Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммунохимическая идентификация поверхностных структур Azospirillum brasilense, участвующих в реализации "социального" поведения бактерий

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Иммунохимическая идентификация поверхностных структур Azospirillum brasilense, участвующих в реализации "социального" поведения бактерий"

□ОЗ166951

На правах рукописи

ШИРОКОВ Александр Александрович

ИаШУНОХ&ШИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПОВЕРХНОСТНЫХ СТРУКТУР АгОБР/ЯИ-ШМ ВГгА511.ЕЫЗЕ, УЧАСТВУЮЩИХ В РЕАЛИЗАЦИИ «СОЦИАЛЬНОГО» ПОВЕДЕНИЯ БАКТЕРИЙ

03 00 07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов - 2008

1 6 ДПР 2009

003166951

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН)

Научный руководитель доктор биологических наук

Матора Лариса Юрьевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Богатырев Владимир Александрович

доктор биологических наук, профессор Эль-Регистан Галина Ивановна

Ведущая организация: Саратовский государственный

университет им. Н.Г. Чернышевского

Защита состоите? 23 апреля 2008 г в 14 00 на заседании

диссертационного совета Д 002 146 01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (410049, г Саратов, просп Энтузиастов, 13)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН Автореферат диссертации размещен на сайте http //www lbppm Saratov ru/obyav dis html

Автореферат разослан 22 марта 2008 г

Ученый секретарь диссертационного СОВСТЗ _ __

доктор биологических наук '/¡/^^ Никитина В Е

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы Одной из наиболее характерных черт современной микробиологии можно признать переход от традиционного представления о бактериях как строго одноклеточных организмах без выраженного социального поведения к представлению о микробных сообществах как целостных структурах, регулирующих свои поведенческие реакции в зависимости от изменения условий обитания (Грузина, 2003) Понятие «социальное поведение» активно используется современными исследователями при описании процессов и явлений, обеспечивающих выживание бактерий в неблагоприятных условиях (Олескин с соавт , 2000)

Работы по изучению различных форм кооперативного поведения микробов, а также инициирующих его внешних условий и поверхностных бактериальных структур, обеспечивающих реализацию той или иной формы поведения, представляются перспективными для понимания оперативного «искусства» выживания бактериальных видов в природных экосистемах

Бактерии рода Azospirdlum оказывают рост-стимулирующее влияние на растения (Okon and Vanderleyden, 1997) и широко используются исследователями как модельный объект при изучении эффектов микробно-растительной ассоциативности (Steenhoudt and Vanderleyden, 2000) Исследования последних нескольких лет показали, что для азоспирилл характерны несколько типов «социальной» активности, такие как образование бактериальных биопленок на границе раздела фаз, коллективное распространение в вязких средах с формированием концентрических колец роения и коллективная миграция в полужидких средах с образованием микроколоний (Кацы, 2007)

Формирование специфически организованных биопленок является1 очень распространенной формой существования бактерий в природных условиях, и наиболее активно этот феномен исследуется на примере патогенных бактерий (Хмель и Метлицкая, 2006, Kievit and Iglewski, 2000) Особенности процесса формирования биопленок почвенными бактериями, в том числе, бактериями рода Azospirillum, практически не исследованы Вместе с тем, можно предположить, что именно этот способ социальной активности позволяет обитателям почвы не только выживать в неблагоприятных экологических условиях, но и, в случае ассоциативных взаимоотношений с растениями, обеспечивает эффективное взаимодействие с корневой поверхностью

Известно, что при колонизации корней растений азоспириллы могут формировать микроколонии (Burdman et al, 2000) Очевидный интерес представляет исследование зависимости этого явления от способности изучаемых бактерий образовывать микроколонии (Grf фенотип) при коллективной миграции в полужидких средах (Шелудько и Кацы, 2001), а также выявление поверхностных структур, обеспечивающих реализацию такого типа «социального» поведения

Приспособление азоспирилл к различным условиям среды путем альтернативного запуска механизмов коллективного распространения в полужидких средах (роения или коллективной миграции с образованием микроколоний) может значительно повышать адаптивный ресурс данных бактерий (8с!1е1исГко е( а1, 2007) Поэтому заслуживает внимания поиск компонентов бактериальной поверхности, участвующих в определении способа коллективного поведения азоспирилл в средах, служащих прообразом пространства, окружающего корень растения

В целом, выявление поверхностных полимеров, необходимых для реализации того или иного типа социальной подвижности ассоциативных бактерий, в первую очередь, в прикорневой зоне растений, представляется весьма актуальной проблемой, решение которой может способствовать развитию современных агробактериальных технологий При этом развитие иммунохимических подходов, позволяющих оценивать роль компонентов бактериальной поверхности в осуществлении различных процессов с участием бактерий, является самостоятельным и актуальным методологическим аспектом исследования

Целью настоящей работы являлось выявление поверхностных структур АгоярпИит Ьгаш1еп:;е, участвующих в реализации различных типов «социальной» активности данных бактерий

Для реализации поставленной цели предстояло решить следующие задачи

1 Исследовать природу межклеточного биополимерного вещества, образуемого А ЬгаяЛете при формировании бактериальных биопленок на абиотических поверхностях и корнях пшеницы

2 Отработать методики на основе иммуноферментного анализа для оценки эффективности колонизации азоспириллами корней пшеницы и эффективности формирования биопленок на абиотических поверхностях

3 Исследовать иммунохимическую специфичность поверхностных иммуногенных белков А Ъгаьйете и оценить возможность выявления антигенов, характеризующих бактерии с определенным типом социальной активности

4 Изучить вклад полисахаридных и белковых антигенов в процесс коллективного распространения азоспирилл в полужидких средах и колонизации корней растений

5 Оценить изменения поверхностных структур А Ьгаз11ете при контакте с соединениями, способствующими смене у бактерий способа социальной подвижности

Научная новизна работы определяется ее следующими основными результатами

• Впервые выявлен белковый антигенный маркер, характеризующий бактерии А Ьгаэ11ете, коллективно мигрирующие с образованием микроколоний

• Впервые показано, что реализация описанного ранее механизма распространения азоспирилл с образованием микроколоний (Шелудько и Кацы, 2001) может обеспечивать в ризосфере заселение этими бактериями растущих корневых волосков

• Впервые иммунохимическими методами продемонстрировано взаимодействие витального красителя конго красного (приводящего к стабильному проявлению у бактерий фенотипа) с детерминантами липополисахаридов (ЛПС) азоспирилл

Практическая значимость работы в значительной степени определяется развитыми в ходе ее выполнения методическими приемами, позволяющими оценивать эффективность колонизации азоспириллами корней пшеницы и эффективность формирования биопленок на абиотических поверхностях, а также уровень экспрессии тех или иных поверхностных структур, необходимых для реализации определенного типа социальной подвижности Разработанный тест, основанный на точечной инокуляции бактерий в полужидкие агаризованные среды, содержащие антитела на ЛПС, может быть рекомендован для скрининга штаммов, демонстрирующих антигенные перекресты с модельными штаммами АюзртИит Ьга$11ете, и/или для отбора мутантов по структуре ЛПС

Материалы диссертации использованы при написании учебно-методического пособия «Методы изучения бактериальной подвижности в приложении к биохимическим, генетическим и иммунохимическим задачам» (Саратов Изд-во Научная книга, 2007 г)

Основные положения, выносимые на защиту

• Липополисахариды участвуют в структурной организации биопленок А Ьгахйепзе на границе раздела фаз «жидкость - твердая гидрофильная/гидрофобная поверхность» Прикрепление азоспирилл к абиотическим поверхностям сопровождается усилением синтеза поверхностных полисахаридных антигенов, изолирующих бактерии от окружающей среды

• В составе наружной мембраны штаммов А Ьга$11еюе Бр7 и Бр245 дикого типа выявляется видо/родоспецифичный белковый антиген, идентичный таковому Оп+-мутантов А Ьгазйете 8р245, распространяющихся с образованием микроколоний

• Усиление синтеза предсуществующих белковых поверхностных структур, вовлеченных в процесс микроколониального распространения азоспирилл, происходит в результате взаимодействия с корнями пшеницы

• Тест, основанный на точечной инокуляции бактерий в полужидкие агаризованные среды, содержащие антитела на ЛПС, может применяться для скрининга штаммов, демонстрирующих антигенные перекресты с модельными штаммами А Ьгазйете, и/или для отбора мутантов по структуре ЛПС

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены в виде устных и стендовых сообщений на 9-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2005), 2-м Агробиотехнологическом симпозиуме стран Балтии (Гамбург, Германия, 2006), Международной научной конференции «Микробные биотехнологии» (Одесса, Украина, 2006), 3-ей Региональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2006), Международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва-Пущино, 2006), Международной конференции «Ризосфера - 2» (Монпелье, Франция, 2007), Международной научной конференции «Микроорганизмы и биосфера» (Москва, 2007) и Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем» (Саратов, 2007)

Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании лаборатории физической химии клеточных структур ИБФРМ РАН 1 февраля 2008 года

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, описывающей материалы и методы исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка использованных источников, содержащего 160 источников, и двух приложений Работа изложена на 114 страницах машинописного текста, включает 23 рисунка и 2 таблицы

Работа выполнена в лаборатории физической химии клеточных структур ИБФРМ РАН в соответствии с плановыми темами НИР «Разработка эффективных тест-систем к антигенным структурам клеток микроорганизмов и растений» (№ гос регистрации 01890017743, научный руководитель зав лаб д х н , профессор Щеголев С Ю ) и «Комплексный иммунохимический анализ антигенных структур, определяющих ассоциативные взаимодействия микроорганизмов с растениями» (№ гос регистрации 01200606177, научный руководитель зав лаб д х н , профессор Щеголев С Ю ), а также в соответствии с планом НИР по проекту «Выяснение молекулярно-генетических механизмов взаимодействий микроорганизмов с растениями как основы для развития эффективных современных генно-инженерных, экологических, аграрных и иных биотехнологий» в рамках государственного контракта с Роснаукой № 02 445 11 7130 (ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002-2006 годы») (руководитель научной школы д б н, профессор Игнатов В В ) Работа поддержана фантами Президента РФ №№ НШ-1529 2003 4 и НШ-6177 2006 4 на поддержку молодых российских ученых и ведущих научных школ

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Обзор литературы состоит из следующих разделов 1 1 Понятие социальной активности бактерий, 1 2 Почвенные ассоциативные азотфиксирующие бактерии рода Azospirillum как объект исследований, 1 3 Молекулярные механизмы «ощущения кворума» (QS), 1 4 Формирование многоклеточных бактериальных образований, 1 4 1 QS-регуляция в многоклеточных образованиях (биопленках), 1 4 2 Роль матрикса в микробных колониях, 1 4 3 Факторы, влияющие на эффективность формирования многоклеточных ассоциаций

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Бактерии выращивали на синтетической малатной среде (Dobereiner and Day, 1976) при 30°С Полужидкая среда содержала 0 4 % агар-агара В некоторых случаях бактерии выращивали на среде LB (Sambrook et al, 1989)

Для получения антител (Ат), специфичных к соматическим антигенам бактерий, использовали методику иммунизации животных целыми бактериальными клетками, предварительно обработанными 2% глутаровым альдегидом (Матора с соавт, 1998)

Для получения Ат на весь пул поверхностных бактериальных антигенов кроликов иммунизировали путем инъекций в подколенные лимфатические узлы или множественных внутрикожных инъекций 1-го мл бактериальной суспензии, смешанной с равным объемом адъюванта Фрейнда, с четырьмя недельными интервалами

Использованные в работе Ат на флагеллин типового штамма A brasilense Sp7 были получены на высокоочищенные субъединицы полярного жгутика, разделенные с помощью электрофореза в ПААГ и извлеченные из геля путем специальной диффузии (Бурыгин, 2003)

Двойную иммунодиффузию проводили по стандартной методике (Ouchterlony and Nilsson, 1979)

Линейный и двумерный иммуноэлектрофорез проводили по Аксельсон с соавторами (Axelson et al, 1973) с помощью прибора «Multiphor II» (LKB, Швеция) Использовали 1%-ные агарозные гели, приготовленные на барбитал-глицин-Трис-буфере с ионной силой 0 02 и pH 8 8

ДСН-электрофорез (Hitchcock and Brown, 1983) проводили в 12 5% ПААГ Для визуализации белков гели окрашивали Кумасси R-250

При иммуноблоттинге проводили электроперенос разделенных компонентов на нитроцеллюлозные фильтры («Sigma», 0 22 мкм)

