Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммунохимические свойства углеводных компонентов клеточной поверхности почвенных бактерий AZOSPIRILLUM BRASILENSE

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Иммунохимические свойства углеводных компонентов клеточной поверхности почвенных бактерий AZOSPIRILLUM BRASILENSE"

$0 04 9 1

государственный комитет по санитарно-эпидемиологическому надзору российской федерации

всесоюзный ордена трудового красного знал\ени научно-исследовательский противочумный институт «микроб»

На правах рукописи МАТОРА Лариса Юрьевна

удк: 579.835.083.3.232.25.5

ИММУНОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА УГЛЕВОДНЫХ КОМПОНЕНТОВ КЛЕТОЧНОЙ ПОВЕРХНОСТИ ПОЧВЕННЫХ БАКТЕРИЙ

АгОЗРЩИХиМ ВКАБ^ЕМБЕ

(03.00.07 — ¡микробиология)

автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов — 1992

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской Академии Наук (ИБФРМ РАН) и на кафедре биохимии и биофизики Саратовского государственного университета им. Н. Г. Чернышевского.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор ИГНАТОВ В. В., кандидат химических наук ШВАРЦ-БУРД Б. И.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, старший научный сотрудник ТАРАНЕНКО Т. М., доктор химических наук, профессор ДМИТРИЕВ Б. А.

Ведущая организация — Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского.

Защита состоится « » 1992 г.

в /3 часов на заседании Специализированного совета ® 074.32.01 при Всесоюзном научно-исследоватсльсксм противочумном институте «Микроб» (410071, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИПЧИ «Микроб».

Автореферат разослан «

1992 года.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор биологических наук

Г. А. Корнеев

г г.,л

тлел ;ртгций . I- Т У

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

альность темы. Растения формируют вокруг

микробные сообщества, оказывая медное воздействие на их .ктивность посредством продуктов своего метаболизма. Поиск, зучение и целенаправленное использование в практике седьмого хозяйства биологических агентов, способных влиять на рожайность растений, относятся к категории важнейших фунда-[ентальных и прикладных проблем микробиологии и сельскохо-яйственной биотехнологии. В их ряду находится проблема ксн-■акта и обмена метаболитами между растениями и почвенными [икроорганизмами, занимая одно из центральных мест при изучении микробного симбиоза, паразитизма и иммунитета растений.

При исследовании молекулярных основ контактных взаимо-;ействий внимание исследователей привлекает анализ поверх-:остных структур растительных и микробных меток. Известно, что в анализе структуры и функций компонентов клеточной по-1ерхности разнообразных микроорганизмов хоро'пута перспективу ;меют подходы с применением методов иммунохимии. Однако чис-ю работ с использованием подобных методов при исследовании ;редставителей почвенной микрофлоры пока сравнительно неве-

1ико.

В том числе это касается свободноживущих бактерий рода .говрАгШип . Бактерии данного рода способны вступать в .ссоциативные взаимоотношения с растениям, представляющими :ельскохозяйстненнук> ценность, но не используют при этом до-юльно хорошо изученных фенотипических признаков симбиоза в частности, клубеньков), присущих, например, бактериям ро-,а ПЫгоМип. Возрастающий интерес к представителям ассоциа-'иеной почвенной микрофлоры объясняется многочисленными фак-ами их обнаружения на корнях (и даже в тканях) растений и становленной способностью данных микроорганизмов к синтезу ажных метаболитов (в частности, фитогормонов).

Углеводные компоненты наружной мембраны грамотрицатель-:ой бактериальной клетки считаются её важнейшими структурны-и элементами, поскольку они непосредственно участвуют во заимог^йствии бактерий с другими организмами. В целом ряде >абот, в частности, посвященных ризобиям, кг-зло подтвержде-ие существенное значение внеклеточных полисахаридов (ВИС) и

липополисахаридов (ЛПС) бактерий при ризобиальном симбиогзе. Однако для азоспирилл (в отличие от ризобий) структура ВПС, ЛПС и их роль в ассоциативных взаимоотношениях микрооргачиз мов с растениями пока не паяли достаточного освещения в литературе. Отметим, что особенности строения О-специфических полисахаридов (0-ПС), являющихся составной частью ЛПС, е значительной мере определяют индивидуальность данного микро организма и служат основой для его надежной иммунологическо идентификации.

Б связи со сказанным представляет интерес сравнительны анализ степени гетерогенности, химического строения и локализации углеводных соматических и внеклеточных антигенных детерминант (эпитопов), позволивший, кроме прочего, судить об "аохитектурк" поверхности клеток азоспирилл. Следует заметить, что в литературе пока не представлена достаточно развитая система их серологической классификации.

В работах по биохимии и генетике почвенных микроорганизмов внимание исследователей привлекает взаимосвязь между их фенотипическими свойствами и молекулярно-генетическими характеристиками. В частности; известны данные о влиянии плазмидного состава на структуру клеточной поверхности ризобий и их симбиотическое поведение. Для бактерий рода Агоор1-г111ша пока не имеется достаточных сведений по этой проблеме, для речения которой представляется вполне обоснованным использование фенотипических характеристик, получаемых методами иммунохимии.

