Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммунохимический анализ цитокинин-связывающего белка из проростков кукурузы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шепеляковская, Анна Олеговна

л ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Открытие мембранного рецептора цитокининов.

1.1.1 Бикомпонентная регуляторная система.

1.1.2. Обнаружение и характеристика генов АгаЫйорз'м, кодирующих сенсорные гистидиновые киназы, участвующие в передаче цитокининового сигнала.

1.1.3. Другие белки бикомпонентной регуляторной системы, задействованные в передаче цитокининового сигнала.

1.1.3.1. Характеристика белков - регуляторов ответа А-типа.

1.1.3.2. Характеристика белков - регуляторов ответа В-типа.

1.1.3.3. Обнаружение и характеристика фосфотрансмиттерных белков.

1.1.4. Обобщение данных о передаче цитокининового сигнала через мембранный рецептор.

1.2. • Цитоплазматические и ядерные цитокинин-связывающие белки.

Ф 1.3. Обнаружение и характеристика цитокинин-связывающих белков в хлоропластах.

1.4. Множественность путей реализации цитокининовых сигналов в клетках растений.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Растительный материал.

2.2. Моноклональные антитела против ЦСБ-70.

2.3. Выделение моноклональных антител из асцитной жидкости мышей.

2.4. Выделение моноклональных антител из культуральной среды.

2.5. Биотинилирование МА.

2.6. Фракционирование белкового экстракта из проростков кукурузы.

2.7. Определение цитокинин-связывающей активности белков.

2.$. Сэндвич-вариант твердофазного ИФА.

2.9. Получение белковых экстрактов из различных частей проростка.

Щ 2.10. Определение числа клеток.

2.11. Определение содержания белка.

2.12. Определение содержания эндогенных цитокининов.

2.13. Выделение полирибосом.

2.14. Синтез аффинного сорбента на основе МА и Sepharose dL-4B (Pharmacia).

2.15. Синтез аффинного сорбента на основе зеатинрибозида и

Toyopearl HW-65.

2.16. Аффинная хроматография полисом на колонке с иммобилизованными М А.

2.17. Клонирование кДНК (1-й вариант).

2.18. Аффинная хроматография полисом на колонке с иммобилизованным зеатинрибозидом.

2.19. Клонирование кДНК (2-й вариант).

2.20. Анализ библиотек кДНК методом иммуноскрининга на чашках.

2.21. Анализ клеточных белков Rcoli методом иммуноблотинга.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Моноклональные антитела к ЦСБ-70, их выделение и характеристика.

3.2. Разработка тест-системы для анализа ЦСБ-70 на основе сендвич-варианта ИФА в сочетании с стрептавидин-биотиновой системой.

3.3. Локализация ЦСБ-70 в меристеме и зоне растяжения корня.

3.4. Локализация ЦСБ-70 в этиолированном проростке кукурузы.

3.5. Динамика содержания ЦСБ-70 в различных органах проростка в процессе его роста.

3.6. Использование моноклональных антител для выделения мРНК, конструирования и анализа библиотеки кДНК из проростков кукурузы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Иммунохимический анализ цитокинин-связывающего белка из проростков кукурузы"

Цитокинины были открыты, благодаря своей способности стимулировать клеточные деления в культуре растительных клеток in vitro [Skoog et all, 1957]. Природные цитокинины являются Ы6-замещенными производными аденина. Эти гормоны влияют на многие аспекты жизни растений, включающие прорастание семян, дифференцировку хлоропластов, индукцию стеблевого морфогенеза, участие в регуляции транспорта метаболитов в растении, регуляцию функциональной активности надземных органов растения и задержку старения [Кулаева, 1973]. Безусловно, все эти процессы подвержены влиянию также и других факторов (свет, другие фитогормоны), поэтому те или иные физиологические реакции растительного организма отражают комплексный ответ на множественные стимулы. Это обстоятельство осложняет изучение молекулярных механизмов действия индивидуальных фитогормонов.

