Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммуноферментный анализ протеина А стафилококка в биологических объектах

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Иммуноферментный анализ протеина А стафилококка в биологических объектах"

МШ&КИЙ ОРДЕНА' КРАСНОГО ЗНАМЕНИ

г

^ ч.д^гшшгственныя: медицинский институт

На правах рукописи

Окулич Виталий Константинович

ЮЛШЮФЕРМЕНГНЫЙ АНАЛИЗ ПРОТЕИНА А СТАФИЛОКОККА В

БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТА.-:

03.00.07 - Микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских каук

Минск, 1&1-4 г.

Работа выполнена в Витебском ордена Дружбы Народов медицинском институте

Научные руководители:

Лектор медицинских наук, профессор (К. с. Азаренок! Доктор медицинских наук, профессор Д. К Новиков

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук Адарченко А. А. Кандидат медицинских наук Борткавич Л. Г.

Ведущее учреждение - Белорусский Государственный институт усовершенствования врачей.

Закат дозеергаякг состоятся на ваоедании скецкалпзирова] кого совета К 077. 01. 05 ь Минском шдздияеком институт« КЗ Республики Беларусь

"2?' маЬмс, 1994 г. в £5часоз (г. Штск, пр. Лзо]

/

/

глнекого, 83).

С диссертацией юяво ознакомиться в библиотеке Шьскогс ыздицинского института КЗ Республики Беларусь (г. Минск, пр. Дэернкнского, 83).

Автореферат разосхан ">У' сг*£&ъ>/г* 1334 г.

' /

Ученый секретарь специализированного совета, доцент

И. А. КРЫЛО!

■ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Золотистый стафилококк является наиболее частым возбуди-злем внутрибольничных инфекций, заболеваний у детей, ослаб-?нных новорождённых, гнойно-воепалитеяьдах процессов у ро-лльниц и женщин в послеабортном периоде, гнойно-септичесгах эоцесеов у хирургических больных. Стафилококковые пневмонии, дароколиты, менингиты, сепсис часто возникают как осложнения •агоаых поражений» а также как суперинфекцш у больных, нахо-нцихся в стационаре (Акатов А. К. и соавт. , 1976; Бароян О. В. соавт. , 1980; КуляШ id В., 1988).

Важным фактором, участвующем в патогенезе стафилококковой л$екции служит протеин А золотистого стафилококка (Oosset H. е. а , 1969; Акатов А. К. и соавт. , 1983-, Бухвальд 3. , 585). Булок А - один из самых распространенных и изученных ■-рецепторов иммуноглобулинов (Акатов А.К. и соавт. , 1983; >yle М. 0. Р., 1990). Оценка роли протеина А в патогенезе может кь проведена только на основании количественного определения 1о у штаммов S. aureus (Фоменко Г. А. , 1980). Такого рода исс-'довани'л требует применения высоковоепроязводимых и чувстви-(льных методов выявления белка А. Значительные расхождения '.инь«, характеризующих содержание белка А з штаммах стафяло->кка, вероятно, связаны о применением недостаточно чувстви-льных методоз его количественного измерения (Каральник Б. В. соавт. , 1977; Фоменко Г. А. » 1.980). В большинстве исследова-;й для .характеристики количества протеина А а штаммах пользу-ся лишь качественными (Lind I., 1368; Носова Т. В. , 19S4; rtzioti Е, е. а., 1991) п полуколичесТЕенными методами (1Гси-, X. М. и coasT., 1977; Фоменко Г. A. s 1S80; Савицкая К. й. и авт., 1981; -Tamargo МЛ. е. а , 199D), Которые кэ могут дать чной картины. В связи с этим разработка, воспроизводимого, вствительного и количественного метода определения протеина является актуальной.

Широкое распространение стафилококковой йкфэкцкй диктует обходишоть поиска методов быстрой идеа^йфаиад^и стафшюкок-з с последующим выбором опфишльных схем и катодов лечения с этом чувствительности к антибиотикам Позто«^ дэлесообраана эработка, как более точных,- так и .ускоренных кетодо.1-' определяя чувствительности стафилококков к антибиотикам. Зто осо-

octHHP важно в связи с ростом полирезистентных штаммов, НеоОхо димо такяе улучшение методов определения антибиотиков в биоло гичеоких вдкоотях и их стандартизация, так как "ущеотвующи недостаточно точны (Наващин С. )1 и еоавт, , 1982. Зуева в. с, создт,, 1938, Кардоэд« г. А, и ооавт,. 1991).