Цель и задачи исследования. Целью исследований было развитие методических подходов на основе иммунохимического анализ;, и их реализация для получени* сведений: об антигенных свойствах углеводов клеточной поверхности типовых штаммов бактерий рода ЛгоарЗ-гШис , о химической структуре их антигенных детерминант и о влиянии плазмидного состава бактерий на иммунохимические характеристики углеводных компонентов внеиней мембраны азоспирилл.' Поэтому б -адачи нааей работы входило:

I. Разработать эффективные методики получения моноспецифических антител, обеспечивающие направленный скрининг углеводных антигенов клеточной поверхности азоспирилл.

2. Провести сравнительный серологический анализ типовых штаммов азоспирилл с использованием антител, специфичных * углеводным антигенам их клеточной поверхности.

3. Выполнить сравнительное изучение антигенных свойств \ установить состав антигенов для ШС и 0-ПС 5 -варианта 1иоэр1гИ1иа ЪгааПепзе Эр 7.

4. Проанализировать конкурентные взаимодействия Полуниных антител с ЛПС, очищенными фракциями 0-ПС известного состава и отдельными моносахаридами с целью установления химического строения О-антигенных детерминант 3 -варианта

I. ЪгааИепзе Бр 7.

5. Оценить влияние плазмидного состава на антигенные свойства углеводных компонентов клеточной поверхности азоспирилл на примере штамма А.Ъгаз11епзе Эр 245 и его бес-гяазмидных мутантов.

1 а у ч н а я новизна работы заключается в том, ?то в ней впервые предложен эффективный способ иммунизация кивотных целыми клетками, поверхность которых обработана би-[)ункциональным реагентом, и показано, что это приводит к неимущественному иммунному ответу на углеводные соматические антигены азоспирилл. На этой основе с привлечением сведений из литературы получены данные о моносахаридном составе эпитопов и серотипе 5 -варианта А,ЪгааИепзе Зр 7 , уста-ювлена фактическая идентичность антигенных свойств экзопо-тасахаридов (ЭПС), калсульных и 0-специфических полисахаридов указанного штамма азоспирилл. При этом использованы оригинальные методические приемы с применением метода спектро-гурбидиметрии и биодот-анализа с зондами, мечек..ыми коллоидным золотом (КЗ). Впервые для азоспирилл на примере штампа А.ЪгааИеьзе Бр 245 показано, что особенности структуры антигенных детерминант ЛПС связаны с их плазмидным составом. Трактическая значимость работы. Доведенные исследования создают основу для построения си-гтемы серологической классификации почвенных бактерий рода 1гоар1г1Ии1л с учетом иммунохимических свойств их соматических (липополисахаридных) антигенов. Разработанный способ получения антител, обеспечивающий преимущественный иммунный ответ на углеводные соматические антигены целых клеток азоспирилл (и, возможно, более широкого круга грзмотряцатель-

ных бактерий), используется при проведении плановых НИР в Лаборатории физической химии клеточных структур (ЛФХКС) ИБФРМ РАН. Кроме того, развитые методики твердофазного анализа бактериальных клеток с применением биоспецифических зондов, меченных КЗ, применяются е исследовательской практике Лаборатории микробиологии, Лаборатории биохимии и Лаборатории генетики микроорганизмов (ЛГМ) ИБФРМ РАН.

Получений данных о серотипе бактерий, проиллюстрированное на примере штамма л.ЬгьзИепзе зр 7 (галактоэосодержащде детерминанты), делает возможным целенаправленный подбор биоспецифических зондов для последующего их использования в экологических, таксономических и цитохимических исследованиях азоспирилл. Целью последних является изучение пространственного распределения в пределах клеточной поверхности 0-анти-генов бактерий как потенциальных сигнальных и узнающих структур при взаимодействии данных микроорганизмов с растениями.

Материалы диссертационной работы использованы автором при подготовке и проведении занятий со студентами дневного отделения химического факультета Саратовского университета, специализирующимися в филиале Кафедры органической химии при ИБФРМ РАН и Саратовском филиале ВНШГенетики, по спецкурсу: "Основы аналитической иммунохимии".

Основные по.ложения, выносимые автором на защиту:

1. Модификация метода иммунизации животных, обеспечивающая преимущественный иммунный ответ на углеводные соматические антигены целых клеток, обработанных глутаровым альдегидом, минуя стадии их термообработки и специальной очистки антител.

2. Результаты серологических исследований типовых штаммов ачоспирилл, показывающие: а) видовую и штаммовую специфичность антител, полученных по модифицированному методу иммунизации животных; б) эффективность иммунодот-анализа целых клеток с использованием их непрямого мечения комп-лек ом протеин А + КЗ (cell gold ic.-.:uaoJot).

3. Установление гетерогенности антигенных структур клеточной поверхности и антигенной идентичности 5ПС, 0-ПС и капсульного материала для bruailcnso Up 7 (^-варианта).