Тем не менее, за последние несколько лет в области изучения механизма действия цитокининов достигнут значительный прогресс. В растениях найдены гены, кодирующие ключевой фермент биосинтеза цитокининов - изопентенилтрансферазу, открыт мембранный рецептор цитокинина, идентифицированы гены первичного ответа на цитокинин и выделены белковые факторы транскрипции, участвующие в регуляции экспрессии этих генов. Вместе с тем обнаружены факты, указывающие на наличие альтернативных путей восприятия и передачи цитокининового сигнала [Hutchison & Kieber, 2002; Kulaeva et al., 1995; 1996; 1998]. В связи с этим привлекает интерес цитокинин-связывающий белок, выделенный из цитоплазмы и ядер листьев ячменя (ЦСБ 67 кД) [Kulaeva et al., 1995; 2000]. Для этого белка показана высокая избирательность и аффинность в связывании природного цитокинина транс-зеатина [Kulaeva et all, 1998], которое приводит к формированию функционально активного комплекса, способного активировать транскрипцию in vitro [Kulaeva et al., 1995; 1998; Селиванкина и соавт.,

2001]. Эти данные позволяли рассматривать ЦСБ 67 в качестве ядерного рецептора цитокинина, участвующего в комплексе с ним в регуляции транскрипции.

В нашей лаборатории из этиолированных проростков кукурузы был выделен цитокинин-связывающий белок с мол. м. 70 кД (ЦСБ-70) [Бровкой соавт. 1996]. Этот белок проявлял способность обратимо связывать цитокинин, взаимодействовал с антиидиотипическими антителами, которые были получены против антител к транс-зеатину, а также усиливал цитокинин-индуцируемую транскрипционную активность in vitro в системе, содержащей хроматин и РНК-полимеразу из листьев ячменя. Эти свойства указывали на возможное родство ЦСБ-70 из проростков кукурузы с выделенным ранее ЦСБ-67 из листьев ячменя [Kulaeva et al. , 1995]. К ЦСБ-70 была получена представительная панель моноклональных антител. При использовании этих антител сделанное ранее предположение о функциональном и структурном подобии ЦСБ-70 из проростков кукурузы и ЦСБ-67 из листьев ячменя было подтверждено экспериментально. На наш взгляд, выделенный ЦСБ-70 весьма интересен для дальнейших исследований на предмет изучения его роли в цитокинин-регулируемых процессах в растительном организме.

Характерное свойство иммуноглобулинов с высокой специфичностью и высокой аффинностью связываться с антигеном обусловило широкое применение иммунохимических подходов для решения самых разнообразных задач в области структурно-функциональных исследований биомолекул. В частности, особенно г эффективно использование моноклональных антител при изучении рецепторных белков.

Цель данной работы состояла в разработке и применении высокочувствительных и высокоспецифичных методов анализа цитокинин-связывающего белка 70 кД, основанных на применении моноклональных антител. В связи с этим были определены следующие основные задачи работы:

Поиск пары моноклональных антител к неперекрывающимся эпитопам ЦСБ-70 и разработка на их основе высокочувствительного метода для определения ЦСБ-70 в растительных тканях.

Применение разработанного метода определения ЦСБ-70 для изучения его локализации в этиолированном проростке кукурузы.

Исследование динамики содержания ЦСБ-70 в этиолированных проростках кукурузы в процессе их роста.

Разработка на основе моноклональных антител к ЦСБ-70 метода аффинного выделения фракции полисом, обогащенной полисомами, синтезирующими цитокинин-связывающий белок для последующего выделения мРНК и конструирования библиотек кДНК.

Иммуноскрининг сконструированных библиотек и анализ с помощью моноклональных антител белковых продуктов, экспрессируемых клетками рекомбинантных клонов.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Шепеляковская, Анна Олеговна

ВЫВОДЫ.

1. Разработан высокочувствительный метод для определения ЦСБ-70 на основе сэндвич-варианта ИФА с использованием пары моноклональных антител к неперекрывающимся эпитопам ЦСБ-70 и стрептавидин-биотиновой системы.

2. С помощью разработанного метода определения ЦСБ-70 впервые изучено его распределение в 4-ех дневных этиолированных проростках кукурузы и установлено, что максимальная концентрация этого белка сосредоточена в меристеме корня и в узле, где в этот период происходят клеточные деления.

3. Установлено, что в меристеме корня клетки содержат существенно больше ЦСБ-70, чем в зоне растяжения, причем доля ЦСБ-70 от общего количества внутриклеточного белка в клетках меристемы в пять раз выше, чем в клетках зоны растяжения. Это доказывает избирательное обогащение меристематических клеток белком со свойствами внутриклеточного рецептора цитокининов и позволяет предположить его участие в регуляции клеточных делений.