Несмотря на быстрое развитие научно-тшшдаского прогрее оа, достижения микробиологии, биохимии, повышение санитар нр-культурного уровня лаоедания, стафилококк остается в числ' еодувдх возбудителей пищ&вше токсикоинфекцйР т только в раз вивающихея, но и е развиты« странах (Домарадская Т, И,, Ш1У В последние годы для диагностики стафилококковой- койФ&вдадс ПВДЭВЫХ продуктов наибольшее распространение- подучило опреДе* ленда знтеротокоинов кммуноф&рг,битным аналшш. Однако данньи способ да является универсальным (Вейлбаева M.JL и еоавт. 1988, Флуер Ф.С, и соавт,, Ш1, Hamama А. е. а. 1991). Ш этой причине широку.-i известность, особенно в США, приобрел! методы определения контаминации пщеь « продуктов по продукцш протеина А стафилококка, которые однако вследствие своей высокой сложности и стоимости не шш из стен лабораторш (MlrhabibolJehí В. е. а, 1990, Brooks J.L е. а., 1991).

В с*ши с высокой частотой встречаемости и высокой летальность» при стафилококковом сепсисе, а также* других процессов стафилококковой этиологии, проблема ранней диагностики s. aureus нрляотоя весьма актуальной (Архилова Г, Р. и еоайт,, Ваняева R И и еоавт., 1684, Азаренок КС, и еоавт., 1987), Ранее разработанные методы с цель» ранней диагностик» стафилококкового сепсиса в связи относительно низкой специфичностью и чувствительность» не получили широкого распространений,

Учитывая иулокоино<\ ш считали необходимые разработать иммунофсрмэнтный анализ для определения белка А сV. алробирошть его на различных об'ьектах, включая мшробщ^ш кожных покровов больных раком ¿»дудка и толстой кишку.

Цель рролэловачия.

Целью ишюго исследования явилась разработка и апробация метода количественного определения белка А золотистого стафилококка.

Для достижения указанной дели были поставлены едущий

задачи:

1) разработать .чувствительный и количественный иммунофэр-мектный метод Для опр^елешм свободного и связанного с &&3-* точной «теккой протеина А пта-^лококка;

3} изучить продукция А у итафнлокожов, выделенных ОТ различных Контййгеитсв обследуешь;

3) оценить возможность зьймэния протеина А о целью идентификации золотистого стафилококка:

4} изучить возможность использования разработанного метода на иротейМ А для экспресс-диагностики КОИТаМйнацИИ проЛУК» тин гжтаНия стафилококки: определения ч/вствйтельшетй стафилококков ч инш^иу^иким и биологической активности ан^йбак-тер1-алчных препаратов.

Научная новизна:

Разработан количественный ?ммуноф*рмеитНЫй »Фод последо-í птельного насыщении для определения белка А стафилококка И протеина G стрептококка.

. Показана возможность тонирования штаммов 5. aureus lío уровню продукции белка А.

Разработан и апробирован новый Иквдоюферкепт&ыд метод определения биологической активности ннт.яОакгеркашшй препаратов по уровни продукции протеина А отйфйЛококка.

разработана и пр&Дло??&на иммуно^г>рментная тест-екотемз для определения чуветтшмти золотистого стафилококка к антибиотикам по продукции бэлт А стафилококк,

Впзрвк© в СНГ предложено использовать ИФА на протеин л дм ótíctрой диагностики контаминации мирных продуктов ачёфй» лококкамй,

Ш шш шттш яшшш шмйтш.

- иммунофэрментный анализ последовательfloró насй^йШ № планшете и нитроцеллавоэной мембране т протеин А стефялокекка может елузэ4Т» дм обнаружения микробной Рорэцепция fiffiü 1 (протеин А) и типа Ш (протеин <3) с чусаТЕител&ностьо ;:о • 10 vr/ш для белка А и до Б нг/мл для белка

протеин А стафилококка, вшв -яешй в №2Wna$2ptc£WS№ti 'анализе, является, наряду е наличием плазмокоагулазиой актий» ностй, ш.'.более значимым признаком для идентификаций S. aireos: шта^ы золотистого стафилококка различайся по урогиш пролуй!йи свободного »ротика А, что мой» потшавн-пз тя т

типирования;

- ншфвоферментный метод определения белка А поз вол: определясь Оишоглческую активность антибактериальных щ>ещ тов по уровню- продукции протеина А стафилококка: осуществи определение чувствительности стафилококка к антибиотик! идентифицировать штаммы S. aureus; проводить быструю диагнс тику контаминации пищевых продуктов стафилококкаш-продуцеш ми белка А.