4. Итоги сравнительного анализа иммунохимической актав-<ости фракций 0-ПС, выделенных (Немеричкин с соавт., 1989) лэ клеток s -варианта А.ЬгазПепзе Sp 7 , и определение зеротипа (галактозосодсржащие детерминанты) данного микроорганизма.

5. Обнаружение зависимости иммунохимиче-гких свойств углеводных компонентов внешней мембраны А.Ъга-зИепзе Sp 245 от плазмидного состава 5актерий и оценка возможной локализации генов (плазмида 120 или 130 МДа), ответсть^нных за отмеченные изменения иммунологических характеристик.

Работа выполнена в ЛФХКС ИБФРМ РАН в соответствии с плановой тематикой: "Изучение молекулярно-генети-1еских механизмов узнавания, контакта и обмена метаболитами азоспирилл и культурных злаков" О? гос.per. 0I860Q245I6, на-Лиый руководитель профессор В.З.Игнатов) и "Разработка эф-(гактивных тест-систем к антигенным структурам клеток микро-эрганиэмов и растений" Of гос.рег.01890017743, научный руководитель зав.лаб. канд. физ.-мат. наук С.Ю.Щеголев). Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены: на Всесоюзной конференции "Химия и 5иохимия углеводов" (Тбилиси, 1987), на Всесоюзной конферен-дии "Регуляция микробного метаболизма" (Пущино, 1989), на Зсесоюзном семинаре "Химия и биохимия углеводов клеточной юверхности микроорганизмов" (Саратов, 1991), на Европейском симпозиуме по углеводам (Прага, 1989), на Международном сим-зозиуме по азотфиксации у небобовых растений (Флоренция, L990), на Европейском.симпозиуме по химии углеводов (Эдин-5ург, 1991), на научных семинарах и отчетных конференциях ifeiPM РАН с 1989 по 1992 г. г;

1убликации. По теме диссертации опубликовано V печатных работ (и одна работа принята к публикации в 1992 г.). Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырем глав (включающих аналитический обзор литературы, описание материалов и методов исследования, изложение полученных результатов и их об-гуждеш т), заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 134 страницах мази-

нсписного текста, иллюстрирована 29 рисунками и 5 таблицами Список использованных источников включает 140 наименований.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

В обзоре литературы обсуждены проблемы взаимоотношений почвенных микроорганизмов с растениями и отмечены возможные место и роль,азоспирилл как ассоциативных аэотфиксаторов в микробных ценозах. Рассмотрены особенности строения клеточной поверхности грамотрицательных бактерий и проачализирова ны достоинства и ограничения известных подходов к их изучению с использованием методов иммунохимии. Проанализированы результаты серологического анализа азоспирилл, отмечены данные по генетике их углеводных антигенов. По итогам этого рассмотрения обоснован выбор штаммов азоспирилл для детального исследования имьунохимических свойств их изолированных углеводных компонентов и для оценки влияния на эти свойства плазмидного состава бактерий. При этом учтены имеющиеся литературные данные о моносахаридном составе фракций 0-ПС S -варианта A.braoilenso Sp 7 , выделенных сотрудниками Лаборатории биоорганической химии (ЛБХ) ИБФРМ РАН, и результаты молекулярно-генетических исследований бесплазмидных ыутанто! R-варианта A.brasilense 5р 245 , полученных сотрудниками ЛГМ ИБФРМ РАН. На этой основе сформулированы задачи нащих исследований.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Материалы и методы исследования

В работе использовали 13 зтаммов почвенных азотфикси-pywx бактерий, относящихся к роду iizospirilluia . Для анализа иммунсхимических свойств изолированных углеводных компонентов использовали:з -вариант л.ЬгазИепзе Sp 7 ,R -вариант a.brusilenae Зр 245 , спонтанный мутант этого лтамма ут,,атив;оий плаэмиды 85, 120 и 130 1!Да, и его трансконъагант с возвращенной плазм идо tl 85 НДа. Типовые штаммы азоспирилл были взяты нами из коллекции 'ЛЫРМ РАН. Мутанты с измененным плазмидным составом штамма ^р 245 были получены и любезно предоставлены нам сотрудниками ЛГМ ИБФРЫ РАН.

Мы использовали препараты: ЭПС, 0-ПС, капсульных полисахаридов и липополисахарид-белкового комплекса (ЛПБК) з -формы A.brasilense Sp 7 , любезно предоставленные сотрудниками ЛБХ ИБФРМ РАН. При этом ЛПБК были двух типов: выделенные сравнительно "мягкой" солевой экстракцией (ЛПБК-I) и более "жесткой" водно-фенольной экстракцией (ЛПБК-2). Кроме того, использовали препараты наружной мембраны азоспирилл, выделенные нами по методу Покстона (Poxtor. et al., 1985).

Культуры клеток азоспирилл выращивали на жидкой синтетической малатной среде (Bulow and Dobereinor, 1975) при 28°С до поздней логарифмической фазы роста, дважды отмывали и осаждали центрифугированием.