4. Исследована динамика содержания ЦСБ-70 в этиолированных проростках кукурузы в период их роста от 3-го до 5-го дня. Для этого периода показано стабильно высокое содержание ЦСБ-70 в меристеме корня, что соответствует происходящим в ней клеточным делениям. В узле обнаружено существенное снижение содержание ЦСБ-70, что связано с происходящими здесь процессами закладки и развития различных типов тканей будущего проростка, при которых доля активно делящихся клеток уменьшается по отношению к общему числу клеток. В остальных частях проростка существенных изменений содержания ЦСБ-70 не обнаружено.

5. На основе использования аффинного взаимодействия ЦСБ-70 (во время его синтеза на рибосомах) с моноклональными антителами, а также с зеатин-рибозидом предложено два методологических подхода к выделению фракции полисом, обогащенной полисомами, синтезирующими данный белок, что было важно для выделения его мРНК и конструирования библиотек кДНК.

6. Продемонстрирована эффективность применения моноклональных антител для скрининга клонотек кДНК, полученных с использованием двух методологических подходов.

В заключение мне очень приятно назвать имена тех людей, которые оказывали помощь и поддержку д процессе выполнения и оформления этой работы. Это мои научные » руководители Ольга Николаевна Кулаева и Федор Александрович Бровко, которые не только организовывали и направляли мою работу, но и истинно по родительски опекали и ободряли меня в моменты неудач и сомнений. Это все сотрудники группы молекулярных аспектов иммунологии репродукции ФИБХ РАН. Отдельно я выражаю благодарность Э.А. Бурхановой из лаборатории О.Н.Кулаевой Института физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН, и Г.Р.Кудояровой из Института биологии Уфимского научного центра РАН.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

К настоящему моменту в научной литературе опубликовано множество работ, свидетельствующих о достижении значительного прогресса в изучении механизмов передачи цитокининового сигнала. У Arabidopsis открыт мембранный рецептор цитокининов CREI, действующий по принципу бикомпонентной регуляторной системы. В результате изящно спланированных и осуществленных экспериментов получены неопровержимые доказательства участия в передаче цитокининового сигнала мембранного рецептора CREI и других белков, имеющих отношение к бикомпонентной регуляторной системе, в частности, RR белков В-типа, обладающих функциями транскрипционных факторов.

Однако в настоящее время становится очевидным, что действие цитокининов реализуется не только в результате передачи сигнала через мембранный рецептор и сопряженной с ним цепи фосфорилирования цитоплазматических и ядерных белков. Значительное количество экспериментальных данных указывает на существование альтернативных путей передачи цитокининового сигнала, что подчеркивает важность выясненя действия в клетках рецепторов цитокининов разного уровня.

Для цитокинин-связывающего белка кукурузы, выделенного в нашей лаборатории, было показано, что он обладает свойствами цитокинин-зависимого транскрипционного фактора. По ряду признаков он был отнесен к семейству ядерных цитокинин-связывающих белков со свойствами рецептора цитокининов, к которому принадлежат и цитокинин-связывающие белки 67 кД (ЦСБ-67) из листьев ячменя [Kulaeva, 1995] и Arabidopsis [Селиванкина и соавт., 2001]. В отношении ЦСБ-67 были получены экспериментальные данные о присущей этому белку протеинкиназной активности, регулируемой цитокинином.

В рамках данного исследования с использованием разработанных иммунохимических подходов было показано, что ЦСБ-70 кукурузы активно экспрессируется в меристематической зоне корня. При переходе к зоне растяжения количество этого белка в клетках значительно уменьшается. Вместе с тем было показано, что содержание физиологически активного цитокинина - зеатина в клетках меристемы ниже, чем в клетках зоны растяжения. Поэтому, если предположить, что ЦСБ-70 в комплексе с зеатином участвует в регуляции деления клеток, то лимитирующим звеном, останавливающим клеточные деления, при переходе клеток из зоны деления в зону растяжения может оказаться именно этот белок. Полученные данные хорошо согласуются со свойствами цитокининов активировать деления клеток и делают актуальным изучение роли ЦСБ-70 в этом процессе.