Для иммунодетекции антигенов в качестве первых Ат использовали кроличьи Ат на флагеллин типового штамма A brasilense Sp7 В качестве вторых Ат использовали козьи антикроличьи Ат, меченые пероксидазой хрена («Sigma», США) (Tsang et al, 1983)

Способность бактерий к формированию биопленок изучали согласно рекомендациям, приведенным в работе (Fernere and Clarke, 2003)

В экспериментах по инокуляции растений использовали мягкую яровую пшеницу Triticum aestivum cv Саратовская 29 Распределение бактериальных клеток на корнях определяли методом иммунолюминесценции Гомогенат отделенных корней трех растений использовали для определения численности бактерий методом подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ) и для иммуноферментного анализа с использованием Ат различной специфичности

Иммуноферментный анализ (ИФА) проводили в полистироловых 96-луночных планшетах Тестируемые соединения иммобилизовали за счет простой адсорбции В качестве ферментной метки использовали пероксидазу хрена, конъюгированную с козлиными анти-кроличьими антителами («Sigma», США) В качестве субстратного реагента использовали орто-фенилендиамин с перекисью водорода Измерения оптической плотности исследуемых проб проводили при длине волны 490 нм на иммуноферментном анализаторе АИФ-Ц-01С с последующей обработкой результатов с помощью программы ЛабАРМ (ЗАО ИЛИП, г Санкт-Петербург)

Микроскопический анализ характера взаимодействия Ат с поверхностью бактериальных клеток проводили на приборе «BS-500» («Tesla», ЧССР) при ускоряющем напряжении 80 кВ, используя в качестве метки конъюгат коллоидного золота с протеином А

Люминесцентную микроскопию проводили на микроскопе DAS фирмы Leica (модель DMLB), снабженным встроенным фотоаппаратом Leica MPS 60 (Швейцария)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Иммунохимическая идентификация поверхностных структур, участвующих в реализации социального поведения Azospirillum brasilense, предполагала использование Ат, специфичных в отношении различных биомакромолекул, экспонированных на наружной мембране исследуемых бактерий В настоящей работе использовали поликлональные кроличьи Ат

Для оценки роли ЛПС азоспирилл были использованы обладающие О-антигенной специфичностью Ат, полученные на обработанные глутаровым альдегидом клетки бактерий модельных штаммов A brasilense Sp7 и Sp245 С учетом моноспецифичности данных Ат в отношении ЛПС (Матора с соавт, 1998, 2005), полученные таким способом Ат мы обозначали также как «Ат на ЛПС», а определения «экстракт наружных бактериальных мембран» и «препарат

[ПС» в описании иммунохимических экспериментов с использованием этих Ат потребляли как синонимы

Для оценки роли Н-антигена полярного жгутика использовали Ат на изолированные субъединицы жгутика типового штамма А Ьгазйете Бр7 (Бурыгин, 2003) Для исследования роли поверхностных белковых антигенов нефлагеллиновой природы в работе были получены и охарактеризованы антитела на пул белковых антигенов наружной мембраны

Исследование специфичности иммуногенных белковых антигенов бактерий

А. Ьга$!1ете

Для оценки антигенной специфичности поверхностных иммуногенных белков азоспирилл были получены кроличьи поликлональные Ат на интактные клетки бактерий модельных штаммов А Ьгавйете Бр7 и 8р245, относящихся к различным серологическим группам согласно характеристикам их ЛПС или О-антигена (Матора с соавт, 2005) Кроликов иммунизировали суспензиями отмытых от капсулы клеток, вводя их внутрикожно или в подколенные лимфатические узлы Полученные Ат на интактные клетки, в отличие от О-специфических Ат на клетки, обработанные глутаровым альдегидом (Матора с соавт, 1998), обладали более широкой специфичностью и, наряду с О-антигеном, взаимодействовали с белками, входящими в состав наружной мембраны всех протестированных штаммов азоспирилл В то же время, у Ат на интактные клетки азоспирилл не было выявлено перекрестных реакций с препаратом флагеллина типового штамма А Ьгавйете Бр7 Последний результат « « щ согласовался со сделанным ранее наблюдением о наличии - чехла полисахаридной природы на поверхности полярного

А ^ жгутика азоспирилл (Бурыгин, 2003), который экранирует флагеллин жгутика, в том числе, и от иммунокомпетентных клеток

Анализ картины иммунопреципитации позволил выявить в составе наружной мембраны диких типов Бр7 и Бр245 не менее трех различных видо/родоспецифичных белковых антигенов (отличных от антигена полярного жгутика 4 или Н-антигена) (рис 1) Полученные результаты

свидетельствовали о консерватизме мажорных белков, 1 | 2 формирующих наружную мембрану азоспирилл, и позволили в дальнейшем использовать для перекрестного выявления белковых антигенов данных бактерий Ат на целые клетки серологически отличного штамма

Рис 1 Рез>тьтат линейного тппноэтектрофореза экстрактов нар\/кны\ мембран штаммов Ьп^Пете вр7 (1) и 8р245 (2) с антитетами на интактные клетки 8р7 (А)

Иммунохнмический анализ взаимодействия азоспирилл с абиотическими и биотическими поверхностями

Известно, что при росте бактерий в природных местах обитания, а также на абиотических поверхностях формируются биоплёнки - высокоупорядоченные бактериальные сообщества, которые позволяют бактериям жить в прикреплённом состоянии. С помощью ИФА, иммунодиффузионного анализа и иммунофлуоресцентной микроскопии с использованием Ат различной специфичности была исследована природа межклеточного биополимерного вещества, образуемого азоспириллами при прикреплении к стеклу, полистиролу и к поверхности корней растений. Работа выполнялась совместно с сотрудниками лаборатории генетики микроорганизмов и лаборатории физиологии растительной клетки ИБФРМ РАН.

Для определения антигенной природы биопленок, формируемых азоспириллами при прикреплении к гидрофильной поверхности, в качестве твердой фазы использовали покровные стекла, которые выдерживали в течение 4-х суток (96 ч) в бактериальной суспензии, осторожно отмывали ЗФР, инкубировали в растворе соответствующих кроличьих выявляющих Ат, а затем в растворе ослиной анти-кроличьей люминесцирующей сыворотки. Образованные в процессе непрямого мечения комплексы просматривали с помощью люминесцентного микроскопа. Использование Ат на ЛПС (в отличие от Ат на белковые детерминанты) приводило к выявлению в препаратах ярко светящихся структур на темном поле, что служило доказательством образования иммунных комплексов (рис. 2).

ШШЖШШ'ШЩШ ШЖШМтШШШШШШ' ттшт^шмтшт ШМ.......1......КК ж . . «в#

Рис. 2. Результат иммунофлуоресцентной микроскопии биопленки, сформированной .-(. ЬгазИепзе $р245 на поверхности стекла. Для выявления антигенов использованы Ат на ЛПС (А) и родоспецифичные Ат на белковые детерминанты (Б). Для сравнения в нижнем ряду приведены изображения, полученные в проходящем свете. Длина масштабной линейки 100 мкм.

Следовательно, межклеточный матрикс, формируемый азоспириллами при фикреплении к гидрофильной поверхности (по меньшей мере, его кспонированный слой) имеет полисахаридную природу и содержит антигенные етерминанты, идентичные детерминантам ЛПС

Для анализа биопленок, формируемых на гидрофобной поверхности полистироле) штаммом A brasilense Sp245 и его мутантами с измененной труктурой ЛПС, был использован метод иммуноферментного анализа 18-асовые культуры бактерий в LB разводили стерильной средой, вносили успензии в ячейки полистирольных планшетов и инкубировали без стряхивания в течение 96 ч при 30°С По окончании культивирования планктонные бактерии удаляли аспирацией, и ячейки планшетов осторожно промывали водой Иммуноферментный анализ сформированных бактериями биопленок проводили непосредственно в лунках данных планшетов Параллельно проводили ИФА планктонных бактериальных культур, выращенных на жидкой среде LB, а также оценивали выраженность бактериальных пленок, образуемых на поверхности пластика, с использованием красителя кристаллического фиолетового (Fernere and Clarke, 2003)

Было установлено, что общее количество полисахаридных антигенов в биопленках, образуемых на гидрофобной поверхности диким штаммом Sp245 и его мутантами, дефектными по синтезу одного из двух характерных для дикого типа О-специфических полисахаридов - 0-ПС1, различается несущественно В то же время планктонные клетки 0-ПС1" мутантов взаимодействовали в ИФА с антителами менее эффективно, чем штамм дикого типа С учетом примерно равного количества биомассы в пленках, формируемых штаммом дикого типа и мутантами, можно предположить, что при взаимодействии с твердой поверхностью в клетках О-ПСГ мутантов активируется синтез полисахаридов

Общее количество полисахаридных детерминант, продуцируемых 0-ПС2" мутантом, как бульонной культуре, так и в биопленках, было значительно выше, чем у других штаммов Однако и у данного мутанта при взаимодействии с твердой гидрофобной поверхностью можно было наблюдать усиление продукции полисахаридных антигенов

Очевидно, что дефект синтеза каждого из О-ПС исследованных бактерий компенсируется повышением уровня продукции других ПС, принимающих участие в образовании биопленки При этом продолжительный контакт с гидрофобной поверхностью приводит к активизации синтеза полисахаридных детерминант

Таким образом, было показано, что липополисахариды (О-антигены) участвуют в структурной организации биопленок азоспирилл на границе раздела фаз «жидкость - твердая гидрофильная/гидрофобная поверхность» При этом прикрепление азоспирилл к абиотическим поверхностям сопровождается усилением синтеза поверхностных полисахаридных антигенов, изолирующих бактерии от окружающей среды

Иммунофлуоресцентная микроскопия корней растений, инокулированных

А. ЬгаьИете 8р245

С помощью иммунофлуоресцентной микроскопии был исследован характер экспрессии поверхностных антигенов А. ЬгавИете Бр245 в процессе прикрепления бактерий к поверхности корней проростков пшеницы.

Результаты иммуномечения показали, что, в отличие от контакта с абиотическими поверхностями, взаимодействие с поверхностью растительного корня приводит к экспрессии как полисахаридных, так и белковых поверхностных антигенов. Однако характер выявления данных антигенов существенно различался. В то время как Ат на ЛПС выявляли скопления бактериальных клеток и сформированную пленку на поверхности корней и корневых волосков (рис. ЗА), Ат на белковые детерминанты выявляли исключительно клеточные агрегаты (рис. ЗБ). При этом картина иммунофлуоресценции в части выявления скоплений бактериальных клеток в случае использования Ат на ЛПС заметно отличалась от таковой с использованием Ат на белковые детерминанты. В первом случае немногочисленные клеточные агрегаты тесно прилегали к поверхности корневых волосков, оплетая их (рис. ЗА), и, очевидно, отсоединялись от поверхности корня в ходе растяжения клетки волоска. В то время как в последнем случае флуоресценция агрегатов носила диффузный характер (рис. ЗБ).

Я_ Следует подчеркнуть, что

наблюдаемая картина была характерной [ щ^Ш - для седьмых суток, прошедших с ■Щ момента инокуляции корней I НЕ бактериями. Анализ полученных В результатов (с учетом среднего времени жизни одного корневого волоска - 24 аШл-'.- ] часа), позволил высказать

р? ' 1 предположение, что заселению

' растущих корневых волосков 4 - " азоспириллами может способствовать

реализация описанного ранее механизма ■гш-пгдг"-' - - -— - -■-■-:-тг ми» распространения с образованием -:'микроколоний (Шелудько и Кацы, 2001).

% . Тогда как распространение исследуемых

бактерий по поверхности собственно Ь ■ КМфР! корня (и, в значительно меньшей

рИЯЯИВ^И!^^^^^^^^^^^^ степени. ^ по поверхности корневых

Рис. 3. Результат иммунофлуоресцентной микроскопии корней пшеницы, инокулированных А. ЬгазИепзе 5р245. Для выявления антигенов использованы Ат на ЛПС (А) и родоспецифичные Ат на белковые детерминанты (Б). Длина масштабной линейки 100 мкм.