При получении антител (Ат), специфичных к углеводным компонентам клеточной поверхности бактерий, сравнивали возможности двух методик: известной, включающей иммунизацию кроликов очищенными фракциями полисахаридных антигенов, и ^традиционной, с использованием иммунизации яиеоткых целили слетками, предварительно обработанными глутаровым альдегидом. Гитр антител определяли в реакциях иммунодиффузии и агГЛЮТИ-^ИИ.

Для оценки эффективности ингибирования икмунохимкческих зеакций предполагаемыми гаптенами (моносахаридами) и фрагади-ади бактериальных 0-ПС (0-ПС1, 0-ПС2 и 0-ПСЗ) с известным юносахаридным составом (Жемеричкин с соавт., 1989) исполь-¡овали метод деойной радиальной иммунодиффузии. Кроме того, з этих экспериментах проводили количественное определение сонцентрации нерастворимых комплексов ЛПС+Лт или 0-ПС+Лт в ;вух вариантах. В первач- на стадии образования комплексов ) форме макроосадков, использовали специфические реакции на юлки и углеводы. Во втором- на стадии образования ксмплек-:ов в виде Еысокодисперсной взвеси коллоидных частиц преципитата, пользовались спектротурбидиметрическим методом (Кле-мн с соавт., 1979; Щеголев и Хлебцов, 1984).

В серологических исследованиях интактных клеток азоспи-)илл нами испол. юваяа оригинальная методика cell aunodot твердофазного иммуноанализа целых клеток с примене-гием коллоидного золота (Богатырев с соавт., 1991), разрабо-•г:шая в JI3XKC ИБ5РМ РАН.

В опытах с изолированными антигенами применяли трлди-

ционный метод иммуиодиффу зионного анализа. Исследования ЛПС методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) проводили по методу Хичкока (Hitchcock and Brov/n, 1983). Идентификацию полос ЛПС в геле проводили с помощью окрашивания серебром (Tsai and Presch, 1982).

Иммуноэлектрофорез, ракетный электрофорез, двумерный иммуноэлектрофорез и их разновидности (двойной перекрестный и слитный ракетный иммуноэлектрофореэ) проводили в соответст вии с описанием, приведенным в Руководстве по количественному кммуноэлектрофореэу под. ред. Н.Аксельсен и Н. Крелль (1977). Кроме того, применяли двумерный иммуноэлектрофорез с использованием ПААГ для разделения мембранных клеточных компонентов в первом направлении (Owen, 1985)»

Эксперименты по ичыунозлектрсфоретичаскому анализу проводили на приборе "Uultiphor- II" (LKB) . Спектротурбидимет-рические, УФ-спектроскопические и колориметрические анализы проводили на приборах CS-46 и "Specord Ы-40" (Corl Zeiss .Jena).

Полученные результаты и их обсуждение

I. Получение антител, специфичных к углеводным компонентам клеточкой поверхности бактерий.

Из литературы известно, что иммунизация животных ин-тактными клетками приводит к получению антисывороток, богатых антителами к термолабильным антигенам (De-Polli, 1980), предположительно белковой природы. В этом случае отмечается существование внутривидовых перекрестных реакций для больь.> го числа штаммов азоспирилл. В экспериментальной практике часто используют иммунизацию целыми клетками, предварительна подвергнутыми термической обработке (Васильев с соавт.,1984) в расчете на получение Ат, специфичных, в основном, к поли-сахаридным (термостабильным) антигенам клеточной поверхноси Однако при этом сохраняется опасность конкуренции за иммунный ответ со стороны денатурированных белков Енешней мембраны бактерий. Поэтому мы попытались модифицировать способ иммунизации целыми клетками, минуя стадии их термообработки и дополнительной очистки антисывороток.

Наши эксперименты показали, что при иммунизации животных препаратами изолированных ЭПС, активность полученных антисывороток оказывается недостаточной для их использования в методах, основанных на иммунопреципитации. В то же время, антисыворотки к целым клеткам, обработанным глутаровым альдегидом, обладали преципитирующими свойствами и имели более высокие титры агглютинации по сравнению с антисыворотками против очищенных фракций ЗПС (I : 5120 и I : 320 соответственно).

Для установления специфичности Ат, содержащихся в сыворотках против целых клеток, обработанных бифункциональным реагентом, применял метод двумерного иммуноэлектрофореза с разделением препаратов клеточных мембран в ПААГ (в первач направлении) в присутствии додсцнлсульфата натрия. Для улучшения разрешающей способности этого метода в гель второго направления вносили 1.25% пененного детергента тритон Х-100. Электрофореграмма второго направления (рис. I) показывает, что из всего спектра биополимеров внешней мембраны штамма А. ЬгааНепза Эр 7 (3-форма), полученные Ат практически выявляют только фракции, которые принадлежат полисахариднкм

Л

I

Рис. I. Двумерный имцуноэлектрофореэ препарата наружных мембран А. ЬгазИепае Зр 7 (Б-форма): в первом направлении - в ПААГ в присутствии ДСН, во втором -в агарозном геле с гомологичными Ат в присутствии тритона Х-100.

компонентам. Их идентификация в качестве О-антигена проведена на основе специальных электрофоретичгских эксперимент« с препаратом ЛПБК-2.