В работах зарубежных авторов для изучения локализации в растительном организме тех или иных белков, связанных с реализацией цитокининового сигнала, были применены подходы, с использованием непрямых методов анализа. Так в одних экспериментах, анализ был основан на определении количества в различных тканях растения РНК-транскриптов соответствующих генов, в других, с использованием репортерных генов, таких как GFP или GUS, анализировалась активность промоторов генов регулируемых цитокинином или белков, участвующих в трансдукции сигнала, третьих - исследуемые белки были экспрессированы в составе гибридных молекул исследуемого белка с продуктами репортерных генов. Полученные с использованием этих подходов результаты не всегда в точности отражают истинное содержание исследуемого белка в ткани. В случае применения анализа РНК-транскриптов следует учитывать тот факт, что экспрессия некоторых белков может регулироваться не только на уровне транскрипции, но и на уровне трансляции, как, например, в случае некоторых ARR белков А-типа. Иными словами количество мРНК не всегда корреллирует с количеством белка.

При использовании репортерных генов не стоит забывать, что полученные результаты будут отражать активность тех или иных генов в трансформированном растении. Поскольку вопрос о степени воздействия на растительный организм чужеродных генов до сей поры остается спорным, заключения об уровне экспрессии тех или иных белков, полученные с помощью этой методологии зачастую требуют подтверждений, полученных альтернативными способами.

Примененный в нашей работе иммунохимический подход позволил сравнить содержание исследуемого белка в различных частях проростка кукурузы прямым методом, а полученные данные отражают содержание самого цитокинин-связывающего белка, а не его мРНК или продукта репортерного гена.

Во второй части работы была продемонстрирована возможность эффективного применения иммунохимических подходов для выделения и последующего клонирования мРНК, служащих матрицами для синтеза белков, несущих антигенные детерминанты для конкретных моноклональных антител. В нашей работе мы использовали моноклональные антитела к ЦСБ-70 и стремились получить рекомбинантные клоны, содержащие последовательность ДНК, кодирующую ЦСБ-70. Двумя незамисимыми методами было достигнуто обогащение мРНК из этиолированных проростков кукурузы матрицами, кодирующими ЦСБ-70. На их основе была сконструирована библиотека кДНК и выделены клоны, синтезирующие полипептид, близкий по молекулярной массе к рецептору цитокининов и взаимодействующий с антителами, полученными против рецепторного белка.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шепеляковская, Анна Олеговна, Пущино

1. Дин П., Джонсон У., Мидл. Ф. Аффинная хроматография. Методы: Пер. с англ. М.: Мир, 1988. (P.D.G .Dean, W.S.Johnson and F.A.Middle. Affinity chromatography. IRL Press, Oxford-Washington DC, 1985).

2. Заграничная Т.К., Бровко Ф.А., Шепеляковская A.O., Бозиев Х.М., Липкин В.М. Моноклональные антитела к цитокинин-связывающему белку 70 кД из этиолированных проростков кукурузы. Физиология растений. 1997, том 44, стр. 510.

3. Кудоярова Г.Р., Веселов С.Ю., Каравайко H.H., Гюли-Заде В.З., Чередова Е.П., Мустафина А.Р., Мошков И.Е., Кулаева О.Н. Иммуноферментная тест-система для определения цитокининов. Физиология растений. 1990, том 37, стр. 193-199.

4. Кулаева О.Н. Влияние корней на обмен веществ листьев в связи с проблемой действия на лист кинетина. Физиология растений. 1962, том 6, стр. 229-239.

5. Кулаева О.Н. Цитокинины, их структура и функция. М.: Наука. 1973.

6. Кулаева О.Н. Восприятие и преобразование гормонального сигнала у растений. Физиология растений. 19956 том 42, стр. 161-171.

7. Baumgarten H., Peters J.H. Production of murine monoclonal antibodies in the peritoneal cavity of the mouse. In Monoclonal Antibodies, Ed. Peters J. H., Baumgarten H.: SpringerVerlag, Berlin. 1992. pp. 225-233.

8. Beaty, J.D., Beaty, B.G. & Vlahos, W.G. J. Immunol. Meth. 1987. vol. 100. pp. 173-179.

9. Berridge, M.V., Ralph, R.K., Letham, D.S. The binding of kinetin to plant ribosomes. Biochem. J. 1970, vol. 119, pp. 75-84.

