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Чммуноблоттинг

Белки подвергали электофоретическому разделению по Лэмли, после чего их переносили на два ш.грсцеллюлозных фильтра ВА-85 в течение 16 vácoi;. После переноса фильтры промывали фосфатно-солевым буфером (СОЕ), и инкубировали 1 час в ®СБ с 0,1% Tween-20 (ФСБ-Т). После ин-куйАци!: фильтры.разрезали на полоски и обрабатывали соответствующими щгит^лйми »..концентрации 1-10 мкг/мл в 5СЕ-Т в течение 1 часа при £S"C.''ót«H3a*a'-4 раза. «СБ-Т и иякубироь&ии с антителами кролика про-тн^^львой-.мохекула ;I(cG шви. , краьюгированньш с пероксидазой хре-

на при 25°С. После инкубации Фильтри отмывали 5 раз ФС-В-Т. Иммучохи мическое окрашивание проводили раствором 4-хлор-1-нафтола (0,5 мг/мл) и 0,05Z Н40ав 0,05 М трис-BCL, рН 7,5.

Радиоадсорбция t'25 ПТгр-тРНК-синтетавы на белках. В реакции радиоадсорОции белки (2 мг/мл) в обьеме 100 мкл ТСБ адсорбировали в лунках 96-луночного поливинилового планшета в течение ночи при +4°С или 2-3 часа при 3?°С. Избыток белка удаляли промыванием ФСБ-Т, после чего инкубировали с 0,2 мл ФСБ-Т 1 час при 25° С. Затем в лунки добавляли ^ПТгр-тРНК-синтетазу в трис-HCL буфере, рН 7,3 с 0,1% БСА. После инкубации 1 час гои 25°С лунки промывали Б раз ФСБ-Т. Радиоактивность определяли в г-спектрометре.

Маркирование ультратонких срезов.

Свежеприготовленные ультратонкие срезы инкубировали 10 мин. при комнатной температуре в растворе, содержащем 0,25 7, БСА, 0,15 М NaCL, 0,01 М фосфат натрия, рН 7,5 (ФСБ-Б); затем переносили на капли с комплексами коллоидного золота, разведенными в 20-40 раз раствором ФСБ-Б. После 30 мин. инкубации при 37 °С во влажной камере срезы промывали в течение 15 с. в 0,2%-ном растворе "Kodak Photo-flo" ("Kodak-Pathe", Франция) на 2 мМ боратном буфере, рН 8,5, в дистили-рованной воде и контрастировали 2%-ным водным раствором уранилацета-та (1,ч.) и цитратом свинца (15 мин.).

Препараты просматривали в электронном микроскопе "JEM-100CX" при ускоряющем напряжении 80 кВ. Измерения проводили на -микрофотографиях с конечным увеличением 41 500 и 80 ООО.

РУЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Иммуноэлектронномикроскопическое_определение локализации

триптофанил-тРНК-синтетазы в фиброблаетах крыс.

В клетках фибробластов крыс триптофанил-тРШ-синтетазу локализовали с помощью моноспецифических поликлональных-, а также монокло-нальных антител Ам1, так как они получены на эволюционно консервативную детерминанту, присутствующую на молекуле Ггр-тРНК-синтетазы как про- так и эукариот (Favorova et al. , 1989), конъюгированных с частицами коллоидного золота разного размера. Наибольшее количество метки" обнаруживается над участками цитоплазмы, где присутствует большое число рибосом (рис. 1). Следует заметить, что метка не обя-

-

Рис.1. Ультратонкий срез фибробласта крыс фиксированного глутаральдегидсм, заключенного в смолу "Ьоу^кгП К4М" и обработанного комплексами моноАТ Ам1-Аи15 и полиАТ-Аи8. Увеличение 41 500. Обозначения на срезах: Я - ядро; Мх - митохондрия; Дх -дшЭДувный хроматин; Кх - компактный хроматин; ГЭР - гранулярный эндопла^матический ретикулум; Ц - цитоплазма.