Предварительно можно предположить, что белки крови иммунизированных животных вступают в реакции со свободными функциональными группами глутарового альдегида и экранируют чужеродные для данного организма белки меточной поверхности иммунизирующих бактерий. Благодаря такому экранирования, вероятно, иммунный ответ на белковые антигены ослабляется и создаются условия для предпочтительного иммунного ответа на углеводные антигены. Более обоснованная трактовка данного феномена требует, конечно, проведения специальных исследований.

2. Сравнительный серологический анализ штаммов азоспирилл.

Сравнительное серологическое исследование ряда типовых штаммов азоспирилл проводили методами дот-анализа целых клеток и иммуноди^рузии. При этом использовали Ат, полученные к углеводным антигенам клеток (см. выие). На рис. 2 приведены результаты иммунодот-анализа -итаммсв двух видов азоспирилл с помощью гомологичных Дт, выявляемых комплексом протеин А + КЗ (непрямое мечение). Рис. 2 показывает, что подученные Ат обладают выраженной видовой и штаммовой специфичностью. Четкие перекрестные реакции, сравнимые с прямыми редакциями по интенсивности окрашивания мест связывания Ат антигенами клеточной поверхности, наблюдаются для ятаммов Л. ЬгазНепзе ар 107 и ^р 245 . Аналогичные перекрестные реакции для данных итаммов наблюдали при использовании иммуно-диффузионного метода. Эти лтаммы были выделены из корней пшеницы и отличаются тем, что один был получен в полевых условиях (£р 245) , а другой (^р 107) - в лабораторных (Ва1-(1ьп1 ог а!., 1900) . Не исключено, что дополнительные исследования могут привести к заключению об идентичности данных шта"мов по целому ряду фенотипических признаков. Приведенные результаты согласуются с данными из литературы, полученными методами иммунофлуоресценции и агглютинации.

о

о

\ О

О

а

U

'О

.U

л-

.Л

1

2

а б в где Зис. 2. Дот-анализ целых клеток (а-е) с гомологичными Лт (I-б), меченными конъюгатом протеин А + КЗ, для ятаммов: A.lipoferum Зр 59b (а, I); A.brasilenae Зр 107 (б, 2); Л.Ьгазileriso JU 125 А2 (в, 3); A.braailenae Зр 7 (3-форма - г, 4); А.ЬгааНепзо Sp 7 (R-форма - д, 5); Л.ЬгазИепае Зр 245 (е, б).

I. Антигенные свойства изолированных полисахаридных компонентов азоспирилл.

Мы провели эксперименты, позволяющие сравнить антиген-[ы!1 состав полисахаридов, выделенных из капсульного материа-[а, с таковым для ЭПС и соматических антигенов (ЛПБК-1 и Т1БК-2). Устансыено, что антигенные компоненты некоторых из (еречисленных препаратов состоят, как минимум, из двух фрак-;ий и, кроме того, имеют близкие значения электрофоретичес-:оЯ подвиулости (рис. 3). Данные, полученные методом двойней :><мунодиффулии, показачи полную идентичность антнгешогх де-'ерминант исследуемых препаратов (рис. 4). Это наило подт-ерждение в экспериментах по двойному перекрестному иммуно-лектрофоречу (рис. 5) и слитному ракетному иммуноэлектрофо-Г;1у (риз. С).

■и

1

1 I

V

ф

\\

\\

ф 1/

.3-

■»v

Рис. 3. Линейный иыцуноэлектрофорез ЛПЕК-2 (I), ЗДС (2) и капсульного полисахарида (3) А.ЪгавИепае Эр 7, 3-форма.

• (2: '3 а $ ■."'3; 'ч4

з® 3

г ф

I •

Рис. 4. Сравнительны!! анализ ЭПС (2), калсульного

полисахарида (3) и ЛПБК-2 (4) А.ЬгааНепав Зр .? (з-форма) методом двойной радиальной имцунодиффузин с антителами к целым нлеткзл (I).

16.

4 Z

ne. б. Двойной перекрестный иимуноэлектрофорез препаратов ЭПС (2) и ЛПБК (4).

rht* *

i •

3 ' • _4 2 Z

!îc. 6. Статный ракетный швауноэлоктрсфорзэ прэпаратов сПС (2), ЛПЕХ-1 (3) и ЛПБК-2 (4).

Следовательно, соматический 0-антиген имеет аналогичные иммунодетерминантные участки как с капсульным полисахаридом, так и с ЭПС. Учитывая, что согласно данным работы Бабердиной с соавт. (1987), названные углеводсодержащие биополимеры имеют одинаковый моносахаридный состав, можно сделать вывод об отсутствии у з -формы а. brasilense Sp 7 специфического кап-сульного материала. По-видимому, капсула и ЭПС в данном случае представляют собой О-специфические фрагменты ЛПС, экскре-тируемые клеткой в культуралъную среду. Их идентификация в качестве капсулы или ЭПС зависит от прочности связи данных полисахаридов с поверхностью бактериальной клетки.

4. О химическом строении эпитопов О-антигенов s-варианта штамма Л. brasilense Sp 7.