Практическая значимость работы.

В результате проведенных исследований разработан и np« додан иммуноферментный метод в двух модификациях для обнару) ния протеина А стафилококка и протеина G стрептококка

Применение ИФА на протеин А для диагностики контамина! пищевых молочных продуктов позволяет выявлять S. aureus чувствительностью не менее, чем 1000 шкро-Звых частиц в 1 ш течение 20-24 часов. Данная методам позволит ускорить дие носткку стафилококкового сепсиса по белку-А, -связанному с кл точной стенкой.

Шьдаоферменкшй нет од Ьэса&дрватрьаого' насыщения протеин А стафилококка рекомендуете® -использовать для ' бол точного количественного определение чувствительности штамм S. aureus к антибиотикам,- что позволяет в течение 6 часо включая время на выполнение методики, .побить ответ и.назн дать рациональную терапию.

По продукт® протеина А предложено -определять концентр цшо антибиотиков в биологических шдкостях а. проводить стандартизацию по эталону,' что значительно улучшает' точкой исследования по сравнена» с каасоа'юсгаши методикам.

При идентификаций S. -aureus, вщеделного с -кожных покр вов Сольных онкологического диспансера.' -рекомендована кспа-л зоваяие .комплекса диагностических прязкскш: яаявчве плазма» агулазы и продукции протеина А. гиажуронщазной активности.;

Внедрение результатов в практику. . •-.'-:.'

-Ш материалам исследования разработана и ' утверждена - II нистерстЕом здравоохранения,республют Беларусь инструкция- з метод "Способ определения^протеина.А и гиалуронидазной акти ности золотистого стафилококка с целью .его идентификации".

Результаты исследования внедрены в практику .работы баклг борат-орил Витебского городского девтра гигиены', -и -' зпидемиол

[и, эпидотделе Витебского областного центра гигиены и эпиде-юлогии, Кармянском районном центре гигиены и эпидемиологии, тают» используются в учебном процессе на кафедре микробколо-[и с курсом аллергологии и иммунологии.

Получено 2 удостоверения на рационализаторские предложе-

[Я.

Апробация работы.

Результаты работы доломаны на научных сессиях Витебского ■дицинскиго института, ежегодных конференциях молодых ученых, ¡еци.сишитои и студентов '1991, 1982, 1993).

М«1'*риалы диссертации были представлены на Пленуме лроб-■ч*ий комиссии " Инфекция з хирургии" и республиканском семи-^ по внедрению достижений науки в практику здравоохранения дагебок, 29 - 30 октября 1952 г.) и на Пленуме республикански общества иммунологов и аллергологов.

Но теме диссертации опубликовано 8 научных работ.

Об^ем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 167 страницах, включая 9 таблиц и > рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, материа->0 и методов, 2-х глав собственных исследований, заключения, шодов. Библиографический указатель включает 265 отечеетвен-¿х и зарубежих -источников.

^йТЕййлн 'К шш шюмтвтт

3 фсйбТй "КСйййъзаваны штамму стафилококков. получешаю ) •ЕяйтеОсйсйЧ) Городского центра гигиены и эпидемиолзогии а 'культут>ы, выделенные из носа и кола кивота. Но-Фиучгейых штаммов были студенты мединститута, медпер-)нал леченых учреждения, бег-м?нные Яншины, больные с вес-дал'^льнь'Кй заболеваниями ра8лм«'"оЧ локализации. Иденткфика-<н «ид«, ст&ф'илококчон и других микроорганизмов проводилась );".?<псно методическим ^комендащмм А. П. Ярасильнинова с

соавт. . 1S8D и 1985 г. У всех выделенных штаммов определял! чувствительность к антибиотикам: пенициллину, ампициллину, ок-сациллину, карбенициллину. стрептомицину, левомшетину. эритромицину. лннкомицину. фуаидину. канзмицину, метицилишу методом стандартных бумажных дисков.

В качестве объекта для изучения S. aureus микробиоценозг кота использовались больные со злокачественными и доброкачественными опухолями далудочно-кишечного тракта. Среде. qc злокачественными заболи, знияыи иелудочно-кишечного трака ес^-го было обследовано 39 человек (13 женщин и 26 щжчвде) з расге от 32 до 81 года. Для сравнения дополнительно были, оболе дована 20 больных с доброкачественными новообразо^акиямз, которые также находились на лечении б хирургическом, отделении онкологического диспансера.

Контрольную группу составили 32 здоровье студецта,. которые не контактировали с клиникой.