ГЦ 1 ■ щ

«

« ■ ^ЯиЯНдН .^Р®^* — 1

■

- ' • ■ рИШ

Выявление белкового антигена, характеризующего вп+фенотип бактерий А. Ьгаьйете

Коллективная миграция с образованием зернистых скоплений бактерий (микроколоний) - так называемый, Сп+-тип подвижности - является одним из проявлений социальной активности бактерий рода АгоэрпНит (Шелудько и Кацы, 2001) Этот способ колониальной подвижности реализуется у мутантов азоспирилл, неспособных к роению в полужидких средах за счет вращения полярного жгутика, а также у диких штаммов под влиянием ряда факторов окружающей среды (Шелудько с соавт, 2006, Кацы, 2007)

Для выявления у азоспирилл антигена, характеризующего бактерии с вп' фенотипом, был проведен сравнительный иммунохимический анализ белковых антигенов, выделенных из наружной мембраны дикого штамма А Ьгазйете Бр245 и его Оп+-мутанта БК048 Для выявления антигенов использовали Ат на интактные клетки штамма А Ьгазйете Бр7

Было установлено, что только один из родоспецифичных белковых антигенов азоспирилл А

идентичен таковому Оп+-мутанта, распространяющегося с образованием микроколоний (рис 4)

С помощью иммуноферментного анализа сравнили общее количество белковых детерминант, синтезируемых планктонной культурой дикого типа Бр245, с общим количеством белковых детерминант планктонной культуры его вп^-мутанта Примерно одинаковый уровень выявления данных детерминант позволил сделать вывод о сверхпродукции белкового антигена, характерного для мутантного штамма ^ - 2

Для подтверждения возможности означенного антигена являться маркером ОгГ фенотипа у азоспирилл, провели серию экспериментов с использованием витального красителя конго красного Выбор данного агента был обусловлен тем, что его адсорбция на клеточной поверхности азоспирилл приводит к стабильному проявлению у бактерий способности к распространению в полужидкой среде с образованием микроколоний (Шелудько с соавт, 2006) '-

Рис 4 Результат сравнительного линейного иммуноэлектрофореза белковых антигенов нар>/Кной мембраны птанктонной к>льт\ры дикого штамма 4 Ьгаикпзе Бр245 (1) и Оп+-чутанта ЬК048 (2) с родоспецифичными Ат на белковые детерминанты

Смену способа коллективной подвижности клеток модельного штамма в полужидкой среде, содержащей краситель (переход от роения к бгГ-подвижности), наблюдали визуально, уровень экспрессии белковых антигенов оценивали посредством ИФА. идентификацию Оп-антигена в образцах проводили с помощью двумерного иммуноэлектрофореза

По результатам ИФА, переход к Оп+-типу подвижности дикого штамма 8р245 в присутствии конго красного сопровождался выявлением на поверхности его клеток на 30% больше белковых детерминант по сравнению с клетками, выращенными на полужидкой среде без красителя

В ходе двумерного иммуноэлектрофореза экстрактов наружных мембран клеток Бр245, распространяющихся в полужидкой среде с помощью роения (1) и мигрирующих с образованием микроколоний (11) в сравнении с экстрактом наружных мембран Сп+-мутанта БК048 (111) Ат на белковые детерминанты выявили один и тот же мажорный антиген в составе двух последних препаратов

Для точной классификации данного белка представляется необходимым проведение в дальнейшем соответствующих биохимических и электронно-микроскопических экспериментов Вместе с тем, полученные к настоящему времени результаты дали основание рассматривать антиген белковой природы, экспрессируемый бактериями, мигрирующими с образованием микроколоний, в качестве антигенного маркера Оп+ фенотипа азоспирилл

Количественная оценка участия поверхностных антигенных детерминант в колонизации штаммом А. Ьтъйете Бр245 корней пшеницы

Использованный в предыдущих экспериментах витальный краситель конго красный, приводящий к проявлению у азоспирилл способности к распространению с образованием микроколоний, может имитировать действие определенных компонентов поверхности корней растений (Кацы, 2007) Настоящий раздел работы был посвящен количественной оценке уровня синтеза поверхностных антигенных детерминант клетками штамма Бр245 при колонизации корней пшеницы Работа выполнялась совместно с сотрудниками лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН

Для получения количественных оценок участия поверхностных антигенов азоспирилл в процессе колонизации корней пшеницы были оптимизированы условия проведения твердофазного ИФА Тестируемыми образцами в данном случае являлись гомогенаты корней инокулированных растений Экспериментально были выбраны оптимальные разведения образцов, дающие достоверные результаты при проведении сравнительного ИФА Анализ результатов титрования антигена позволил производить разведение проб (те гомогенатов корней 3-х растений в 1 мл забуференного фосфатами физраствора) в 80 раз Концентрация выявляющих антител составляла 50 мкг/мл С учетом необходимых повторностей (до 8-ми), в одном эксперименте анализировали до 40 различных проб Данные, полученные с помощью ИФА, соотносили с результатами подсчета КОЕ

Результаты, полученные с помощью ИФА с использованием Ат на ЛПС, продемонстрировали хорошую корреляцию с результатами подсчета КОЕ (рис 5) и позволили прийти к заключению о возможности применения

оптимизированного протокола ИФА для количественной оценки колонизации азоспириллами корней пшеницы.

" З-ХДНйВНЫ* проросгкя. Зч

Н!ОС11*.'ШШ С 13Х&ГКШИ

шюкунфсвэыин?

клаками

1па-' блшш С

Рис. 5. Определение количества бактериальных липополисахаридных детерминант в гомогенатах корней растений, инокулированных А. ЬгазИепзе Бр245 с помощью ИФА с использованием Ат на ЛПС А. Ьгаз11епзе Бр245 (А), коррелирующее с результатами подсчета КОЕ (Б).

Результаты ИФА с использованием Ат на белковые антигены показали, что динамика выявления данных детерминант отлична от липополисахаридных. Если количество выявляемых ЛПС-детерминант достигало максимума к 3 ч и снижалось через 7 суток более чем в 2 раза (что коррелировало со снижением численности бактерий по результатам подсчета КОЕ), то количество выявляемых белковых детерминант при этом не уменьшалось, а, напротив, увеличивалось (в пересчете на количество бактерий (рис. 6).

Полученные данные вкупе с микроскопии инокулированных корней растений позволили предположить, что в процессе взаимодействия с корнями пшеницы у азоспирилл происходит усиление синтеза предсуществующих белковых поверхностных структур -возможно, пилей, обеспечивающих Оп -тип подвижность.

Это предположение

подтверждалось результатами

экспериментов по колонизации корней пшеницы ОгГ-мутантами штамма 8р245. Будучи выращенными на бульонной культуре, клетки этих мутантов и дикий тип Бр245 демонстрировали близкий уровень выявления липополисахаридных детерминант. На этапе адсорбции липополисахаридные детерминанты в

результатами

иммунофлуоресцентной

* З-хайаиы.

«КЧДШВИИ;;

цкртпс

пимлицхчшнще

.•¿1.245 Ч.'ДПС

Хр2.|5 Ль Б

Рис. 6. Определение количества бактериальных липополисахаридных и белковых детерминант в гомогенатах корней растений, инокулированных А. Ьга$Иеп$е Бр245 с помощью ИФА с использованием родоспецифичных Ат на белковые (Ат/Б) и Ат на ЛПС Аг.

составе образцов (гомогенатов корней) выявлялись в несколько раз лучше в случае инокуляции диким типом Бр245 по сравнению с мутантами - что говорило об определяющей роли полярного жгутика (не функционирующего у Сп+-мутантов) на данном этапе колонизации Однако на более поздних этапах колонизации (7 суток) именно для Оп+-мутантов было характерно существенное нарастание количества прикрепившихся клеток, что, вероятно, объяснялось участием пилей

Следовательно, антиген белковой природы, характерный для клеток А Ъгаъйете, распространяющихся в составе микроколоний, участвует в заселении корней пшеницы данными бактериями Усиление его синтеза, очевидно, может быть вызвано как взаимодействием азоспирилл с некими (пока неизвестными) компонентами корней растений, так и препятствиями любого рода, возникающими при распространении бактерий в вязких средах

Исследование коллективной подвижности бактерий А. ЬгаьПепье в полужидких средах, содержащих антитела различной специфичности

Чтобы выяснить, меняется ли коллективное поведение азоспирилл при создании препятствий их распространению в вязких средах, мы использовали оригинальный подход, основанный на добавлении Ат на различные детерминанты бактериальной поверхности в полужидкую синтетическую среду для культивирования (которую с некоторым допущением можно рассматривать как аналог среды обитания бактерий) Мы оценивали влияние на коллективную подвижность Ат, взаимодействующих с флагеллиновыми, с общим пулом белковых, а также с липополисахаридными детерминантами бактерий рода А:озрт11ит

Известно, что на поверхности полярного жгутика модельных штаммов азоспирилл обнаруживается чехол (липо)полисахаридной природы, и добавление к клеточной суспензии штаммоспецифичных Ат на ЛПС приводит к ингибированию подвижности бактерий в жидких средах Для штамма А Ьгахйете 5р245, являющегося объектом нашего исследования, было показано, что материал чехла жгутика иммунохимически идентичен одному из О-специфических полисахаридов (0-ПС1) (Бурыгин, 2003) Нам предстояло выяснить, насколько полно полисахаридный чехол экранирует флагеллин, и не происходит ли смещения чехла при движении бактерий в вязкой среде

Добавление Ат на флагеллин в полужидкую среду не изменяло характер распространения тестируемых штаммов и практически не сокращало диаметр кольца роения бактерий (рис 7), что говорило о надежной экранированности флагеллина полярного жгутика у азоспирилл

Ат на белковые детерминанты незначительно, но достоверно сокращали диаметр зоны распространения клеток Бр245 в полужидкой агаризованной среде Однако характер их распространения не изменялся, и бактерии в присутствии данных Ат формировали концентрические кольца роения

Рис. 7. Характер коллективной подвижности клеток А. ЬгазИепяе 5р245 в полужидких средах в присутствии Ат на флагеллин (Ат/Яа), на белковые детерминанты (Ат/Б) и на ЛПС (Ат/ЛПС).

Антитела к ЛПС значительно снижали скорость распространения азоспирилл, и способ распространения бактерий изменялся с увеличением концентрации Ат. На рис. 7 можно видеть, что добавление штаммоспеиифичных Ат на ЛПС в полужидкую среду до конечной концентрации 5-^7 мкг/мл приводило к появлению во фронте распространения одиночных микроколоний, однако бактериальная популяция сохраняла способность к роению. В то время как при концентрации Ат 10-И 00 мкг/мл колонии формировались только на поверхности агара, а в толще полужидких сред распространение бактерий блокировалось полностью.

Вероятно, Ат к ЛПС, будучи добавленными в среду распространения бактерий до концентрации 10 мкг/мл, начинали создавать препятствия (возможно, стерического характера) для вращения полярного жгутика, и дальнейшее увеличение концентрации данных Ат полностью блокировало любой тип коллективной подвижности.

Учитывая, что Ат на белковые детерминанты (взаимодействующие с собственно бактериальной поверхностью) даже в больших концентрациях лишь сокращали диаметр зоны роения бактерий, мы полагаем, что смена способа коллективного распространения азоспирилл в присутствии Ат на ЛПС является, в частности, следствием возникновения затруднений вращения полярного жгутика, в результате чего у бактерий в полужидких средах может индуцироваться СгГ фенотип.

Следует также отметить, что в настоящей работе была оценена возможность практического использования эффекта ингибирования подвижности азоспирилл в присутствии Ат на ЛПС и разработан тест, основанный на точечной инокуляции бактерий в агаризованные среды со специфическими Ат, предложенный к применению для скрининга штаммов, демонстрирующих антигенные перекресты с модельными штаммами А. ЬгааНгте, и/или для отбора мутантов по структуре ЛПС.

Иммунохимичеекий анализ ЛПС бактерий А. ЬгазНепэе 8р245, выращенных в присутствии конго красного

Несомненный интерес представляла регистрация изменений, происходящих с ЛПС азоспирилл при контакте с природными соединениями, предположительно, способствующими смене у части бактерий способа коллективной подвижности. Но, поскольку гомогенаты/экссудаты корней растения представляют собой сложную многокомпонентную систему, оправданным было использование конго красного для оценки возможных вариаций бактериальных ЛПС.

Были оценены изменения, происходящие с ЛПС А. ЬгаэПете Бр245 при их росте на среде, содержащей данный краситель. В экспериментах использовали клетки дикого типа Бр245 и мутантов этого штамма с измененной структурой ЛПС. Для подавления роения бактерий и проявления у них вгГ фенотипа краситель добавляли в полужидкую культуральную среду до концентрации 37.5 мкг/мл. Антигенные структуры сравнивали с помощью линейного иммуноэлектрофореза с использованием штаммоспецифичных Ат на ЛПС.

Было установлено, что выращивание бактерий в присутствии конго красного изменяет картину иммунопреципитации их ЛПС и приводит к выявлению дополнительных иммунных комплексов (рис. 8).