зательно находится адоль мембран грубого эндсплазматичесного (.<-ч'Иг,у лума, а может локализоваться в участки» свободных риОосон. Ъ il-km-k-рнх случаях частицы коллоидного золота располагаются непоор.пь.'ТЬт i. в цитозоле. Триш'офаншт-тРНК-еинтетаэа не обнаружена в цкет-н-млх :•>• доплаэмагического ретикулума и б участках цлтоплзьмы, 1д* (ч^н-чии л ются микрофиламенты. Однозначного вывода об отсутствии или и-нл тип Тгр-тРНК-стггетазы в комплексе Годьлжи сделать noica нельзя. |>*vik»i.4 уровень связывания Ам1-Ан15 и полиАТ-АиР характерен для отд.'-лиил аутофагосом (рис. 1), что совпадаем' с данными полученным»! с поюдьь непрямого иммунопероксидазного метода ('Палей и др., 19СБ). ¿н»чи • тельные количества триптофанил-тРНК-синтетаэы обнаруживаются р. митохондриях (рис. 1 и 2). Исходя из количества частиц золота на г мкм плошэди среза, содержание еинтетааы » митохондриях составляет VOZ о г его содержания в цитоплазме (рис. ?). Удалось показать присутствие Trp-тРНК-синтетазы в ядрах >1>мбг>облвстоА крыс, где метка содау.жтся ■» основном над зонами, где находится диффузный xj оматин, а именно ну«:-леоиротеиновые частицы аиф)»уэаого хроматина (рис. 2). Момю предположить, что тригсгофанил-тРНК- сиктетаза связана в ядре а эукроматином или ядерным матриксом в участках расположения диффузного хроматина. В районе компактного хроматина метка почти отсутствует (рис. 1 и Z). Небольшое число частиц золота связывается с ядрышками.

Для проверки специфичности маркирования поставлены контрольные опыты: 1) срезы инкубировали i.а каплях раствора коллоидного золота, не конъюгированного с антителами. Специфического связывания обнаружено не было; 2) в капли с комплексами Ам1-Аи15 и полиАт-Аив добавляли Тгр-тРНК-синтетазу до конечной концентрации 1 мт/мл. При этом количество метки над структурами снижалось практически до фонового уровня (рис. 2).

йммуноэлектрониомикроекопическое определение локализации триптофанил-тРНК-синтетазы в Е.соИ.

В клетках Е.coli Тгр-тРНК-синтетазу локализовали с помощью мо-ноклональных антител Ам1. На рис. 3 представлена гистограмма распределения частиц золота на срезе клеток Е.coli. Основная часть метки (80-90%) распределена по цитоплазме, обычно более или менее равномерно, хотя иногда можно наблюдать предпочтительное распределение метки по периферии цитоплазмы. Нуклеоид метится слабо, метка в нем часто сравнима с уровнем фона и обычно не превышает 10-15Х от уровня

ï

Число частиц золота ira I мкм плацави среза

26 У О »5 10 5 О

хроматин

ЕЗ ПолиАТ-Аи8 ШЗ Ам1-Аи15'

ЁЭ ПолиАТ—Ai'ß + Ам1-Аи15 СИ + lMr/WTrpRS

Рис. 2. Гистограмма распределения частиц золота над различными клеточными структурами. фиОробласгов крыс с использованием меченных -!олиАТ и моноАТ против Тгр-тРНК-синтетазы.

60 60 40 30

го ю о

ЕЭ Aul-Aul5 e...Au.l-Aul6+lur/un Trpftë ..

Рис. а Гистограмма распределения частиц золота на ультратонком срезе кд«ок Е. coli.

Цитоплозмо MurnoxotCpuu ЯОрцшко ДйЬ. Цомп,

Число чаотиц эопота на 1 ики площади среза

ii . 1

л

. 1

» je}

¿lU».

- г -

в цитоплазме. Важным отличием в распределении Trp-TFHK-синтетазы в бактериальных и эукариотических клетках является присутствие значительного ее количества в ядрах меток эукариот (рис. 1 и 2). к « Иммунохимическое изучение аминоацил-тРНК-синтетаз входящих в состав высокомолекулярного сиктетазного комплекса.