. Материал брали о кожи живота вокруг пупка прямым методов бакотпечатков. Для этой цели готовили .бакотпечатки с стерильных питательных сред: келточно-солевой агар (ЖСА), мя~ со-пептонный агар (МПА), Сабуро, Левина, кровяной агар, специальная среда для выращивания анаэробов. Посевы инкубировались при 37°С в течение 18-24 часов, а при использовании среды анаэробов - в анаэростате при минус одной атмосфере, температура 37°С. в течение 24 часов.

Концентрацию микроорганизмов определяли турбидиметрически на спектрофотометре при длине волны 600 им. За одну условную единицу (усл. ед.) для удобства принята Езвесь микроорганизмов, имеющая оптическую плотность 0,2, что по данным Fey Н. и З.игк-hard G. (1981) соответствует содержанию 200 млн микробных частиц стафилококка на 1 мл.

Гиадуронидазную активность определяли по методу Гекерздо^-ва ЕИ. (1991) в модификации. Белок А стафшркркца и друще Fc-рецепторы из клеточной стенки стрептококков щщч&т по, тодике предложенной Vsrnes А с соавт. (1986) в ции.

Иммуноглобулины человека вьщеляли из сывороток щ риванол-сульфатного метода, а также - аффшщо,й ^фомдтог-рафи^ на агарозе с рекомбинантным стафилококковым протейной А (производство института иммунологии Минмедбиопрода COOP).

- ? -

Концентрации вьщелэнных препаратов тдлуногяобулпнсв стреляли прямым епзкзрофото:*этричееким методом на 280 нм (Деш- IL coas?, 1988). Для срззнешщ концентрацию Гг. а также и друзе белкоз опреде зяли по методу Доури.

Дая получения Fc-фрагшптоа IgG использовали две мзтодк-. В .первом случае фрагментироваяпе tg осуществляли палашом, следующей очистку препарата проводила последовательно й хроматографией на агарозе о протеином А и хроматографией сефадексе S-2D0. Fe-фрагмэнты получали тшсэ обработкой IgG псином. Очистку в данном случае проводили с помощью1 ультра-льтрацстнио!о волоконного аппарата с диаметром пор 100 и 15 з с последующей аффинной.хроматографией препарата на колон-с агарозой, конгязгировзнной с протейной А.

Тестирование препаратов IgG и их Fc-фрагмэнтов проводили, пользуя в качестве твердой фазы нитроцеялшознш мембраны и Ei) планшеты для кммунофермвтгного анализа. При этом активен» IgG и Fc-фрагментов считали прямо пропорциональной кн-нсизноети окрашивания нитроцеялюлозной полоски или величине гической плотности пробы.

Статистическую обработку получэнньпс результатов проводили компьютере IBM FC AT, используя пакэты прикладных программ.

FESyj&TATH ШадОЕДШ И JEC ОБСУЖДЕНИЕ

1. Разработка и апробапяя танунойэрментиого метода опре-жща прдтеиза А стафилококка. -

С ц&лза разработки простого, с использованием доступных агентов, но з.тояэ•время достаточно точного и чувствительно-пшуаофйрьйнтпого анализа ' {ЖМ) па протеин А стафилококка ш 6ua'проведан предварительна подбор препарата для сенси-заззцпя лунок шзшэт й- нктроцэллшлззаой мембраны.

Предварительный подбор препарата для сенсибилизации лунок газет и игтроцеллялсгясй мэмбрана показал, что наиболее придан для этой цэли шршлвкнй иммуноглобулин человека. Данный snapa? «оказал найЗольиуи интенсивность окрашивания- npir сен-билизацки. ни йолзскп нстрофдлшозы, а. тага© зысога-ie зваче-я С средняя оптическая шзтюсть 0,619+0,021) для' лунок аяигет. Д&угие- препараты иммуноглобулинов человека - IgQ, точенные ризаяол-сульфагпкм методом (PC) й аффинно очиюзннш S, уступая нервы?.! при.' использования- в качестве твердой фазы.

подоски нитроцеллюлозы, показывают очень близкие результаты (0,650+ 0,023 и 0,643+0,032, соответственно). Однако использование этих препаратов для сенсибилизации из-за большей трудоемкости получения рекомендовать трудно. Испытание Рс-фрагмен-тов, полученных из путем обработки пепсином или папаиноы, показало невозможность, их использования для сенсибилизации нитроцеллюлозы и сравнительно низкую эффективность для планшет (0,211+0,0034 и О,350+0,СРВ, соответственно), Низкая сорбцкон-иая способность Рс-фрагыентов иммуноглобулинов, по-видимому, связана с сравнительно ыеньвей молекулярной массой этих белков и снижением доступности связывающего центра длз белка А стафилококка при его взаимодействии с тсгрдой фазой. Очевидно, что применение Рс-фрагментов несмотря на сложность их получения, но улучшает характеристики КФА на протеин А стафилококка и не целесообразно.