КМШ КМ 13* км°1® Ш252:1

¡КМЗ«к ..,.Р»|3<)К Шв1вк Шы252*

Рис. 8. Картина иммунопреципитации препаратов ЛПС дикого штамма А. Ьгаэ^епэе 5р245. его 0-ПСГ- мутантов КМ348 и КМ252 и 0-ПС2~-мутантов КМ139 и КМ018. Буквой «к» обозначены препараты, выделенные из бактерий, выращенных в полужидкой среде с добавлением конго красного (37.5 мкг/мл). Для выявления антигенов использовали Ат на ЛПС 5р245.

Результаты линейного иммуноэлектрофореза показали, что данный краситель связывается с некими детерминантами в составе исследуемых препаратов, что приводит к формированию структур, обладающих катодной подвижностью При этом основная масса красителя при электрофорезе двигалась независимо от ЛПС, в результате чего можно было наблюдать окрашенные треки, имеющие характерную форму ракеты и направленные в сторону анода

Сравнение картин иммунопреципитации ЛПС дикого штамма Бр245 и его мутантов с измененной структурой ЛПС показало, что дополнительные полосы появляются как у 0-ПСГ-, так и у 0-ПС2 -мутантов Поскольку выявляемые новые иммунные агрегаты нельзя было однозначно охарактеризовать как полосы преципитации (исключение составлял лишь ЛПС КМ 134), мы предположили, что конго красный может образовывать прочные комплексы с липидной или с коровой областью ЛПС азоспирилл Возможно, блокирование красителем именно этих детерминант в составе ЛПС Бр245 делает невозможным (или затрудняет) роение клеток, вследствие чего индуцируется бп* фенотип

Следует отметить, что полученные результаты хорошо согласовались с данными Конновой с соавт (1994) о комплексообразовании конго красного с липополисахарид-белковыми комплексами и с полисахаридами, выделенными из полисахарид-липидных комплексов ряда штаммов А Ьгазйете, а также полученными в настоящей работе результатами сравнительного спектроскопического анализа свободного и адсорбированного на поверхности бактериальных клеток красителя (пик поглощения света красителем сдвигался в последнем случае в длинноволновую область на 19±2 нм (примерно от 490 до 510 нм)

Таким образом, в настоящей работе впервые иммунохимическими методами удалось выявить взаимодействие витального красителя конго красного с детерминантами ЛПС азоспирилл и зафиксировать сопряженное с этим событием усиление синтеза белковых структур, являющихся, по нашему предположению, маркерами Оп+ фенотипа у азоспирилл

Поскольку данное соединение имитирует действие неких компонентов поверхности корней растений, изменяющих социальное поведение азоспирилл, полученные результаты могут способствовать раскрытию молекулярных механизмов взаимовыгодных отношений ассоциативных азоспирилл с растениями

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Примененные и развитые в настоящей работе иммунохимические приемы (в частности, варианты иммуноферментного анализа для определения специфических антигенных детерминант в составе бактериальных биопленок, количественных оценок колонизации азоспириллами корней растений, оригинальный тест, основанный на точечной инокуляции исследуемых бактерий в полужидкие агаризованные среды с антителами различной специфичности и

др) позволили идентифицировать поверхностные структуры, участвующие в реализации различных форм социального поведения почвенных ассоциативных бактерий Агозр1п11ит Ьгаьйете

Наиболее значимым результатом работы представляется выявление способа социального поведения азоспирилл, дающего им возможность заселять корневые волоски растений На основе полученных экспериментальных данных сформулировано предположение о том, что именно реализация описанного ранее механизма распространения азоспирилл с образованием микроколоний (Кацы, 2007) обеспечивает в ризосфере заселение азоспириллами растущих корневых волосков Тогда как распространение исследуемых бактерий по поверхности собственно корня, преимущественно, происходит в составе биопленок

С помощью иммуноферментного и иммунодиффузионного анализа и иммунофлуоресцентной микроскопии исследована природа межклеточного биополимерного вещества, образуемого азоспириллами при формировании бактериальных биопленок на абиотических поверхностях и корнях пшеницы Для модельного штамма А Ьгазйете Бр245 установлено, что материал, экстрагированный из биопленок, как и капсульный материал, антигенно идентичен одному из О-специфических полисахаридов, входящих в состав ЛПС данного штамма

Выявленное в работе усиление синтеза полисахаридных антигенов, сопровождающее прикрепление азоспирилл к абиотическим поверхностям, очевидно, имеет защитный характер В то время как биопленка на поверхности растительных корней, кроме защитных функций, может обеспечивать также пассивный способ распространения иммобилизованных в ней бактерий по растущему корню

Анализ полученных результатов позволил предположить существование следующей стратегии поведения азоспирилл в ризосфере

• при контакте с поверхностью корня происходит формирование многоклеточных бактериальных образований, изолированных от окружающей среды полисахаридным матриксом,

• бактериальные биопленки, тесно прилегающие к растительной ткани, растягиваются по поверхности корня в процессе его роста,

• при изменении влажности среды у части популяции может возвращаться способность к роению, которое, в свою очередь, при определенных условиях сменяется Оп-подвижностью

Переход от роения к йп-подвижност является как следствием возникновения затруднений для вращения полярного жгутика, так и результатом взаимодействия неких компонентов корней растений (а также соединений, имитирующих их действие) с консервативной областью ЛПС наружной мембраны бактерий Представляется весьма вероятным, что макромолекулы ЛПС выполняют ключевую роль (среди контактных структур) в определении способа коллективного поведения бактерий АюзртЦит Ьганйете в

полужидких/вязких средах, которые обычно возникают в пространстве, окружающем корень растения

В составе наружной мембраны диких типов серологических различных модельных штаммов A brasilense Sp7 и Sp245 выявлен белковый антиген, идентичный таковому Сг1+-мутантов, распространяющихся с образованием микроколоний Полученные результаты дали основание рассматривать этот видо/родоспецифичный антиген белковой природы, экспрессируемый бактериями, мигрирующими с образованием микроколоний, в качестве антигенного маркера Gri+ фенотипа азоспирилл

Выявленное в работе усиление синтеза данного маркерного белка азоспирилл при взаимодействии бактерий с корнями пшеницы хорошо согласуется с литературными данными и, в частности, с результатами, полученными в работе Башан и Леванони (Bashan and Levanony, 1989) Имеются основания полагать, что продемонстрированное этими авторами существенное силение адсорбции клеток A brasilense Cd на поверхности корневых волосков юсле предобработки азоспирилл корневыми экссудатами обеспечивается именно экспрессией у бактерий Gri+ фенотипа

Исследование коллективного распространения азоспирилл в полужидких редах в присутствии антител на различные детерминанты клеточной юверхности позволило получить свидетельства вклада выявленного ранее Бурыгин, 2003) полисахаридного чехла полярного жгутика в реализацию одвижности данных бактерий Последний методический прием может быть екомендован в качестве серологического теста для использования в икробиологических лабораториях, не оснащенных специальным борудованием и реактивами для иммунохимических экспериментов

Полученные в работе результаты могут способствовать более полному юниманию молекулярных механизмов взаимовыгодных отношений ссоциативных бактерий с растениями, а также развитию соответствующих гробактериальных технологий

ВЫВОДЫ

1 Иммунохимический анализ с использованием антител, специфичных в отношении различных биомакромолекул, экспонированных на наружной мембране Azospirillum brasilense, позволил качественно и количественно охарактеризовать вклад полисахаридных и белковых антигенов в осуществление коллективной миграции азоспирилл в вязких средах, их роль в процессах образования бактериальных биопленок на границе раздела фаз и распространения в полужидких средах с образованием зернистых скоплений бактерий (микроколоний)

2 Показано, что липополисахариды (О-антигены) участвуют в структурной организации биопленок Azospirillum brasilense на границе раздела фаз «жидкость - твердая гидрофильная/гидрофобная поверхность»

Установлено, что прикрепление азоспирилл к абиотическим поверхностям сопровождается усилением синтеза поверхностных полисахаридных антигенов, изолирующих бактерии от окружающей среды

3 В составе наружной мембраны штаммов A brasilense Sp7 и Sp245 дикого типа выявлено не менее трех видо/родоспецифичных белковых антигенов, отличных от Н-антигена полярного жгутика Обнаружено, что только один из этих антигенов идентичен таковому вп^-мутантов A brasilense Sp245, распространяющихся с образованием микроколоний

4 Показано, что в процессе взаимодействия с корнями пшеницы происходит усиление синтеза предсуществующих белковых поверхностных структур, вовлеченных в процесс микроколониального распространения азоспирилл и являющихся антигенными маркерами Gri+ фенотипа у данных бактерий

5 Впервые иммунохимическими методами продемонстрировано взаимодействие витального красителя конго красного (приводящего к стабильному проявлению у бактерий Gn+ фенотипа) с детерминантами ЛПС азоспирилл

6 Показано, что разработанный тест, основанный на точечной инокуляции бактерий в полужидкие агаризованные среды, содержащие антитела на ЛПС, может применяться для скрининга штаммов, демонстрирующих антигенные перекресты с модельными штаммами Azospirillum brasilense, и/или для отбора мутантов по структуре ЛПС

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Бурыгин ГЛ, Широков А А, Шелудько АВ, Кацы ЕИ, Щеголев СЮ, Матора Л Ю Выявление чехла на поверхности полярного жгутика Azospirilhim brasilense // Микробиология - 2007 - T 76, № 6 - С 822-829

2 Методы изучения бактериальной подвижности в приложении к биохимическим, генетическим и иммунохимическим задачам / Сост А В Шелудько, Е И Кацы, Л Ю Матора, Г Л Бурыгин, А А Широков, С Ю Щеголев, под ред В В Игнатова Учеб метод пособие для студентов и аспирантов хим и биол факультетов - Саратов Изд-во Научная книга, 2007 - 56 с

3 Широков А А , Шелудько А В , Бурыгин Г Л , Кацы Е И , Панасенко В И , Матора Л Ю, Щеголев С Ю Исследование влияния антител различной специфичности на подвижность бактерий Azospirilhim brasilense в жидких и агаризованных средах // Сб тр 9-й Международной Пущинской школы-конф молодых ученых «Биология - наука XXI века» - Пущино, Россия, 1822 апреля 2005 г - С 222

4 Matora L Yu, Burygin G L , Shirokov A A , Krasov A A Immunochemical detection and enumeration of bacteria in the environment // Abst The Second Baltic Sea Region Symposium agro-biotechnology focused on root-microbe systems — Hamburg, February 25-March 3, 2006, Germany - P 38

5 Бурыгин Г JI, Широков А А , Шелудько А В , Соколова M К , Соколов О И , Плешакова Е В , Кацы Е И , Щеголев С Ю , Матора Л Ю Специфическое выявление бактерий в почве и на корнях растений // Тези доповщей М1жнародна наукова конфернцш «Мжробш бютехнолопп» - Одеса, Украша, 11-15 вересня 2006 - С 40

6 Кулибякина О В , Шелудько А В , Петрова Л П , Широков А А , Матора Л Ю, Кацы Е И Роль липолисахаридов Azospirillum brasilense в формировании биопленок // Матер 3-ей регион конф молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 10-12 октября 2006 г) - Саратов Изд-во «Научная книга» - С 15

7 Шелудько А В , Широков А А , Кулибякина О В , Петрова Л П , Хлебцов Б H , Соколова M К , Матора Л Ю , Кацы Е И Изменения в социальной активности и взаимодействие Azospirillum brasilense с проростками Triticum aestivum cv II Там же - С 18

8 Широков А А, Шелудько А В, Кулибякина О В, Матора Л Ю Использование иммунохимических подходов в исследовании роли липополисахаридов бактерий Azospirillum brasilense в реализации социального поведения бактерий//Там же - С 30

9 Петрова Л П , Шелудько А В , Широков А А , Матора Л Ю , Кацы Е И Генетическая гетерогенность и изменения структуры клеточной поверхности в популяциях Azospirillum brasilense II Материалы межд школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» - Москва-Пущино, 28 ноября-1 декабря 2006 г - С 70

10 Burygin G , Shirokov А , Krasov А , Shchyogolev S , Matora L Immunochemical revealing of soil and rhizosphere bacteria // Abstr Intern Conference «Rhizosphere-2» - Montpellier, France, August 26-31, 2007 - P 79

11 Шелудько А В , Тугарова А В , Широков A A , Пономарева E Г, Никитина В E , Антонюк Л П , Матора Л Ю , Кацы Е И Внешние факторы, влияющие на социальную активность стимулирующих рост растений бактерий рода Azospirillum // Сб матер Междунар науч конф «Микроорганизмы и биосфера» - Москва, 19-20 ноября 2007 г - С 149

12 Широков А А , Шелудько А В , Бурыгин Г Л , Кацы Е И , Щеголев С Ю , Матора Л Ю Антигенные структуры бактерий рода Azospirillum, участвующие в реализации их социальной активности // Сб матер Всеросс конф с междунар участием «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем» (Саратов, 25-27 сентября 2007 г ) -Саратов Научная книга, 2007 - С 37

13 Шелудько А В , Широков А А , Кулибякина О В , Пономарева Е Г , Тугарова А В, Никитина В Е, Антонюк Л П, Матора Л Ю, Кацы Е И Внутрипопуляционные и внешние факторы, определяющие изменения в социальной активности Azospn ilium brasilense И Там же - С 42

Подписано в печать 17 03 20С8

Отпечатано с готового оригинал-макета в ИБФРМ РАН 410049, Саратов, пр Энтузиастов, 13

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Широков, Александр Александрович

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.1.