Дня получения линий гибридных клеток продуцирующих моноклональные антитела, в качестве антигена использовали высокомолекулярный аминоацил-тРНК-синтетазный комплекс, в состав которого входили синтетазы, специфичные для Glu, Gin, Ile, Leu, №?t, Arg, Lys, а также полипептиды с мол. массой 3" и 43 кДа. Получены шесть ликчй гибридных клеток," продуцирующих моноклональные антитела, обозначенные как F6, F7, F12, F25 и F31. Специфичность мо-ноклональных антител к высокомолекулярному комплексу, содержащему 9 полипептидов, определяли методом иммуноблоттинга. На рис. 4 показан иммуно'блоттинг, на котором видно, что моноАТ F6 узнает полипептид 37 кДа (дорожка 3); моно AT Fl2 - 43-кДа (дорожка 4); F7 и F31 узнают полипептид с молекулярной массой 74 кДа (дорожа б и 7),.идентифицированный ранее как аргинил-тРНК-синтетача; моноАТ F8 и F25 узнают белок, по подвижности соответствующий 150 кДа (дорожки 8 и 9) идентифицированный как глютамил-тРИК-синтета-за. Видовую специфичность моноАТ проверяли методов иммуноблоттинга, при этом ,в качестве антигенов для сравнения использовали мультиферментные 'синтетазные комплексы, выделенные из печени овцы, крысы и морской свинки. Оказалось, что ни одно из'антител не взаимодействует с соответствующими полипептидами из разных гетероло-гичных'комплексов, •следовательно данные антитела-видоспецифичны. Исключение представляет моноАТ F25, специфически взаимодействующее с полипептидом 150 кДа в составе комплекса из печени овцы, соответствующим бШ-тРНК-сиотетазе. ■ .

Известно, что многие эукариотические синтетазы имеют каталитический и дополнительный домены, функциональное назначение дополнительного домена окончательно не 'установлено. Например, ограниченным протеолизом бычьей Тгр-тРНК-синтетааы можно получить "коровый" ' (core), полностью активный фрйгмент (Prassolov et al. , 1975). Ограниченным протеолизом папаином можно получить полностью активную форму а^гинил-тРНК-синГетазы из печени кролика с мол. массой 60 кДа (Miranda et .al., 1991). Иммуноблот.тинг протеолизованной формы арги-

Таблица 1

Специфичность моноАТ против мультиферментного аминоацил-тРНК-синтетазного комплекса и? печени кролика

Шифр Узнаваемый Специфичность Разме-р полипептида, на котором моноАТ полипептид ÄPC находится элитон (кДа)

F7 74 Arg : 60

F31 74 Arg . 60

F8 150 Glu 85

F25 150 Glu 'не опр.

F6 37 ' ие опр.

F12 , 43 — не опр.

150 13® 12^

108 Q6

76 р

57

'43 3i8

nwntea

'Ш

3 4 S .6 Г S 9

Рис. 4. Иммуноблогтинг компонентов мультиферментного комплекса из печени кролика с использованием полиАТ к целому комплексу (дорожка 1), контроль без антител (дор. 2), моноАТ Р12 (дор. 3), Г6 (дор. 4), Г6+П2 (дор. 5), Г7 (дор. 6). Р31 (дор. 7), Р8 (дор. 8), Р25 (дор. 9).

нил-тРНК-синтетавн с использованием моноАТ Г31 и F7 показал, что антигенная детерминанта для этих антител расположена на фермеитатиЕНО активном "коровом" фрагменте Ага-тРНК-синтеоазы, поскольку они узнают форму 60 кДа.

Глютамил-тРНК-синтетаза в составе комплекса из печени кролика мо.мет находиться в клетке в двух формах: в виде полипептида с мол. массой 150 кДа, и ферментативно активной Форме 05 кДа. Оказалось, что F25 не узнает форму 85 кДа, a F8 узнает. Следовательно, антигенная детерминанта для F25 расположена на несущественной для каталитической активности части фермента, а для F8 - на "коровой" части молекулы. Данные о специфичности моноАТ суммированы в табл. 1.