В итоге предложи шлуиофермеитный метод последовательного насыщенна в двух модификациях с использованием планшет и нитроцеллшоэиой -мембраны.- Он заключается в последовательном взаимодействии сТс-фрагментами ишсбилизированных 1е£3 сначала свободного белка А стафилококка, а ватем протеина А, меченного яероксадазоз хрена

С долью сенсибилизации планшет для шмуноферментного анализа производства "Лекыедпожер", в каждую лунку за исключением НИ и Н12 (контроль секск5цлкБац;;л) вносили по 0,2 ш раствора, содержащего 5 мсг/мл нормальных иммуноглобулинов человека производства БолВШШ на 0,01 Н На-карбонатном буфере. рН 9,6 и вццергзшали в холодильнике при 4°С от 3-х до 12 часов. После инкубации планшеты четырехбитно -отмывали 0,01 и фосфаткш буфером, рЗ 7,4, содержащий 0,05?; детергента твшх-ЕО (ТФВ) и подсушивали на фйльтроззальной бумаге,

- Прй опр-зделзкот свободного протеина & бульонную культуру стафилококка Еотрш-ззалн и центрифугировали при 2000 об/миа в течение 5 ылнут. .Ялз тдичэетвшшш; измерений из надосадочной жидкости готовили разг-сдешш от 1/2 до 1/32 на ТЕ-5, содержащей 1% бычкЗ альбумин (ТЕЛЕСА), которые вносили по 0,1 мл в лунки планшеты. Параллельно в ряд лушгвносили белок А по 0,1 мл, ошнценшй штодом &ффкзиоЯ хроматографии, (производства института ии. Шотера) а зголичествб 50 нг, 20 иг, 15 нг, 12,5 нг, .10 яг, 8 яг, 6 иг, Б ит. 3 нг, 1 яг в дублях. Дополнительно в

:ачестве отрицательного контроля использовали 4 лунки с 'ФВ-БСА. В две лунки вносили стерильный бульон, разведенный на 'ФБ-ЕСА (контроль кулътуралъной среды). После инкубации в тер-юстате при температуре 3?°С в течение 40 минут, отмывали че-;ырехкратно ТФВ и высушивали. В каждую лунку, за исключением :ервой лунки первого ряда А 1, которая служила для выведения рибора на <<0>>, добавляли по 0,09 мл белка А, меченного пе-оксидазой хрена, в рабочем разведении на ТФБ-БСА. Планшет ин-убировали при вышеуказанных условиях. После промывания и вы-ушивания планшета, как описано выше, в каддую лунку вносили о 0,09 мл цитратно-фоофатного .буферного prtCTBopa, содержащего ,15Х перекись иодорода и орто-фенилендиа.м-ш (ОФД), пркготов-еннкй из расчета 5 мг на 13 мл. Пластины закрывали, защищали т света и выдерживали при комнатной температуре в течение 15 инут. Добавляли 10 мкл серной кислоты фирмы <<Roche>> или .3 н ее раствор, приготовленный из концентрированной югелоты, езультаты учитывали на мультиекане АКФ-Ц-01С при длине нолны 92 им.

Для построения калибровочной кривой, использовался пакет риклздных программ на ЭВМ IBM PC AT 286. График зависимости ©держания протеина А в лунке от оптической плотности строился ' помощью регрессионного анализа. Точность и воспроизводимость этода увеличивали за счет подбора графика с наибольшей сте-еяь» корреляции в виде линейной или чаще экспоненциальной законности (см. РисЛ), а также благодаря использованию для ко-ичественных расчетов корреляционного отношения не ниже 0.9. целью стандартизации исследований'проводили перерасчет со-ер^лние белка А у итаммоз S. aureus на одну усл. ед. Стандар-изация результатов позволила улучшить кежанаяизную воспроиз-одимостл, что необходимо для более точной характеристики про-екя А-образовашта штаммов S. aureus.

Нами баш проведено сравнение предложенного нами метола с аиболее часто практикуемым, РИГА по Б. В. Каральнику. В ка-ественном- исполнения И2М сшаял на 20% больше протеин А-'пози-иваых штаммов» чем Ш&. Как оказалось* штаммы S. aureus, у оторых выявлено наличие протеина А только одним методом, от-осятся к слабы» продуцентам балка А. В количественном исяол-еяии ша оказался аа- порядок чувствительнее.