1.1. Понятие социальной активности бактерий.

1.2. Почвенные ассоциативные азотфиксирующие бактерии рода Azospirillum как объект исследований.

1.3. Молекулярные механизмы «ощущения кворума» (QS).

1.4. Формирование многоклеточных бактериальных образований

1.4.1. QS-регуляция в многоклеточных образованиях (биопленках).

1.4.2. Роль матрикса в микробных колониях.

1.4.3. Факторы, влияющие на эффективность формирования многоклеточных ассоциаций

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Бактериальные штаммы, условия выращивания бактерий и использованные реактивы.

2.2. Иммунизация животных и получение антител.

2.3. Реакция агглютинации

2.4. Препараты наружных мембран.

2.5. Двойная иммунодиффузия

2.6. Иммуноэлектрофорез.

2.7. Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле и иммуноблотинг.

2.8. Оценка способности бактерий к формированию биопленок

2.9. Инокуляция растений бактериями.

2.10. Иммуноферментный анализ (вариант ELISA)

2.11. Иммуноэлектронная микроскопия

2.12. Иммунолюминесцентная микроскопия бактериальных биопленок и корней растений, инокулированных A. brasilense

Глава 3. Результаты и обсуждение.

3.1. Исследование специфичности иммуногенных белковых антигенов бактерий A. brasilense.

3.2. Иммунохимический анализ взаимодействия азоспирилл с абиотическими и биотическими поверхностями.

3.2.1. Исследование антигенного пула биопленок, образуемых бактериями A. brasilense при контакте с абиотическими поверхностями.

3.2.2. Иммунофлуоресцентная микроскопия корней растений, инокулированных A. brasilense Sp245.

3.3. Выявление белкового антигена, характеризующего Оп+-фенотип бактерий A. brasilense.

3.4. Количественная оценка участия поверхностных антигенных детерминант в колонизации штаммом A. brasilense Sp245 корней пшеницы.

3.5. Исследование коллективной подвижности бактерий A. brasilense в полужидких средах, содержащих антитела различной специфичности.

3.6. Иммунохимический анализ ЛПС бактерий A. brasilense Sp245, выращенных в присутствии конго красного.

3.7. Возможность практического использования эффекта ингибирования подвижности азоспирилл в присутствии анти-ЛПС антител.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Иммунохимическая идентификация поверхностных структур Azospirillum brasilense, участвующих в реализации "социального" поведения бактерий"

Одной из наиболее характерных черт современной микробиологии можно признать переход от традиционного представления о бактериях как строго одноклеточных организмах без выраженного социального поведения к представлению о микробных сообществах как целостных структурах, регулирующих свои поведенческие реакции в зависимости от изменения условий обитания (Грузина, 2003). Понятие «социальное поведение» активно используется современными исследователями при описании процессов и явлений, обеспечивающих выживание бактерий в неблагоприятных условиях (Олескин с соавт., 2000).

Работы по изучению различных форм кооперативного поведения микробов, а также инициирующих его внешних условий и поверхностных бактериальных структур, обеспечивающих реализацию той или иной формы поведения, представляются перспективными для понимания оперативного «искусства» выживания бактериальных видов в природных экосистемах.

Бактерии рода Azospirillum оказывают рост-стимулирующее влияние на растения (Okon and Vanderleyden, 1997) и широко используются исследователями как модельный объект при изучении эффектов микробно-растительной ассоциативности (Steenhoudt and Vanderleyden, 2000). Исследования последних нескольких лет показали, что для азоспирилл характерны несколько типов «социальной» активности, такие как образование бактериальных биопленок на границе раздела фаз, коллективное распространение в вязких средах с формированием концентрических колец роения и коллективная миграция в полужидких средах с образованием микроколоний (Кацы, 2007).

Формирование специфически организованных биопленок является очень распространенной формой существования бактерий в природных условиях, и наиболее активно этот феномен исследуется на примере патогенных бактерий (Хмель и Метлицкая, 2006; Kievit and Iglewski, 2000). Особенности процесса формирования биопленок почвенными бактериями, в том числе, бактериями рода Azospirillum, практически не исследованы. Вместе с тем, можно предположить, что именно этот способ социальной активности позволяет обитателям почвы не только выживать в неблагоприятных экологических условиях, но и, в случае ассоциативных взаимоотношений с растениями, обеспечивает эффективное взаимодействие с корневой поверхностью.

Известно, что при колонизации корней растений азоспириллы могут формировать микроколонии (Burdman et al., 2000). Очевидный интерес представляет исследование зависимости этого явления от способности изучаемых бактерий образовывать микроколонии при коллективной мигрирации в полужидких средах (Шелудько и Кацы, 2001), а также выявление поверхностных структур, обеспечивающих реализацию такого типа «социального» поведения.

Приспособление азоспирилл к различным условиям среды путем альтернативного запуска механизмов коллективного распространения в полужидких средах (роения или коллективной миграции с образованием микроколоний) может значительно повышать адаптивный ресурс данных бактерий (Schelud'ko et al., 2007). Поэтому заслуживает внимания поиск компонентов бактериальной поверхности, участвующих в определении способа коллективного поведения азоспирилл в средах, служащих прообразом пространства, окружающего корень растения.

В целом, выявление поверхностных полимеров, необходимых для реализации того или иного типа социальной подвижности ассоциативных бактерий, в первую очередь, в прикорневой зоне растений, представляется весьма актуальной проблемой, решение которой может способствовать развитию современных агробактериальных технологий. При этом развитие иммунохимических подходов, позволяющих оценивать роль компонентов бактериальной поверхности в осуществлении различных процессов с участием бактерий, является самостоятельным и актуальным методологическим аспектом исследования.

Целью настоящей работы являлось выявление поверхностных структур Azospirillum brasilense, участвующих в реализации различных типов «социальной» активности данных бактерий.

Для реализации поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

1. Исследовать природу межклеточного биополимерного вещества, образуемого A. brasilense при формировании бактериальных биопленок на абиотических поверхностях и корнях пшеницы.

2. Отработать методики на основе. иммуноферментного анализа для оценки эффективности колонизации азоспириллами корней пшеницы и эффективности формирования биопленок на абиотических поверхностях.

3. Исследовать иммунохимическую специфичность поверхностных иммуногенных белков A. brasilense и оценить возможность выявления антигенов, характеризующих бактерии с определенным типом социальной активности.

4. Изучить вклад полисахаридных и белковых антигенов в процесс коллективного распространения азоспирилл в полужидких средах и колонизации корней растений.

5. Оценить изменения поверхностных структур A. brasilense при контакте с соединениями, способствующими смене у бактерий способа социальной подвижности.

Научная новизна работы.

В работе впервые удалось показать, что реализация описанного ранее механизма распространения азоспирилл с образованием микроколоний (Шелудько и Кацы, 2001) обеспечивает в ризосфере заселение этими бактериями растущих корневых волосков. Впервые выявлен белковый антигенный маркер, характеризующий бактерии A. brasilense, коллективно мигрирующие с образованием микроколоний, а также впервые иммунохимическими методами продемонстрировано взаимодействие витального красителя конго красного (приводящего к стабильному проявлению у бактерий Gri-фенотипа) с детерминантами липополисахаридов (ЛПС) азоспирилл.

Практическая значимость работы в значительной степени определяется развитыми в ходе ее выполнения методическими приемами, позволяющими оценивать эффективность колонизации азоспириллами корней пшеницы и эффективность формирования биопленок на абиотических поверхностях, а также уровень экспрессии тех или иных поверхностных структур, необходимых для реализации определенного типа социальной подвижности. Разработанный тест, основанный на точечной инокуляции бактерий в полужидкие агаризованные среды, содержащие антитела на ЛПС, может быть рекомендован для скрининга штаммов, демонстрирующих антигенные перекресты с модельными штаммами А. brasilense, и/или для отбора мутантов по структуре ЛПС.

Материалы диссертации использованы при написании учебно-методического пособия «Методы изучения бактериальной подвижности в приложении к биохимическим, генетическим и иммунохимическим задачам» (Саратов: Изд-во Научная книга, 2007 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

• Липополисахариды участвуют в структурной организации биопленок А. brasilense на границе раздела фаз «жидкость — твердая гидрофильная/гидрофобная поверхность». Прикрепление азоспирилл к абиотическим поверхностям сопровождается усилением синтеза поверхностных полисахаридных антигенов, изолирующих бактерии от окружающей среды.

• В составе наружной мембраны штаммов A. brasilense Sp7 и Sp245 дикого типа выявляется видо/родоспецифичный белковый антиген, идентичный таковому Gri+-мутантов A. brasilense Sp245, распространяющихся с образованием микроколоний.

• Усиление синтеза предсуществующих белковых поверхностных структур, вовлеченных в процесс микроколониального распространения азоспирилл, происходит в результате взаимодействия с корнями пшеницы.

• Тест, основанный на точечной инокуляции бактерий в полужидкие агаризованные среды, содержащие антитела на ЛПС, может применяться для скрининга штаммов, демонстрирующих антигенные перекресты с модельными штаммами A. brasilense, и/или для отбора мутантов по структуре ЛПС.

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены в виде устных и стендовых сообщений на 9-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2005); 2-м Агробиотехнологическом Симпозиуме стран Балтии (Гамбург, Германия, 2006); Международной научной конференции «Микробные биотехнологии» (Одесса, Украина, 2006); 3-ей Региональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2006); Международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва-Пущино, 2006); Международной конференции «Ризосфера - 2» (Монпелье, Франция, 2007); Международной научной конференции «Микроорганизмы и биосфера» (Москва, 2007) и Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем» (Саратов, 2007).

Работа выполнена в лаборатории физической химии клеточных структур ИБФРМ РАН в соответствии с плановыми темами НИР «Разработка эффективных тест-систем к антигенным структурам клеток микроорганизмов и растений» (№ гос. регистрации 01890017743, научный руководитель зав. лаб. д.х.н., профессор Щеголев С.Ю.) и «Комплексный иммунохимический анализ антигенных структур, определяющих ассоциативные взаимодействия микроорганизмов с растениями» (№ гос. регистрации 01200606177, научный руководитель зав. лаб. д.х.н., профессор Щеголев С.Ю.), а также в соответствии с планом НИР по проекту «Выяснение молекулярно-генетических механизмов взаимодействий микроорганизмов с растениями как основы для развития эффективных современных генно-инженерных, экологических, аграрных и иных биотехнологий» в рамках государственного контракта с Роснаукой № 02.445.11.7130 (ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002-2006 годы») (руководитель научной школы д.б.н., профессор Игнатов В.В.). Работа поддержана грантами Президента РФ №№ НШ-1529.2003.4 и НШ-6177.2006.4 на поддержку молодых российских ученых и ведущих научных школ.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Широков, Александр Александрович

ВЫВОДЫ

1. Иммунохимический анализ с использованием антител, специфичных в отношении различных биомакромолекул, экспонированных на наружной мембране Azospirillum brasilense, позволил качественно и количественно охарактеризовать вклад полисахаридных и белковых антигенов в осуществление коллективной миграции азоспирилл в вязких средах; их роль в процессах образования бактериальных биопленок на границе раздела фаз и распространения в полужидких средах с образованием зернистых скоплений бактерий (микроколоний).

2. Показано, что липополисахариды (О-антигены) участвуют в структурной организации биопленок Azospirillum brasilense на границе раздела фаз «жидкость - твердая гидрофильная/гидрофобная поверхность». Установлено, что прикрепление азоспирилл к абиотическим поверхностям сопровождается усилением синтеза поверхностных полисахаридных антигенов, изолирующих бактерии от окружающей среды.

3. В составе наружной мембраны штаммов A. brasilense Sp7 и Sp245 дикого типа выявлено не менее трех видо/родоспецифичных белковых антигенов, отличных от Н-антигена полярного жгутика. Обнаружено, что только один из этих антигенов идентичен таковому Оп+-мутантов A. brasilense Sp245, распространяющихся с образованием микроколоний.