10. Blackman, P.G. & Davies, W.J. Age-related changes in stomatal responses to cytokinins and ABA .Ann. Bot. 1984, vol. 54, pp.121-125.

11. Brandstatter, I.B., & Kieber, J.J. Two genes with similarity to bacterial response regulators are rapidly and specifically induced by cytokinin in Arabidopsis. Plant Cell. 1998, vol. 10, pp. 1009-1019.

12. Brown, R., Rickless, P. A new method for the study of cell division and cell expression with some preliminary observation on the effect of temperature and of nutrients. Proc. R. Soc. London. 1949, vol. 136, pp. 110-121.

13. D'Agostino, I.B. & Kieber, J.J. Phosphorelay signal transduction: The emerging family of plant response regulators. Trands Biochem. Sci. vol. 24, pp. 452-456.

14. D'Agostino, I.B., Deruere, J., & Kieber, J.J. Characterization of the response of the Arabidopsis response regulator gene family to cytokinin. Plant Physiol 2000, vol.124, pp. 17061717.

15. Dubell, A.N. & Mullet, J.E. Differential transcription of Pea chloroplast genes during light-induces leaf development. Plant Physiol. 1995, vol. 109, pp. 105-112.

16. Erion, J., Fox, J.E. A cytokinin binding protein from higher plant ribosomes. Plant Physiol. 1975, vol. 56, S-28.

17. J. Biol. Chem. 2001, vol. 276, pp. 36869-36872. Hare, P.D., van Staden, J. The molecular basis of cytokinin action. Plant Growth Regul. 1997, vol. 23, pp. 41-78.

18. Jacobs, M., Connell, L., Cattolico, R.A. A conserved His-Asp signal response regulator-like in

19. Heterosigma akashiwo chloroplasts. Plant Mol. Biol. 1999, vol. 41, pp. 645-655. Kende, H. Preservation of chlorophyll in leaf sections by substances obtained from root exudate.

20. Kakimoto, T. Identifikation of plant cytokinin biosynthetic enzymes as dimethilallil diphosphate:

21. ATP/ADP isopenteniltrasferases. Plant Cell Phisiol. 2001, vol. 42, pp. 677-685. Kakimoto, T. CKI1, a histidine kinase homolog implicated in cytokinin signal transduction.

22. Kiba, T., Taniguchi, M., Imamura, A., Ueguchi, C., Mizuno, T., & Sugiyama, T. Differentional expression of genes for response regulators in response to cytokinins and nitrate in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 1999, vol.40, pp. 767-771.

23. Kim, W.Y., Cheong, N.E., Lee, D.C., Je, D.Y., Bank, J.D., Cho, M.J. & Lee, S.Y. Cloning and sequencing analysis of a full-length cDNA encoding a G protein a-subunit, SGA1, from soybean. PL Physiol. 1995, vol. 108, pp. 1315-1316.

24. Kohler, G. & Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 1975. vol. 256, pp. 495-497.

25. Kulaeva, O.N., Zagranichnaya, T.K., Brovko, F.A., Karavaiko, N.N., Selivankina, S.Yu., Zemlyachenko, Ya.V., Hall, M.A., Lipkin, V.M., Boziev, Kh.M. A new family of cytokinin receptor from cereals. FEBS Lett. 1998, vol. 423, pp. 239-242.

26. Kulaeva, O.N., Karavaiko, N.N., Selivankina, S.Yu., Zemlyachenko, Ya.V. Receptor of trans-zeatin involved in transcription activation by cytokinin. Febs Lett. 1995, vol. 366, pp. 2628.

27. Kulaeva, O.N., Karavaiko, N.N., Selivankina, S.Yu., Moshkov, I.E., Novikova, G.V., Zemlyachenko, Ya. V., Orudgev, E.M. Cytokinin signaling systems. From a Whole Plant to the Molecular level. Plant Growth Regul. 1996, vol. 18, pp. 29-37.

28. Ma, H., Yanofsky, M. F. & Meyerowitz, E.M. Molecular cloning and characterization of GPA1, a G protein a subunit gene from Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1990, vol. 87, pp. 3821-3825.

29. Ma, H., Yanofsky, M. F. & Huang, H. Isolation and sequence analysis of TGA1 cDNAs encoding a tomato G protein a subunit. Gene. 1991, vol.107, pp. 189-195.