Максимальная чувствительность для белка А, очищенного ме-

Пример ЗЕСиовшшиадьноа модели для содичестаеххпато расчета бедка А в душж по опгшчксззза плотности

7£»Г

еоо;

Экспоненциальная модель

...............................................................................JUS£3aBÚS**S&......-

а—в,-4Б38

........

scosgi. кор. r-~D,99 осла. BAiíKXKtíi=S8j56?;

О 1 2 3 ¿ £ б Г С » 10 IX i2 1U М 15 16 X"

а-область точньпс расчетов прга1£р (8.2,201)

тсдск аффинной хроматографии (проквзодстга института Бартера) , составила 5-10 кг/пл. Внутрианапшая воспроизводимости была < 10£, а при определении количества- секратдруемого протеина А у штатов стафилококка - не более. 15%, Кзаанадкзззг воспродгводйшгть была несколько низ© для* аффпнно ост^шшгс протеина А < 12%, а для культуры сгафагшокка та дублщшггиг проб - не превышала ЮЖ.

Для проведения едапчньк анализов на йехсн A, heíz-i rpajc-ложна шдпфкк&цзя Ш'Д. Применение в какаетве сорбджзкной поверхности полоса: шп-роц&ллйяозной üs^Cpas» edssüxoxo использовать юшунофершвзгвьй -шгод для праведешэ ^Ш'анкг. исследований с достаточной простатой -и рош^збгл&юстг.н.

Учитывая, что 'наряду с язуяэзши секр^фуеь&ас a ральяую среду Fo-редгпгоров, -вогнаказг веобгодйшсть' CSPSSSSS-нкя п бавхернальвЕК Fe-рецепторов, сгагаккшс о ¡тчтмэй ко£, нале раьработака ущшрнназ" *йздгзжз jsaspsasysosoá да» гкнтеграции. Используя более 'доступный яркбор для улмр^зуйо-вой - хирургии и дэзинтбгращк ткаввй ©?А со сшадально разработанным наконечником, ждалось получить 'этакие г:з' -ревулльтача, как к при обработке на аппарате, дзя уаягразвуковой ^ззянт-егра-

flffi ULTRASONIC DISINTEGRATOR type UD-20. OXECTIS 3 яггзгкзг, no-яученное при,обработке отмытой взвеси Сулаокной культуры стафилококка лизостафином и ультразвуковой, дезинтеграцией на ап-тарате ЛОРА, составило менее 10%, что позволило рекомендовать данный способ для практического использования.

Бзми исследована и возможность есшяьзовзлня КФА для оп-:>?деленкя Ре-рецепторов rpaKnomweeascs кокков других тшов. &тод без иодафикации монет успела» йеясаазоваться для опреде-кнка прот?Ена S (тип Ро-редкщ^я 3115 « более высокой чуве-'вкгехьзостьа (не гуже 5 аг/ая з дуба»). Зак оказалось, проте-:я s з 1»Т5 раза Солее а*$5т$яо ЕБггншаетея с Го-фрагментом З'З, "рэтеиз Д. .

С аарзбгця» дагоз и гшучекия продукции протеина а, было :;sp??eo 212 $>zamaa отвфллокакка. выделенных кэ раз-zmaz жвтстгваа» Лз ss 149 (70, S3 %) бнзп отезоэнн к виду . aureus, 3 - кЗ. saprophytics®, 27 (12,74%) - к S.

p-riermidis я S3 05,57%'} - к S. зрр. При анализе полученных ез/^гзтся ^ пакета,прикладных программ было подт-

ерлзещ, что сбрв&оввте протеина А свойственно только тенях s^zz^zs"or-о етзго.кркка и является его видовым признаком, схеьэдз S. strews ттрстеия А был выявлен в 55,3* случаев (142 з 149}, э лги лучения друпяг культур стафилококков чехзве-не вняагея ни в одном случае. Подтверди-дадггыэ о. дысокой связи кродукции протеина А с ндащ^а гшокоагулгга (r-Q,ss£o), пэлурсвкдазйсй аят^ноети лецитппагнсй активности (г«о,8155) я расцеплением ЗЩГ5ТЗ з gsa?pe3HKX услзвпнх (г=0.7577 ; р - звгдэ < 0,001). -згтвя 'f-senrie ряда авторов о вноской ценности определения ?жа A при сtrpгде зенит: нкдз голотготого ста|.:лонсккз (Хазен-ж 0. Я. и созвт. 1SS2., йзеатов А. К. я coast., 1553), наш бв-i сравнены ряд признаков,' которые лзнболее часто нсяогшаункся оТрй •йгдьа. £psi. корреляционном анализе сказалось, что при вида стафилококка раибол'тЗ гягкшзиа квгявгея ,(^0»£С7'1) д Золка А <ЫЗ,8261), ме-