В кропичьих клетках линии LCC RK-1 изучали локализацию компонентов эысокомолекулярного комплекса с помощью моноАТ F6, F?, F8, FIS, F31. Ультратонкие срезы обрабатывали двумя способами: 1) комплексами моноАТ с частицами коллоидного золота размером 7 и 1Снш; 2.) моноАТ, а затем комплексами белка А с коллоидным золотом с размером частиц 15 ни. Данные по иммуноэлектронномпкроекогшчеешй локализации в клетке мультиФерментного комплекса с помощью моноАТ против Ап'-тРНК-синтетазы (F7, F31), Glu-тРЛК-сиететазы (F8) и полипептида с мол, массой 43 кДа (F12), входящих в состав комплекса, указывают на то, что существенных различий в распределении данных ферментов t клетке нет. Метка, как и в случае с Тг р-тРНН-син^етаэой, сосредоточена в основном в цитоплазме в зонах скопления рибосом, й митохондриях и непосредственно и цитозоле (рис. 5). Вероятно способ компар' ментализации аминоацил-тР!1К~синтетаз в местах биосинтеза белков сядем как для ферментов, входящих в состав мультиферментних комплексов, так и не обнаруженных в составе таковых. Также как и Trp-тРНК-синтетаза, аминоацил-тРНК-синтетазы комплекса в ааачи-тельных количествах обнаружены в ядре в зоне диффузного хроматина ассоциированными с нуклеопротеиновыми частиками диффуяного хроматина. Подобная локализация ферментов может указывать на участие аминоацил-тРНК-еинтетаз во внутриядерных процессах, таких, например, как транскрипция, процессинг, перенос макромолекул из ядра в цитоплазму и др. Интерес представляет локализация полипептида неизвестной. природы с м. м. 37 кДа с помощью моноЛЙ F5 <рис. 6), входящего в состав высокомолекулярного синтетазного комплекса.'-. Оказалось, что в цитоплазме белок с м. м 37 кДа практически

хроматин

ея y-aiils ' щ) fb-au7 о F12~Au7

ИЗ ГО1-Ли7 Щ ЯолиЛ! —А'иВ ЩЦ Лш1-Ли15

Fhc. 5. Гистограмма распределения частиц аолота в клетках высших эукариот с использованием полиАТ и моноАТ к Тгр-тРНК-синтетазе, пюАТ F? и F31 к Arg-TPHK-cmwfeTase, моноАТ F8 к Glu-тРНК-синте-моноАТ* F12 к белку с м. м. 43 кДа.

. Чиемо частиц аолота на 1 ик и ^лдощади среза

- и -

не выявляется, а локализован в основном в ядре в области диффузного хроматина. (Работы по электронной микроскопии проводились совместно с к. Ö. н. Попенко В. К., к. С. н. Черни Н. Е. и Ивановой Ю. и. ИМБ АН СССР)

Глицеральдегид-З-фосфат.дегидрогеназа образует комплекс с

триптофанил-тРНК-синтетаЬОй Данные по иммуноэлектронномикроскопической локализации Trp-тРНК-еинтетазы, говорят о том, что этот фермент в цитоплазме' сосредоточен в основном в местах скопления поли- и монорибоссм. Это может означать, что существуют специальныз механизмы, которые ком-партментзпизуют фермент. Один из механизмов компартментапизации предложен А, С. Спириным (1980), суть его заключается в том, что некоторые аминоацил-тРЕК-синтетьзы эукариот способны образовывать•комплексы с неспецифическими полирибонуклеотидами, например, с рРНК. Однако нативная ОычЬя триптофаиил-тРНКсинтетаза не образует комплекс с рибосомной FHK (Федоров и Фаворова, 1989), следовательно, для нее вероятно существуют иные пути компартментализации. Одна из возможностей состоит в том, что используется тот-же способ через связывание с рРНК, однако не непосредственно, а с пимощью особых белков, играющих роль своеобразного "клея" между данным белком и pPHIL Опыты с лизатами клеток подтвердили такую возможность.

На первом этапе этой части работы применен прием, лежащий п основе иммуноблоттинга и позволяющий выявить взаимодействия, сохраняющиеся при денатурации белковых молекул. Грубый экстракт клеток К56Я. был подвергнут электрофоретичеекому разделению в ПААГ. Гель после пассивного переноса окрашен кумаоси (Рис. 7. А), а фильтр обработан '^-меченной выеокоочищенной Тгр-тРНК-синтетааой (Рис. 7.Б). Из рис. 7. Б видно, что триптофанил-тРКК-синтетаза узнает в клеточном лизате полосу с кажущейся мол. массой 37 кДа'( дорожка 3). В этом опыте взаимодействие между синтетазой и Ам1 использовали как положительный контроль (дорожка 1).