ЛПС из наружной мембраны л.brasilense Sp 7 гетероге-нен, т.е. содержит разные по антигенному (см. Еыше) и химическому (Жемеричкин с соавт., 1989) составу фракции 0-спе",и-фических полисахаридов (0-ПС I, 0-ПС 2 и 0-ПС 3). Для оценки их иммунохимической активности оказалось возможным усовершенствовать традиционный метод, использующий эффект торможения процесса образования нерастворимых'комплексов Ат + ЛПС при добавлении' к их смеси различных "конкурентных" фракций 0-ПС с заранее известной структурой (Kabat, 1980) . При модификации данной процедуры использовали способность 0-ПС даже при относительно малых концентрациях ( < 2 мкг/мл') образовывать нерастворимые комплексы со специфическими Ат. Последние, таким образом, могут быть удалены из раствора, например, центрифугированием.

Растворы Ат заданной концентрации попеременно смешивали с растворами О-ПС I, 0-ПС 2 и О-ПС 3, содержащими одинаковые концентрации полисахарида. Оптимальное время инкубирования смеси Ат + О-ПС (примерно 2 часа) определяли предварительно в экспериментах по кинетике образования коллоидной взвеси нерастворимых иммунных комплексов с помощью спектротурбиди-метрическсго метода. После инкубирования указанной смеси нерастворимые комплексы Ат + О-ПС удаляли центрифугированием. Затем остясотеся в надосадке Ат, специфичные к изучаемому Аг (суммарному ЛПС с поверхности бактерий), определяли в реак-

I7>

,ии комплексообразования с ЛПС с помощью метода спектротур-идиметрии. Специальные эксперименты показали,что в данном лучае концентрацию нерастворимых иммунных комплексов ЛПС + т можно считать пропорциональной концентрации специфичных т. На рис. 7 приведены результаты определения массово-объ-мной концентрации М коллоидных частиц нерастворимых иммун-ых комплексов до истощения (данное значение принято за I) и осле истощения растворов Ат фракциями 0-ПС I, О-ПС 2 и '—ПС 3. Можно констатировать, что фракция 0-ПС 3 обладает пособностыо связывать максимальное количество Ат, специфич-ых к используемому антигену (ЛПС S -варианта A. braailen-е Sp 7).

Полученные результаты были сопоставлены с данными неза-исимого метода - ингибирования реакции преципитации в ага-озном геле (Pazur and Kelly, 1984) . В системе лунок, где в ачестве ингибитора использовали 0-ПС 3, чрезвычайно слабые олосц преципитации были обнаружены только'возле двух из тети лунок при максимальной концентрации ЛПС. В то же время, опытах с 0-ПС I и 0-ПС 2 при всех концентрациях ЛПС наблю-,али четкие линии преципитации. Отсюда можно сделать заклю-:ение, что фракция 0-ПС 3, состоящая из галактозы, рамнозы : галагстуроновоЯ кислоты (Кемеричкин с соавт., 1989), по-ви-.имому, содержит детерминантные участки, наиболее подходящие : активным центрам Ат, специфичных к ЛПС внешней мембраны спользованного штамма азоспирилл. Эта фракция с наибольшей ероятностью определяет иммунохимическуга специфичность ЛПС .анного микроорганизма.

Для фракции 0-ПС 3 провели сценку её валентности, т.е. реднего числа детерминантных групп в расчете на одну моле-улу Ат. Число мест связывания полисахаридной цепи с Ат ус-анавливали методом Кабота (Kaoat. 1900), определяя молярное 1тналение Лг/Ат в преципитате в зоне эквивалентности (макси-ума кривой осаждения). Анализ состава преципитата показал, :то отношение молярных концентраций 0-ПС и Ат составляет .риблизительно 1:6. Допуская, что оба активных центра Ат свя-аны с детерминантами полисахарида, можно получить, что в ^осматриваемой молекуле 0-ПС имеется 12 мест связывания с ■т.

О химическом строении иммунодоминянтннх участков (зпито-

Рис. 7. Относительные значения массово-объемной концентрации частиц нерастворимых комплексов Ж1С+Ат в зависимости от концентрации О-ПС при истощении растворов Ат фракциями О-ПС I (I), О-ПС 2 (2) и О-ПС 3 (3).

Рис. 8. Зависимость концентрации преципитата Ск в смеси

ЛПС + Ат от концентрации липополисахарида Слпс при добавлении моносахаридов: галактозы (I), рамнозы (2), глюкозы (3) и галаотуроновой кислоты (4) в сравнении с контролем (0) (неингибированные Ат) при концентрации моносахаридов ю-Ч

зв) ЛПС судили, исходя из опытов по торможению моносахари-ши реакции преципитации ЛПС + Ат. Получили сравнительную 1рактеристику ингибирующей активности четырех моносахаридов, :татки которых были обнаружены в составе ЛПС 3-формы л.Ьга-,1епае зр 7 : глюкозы, галактозы, галактуроновой кислоты и шнозы. Концентрацию преципитата Ск характеризовали по бел-т Ат. Полученные кривые осаждения приведены на рис. 8. Ус-шовлено, что по убыванию степени торможения иммунохимичес-IX реакций, моносахариды можно расположить в следующий ряд: алактоза, рамноза, глюкоза (кривые I, 2 и 3 на рис. 8). При ром галактуроновая кислота не оказывает заметного влияния 1 полноту осаждения иммунных комплексов.