$ дадаяивэа (г~0}3;:1-33), гиалурсн!:дг.<~а (г=0,34) я

сцепление триста з яназробльег условиях <г<*Э,8104). 3&ого~ кторккй регрэссйгкщй еналцз такгэ показал наибольшую гави-мость зддз от наличия' гшгшкоагулагы и яродук-

и :гфрт.:-;*ш А. . .Определение только шхззмоконгулзгн я протеза

к у шгамдав ехеф&шшкка позволяет достоверно по двум яризна кам отнести 93,3% кулвтур в S. aureus, что является наядучдш показателем. Цри этом вадо отметить, что в наших исследования не наблюдалось шташов S. aureus дефектных сразу по двум эти признакам. Идентификация золотистого '.стафилококка по плазшко агулазе и продукции протеина i оказалось оптимальным и по дан нам дисперсионного анализа, так как критерии 5йшэра были май симальныш (F=10:0; р< 0,00001}, а степень влкянш нековтроли руемых случайных факторов составила всего ö,0ü?5 При ста ткстической обработке полученных даяннг в- дискряшназтЕОи гна лизе обнаружено, ' что более характерны.® ввдшша признакам являются наличке цлазкакоагулазкой активности ж продукции протеина А. Проведенные исояедавания подтверждают, что лродукци протеина А, несмотря на большую значимость определения плазмо-коагулазы, является сравнимым- по нежности диагностически: признаком. Так,-в двух случаях определение продукции белка А при отрицательной плаэмокоагулаэной активности позволяло правильно отнести стафилококк к виду S. aureus.

■ Окзаалось, что секреция протеина А после суточной инкуба-■щ-ш на ЫПВ при- температуре 879с для 133 белок А-продуцируищ итаымов сильно колеблется от 1до 719 нг/ыл на усл. ед. (средний уровень составил 121,9+10,59 нг/шг), а у 10 культур протеин А достоверно не определялся, Изучая 45 культур стафилококка, продуцируЕидх протеин А. при температуре 41а течение Ъ часов, наблюдали достоверно (р<0,01) более высокий среда© уровень секрещш протеина А (160,04+37,39 кг/мя на усл. ед.; колебания от 5,7 до 1692,5 нг/ше). Однако надо отметит», чт< для 44% даашов 5. aureus характерна наоборот бода& визга продукция белка к при температура

ГЬ данным литературы не установлена, связь мэвд- колкчест-венным содержанием белка А и характером патологического процесса (Караяьвиа Б.Е в соавт., 1977, Еошнио Г. А., 1980, Акатов Е. к соавт», 1933}.' Sto нашло Еодтаеращанке при изучеяш уровня продукции протеина А у штаммов S. 'aureus при 37сС п су точной инкубации изолированных от разных контингентов обеледу-емых. Не обнаружено'статистйческй достоверных различий в уровне продукции свободного белка А штаммов, выделенных'от.медперсонала, беременных женщин, пациентов поликлиники и стационара, ртудентов мединститута.

- -

Учитывая, что оыбка зри определении количества продуцируемого протскнэ А не превышает я кзаих асслудогапиях ». метод обладает гысокой вол^рокаг.одч'.юстью,' нами продлоч-нс проводить ТИЛКРОВЗИК* золотистых СТафИЛОКОККОВ ПО УООВ;'.» про-лу-щии протеина при инкусацик в тстеяиа ?Л часов, температура 37°С на МПЕ на оснований б классов (см. Рис. 2.). Предложенный нами спссоб ткпирозаяия золотистог. стафилококка, учитывая актуальность поиска эпидемиологических маркеров, меж? дополнить суиествунЕцие ухе методы.

Про.цс-птлий состав по классам протеин А продукции гатаннов

S.s'jreuj з гевгсдвгс?з ot неточна« еяделйяи

з.г-.

«feisfiTí фф

ш.ф

1 ir

ISMjP-Ж

».•л*--

v г ц а с я r »--6l¿.

ffill

щ

. JÉi

« sse« Ш ' 1ИЕГС О " гв8

2> 203 irr/im

i50-200 лг/мл

Í00-15Q

Iít/Í. tA

!I! isre.ee

50-100 гсг/мл

U tniicc

i-5 a гтгДгл

.s

1 Síl&CC

o

иг/мл Pzrc.S.