30. Mähönen, A.P., Bonke, M., Kauppinen, L., Riikonen, M., Benfey, P.N. & Helariutta, Y. A novel two-component hybrid molecule regulates vascular morphogenesis of the Arabidopsis root. Genes Dev. 2000, vol. 14, pp. 2938-2943.

31. Miyata, S., Urao, T., Yamaguchi-Shinozaki, K. & Shinozaki, K, Characterization of genes for two-component phosphorelay mediators with a single HPt domain in Arabidopsis thaliana. FEBSLett. 1998, vol. 437, pp. 11-14.

32. Moore, H. Kinetin binding protein from wheat germ. Plant Physiol. 1977, vol. 59, S-17.

33. Moore, F.H. A cytokinin-binding protein from wheat germ. Isolation by affinity chromatography and properties. Plant Physiol. 1979, vol. 64, pp.594-599.

34. Nagata, R., Kawachi, E., Hashimoto, Y. & Shudo, K. Cytokinin-specific binding protein in etiolated mung bean seedlings. Biochem. & Biophys. Res. Commun., 1993, vol. 191, No. 2, pp. 543-549.

35. Parthier, B. The role of phytohormones (cytokinins) in chloroplast development. Biochem. Physiol. Pflanz. 1997, vol. 174, pp. 173-214.

36. Perraud, A.-L., Weiss, V. & Gross, R. Signalling pathways in two-component phosphorelay systems. Trends Microbiol. 1999, vol. 7, pp. 115-120.

37. Polya, G.M., Davis, A.W. Properties of a high-affinity cytokinin- binding protein from wheat germ. Planta. 1978, vol. 139, pp. 139-147.

38. Posas, F. & Saito, H. Activation of the yeast SSK2 MAP kinase kinase kinase by the SSK1 two-component response regulator. EMBO J. 1998, vol. 17, pp. 1385-1394.

39. Poulsen, C., Mai, Z.M. & Borg, S. A Lotus japonicus cDNA encoding an a subunit of heterotrimeric G-protein. PI. Physiol. 1994, vol. 105, pp. 1453-1454.

40. Rashotte, A.M., Carson, S.D.B., To, P.C. & Kieber, J.J. Expression profiling of cytokinin action in Arabidopsis. Plant Physiology. 2003, vol. 132, pp. 1998-2011.

41. Reichmann, J.L.,et all. Arabidopsis transcription factors: Genom-wide comparative analysis among eukaryotes. Science. 2001, vol. 290, pp. 2105-2110.

42. Rodermel, S. Pathways of plastid-to-nucleus signaling. Trends Plant Sci. 2001, vol. 6, pp. 471478.

43. Romanov, G.A., Taran, V.Ya, Khvojka, L. & Kulaeva. Receptor-like cytokinin-binding protein(s) from barley leaves. J. Plant Growth Regul., 1988, vol. 7, pp. 1-17.

44. Sakai, H., Aoyama, T., Bono, H. & Oka, A. Two-component response regulators from Arabidopsis thaliana contain a putative DNA-binding motif. Plant Cell Phisiol. 1998, vol. 39, pp. 1232-1239.

45. Sakai, H., Aoyama, T. & Oka, A. Arabidopsis ARR1 and ARR2 response regulators operate as transcriptional activators. Plant J. 2000, vol. 24, pp. 703-711.

46. Sakai, H., Honma, T., Aoyama, T., Sato, S., Kato, T., Tabata, S. & Oka, A. ARR1, a transcription factor for genes immediately responsive to cytokinins. Science. 2001, vol. 294, pp. 1519-1521.

47. Sakakibara, H., Suzuki, M., Takei, K., Deji, A., Taniguchi, M., & Sugiyama, T. A response-regulator homologue possibly involved in nitrogen signal transduction mediated by cytokinin in maize. Plant J. 1998, vol. 14, pp. 337-344.

48. Schaller, G.E. Histidine kinases and the role of two-component systems in plants. Adv. Bot. Res. 2000, vol. 32, pp. 109-148.

49. Seo, H.-S., Kim, H.-Y., Jeong, J.-Y., Lee, S.-Y., Cho, M.J. & Bahk, J.-D. Molecular cloning and characterization i of RGA1 encoding a G protein a subunit from rice (Oryza sativa L. IR-36). PI. Molec. Biol. 1995, vol. 27, pp. 1119-1131.