3 качестве независимого метода использовали двойную ра-1альную иммунодиффузию. Обнаружено, что добавление к раст-эру Ат галактозы и рамнозы приводит к существенному ослаб-;нию линий преципитации по сравнению с контролем (без добав-гния моносахаридов). Таким образом, и в этих случаях эффектными ингибиторами для реакции между ЛПС з-формы л.Ьга-Непзе Зр 7 и Ат оказываются галактоза и рачноза, что, ловимому, свидетельствует об та доминирующей роли в составе <тигенных детерминант.

Отметим, что из десяти штаммов азоспирилл, изученных в хботе польских исследователей (С1гоиа ег ех., 1987) , галак-зза была обнаружена только у штамма Л.Ъгаз11епзо Ор 7. роме того, изучение лектин-связывающей активности клеток того же штамма показало, что галактозоспецифичный лектин гоит на втором месте после лектинов, специфичных к аминоса-*рам (Уа£о¿а-ЗЬв^ап et а1., 1938) , по эффективности взаи-эдействия с клеточной поверхностью. Таким образом, есть ос-твания считать, что именно остатки галактозы, вероятно, оп-гделяют серотип з-варианта а. ъ-изиешзс Зр 7.

, Влияние плазмидного состава на антигенные свойства клеточной поверхности бактерий.

Связь между плазмидным составом и структурой углеводных -¡тигенов клеточной поверхности д.Ьгаа11спзо исследовали 1 примере дикого штамма (¡¡-варианта) Зр 245 , используя его гсплазмидныЯ мутант (утративший плазмиды 85, 120 и 130 МДа) трздсконыпгант с рлзвр;аденной плазмидой 85 ?ДДа (мутанты

получены Е.И.Кацы с сотр.). Опыты по двумерному иммуноэлем рофореэу показали, что пики преципитации, соответствующие ЛПС исходного штамма (рис. 9, а), не выявляются в экспериментах с препаратами мембран его бесплазмидного мутанта (рис. 9, б). При этом возвращение плаэмиды 65 ВДа не приводит к восстановлению исходной йымуноэлектрофоретической ка£ тины (рис. 9, в). В то же время, на электрофореграммах, представленных на рис. 9, сохраняется относительно слабый пик преципитации, соответствующий "репперному" антигену (предположительно, белковой природы), характерному для всех трех микроорганизмов. Эксперименты по электрофоретическому разделению в ПААГ препаратов мембран исследуемых бактерий не обнаружили различий в макромолекулярном составе их липо-полисахаридных фракций: полученные электрофоретические спек тры ЛПС оказались практически идентичными.

V

ь

¿V-

/Г

.а ■

Рис. 9. Двумерный иммуноэлектрофорез препаратов наружных мембран А.ЪгавИепое Зр 245 дикого штамма (а), его спонтанного бесплазмидного мутанта (б) и трансконъюганта с возвращенной плазмидой 65 ЦДа (в)

Полученные результаты позволяют сделать следующие пред-[сложения. Электрофоретический анализ в ГЫ.чГ (в отличие от [ммунохимического анализа) но позволяет зарегистрировать избиения, происходящие с ЛПС после утраты клетками плаэмид, > силу того, что эти изменения, вероятно, выражаются в до-юльно тонких химических превращениях полисахаридных антиге-юв. Последние могут быть связаны с относительно небольшими ю размеру иммунодоминантными участками, не влияющими на интегральные молекулярные свойства, в частности, на электрофо->етическую подвижность и фракционный состав ЛПС, но радикаль-[ым образом меняющими эффективность взаимодействия антител ! О-специфическими полисахаридами.

Следует отметить, что уже накоплен определенный факти-[еский материал по генетике диссоциации л.ЬгазИепзе Зр 7, ¡Еидетельствующий о существенней роли плазмид (Матвеев с юавт., 1987). Поэтому представляется логичным использовать юлученные нами результаты для распространения анализа зави-:имости поверхностных свойств бактерий от их плазмидного со-¡тава на изучение молекулярно-генетических аспектов и—з .иссоциации азоспирилл. Кроме того, требуется, очевидно, рогести дополнительные исследования с трансконъюгантами А. газИепзе Зр 245 для более определенного суждения о лока-;изации генов (плазмида 120 или 130 МДа), ответственных за |бнаруженные особенности синтеза ЛПС данных бактерий.

В заверпение наиего рассмотрения заметим, что поверх-остные структуры почвенных бактерий, для которых отмечает-я наиболее четкое взаимодействие с клетками иммунной систе-ы подопытных животных, могут оказаться также и активными, посредниками" при реализации контактных взаимодействий икроорганизмов с растениями.