4. Показано, что в процессе взаимодействия с корнями пшеницы происходит усиление синтеза предсуществующих белковых поверхностных структур, вовлеченных в процесс микроколониального распространения азоспирилл и являющихся антигенными маркерами Gri-фенотипа у данных бактерий.

5. Впервые иммунохимическими методами продемонстрировано взаимодействие витального красителя конго красного (приводящего к стабильному проявлению у бактерий Gri-фенотипа) с детерминантами ЛПС азоспирилл.

6. Показано, что разработанный тест, основанный на точечной инокуляции бактерий в полужидкие агаризованные среды, содержащие антитела на ЛПС, может применяться для скрининга штаммов, демонстрирующих антигенные перекресты с модельными штаммами Azospirillum brasilense, и/или для отбора мутантов по структуре ЛПС.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Примененные и развитые в настоящей работе иммунохимические приемы (в частности, варианты иммуноферментного анализа для определения специфических антигенных детерминант в составе бактериальных биопленок, количественных оценок колонизации азоспириллами корней растений; оригинальный тест, основанный на точечной инокуляции исследуемых бактерий в полужидкие агаризованные среды с антителами различной специфичности и др.) позволили идентифицировать поверхностные структуры, участвующие в реализации различных форм социального поведения почвенных ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense.

Наиболее значимым результатом работы представляется выявление способа социального поведения азоспирилл, дающего им возможность заселять корневые волоски растений. На основе полученных экспериментальных данных сформулировано предположение о том, что именно реализация описанного ранее механизма распространения азоспирилл с образованием микроколоний (Кацы, 2007) обеспечивает в ризосфере заселение азоспириллами растущих корневых волосков. Тогда как распространение исследуемых бактерий по поверхности собственно корня, преимущественно, происходит в составе биопленок.

С помощью иммуноферментного и иммунодиффузионного анализа и иммунофлуоресцентной микроскопии исследована природа межклеточного биополимерного вещества, образуемого азоспириллами при формировании бактериальных биопленок на абиотических поверхностях и корнях пшеницы. Для модельного штамма A. brasilense Sp245 установлено, что материал, экстрагированный из биопленок, как и капсульный материал, антигенно идентичен одному из О-специфических полисахаридов, входящих в состав ЛПС данного штамма.

Выявленное в работе усиление синтеза полисахаридных антигенов, сопровождающее прикрепление азоспирилл к абиотическим поверхностям, очевидно, имеет защитный характер. В то время как биопленка на поверхности растительных корней, кроме защитных функций, может обеспечивать также пассивный способ распространения иммобилизованных в ней бактерий по растущему корню.

Анализ полученных результатов позволил предположить существование следующей стратегии поведения азоспирилл в ризосфере:

• при контакте с поверхностью корня происходит формирование многоклеточных бактериальных образований, изолированных от окружающей среды полисахаридным матриксом;

• бактериальные биопленки, тесно прилегающие к растительной ткани, растягиваются по поверхности корня в процессе его роста;

• при изменении влажности среды у части популяции может возвращаться способность к роению, которое, в свою очередь, при определенных условиях сменяется Gri-подвижностью.

Переход от роения к Gri-подвижности является как следствием возникновения затруднений для вращения полярного жгутика, так и результатом взаимодействия неких компонентов корней растений (а также соединений, имитирующих их действие) с консервативной областью ЛПС наружной мембраны бактерий. Представляется весьма вероятным, что макромолекулы ЛПС выполняют ключевую роль (среди контактных структур) в определении способа коллективного поведения бактерий Azospirillum brasilense в полужидких/вязких средах, которые обычно возникают в пространстве, окружающем корень растения.

В составе наружной мембраны диких типов серологических различных модельных штаммов A. brasilense Sp7 и Sp245 выявлен белковый антиген, идентичный таковому Оп+-мутантов, распространяющихся с образованием микроколоний. Для точной классификации данного белка необходимо проведение в дальнейшем соответствующих биохимических и электронномикроскопических экспериментов. Вместе с тем, полученные результаты дали основание рассматривать этот видо/родоспецифичный антиген белковой природы, экспрессируемый бактериями, мигрирующими с образованием микроколоний, в качестве антигенного маркера Gri-фенотипа азоспирилл.

Выявленное в работе усиление синтеза данного маркерного белка азоспирилл при взаимодействии бактерий с корнями пшеницы хорошо согласуется с результатами, полученными ранее в работе (Bashan and Levanony, 1989). Имеются основания полагать, что продемонстрированное данными авторами усиление адсорбции клеток A. brasilense Cd на поверхности корневых волосков после предобработки азоспирилл корневыми экссудатами обеспечивается именно экспрессией у бактерий Gri-фенотипа.

Исследование коллективного распространения азоспирилл в полужидких средах в присутствии антител на различные детерминанты клеточной поверхности позволило получить свидетельства вклада выявленного ранее (Бурыгин, 2003) полисахаридного чехла полярного жгутика в реализацию подвижности данных бактерий. Последний методический прием может быть рекомендован в качестве серологического теста для использования в микробиологических лабораториях, не оснащенных специальным оборудованием и реактивами для иммунохимических экспериментов.

Полученные в работе результаты могут способствовать более полному пониманию молекулярных механизмов взаимовыгодных отношений ассоциативных бактерий с растениями, а также развитию соответствующих агробактериальных технологий.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Широков, Александр Александрович, Саратов

1. Баканчикова Т.И., Мякиньков А.Г., Павлова-Иванова Л.К., Майсурян А.Н. Участие генов хемотаксиса в установлении ассоциативных взаимоотношений между Azospirillum brasilense и пшеницей // Молекуляр. генетика. 1989. - №4. - С. 24-32.

2. Борисов И.В. Генетический анализ вариаций в подвижности и поверхностных структурах ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense: Автореф. дис. канд. биол. наук . Саратов, 2004. — 23 с.

3. Бурыгин Г.Л. Сравнительное исследование О- и Н-антигенов почвенных бактерий рода Azospirillum: Автореф. дис. канд. биол. наук.1. Саратов, 2003. 22 с.

4. Бурыгин Г.Л., Широков А.А., Шелудько А.В., Кацы Е.И., Щеголев С.Ю., Матора Л.Ю. Выявление чехла на поверхности полярного жгутика Azospirillum brasilense // Микробиология. 2007. — Т. 76, № 6.- С. 822-829.

5. Грузина В.Д. Коммуникативные сигналы бактерий // Антибиотики и химиотерапия. 2003. - Т. 48, № 10. - С. 32-39.

6. Кацы Е.И. Молекулярная генетика ассоциативного взаимодействия бактерий и растений / Под. ред. В.В. Игнатова. М.: Наука, 2007. - 86с.

7. Кацы Е.И. Молекулярно-генетические процессы, влияющие на ассоциативное взаимодействие почвенных бактерий с растениями / Под. ред. В.В. Игнатова. Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2003. - 172 с.

8. Кацы Е.И. Молекулярно-генетический анализ ассоциативного взаимодействия бактерий и растений // Молекулярные основы взаимоотношений ассоциативных микроорганизмов с растениями / Под ред. В.В. Игнатова. М.: Наука, 2005. С. 17-45.

9. Кацы Е.И., Борисов И.В., Шелудько А.В. Влияние интеграции вектора pJFF350 в 85-МДа плазмиду Azospirillum brasilense Sp245 на жгутикование и подвижность бактерий // Генетика. — 2001. — Т. 37, №2. -С. 183-189.

10. Коннова С.А., Скворцов И.М., Макаров О.Е., Игнатов В.В. Свойства полисахаридных комплексов, продуцируемых Azospirillum brasilense, и получаемые из них полисахаридов // Микробиология. —1994. —Т. 63(2). -С. 1019-1030.

11. Матвеев В.Ю., Петрова Л.П., Журавлева Е.А., Панасенко В.И. Особенности диссоциации в культурах Azospirillum brasilense Sp7 // Мол. генет., микробиол. вирусол. 1987. - № 8. - С. 16-18.

12. Матора Л.Ю., Бурыгин Г.Л., Щеголев С.Ю. Исследование иммунохимической гетерогенности липополисахаридов Azospirillum brasilense // Микробиология. 2008. - Т. 77, № 2. - С. 1-5.

13. Матора Л.Ю., Серебренникова О.Б., Петрова Л.П., Бурыгин Г.Л., Щеголев С.Ю. Нетипичный характер R-S диссоциации Azospirillum brasilense II Микробиология. 2003. - Т. 72, №1. - С. 60-63.

14. Матора Л.Ю., Шварцбурд Б.И., Щеголев С.Ю. Иммунохимический анализ О-специфических полисахаридов почвенных азотфиксирующих бактерий Azospirillum brasilense II Микробиология. — 1998. — Т. 67. С. 815-820.

15. Матора Л.Ю., Щеголев С.Ю. Антигенная идентичность липополисахаридов, капсулы и экзополисахаридов Azospirillum brasilense 11 Микробиология. 2002. - Т. 71, №2. - С. 211 -214.

16. Николаев Ю.А., Плакунов В.К. Биопленка — "город микробов" или аналог многоклеточного организма? // Микробиология. — 2007. — Т. 76, №2.-С. 149-163.

17. Новик Г.И., Высоцкий В.В. Архитектоника популяций бифидобактерий: субмикроскопический аспект когезии клеток Bifidobacterium adolescentis и Bifidobacterium bifidum II Микробиология. 1995. - Т. 64, № 2. - С.222-227

18. Олескин А.В., Ботвинко И.В., Цавкелова Е.А. Колониальная организация и межклеточная коммуникация у микроорганизмов // Микробиология. 2000. - Т. 69, № 3. - С. 309-327.

19. Павлова И.Б., Куликовский А.В., Ботвинко И.В., Джентемирова К.М., Дроздова т.И. Электронно-микроскопическое исследование развития бактерий в колониях. Морфология колоний бактерий // Журн. Микробиол. Эпидемиол. Иммунобиол. 1990. — № 12. - С. 15-20.

20. Позднякова Л.И., Каневская С.В., Леванова Г.Ф., Барышева Н.Н., Пилипенко т.Ю., Богатырев В.А., Федорова Л.С. Таксономическое изучение азоспирилл, выделенных из злаков Саратовской области //

21. Микробиология. 1988. - Т. 57, №2. - С. 275-278.

22. Сафронова И.Ю., Ботвинко И.В. Межклеточный матрикс Bacillus subtilis 271: полимерный состав и функции // Микробиология. — 1998. -Т.67, № 1. С.55-60.

23. Стендифер Д.К. Иммуноферментный анализ гаптенов и антигенов с разделением компонентов (гетерогенный анализ) // Иммуноферментный анализ. Ред. Иго Т.Т., Ленхофф Г.М.: Мир, 1988. -С. 172-192.

24. Федоненко Ю.П., Егоренкова И.В., Коннова С.А., Игнатов В.В. Участие липополисахаридов азоспирилл во взаимодействии с поверхностью корней пшеницы // Микробиология. 2001. - Т. 70, № 3.- С. 384-390.

25. Феофилова Е.П. Трегалоза, стресс и анабиоз // Микробиология. — 1992.1. Т.61, № 5. С.739-753.

26. Хмель И.А., Метлицкая А.З. QUORUM SENSING регуляция экспрессии генов- перспективная мишень для создания лекарств против патогенности бактерий // Молекулярная биология. — 2006. — Т. 40. №2. -С. 195-210.

27. Шелудько А.В., Борисов И.В., Крестиненко В.А., Панасенко В.И., Кацы Е.И. Влияние конго красного на подвижность бактерий Azospirillum brasilense II Микробиология. — 2006. Т. 75, № 1. - С. 6269.

28. Шелудько А.В., Кацы Е.И. Образование на клетке Azospirillum brasilense полярного пучка пилей и поведение бактерий в полужидком агаре // Микробиология. 2001. - Т. 70, №5. - С. 662-667.

29. Шелудько А.В., Кацы Е.И., Остудин Н.А., Грингауз O.K., Панасенко В.И. Новые классы мутантов Azospirillum brasilense с дефектами в сборке и функционировании полярного и латеральных жгутиков // Мол. генет. микробиол. вирусол. 1998. - №4. - С. 33-37.

30. Agarwala-Dutt R., Tilak K.V.B.R., Rana J.P.S. Isolation of Azospirillum from interior of various parts of some graminaceous plants // Z. Mikrobiol. — 1991.-V.146.-P. 217-219.

31. Ahmer B.M.M. 2004. Cell- to- cell signaling in Esherichia coli and Salmonella enteric // Mol. Microbiol. V.52. - P. 933-945.