50. Skoog, F. & Miller, C.O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. Symp. Soc. Exp. Biol. 1957, vol. 11, pp. 118-131.

51. Sossountzov, L., Maldiney, R., Sotta, B., Subbagh, I., Habricot, Y., Bonner, M., Miginias, E. Immunocytochemical localization of cytokinins in Graigella Tomato and a side-shoot less mutant. Planta. 1988, vol. 175, pp. 291-304.

52. Stock, J.B., Ninfa, A.J. & Stock, A.M. Protein phosphorylation and regulation of adaptive responses in bacteria. Microbiol. Rev. 1989, vol. 53, pp. 450-490.

53. Sussman, M.R., Kende, H. In vivo cytokinin binding to a particulate fraction of tobacco cells. Planta. 1978, vol. 140, pp. 251-259.

54. Suzuki, T., Imamura, A., Ueguchi, C. & Mizuno, T. Histidine-containing phosphotransfer (HPt) signal transducers implicated in His-to-Asp phosphorelay in Arabidopsis. Plant Cell Phisiol. 1998, vol. 39, pp. 1258-1268.

55. Suzuki, T., Miva, K., Ishikwa, K., Yamada, H., Aiba, H. and Mizuno, T. The Arabidopsis sensor His-kinase, AHK4, can respond to cytokinins. Plant Cell Physiol. 2001, vol 42, pp. 107113.

56. Takegami, T. & Yoshida, K. Isolation and purification of cytokinin binding protein from tobacco leaves by affinity column chromatography. Biochem. & Biophys. Res. Commun., 1975, vol. 67, No. 2, pp. 782-789.

57. Takei, K., Sakakibara, H. & Sugiyama, T. Identification of genes encoding adenilate isopenteniltransferase, a cytokinin biosynthesis enzyme, in Arabidopsis thaliana. J. Biol. Chem. 2001, vol. 276, pp. 26405-26410.

58. Taniguchi, M., Kiba, T., Sakakibara, H., Ueguchi, C., Mizuno, T., & Sugiyama, T. Expression of Arabidopsis response regulator homologs is induced by cytokinins and nitrate. FEBS Lett. 1998, vol. 429,259-269.

59. Thiel, G. & Wolf, A.H. Operation of K+-channels in stomatal movement. Trends PI. Sci. 1997, vol. 2, pp. 339-345.

60. Tsai, M.J. & O'Malley, B.W. Molecular mechanisms of action of steroid. Thyroid receptor super family Members. Annu. Rev. Biochem. 1994, vol. 63, pp. 451-486.

61. Urao, T., Yakubov, B., Yamaguchi-Shinozaki, K. & Shinozaki, K. Stress-responsive expression of genes for two-component response regulator-like proteins in Arabidopsis thaliana. FEBS Lett. 1998, vol. 427, pp. 175-178.

62. Yoshida, K., Takegami, T. Isolation of cytokinin binding protein from tobacco leaves by bioaffinity chromatography and its partial characterization. J. Biochem. 1977, vol. 81, pp. 791-799.

63. Weiss, C.A., Carnaat, C.W., Mukai, K., Hu, Y. & Ma, H. Isolation of cDNA encoding guanine nucleotide-binding protein P-subunit homologues from maize (ZGB1) and Arabidopsis (AGB1). Proc. Natn. Acad. Sci. USA. 1994, vol. 91, pp. 9554-9558.

64. Welch, M., Osawa, K., Aizawa, S.-I. & Eisenbach, M. Phosphorylation-dependent binding of a signal molecule to the flagellar switch of bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993, vol. 90, pp. 8787-8791.

65. West, A.H., & Stock, A.M. Histidine kinases and response regulator proteins in two-component signaling systems. Trends Biochem. Sci. 2001, vol. 26, pp. 369-376.

66. Werner, T., Motjrka, V., Strand, M., Schmulling, Th. Regulation of plant growth by cytokinin.

67. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2001, vol. 98, pp. 10487-10492. Würzner R. Limiting-dilution cloning. In Monoclonal Antibodies (Ed. Peters J.H., Baumgarten H.). Berlin: Springer-Verlag. 1992. pp. 203-205.