Б Ы В 0 Д Ы

I. На основе иммунохимического анализа развиты подходы изучению структуры клеточной поверхности почвенных азот-'иксируют.их бактерий рода АгоарХгИХа-л позволяющие оценить етерогенность их углеводных антигенов, получить сведения о имическоч строении иммунодоминантных участков липополиса-оридов бактерий и о рлиянин плазмидного состава на аитиген-ые смйстрч клеточной гюг><;рхности азоспирилл.

2. Установлено, что предварительная обработка клеточной поверхности глутаровым альдегидом обеспечивает преимущественный иммунный ответ на углеводные соматические антигены целых клеток азоспирилл и получение антисывороток с концентрацией моноспецифических антител, достаточной для реализации эффекта иммунопреципитации с целью выявления и анализа угле-водсодерясащих биополимеров в сложных смесях клеточных компонентов. Получаемые при этом антитела обнаруживают выраженнук видовую и гатаммовую специфичность.

3. Зарегистрирована антигенная идентичность при близких значениях электрофоретической подвижности макромолекул экзо-полисахаридов, капсульных и О-специфических полисахаридов s-варианта A.braailenae Sp 7 » что свидетельствует о вероятном отсутствии у данных клеток специфического калсульного материала. Есть основания считать, что внеклеточные полисахарида представляют собой О-антигенные фрагменты их липополисахари-дов, экскретируемые клетками в культуральнуга среду.

4. Показано, что иммуноспецифичность клеточной поверхности S -варианта А.-газИепве Sp 7 обусловлена, главным образом, фракцией.О-специфического полисахарида, которая состоит, судя по литературным данным, из галактозы, рамнозы и галактуроновой кислоты. Установлено, что на одну молекулу данной фракции приходится в среднем 12 детерминантных групп. Отмечено, что существенную роль в формировании структуры эпитопов, определяющих серотип S -варианта A.braailenae

Sp 7 , играют остатки галактозы.

5. Обнаружено, что особенности синтеза ЛПС клеточной' поверхности бактерий A.braailenae í¡p 245, влияющие на их взаимодействие с антителами, связаны с плазмидным составом.• Показано, что гены, определяющие эти особенности, локализованы в одной из двух плазмид - 120 или 130 ЦДа.

Основные положения диссертации изложены в следухгсих работах:

I. Бабердина И.В., Иванова (Матора) Л.Р., Шварцбурд Б.И., Матора A.B., Скворцов И.Ц., Игнатов В.В. Кислые экзо-полисахариды A.braailenae up 7 (--форма): Рыделение, очи-

стка и иммунохимия // Тез. докл. Всес. конф. «Химия и биохимия углеводов». — Тбилиси, 1987. — Пущино: ОНТИ НЦБИ АН СССР, 1987. — С. 160.

2. Шварцбурд Б. И., Щеголев С. 10., Матора Л. Ю., Игнатова Е. Н. О-антигенный состав клеточной поверхности бактерий A. brasilense Sp 7 // Тез. докл. Всес. конф. «Регуляция микробного метаболизма». — Пущино, 1989. — С. 22.

3. Богатырев В. А., Дыкман Л. А., Матора Л. 10., Шварцбурд Б. И. Твердофазный иммуноанализ с использованием коллоидного золота в серотипировании азоспирилл // Микробиология. — 1991. — 60, № 3. — С. 524—538.

4. Матвеев В. 10., Богатырев В. А., Дыкман Л. А., Матора Л. 10., Шварцбурд Б. И. Физико-химические свойства клеточной поверхности R- и S-вариантов штамма A. brasilense Sp 7 // Микробиология. — 1992. — В печати.

5. Bogatyrev V. A., Ivanova (Matora) L. Yu., Schwartsburjd В. I., Khlebtsov N. G. Use of colloidal gold in immunodot technique//Proc. of the 19th FEBS Meeting. — Rome, 1989. — P. 30.

6. Schwartsburd В. I., Matora L. Yu., Zhemerichkin D. A., Ignatov V. V. O-specific polysaccharides of Azospirillum brasilense Sp 7: immunochemical activity and structure of immunodominant sites // Proc. of the 5th European Carbohydrate Symposium. — Prague, 1989. — P. 69.

7. Matora L. Yu., Bogatyrev V. A., DykmanL. A., KatzyE. I., Schwartsburd В. I. Effect of plasmid content on cellsurface antigens of A. brasilense Sp 245 // Proc. of the 5th Int. Symp. on Nitrogen fixation with non-legumes. — Florense, Italy,

1990,— P. 97.

8. Schwartsburd В. I., Shchyogolev S. Yu., Matora L. Yu., Ignatov V. V. Cell surface carbohydrate antigens of soil nitrogen fixing bacteria of Azospirillum genus: immunochemical aspects // Proc. of the 6th Europ. Symp. on Carbohydrate chemistrv. — Heriot-Watt University. Edinburg, Scotland,

1991. —P. 18.

Подп. к печати 23.03.92. Формат 60x84 1/16. Объем 1,25 п. .1. Тираж 100. Заказ 188.

Ротапринт Саратовского СХИ им. Н. И. Вавилова, Саратов, пл. Революции, 1.