32. Alexandre G., Rohr R., Bally R. A phase variant of Azospirillum brasilense lacks a polar flagellum and constitutively expresses mechanosensing lateral flagella // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - V. 65. - P. 4701-4704.

33. Axelson N.H., Kroll J., Weeke B. A manual of quantitative immunoelectrophoresis, methods and applications // Scand. J. Immunol. — 1973.-V. 2. — Suppl. 1.

34. Baldani V.L.D., Baldani J.I., Dobereiner J. Effects of Azospirillum inoculation on root infection and nitrogen incorporation in wheat // Can. J. Microbiol. 1983. - V. 29. - P. 924-929.

35. Baldani V.L.D., Baldani J.I., Dobereiner J. Inoculation of field-grown wheat {Triticum aestivum) with Azospirillum sp. // Brasil. Biol. Fertil. Soils. -1987.-V. 4.-P. 37-40.

36. Baldani V.L.D., Dobereiner J. Host-plant specificity in the infection of cerals with Azospirillum spp. // Soil Biol. Biochem. 1980. - V. 12. - P. 433-439.

37. Barbieri P., Zanelli Т., Galli E., Zanetti G. Wheat inoculation with Azospirillum brasilense Sp6 and some mutants altered in nitrogen fixation and indole-3-acetic acid production // FEMS Microbiol. Lett. 1986. - V. 36.-P. 87-90.

38. Barbiery P., Galli E. Effect on wheat root development of inoculation with an Azospirillum brasilense mutant with altered indole-3-acetic production // Res. Microbiol. 1993. - V. 144.- P. 69-75.

39. Barbiery P., Trambaioli C., Zanetti G., Galli E. Inoculation with Azospirillum brasilense Cd affect the root system development of Sorghum bicolor // Azospirillum VI and Related Microorganisms: Genetics,

40. Physiology, Ecology / Eds. I. Fendrik, M. Del Gallo, J. Vanderleyden, M. de Zamaroczy. Berlin: Springer, 1995. - V. G37. - P. 335-340.

41. Bashan Y., Levanony H. Current status of Azospirillum inoculation technology: Azospirillum as a challenge for agriculture // Can. J. Microbiol.- 1990.-V. 36.-P. 591-608.

42. Bashan Y., Levanony H. Factor affecting adsorption of Azospirillum brasilense Cd to root hairs as compared with root surface of wheat // Can. J. Microbiol. 1989. - V. 35. - P. 936- 944.

43. Bassler В., Wright M., Silverman M. Multiple signalling systems controlling expression of luminescence in Vibrio harveyi: sequence and function of genes encoding a second sensory pathway // Mol Microbiol. 1994. - V. 13.- P. 273-286.

44. Bos, R., van der Mei, H.C., and Busscher, H.J. Physico-Chemistry of Initial Microbial Adhesive Interactions — Its Mechanisms and Methods for Study // FEMS Microbiol. Rev. 1999. - V. 23. - P. 179-230.

45. Bowden M.G., Kaplan H.B. The Myxococcus xanthus lipopolysaccharide O-antigen is required for social motility and multicellular development // Mol. Microbiol. 1998. - V.30, № 2. - P. 275-284.

46. Brand, S.S., Vik, A., Friedman, L., and Kolter, R. Biofilms: the Matrix Revisited // Trends Microbiol. 2005. - V. 13. - P. 20-26.

47. Brandner J.P., Kroos L. Identification of the W 4400 regulatory region, a developmental promoter of Myxococcus xanthus II J. Bacteriol. — 1998. — V.180,№ 8.-P. 1995-2002.

48. Brown L.H., Williams K.L. Gradients in the expression of cell surface glycoprotein in a simple tissue, the Dictyostellium discoideum slug // J. Gen. Microbiol. 1993. - V.139. - P.847-853.

49. Burdman S., Okon Y., Jurkevitch E. Surface Characteristics of Azospirillum brasilense in Relation to Cell Aggregation and Attachment to Plant Roots // Critical Reviews in Microbiology. 2000. - V. 26. - №2. - P. 91- 110.

50. Busalmen, J.P. and de Sanchez, S.R. Influence of pH and Ionic Strength on Adhesion of a Wild Strain of Pseudomonas sp. to Titanium // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2001. -V. 26. - P. 303-308.

51. Byers J., Lucas C., Salmond G., Welch M. Nonenzymatic turnover of an Erwinia carotovora quorum-sensing signaling molecule // J Bacteriol. — 2002.-V. 184, №4.-P. 1163-1171.

52. Carter G., Drummond D., Bermudez L.E. Characterization of biofilm formation by Mycobacterium avium strains // J. Med. Microbiol. — 2003. — V. 52. P. 1-6

53. Chaudhury S., Sengupta A. Association of nitrogen fixing bacteria with leaves of Avicennia officinalis L. a tidal mangrove tree of Sandarban // Indian. J. Microbiol. 1991. - V. 31. - P. 321-322.

54. Chen X., Schauder S., Potler N., Van Dorsselaer A., Pelczer I., Bassler B.L., Hughson F.M. Structural identification of a bacterial quorum-sensing signal containing boron // Nature. 2002. - V.415. - P. 545-549.

55. Conway B.A.,Yepi V., Speert D. Biofilm formation and acyl-homoserine lactone production in the Burkholderia cepacia complex // J Bacteriol. — 2002. V.184, №20. - P. 5678-5685.

56. Costerton, J. W., Stewart, P. S., and E. P. Greenberg. Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections // Science. 1999. - V. 284. - P. 1318-1322

57. Davey, M.E. and O'Toole, G.A., Microbial Biofilms: from Ecology to Molecular Genetics // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000. - V. 64. - P. 847867.

58. Davies D.G., Parsek M.R., Pearson J.P., Iglewski B.H., Costerton J.W., Greenberg E.P. The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm. Science. 1998. - V. 280. - P. 295-298.

59. De Flaun, M.F., Oppenheimer, S.R., Streger, S., Condee, C.W., and Fletcher, M. Alteration in Adhesion, Transport and Membrane

60. Characteristics in Adhesuin Deficient Pseudomonad // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - V. 65. -P. 759-765.

61. DeLisa M.P., Wu C.F., Wang L., Valdes J.J., Bentley W.E. DNA microarray-based identification of genes controlled by autoinducer 2-stimulated quorum sensing in Escherichia coli II J. Bacterid. — 2001. -V.183. — P. 5239-5247.

62. Dobereiner J., Day J.M. Associative symbiosis in tropical grasses: characterization of microorganisms and dinitrogen-fixing sites // Proc. Intern. Symp. on N2-Fixation. Washington. - 1976. - P. 518-537.

63. Dong Y., Xu J., Li X., Zhang L. AiiA, an enzyme that inactivates the acyl-homoserine lactone quorum-sensing signal and attenuates the virulence of Erwinia carotovoru II Proc Natl Acad Sci. 2000. - V. 97. - №7. - P. 35263531.

64. Fallik E., Sarig S., Okon Y. Morphology and physiology of plant roots associated with Azospirillum II Azospirillum/plant associations / Ed. Y. Okon Boca Raton, Fla: CRC Press. - 1994. - P. 77-85.

65. Ferreira M., Fernandes M., Dobereiner J. Role of Azospirillum brasilense nitrate reductase in nitrate assimilation by wheat plants // Biol. Fertil. Soils. — 1987. V. 4.-P. 47-53.

66. Ferriere L., Clarke D.J. The RcsC sensor kinase is required for normal biofilm formation in Escherichia coli K-12 and controls the expression of aregulon in response to growth on a solid surface // Mol. Microbiol. — 2003. — V. 50.-№5.-P. 1665-1682.

67. Frias J., Olle E. Alsina M. Periodontal pathogens produce quorum sensing signal molecules // Infect Immun. 2001. - V. 9. - P. 3431 -3434.

68. Fuqua W.C., Winans S.C., Greenberg E.P. Quorum sensing in bacteria: The LuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators // J. Bacteriol. 1994. - V. 176. - P. 269-275.

69. Fuqua, W. C., Winans S. С and E. P. Greenberg. Census and consensus in bacterial ecosystems: the LuxR-LuxI family of quorum-sensing transcriptional regulators // Annu. Rev. Microbiol. 1996. - V. 50. - P. 727751.

70. Gray K.M. Intercellular communication and group behavior in bacteria // Trends Microbiol. 1997.-V.5.-№ 5.-P. 184-188.

71. Gygi D., Rahmen M.M., Lai H.-C., Carlson R., Guard-Petter J., Hughes C. A cell surface polysaccharide that facilitates rapid population migration by differentiated swarm cells of Proteus mirabilis II Mol. Microbiol. — 1995. — V.17.-P. 1167-1175.

72. Hadas R., Окоп Y. Effect of Azospirillum brasilense inoculation on root morphology and respiration in tomato seedlings // Biol. Fertil. Soils. — 1987. -V.5.-P. 241-247.

73. Hanzelka B.L., Greenberg E.P. Quorum sensing in Vibrio fischeri: Evidence that S-adenosylmethionine is the amino acid substrate for autoinducer synthesis //J. Bacteriol. 1996. - V. 178. - P. 5291-5294.

74. Harshey R.M. Bacterial motility on a surface: many ways to a common goal // Annu. Rev. Microbiol. 2003. - V. 57. - P. 249- 273.

75. Hartmann A., Singh M., Klingmuller W. Isolation and characterization of Azospirillum mutants excreting high amounts of indole acetic acid // Can. J. Microbiol. 1983. - V. 29. - P. 916-923.

76. Hitchcock P.J., Brown T.M. Morphological heterogeneity among Salmonella polysaccharide chemotypes in silver-stain polyacrylamide gels // J. Bacteriol. 1983. - V. 154. - P. 269-277.

77. Il'ina T.S., Romanova Yu.M., Gintsburg A.L. Biofilms as a mode of existence of bacteria in the environment and in the host organism: Phenomenon, genetic control, and systems regulating their development // Genetika. 2004. - V.40. - P. 1445-1456.

78. Ji G., Beavis R., Novick R. Bacterial interference caused by autoinducing peptide variants // Science. 1997. - V. 276. - P. 2027-2030.

79. Kabat E.A. Basic principles of antigen-antibody reaction // Meth. Enzymol. Immunochemical Techniques. New York: Academic Press. - 1980. - V. 70. - P. 3-49.

80. Kapulnik Y., Okon Y., Henis Y. Changes in root morphology of wheat caused by Azospirillum inoculation // Can. J. Microbiol. 1985. - V.31. - P. 881-887.

81. Kato J., Suzuki A., Yamazaki H. et al. Control by A-factor of a metalloendopeptidase gene involved in aerial mycelium formation in Streptomyces griseus I I Ibid. 2002. - V.184. - № 21. - P. 6016-6025.

82. Katzy E.I.,. Matora L.Yu., Serebrennikova O.B., Scheludko A.V. Involvement of a 120-MDa plasmid of Azospirllum brasiense Sp245 in production of lipopolysaccharides // Plasmid. 1998. - V.40. - P. 73-83.

83. Kievit, Т. R., Iglewski, В. H. Bacterial Quorum Sensing in Pathogenic Relationships II Infect. Immun. 2000. - V.68. - P. 4839-4849

84. Kolenbrander P., Andersen R., Blehert D. et al. Communication among oral bacteria // Microb. Molecular Biology Rev. 2002. - V. 66. - № 3. - P. 486-505.

85. Leadbetter J., Greenberg E. Metabolism of acylhomoserine lactone quorum-sensing signals by Variovorax paradoxus 11 J Bacteriol. — 2000. — V. 182. -P. 6921-6926.

86. Lee S., Park S., Lee J., et al. Genes encoding the N-acyi homoserine lactone-degrading enzyme are widespread in many subspecies of Bacillus thuringiensis I I Appl Environ Microbiol. 2002. - V. 68. - № 8. - P. 39193924.

87. Levanony H., Bashan Y. Enhancement of cell division in root tips and growth of the elongation zone in wheat roots induced by Azospirillum brasilense Cd // Can. J. Bot. 1989. - V.67. - P. 56-61.

88. London, J. Bacterial Adhesines // Ann. Rep. Med. Chem. 1991. - V. 26. -P. 229-237.

89. Lyon G.J., Novick R.P. Peptide signaling in Staphylococcus aureus and other Gram-positive bacteria // Peptides. 2004. - V. 25. - P. 1389-1403.

90. Lyon W.R., Madden J.C., Stein J., Caparon M.G. Mutation of luxS affects growth and virulence factor expression in Streptococcus pyogenes II Mol. Microbiol. -2001. V.42. - P. 145-157.

91. Mamson M.D., Armitage J.D., Hoch J.A., Macnab R.M. Bacterial locomotion and signal transduction // J. Bacteriol. 1998. - V. 180. — № 5. -P. 1009-1022.