Установлено, что in vitro Тгр-тРНК-синтб-тэза способна• еваимодой-ствовать с глицеральдегиц-а-фосфаг дегидрогеяазоЯ (Г/.-?Д) (таблица .?.). Шказано, что ГАФД не влияет на ферментативную ндаивкоетъ трип-гофанил-тРНК-синтетРЭЫ ни в реакции аминоацилированил тРШ, ни з реакции. PPi-ATP обмена. Уст&но&шо, "то комплекс Тгр-?РИК-синтв,тпг& - ГАФД имеет довольно ^олъяую константу диссоциации, определенную^ по Скетчарду, равную 3x10 м" : \ , \ г

* Таблица 2

Радиоадеорбцид ['г^ПТгр-тРШ-синтетазы на белках (имп/шн х 10"3)

Белок, адсорбированный на планшете (1 мкг/лунку)

Антитела Глицераль- Лактат- Бычий сиво-- Тгр-тРШ-

Ам1 Ам2 АмЗ дешд-З-фосфат дегндро- роточлыа аль- синтетаза дегидрогеназа геназа бушн

16,1 10,5 15,3 13,9 12,1 13,7

13,2 13.4

0,5 0,1

1.2

0,7

0,3 0,2

Приведены данные двух независимых опытов

' А В

2 3

«Ве»

СЭ р

Л

- 'Ш

.9

• «2

г ■

(,7 4-5

1

•3-1

Рис. 7. Радиоблоттинг ¿изата кл«тои Р/3 Аев 653 с использованием Е^П Тгр-тРНК-сннтетаэы. Гель,' окрашенный кумасси после диффузного переноса полипептидо® на ндародаМтлотый фильтр (А). Дорожл 1 - моноАТ Ам1, Ь - Тгр-'тМЙ-сингетаэа, 3 - ли-ъах 5 к 10* клеток. .

Поскольку Ам1, Ам2 и АмЗ связываются с разными участками моле- ' кулы Trp-тРНК-синтетазы, мы их использовали для идентификации участка на синтетазе, ответственного за связывание с ГАФД. Как видно на рис. 8 Ам1 сильно конкурирует с ГАФД за связывание с Тгр-тРНК-синте-тазой, Ам2 вообще не конкурирует за связывание, а АмЗ конкурирует слабее Ам1. Как известно (Beresten et al., 1989), антигенные детерминанты для Ам1 и АмЗ сближены. Кроме того, известно, что детерминанта для Ам1 расположена на несущественном для ферментативной активности N-концевом участке триптофанил-тРНК-синтетазы. Из этого следует, что Trp-тРНК-синтетаза' взаимодействует с ГАФД несущественным для ферментативной активности N-концевым доменом.

Установлено, что в присутствии ГАФД триптофанил-тРНК-с.интетаэа способна взаимодействовать с рРНК. Данные табл. 3 показывают, что такой тройной комплекс существует. Можно предположить, что подобный комплекс образуется и на нативных рибосомах так как п.ри пониженной ■ ионной силе ГАФД мояет образовывать комплекс с рибосомами (Ryazanov et- al., 1988) причем за: счет связывания с рРШ, поскольку 16S РНК эффжтивно конкурирует с рибосомами за связывание с ГАФД. Установлено, что по крайней мере Ser-, Туг-, РЬе-тРНК-синтетазн из печени быка, а также высокомолекулярный комплекс (в состав которого входят 7 аминоацил-тРНК-синтетаз) из печени кролика способны взаимодействовать с ГАФД (Рис. 9). Все перечисленные синтетаэы конкурируют с t^íl-Тгр-тРНК-синтетазой за связывание с иммобилизованной на пластике ГАФД. . ' ' • $ .. •

' . Таблица 3 ,

Связывание ['^ПТгр-тРНК-синтетазы с рРНК-сефарозой

Количество наносимой [<2ÍI] Тгр-тРШ-синтетаз-ы (мкг/мл)'-'

1.0 5,5

1.1 8,5 2,0 50,0

Адсорбция [''^ПТгр-тРКК-синтетагч на рРНК-сефароае (имп/мин х 103)

глицеральдегид-3-фосфат дегвдрогеназа + • -

1,5 3,0 20, &

Приведены данные трех независимых опытов

- lk -

Днтцте/IA {-{Ó Моль)

Рис. 8. Ингибировачие радиоадсорбция Тгр-тРНК-синтетазы на ГАФД моноАТ Ам1 (1), Ам2 (3), АмЗ (2).