92. Marshall K.C. Mechanisms of Bacterial Adhesion at Solid-Water Interfaces, Bacterial adhesion (mechanisms and physiological significance), Savage, D.C. and Fletcher, M., Eds. //NY-L: Plenum. 1985 - P. 133-155.

93. McNab R., Ford S., El-Sabaeny A. et al. LuxS-based signaling in Streptococcus gordonii: Autoinducer 2 controls carbohydrate metabolismand biofilm formation with Porphyromonas gingivalis IIJ Bacterid. — 2003. -V. 185.-№ l.-P. 274-284.

94. Michiels K., Croes C.L., Vanderleyden J. Two different modes of attachment of Azospirillum brasilense Sp7 to wheat roots // J. Gen. Microbiol. 1991. - V. 137. - P. 2241-2246.

95. Miller M.B., Skorupski K., Lenz D.H., Taylor R.K., Bassler B.L. Parallel quorum sensing systems converge to regulate virulence in Vibrio cholera 11 Cell. 2002. - V. 110. - P. 303-314.

96. Miller, M. B. & Bassler, B. L. Quorum Sensing in Bacteria // Annu. Rev. Microbiol. 2001. - V. 55. - P. 165-199.

97. Moens S., Michiels K., Vanderleyden J. Glycosylation of the flagellin of the polar flagellum of Azospirillum brasilense, a gram-negative nitrogen-fixing bacterium // Microbiology. 1995. - V.l41. - P. 2651-2657.

98. Morgan, P. and Dow, S, Bacterial Adaptation for Growth in Low Nutrient Environments, Microbes in extreme environments / Herbert, R.A. and Codd, G.A. Eds. 1987, L: Academic, P. 187-214.

99. Murty M.G., Ludha J.K. Differential colonization of Azospirillum lipoferum on roots of two varieties of rice (Oryza sativa L.) // Biol. Fertil. Soils. — 1987.-V. 4.-P. 3-7.

100. Mylonakis E., Engelbert M., Qin X. et al. The Enterococcus faecalis fsrB gene, a key component of the fsr quorum-sensing system, is associated with virulence in the rabbit endophthalmitis model // Infect Immun. 2002. - V. 70.-№8.-P. 4678-4681.

101. Novick R.P. Autoinduction and signal transduction in the regulation of staphylococcal virulence // Mol. Microbiol. -2003. V.48. - P. 1429-1449.

102. O'Toole, G.A. and Kolter, R. Flagellar and Twitching Motility Are

103. Necessary for Pseudomonas aeruginosa Biofilm Development // Mol. Microbiol. 1998. -V. 30. - P. 295-304.

104. Ohnishi Y., Kameyama S., Опака H., Horinouchi S. The A-factor regulatory cascade leading to streptomycin biosynthesis in Streptomyces griseus: identification of a target gene of the A-factor receptor // Mol Microbiol. -1999.-V. 34.-P. 102-111.

105. Okon Y. Microbial inoculants as crop-yield enhancers // Crit. Rev. Biotechnol. 1987. - V.6. - P. 388-401.

106. Okon Y., Kapulnik Y. Development and function of Azospirillum-'mocxA&icd roots//Plant Soil. 1986.-V. 90.-P. 3-16.

107. Okon Y., Vanderleyden J. Root-associated Azospirillum species can stimulate plants // ASM News. 1997. - V. 63. - P. 366-370.

108. Okon Y., Vanderleyden J. Root-associated Azospirillum species can stimulate plants // ASM News. 1997. - V. 63. - P. 366-370.

109. Опака H., Ando N., Nihira Т., Yamada Y. et al. Cloning and characterisation of the A-factor receptor gene from Streptomyces griseus II J Bacteriol. 1995.-V. 177.-№21.-P. 6083-6092.

110. Опака H., Horinouchi S. DNA-binding activity of the A-factor receptor protein and its recognition DNA sequences // Mol Microbiol. 1997. - V. 24.-P. 991-1000.

111. Опака H., Nikagawa Т., Horinouchi S. Involvement of two A-factor receptor homologues in Streptomyces coelicolor A3(2) in the regulation of secondary metabolism and morphogenesis // Mol. Microbiol. 1998. - V. 28. №4.-P. 743-753.

112. Ouchterlony O., Nilsson L.-A. Immunodiffusion and Immunoelectrophoresis // Handbook of Experimental Immunology. Vol. 1. Immunochemistry / Ed. D.M. Weiz. Oxford: Alden Press, 1979. - P. 19-33.

113. Parsek M.R., Val D.L., Hanzelka B.L., Cronan J.E. Jr., Greenberg E.P. Acyl homoserine-lactone quorum-sensing signal generation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - V. 96. - P. 4360^1365.

114. Pearson J.P., Pesci E.C., Iglewski B.H. Roles of Pseudomonas aeruginosa las and rhl quorum-sensing systems in control of elastase and rhamnolipid biosynthesis genes // J. Bacteriol. 1997. - V. 179. - P. 5756-5767.

115. Pearson J.P., van Delden C., Iglewski B.H. Active efflux and diffusion are involved in transport of Pseudomonas aeruginosa cell-to-cell signals // J. Bacteriol.-1999.-V. 181.-P. 1203-1210.

116. Pesci E.C., Milbank J.B., Pearson J.P., Mc Knight S., Kende A.S. Quinolone signaling in the cell-to-cell communication system of Pseudomonas aeruginosa II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - V. 96. - P. 1122911234.

117. Piette, J.P. and Idziak, E.S. A Model Study of Factors Involved in Adhesion of Pseudomonas fluorescens to Meat // Appl. Environ. Microbiol. — 1992. — V. 58.-P. 2783-2791.

118. Pratt, L.A. and Kolter, R. Genetic Analysis of Escherichia coli Biofilm Formation: Roles of Flagella, Motility, Chemotaxis and Type I Pili // Mol. Microbiol. 1998. - V. 30. - P. 285-293.

119. Railkin, A.I. Protsessy kolonizatsii i zashchita ot bioobrastaniya (Colonization Processes and Protection from Biofouling) // St. Petersburg: Izd-vo S-Peterburg, un-ta, 1998.

120. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

121. Sarig S., Blum A., Okon Y. Improvement of the water status and yield of field-grown grain sorghum (Sorghum bicolor) by inoculation with Azospirillum brasilense II J. Agric. Sci 1988. - V. 110. - P. 271-277.

122. Scannapieco, F.A., Torres, G.I., and Levine, M.J., Salivary Amylase Promotes Adhesion of Oral Streptococci To Hydroxyapatite // J. Dent. Res.- 1995.-V. 74.-P. 1360-1366.

123. Schuster M., Lostroh C.P., Ogi Т., Greenberg E.P. Identification, timing, and signal specificity of Pseudomonas aeruginosa quorum-controlled genes: A transcriptome analysis // J. Bacteriol. 2003. - V. 185. - P. 2066-2079.

124. Shapiro J.A. The significances of bacterial colony patterns // BioEssays. -1995.-V. 17. -№7. -P. 597-607.

125. Shauder S., Bassler B.L. The languages of bacteria. //Genes Development. -2001.- V.15.-P. 1468-1480.

126. Sifri C., Mylonakis E., Singh V. et al. Virulence effect of Enterococcus faecalis protease genes and the quorum-sensing locust in Caenorhabditis elegans and mice // Ibid. 2002. - V. 70. - № 10. - P. 5647-5650.

127. Singh, P. K., A. L. Schaefer, M.R. Parsek, Т. O. Moninger, M. J.Welsh and E. P. Greenberg. Quorum sensing signals indicate that cystic fibrosis lungs are infected with bacterial biofilms // Nature. 2000. - V. 407. - P. 762764.

128. Sircili M.P., Walters M., Trabulsi L.R., Sperandio V. Modulation of enteropathogenic Escherichia coli virulence by quorum sensing // Infect Immun. 2004. - V. 72. - P. 2329-2337.

129. Skerman V.B.D., McGowan V., Sneath P.H.A. Approved lists of bacterial names // Int. J. Syst. Bacteriol. 1980. - V. 30. - P. 225-420.

130. Stancheva I., Dimitrov I., Kaloyanova N., Dinev N., Poushkarov N.1.provement of the nitrogen uptake and nitrogen content in maize (Zea mays L.) by inoculation with Azospirillum brasilense II Agrochimica. — 1995.-V.39.-P. 299-306.

131. Steenhoudt O., Vanderleyden J. Azospirillum, a free-living nitrogen-fixing bacterium closely associated with grasses: genetic, biochemical and ecological aspects // FEMS Microbiol. Rev. 2000. - V. 24. - P. 487-506.

132. Strzelczyk E., Kampert M., Li C.Y. Cytokinin-like substances and ethylene production by Azospirillum in media with different carbon sources // Microbiol. Res. 1994. - V. 149. - P. 55-60.

133. Suga H., Smith K. Molecular mechanisms of bacterial quorum sensing as a new drug target // Curr. Opin. Chem. Biol. 2003. - V. 7. - P. 586-591.

134. Surette M.G., Miller M., Bassler B. Quorum sensing in Escherichia coli, Salmonella typhimurium, and Vibrio harveyh A new family of genes responsible for autoinducer production // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1999. V. 96. - P. 1639-1644.

135. Sutherland, I.W., Biofilm Exopolysaccharides: a Strong and Sticky Framework // Microbiology (UK). 2001. - V. 147. -P. 3-9.

136. Tada M.E., Bassler B.L. Chemical communication among bacteria // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. - V. 100. - suppl. 2. - P. 14549-14554.

137. Tien Т., Gaskins M., Hubbell D. Plant growth substances produced by Azospirillum brasilense and their effect on the growth of pearl millet 11 Appl. Environ. Microbiol. 1979. - V. 37. - P. 1016-1024.

138. Van Loosdrecht, M.C.H. Bacterial Adhesion / Wageningen, 1988.

139. Van Schie, P.M. and Fletcher, M. Adhesion of Biodegradative Anaerobic Bacteria to Solid Surfaces // Appl. Environ. Microbiol. 1999. -V. 65. - P.5082-5088.

140. Wade D.S., Calfee M.W., Rocha E.R., Ling E.A., Engstrom E., Coleman J.P., Pesci E.C. Regulation of Pseudomonas quinolone signal synthesis in Pseudomonas aeruginosa II J. Bacteriol. — 2005. — V. 187. — P. 4372-4380.

141. Wagner V.E., Bushnell D., Passador L., Brooks A.I., Iglewski B.H. Microarray analysis of Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing regulons: Effects of growth phase and environment // J. Bacteriol. 2003. - V. 185. — P. 2080-2095.

142. Waters C., Bassler B. Quorum Sensing: cell- to- cell communication in bacteria//Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2005. - V. 21.-P. 319- 346.

143. Watnick P., Kolter R. Biofilm, City of Microbes // J. Bacteriol. 2000. - V. 182.-№10.-P. 2675-2679.

144. Watnick, P.I. and Kolter, R. Steps in the Development of a Vibrio cholerae Biofilm // Mol. Microbiol. 1999. - V. 34. -P. 586-595.

145. Will D., Wu S.S., Kaiser D. Contact stimulation of Tgll and type IV pili in Myxococcus xanthus II J. Bacteriol. 1998. - V. 180. - № 3. - P.759-761.

146. Yamazaki H., Ohnishi Y., Horinouchi S. An A-factor-dependent extracytoplasmatic function sigma factor (OAdsA) that is essential for morphological development in Streptomyces griseus IIJ Bacteriol. — 2000. -V. 182. № 16. - P. 4596- 4605.

147. Yegorenkova I.V., Konnova S.A., Sachuk V.N., Ignatov V.V. Azospirillum brasilense colonisation of wheat root and the role of lectin-carbohydrate interactions in bacterial adsorption and root-hair deformation // Plant Soil. -2001.-V. 231.-P. 275-282.

148. Zhu J., Makalanos J.J. QS-dependent biofilms enhance colonization in Vibrio cholera II Dev. Cell. 2003. - V. 5. - P. 647-656.

149. Zhu J., Miller M.B., Vance R.E., Dziejman M., Bassler B.L., Mekalanos J.J. Quorum-sensing regulators control virulence gene expression in Vibrio cholera II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. - V. 99. - P. 3129-3134.

150. Zhulin I.B., Armitage J.P. Motility, chemokinesis and methylation-independent chemotaxis in Azospirillum brasilense И J. Bacteriol. — 1993. — V. 175.-P. 952-958.

151. Zhulin I.B., Armitage J.P. The role of taxis in the ecology of Azospirillum И Symbiosis. 1992. -V. 13. - P. 199-206.113