2 * 6 S A PC (tf'H)

Рис. 0. Ингибирование радиоадсорбции í'rU Тгр-тРНК-синтетазы на ГАФД эукариотическими АРСазами спцифичными к О - Ser, А - Phe, © - Туг, ♦ - мультиферментным синтетазным комплексом, * - протеолизовакой формой Тгр-тРНК-синтетазы м. м. 40 кДа.

- 15 -

Расщэгшиие триптофакил-тРНК-оин'гвтазы ВгСЫ и гюиск

^«^тогенных пептидов с_пом<адыо_ ^оноАТ,_Ам1:_ Проведено исчерпывающее ферментативное ь химическое расцъ-п.чнш^ молекулы триптофанил-тРНК-синтетазы с использованием трипсина, хи мотрипсина, глютаминовой протеазы, однако только при иеч> рньадмцс-м расщеплении ВгСМ по остаткам.метионина детерминанта сохраняется, .т. установлено методом радиоиммуноскрининга. Поскольку для Тгр-тРНК-синтетазы показана сильная тенденция к образованию 3-3 сея зей (Тузиков и др. , 1991), перед гидролизом производили алкилиро-гание -ЗН групп. Фрагменты ВгСИ расщеплении хроматографировали и отобранные иммунореактивные фракции рехрояетографировали методом НРЬС на колонках Адиароге ЙР-ЗОО и ТСК -3000 + ТСК 2000. Иммунореактивные фракции проанализированы электрофоретически, откуда видно, что каждая фрикция содержит по одному гомогенному пептиду с мол, массой 30 кДа (1) и 25 кДа (2), которые соответствовали выявленным в общем гидролиэате иммунореактивным фрагментам трипто-фанил-тРНК-синтетазы.

Определена частичная аминокислотная последовательность (42 аминокислотных остатка) гомогенного пептидного фрагмента м. м. 25 кДа (выполнено Н. Левиной, Институт биоорганической химии им. М. М.йэмяки-на АН СССР). Секвенированная часть этой последовательности оказалась идентичной И-концевой последовательности гена Тго-тРНК-синтетазы из поджелудочной железы быка, расшифрованной в лаборатории Б. Лябузсса. (Бордо, Франция).

Обнаружение Сахаров, связанных с молекулой Тгр-тРНК-синтетазы.

Анализу на присутствие сахарных групп были подвергнуты мономерная Тгр-тРШ-синтетаза и фрагмент 50 кДа. Во всех препарагах обнаружены сахара манноза, фукоаа, галактоза и Н-ацетилглюкозамин. Количественные результаты анализа, представленные как содержание каждого из моносахаридов в 1 нмолъ мономера Тгр-тРНК-синтетазы или ее фрагмента, представлены в табл. 4. Найденные моносахариды связаны с молекулой триптофанил-тРНК-гП'Штетазы скорее всего ковалентно, и Тгр-тРНК-синтетаза из поджелудочной железы быка - гликопротеид.

Таблица 4

Моносахаридный состав бычьей Ггр-тРШ-синтетазы и ее фрагмента

Моносахарид нмоль сахара/нмоль мономерной Тгр-тРНК-синтетазы (60 кДа) или фрагмента (30 кДа)

Тгр-тРНК-синтетаэа Фрагмент

Манноза 3,1 3,0

Фу коза 3,0 2,5

Галактоза 0,5 0,5

N-ацетилглюкозамик 0,4 0,4

вывода

Î. Получены и охарактеризованы моноклональные антитела к компонента' мультиферментного комплекса из печени кролика: антитела идентифицированы как узнающие аминоацил-тРНК-синтетазы: аргинил- (моноАТ F7, F31), глютамил- (моноАТ F8, F25) синтетавы, а также полипептиды 37 кДа (моноАТ F6) и 43 кДа (моноАТ F12) с неизвестной функцией.

2. Проведено иммуноэлектронномикроскопическое изучение локализации трилтофанил-тРНК-с"нтетазы в--клетиах фибробластов крыс с помощью по-лпклонолььых и моноклональных антител, конъки ированных с частицами 1юллоидного еолота. Установлено, что Trp-тРКК-синтетаэа локализована в' основном в цитоэоле в местах скопления рибосом, как ассоциированных с р.ндопдазматическим ретикулумом так и свободных, и в митохондриях. Значительное количество триптофанил-тРНК-синтетазы выявлено в ядре в ассоциации с нуклеопротеидными частицами диффузного хроматина

3. Проведено иммуноэлектронномикроскопическое изучение локализации высокомолекулярного, комплекса аминоацил-тРНК-синтетаэ в клетках почек колика с помощью моноАТ к компонентам комплекса, а также сравнение с локализацией в клетке Trp-тРНК-синтетазы, не входящей в соегав данного аесоциата ¡n vitro. Установлено^ что места компарт-

ментализапии триптофанил-тРНК-синте^азы к высокомолекулярного комплекса практически одинаковы. Изученные синтетазы обнаружены такте в ядре, что по-видимому, связано с 'их участием в регуляции транскрипции и (или) постранскрипционной модификации РНК. Можно также допустить участие этих сиитётаз в перекосе тРНК из ядра в цитоплазму в форме фермент-субстратных комплексов.

4. Проведено иммунозлектронномикроскопическое изучение локализации Тгр-тРНК-синтетазы в клетках Е. coli:- фермент обнаружен в основном в цитоплазме, причем иногда наблюдается предпочтительное распределение по периферии клетки. Основным отличием в распределении трипгофа-нил-тРНК-синтетазы в эу- и прокариотическпй клетке является отсутствие данной синтетазы в области нуклеоида у прокариот.

5. Обнаружено, что Тгр-тРНК-синтетаза в клеточном лизате взаимодействует с белком мол. массой 37 кДа. Установлено, что триптофа-нил-тРНК-синтетаза образует in vitro комплекс с глицеральде-гид-3-фосфат дегидрогзназой. С помощью моноАТ против разных доменов Тгр-тРНК-синтетазы показано, что в образование комплекса вовлекается несущественная для ферментативной активности N-концевая часть молекулы синтетазы. Показано, что в присутствии ГАФД гриптофанил-TFHK-синтетаза способна взаимодействовать с рРНК через образование тройного комплекса Тгр-тРНК-синтетаза ГАФД - pFKK.

6. Установлено, что трчптофанил-тРНК-синтетаза из поджелудочной железы крупного рогатого скота - гликопротеид, в ее составе обнаружены манноза, фукоза, галактоза и N-ацетилглккозамин.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ. ДИССЕРТАЦИИ

1. Filonenko V. V. , Beresten S. F. , Rubikaite В. I. , Kísselev L. L. Bovine tryptophanyl-tRNA synthetase and glyceraldehyde-3-phospliate dehydrogenase form'a complex. Bíochem.. and Biophys. Res. Coirmin.

v. 161, N2, p. 481-488 (1989).

2. Еерестень С. Ф., Филоненко В. В., Фаворова О. О. Иммунохимическое изучение триптофанил-тРНК-синтетаз. (Обзор) Биохимия, т.56, N7,' с.1155-1189 (1991).

-• Pj lo'ieiiV.o V. V. , Volfson A.D., Vartanyan O.A., Beresten S. F. '•<<.•'»>•?01 antibodies to the components of thö !i!<:h- nolecu]ar-we ight. ,aminoacyl-tRNA synthetase couplex. Blomad. "01. (1991) in press.

4. niorwriko V. V. , Beresten S. F. , Bisselev L.L. Eukaryotio

rmijnoaijyl -tRNA synthetases are able to form in vitro complex with slycej-al'.V.'hyde-S-phesplTate dehydrogenase.- 14th Internatinal tRNA (forksliop, Rydzyna-Poziiart, Poland, May 4-9, 1991, Abstracts.