При анализе распределения no классам в завксшости or обследуемого контингента выявлено, что штаммы, выделенные от сотрудников, чзда всего относятся к продуцентам 2-го класса (22 из 59; 37.29 %),. а у берошшых генвдн югамиы золотистого стафилококка, отнесенные к атому «а классу встречаются почти в. десять раз г-аа» (1 из Р8, 3,57%; р<0.001). Как оказалось, второй и третий классы (продукция бе аса А о? 1.до 100 нг/мл на усл. ед.) составляют у штаьггов, выделенных от сотрудников, более 62%. Данный Факт, по-вгод-.одг. указывает на селективное преимущество' продукций протеина . А от 1 до 100 нг/мл на усл. ?д. для госпитальных штатов.

-14 ~ ' ' : . другой ocoCeKHopí&K3', ез^аьш э<?даио?о?р .стаФрзкожз» ад-деленных оу сотрудников, яшиетея более, частая встречаемость S. . aureus (р<0,05), продуцирую©;*: как белок К гкй гвдро-нидаэу С65 из .53; ,95 Z), яо сравнений с ффемшаЬи жоиадааыи (18 из 28; 64,3%)i 1

2. Определение' иимуно1|врмэщ'йнм1 методом протеина. А ста$й-

• лококка в бирдогио.ееккк .об^^й^ -■

Нащ изучена лозмодаость ^'мувофермейтного анализа на белок А для определения контаминации тдавух продуктов. шгашаад золотистого, стафилококка, Зксоеришатальнос 'еагрязневиз образ- -цов пастеризованного молока стандартными -штаммами Covan í. Wood 46 и A-7S показало, что .метод хорош, воспроизводим. Его чувствительнее^ составила до 10 частиц стафилококка ■ в пробе при суточной инкубация. При 20 часовой инкубации наблюдался существенный рост продукции белка к в зависимости от количества внесенных микробных частиц. . При увеличении времени инкуба- •

• ции т 24 часов различия егладишотся. Наблюдаемые 'количественные различи« иритеина А ми стандартных .»гшмоа -отра&ш Ш уровень продукции на МПБ. Дяя штамма Cowan I наОладшшсь бания от 46.4 до S27 нг/мл белка А в пробе в ащювшзеш «г? дозы инокуляции -и"серая опыта. • Несколько меньшее . шк'Л'ойшо определялось при использовании штамма А-75. (от

Ш'/мл) и наименьшее, у Vood-46 (от 48 до 125 ш*/йл). Кс&э&ьгш~ еание а качеств« обраашв сметаны и едиваадого швла т «аЩ-■ выло выявленных «аконш^рностей. Однако нрииспользований й» эксперимента российского и теорояиом сыра наблюдали -бола»* низкий (от 3,6.до SO нг/мл; р<0.001) уровень продукции- протей-* На А- Ш-видимому, за счёт специфичной (¡шоры.' ийиааьауешй щк изготовлении, кефир имеет высокую устойчивость к ащ^швешо стафилококками {уровень продукции белка 5,2 до 13 Ш'/мл, а в раде серий опытов отсутстаует'Ь

Еаыи баш вдОорочно -«зучвио''SS^«рк«3" взятых аа. магазина в разное:время,.' с' оаравделшш гическим ■ обследованием ^щуна^рментвш -шшщож-т.Ш^ &

выявлена очень васогед .уастста 'вш^азаеййя'' к' т^швт^ ■зовааворо модока, сливочного шела. крема- щ !<2Э %

случаев). Гораздо ыецытй-уровень загрязненности ттжа исследовании проб еметавк (ЗВД, а при «бследрвааш.^ой ждй и кефира золотистый стафилококк,' .в' -«бм-чисую и бактериолога-

- 15 -

ческим методом, выявлен не был.

Таким образом, применение ИФА на протеин А позволяет выявить контаминацию пищевых молочных продуктов с чувствительностью н нике, чем 1000 частиц S. aureus в течение 20-24 часов. Однако Ш» пищевых продуктов не иозэзт заменить бактериологическое исследование пищевых образцов по цело!,у ряду причин. Так, метод не позволяет диагностировать конташнащоо продуктов другими микроорганизмами, позволяет судить о наличии S. aureus в пробе, но кэ может точно определить его количество,. что, гдесрходs;;.p дж? решения вопроса о пригодности продукта. Избегать атгх ие/;ретатков поможет, на наш взгляд, совместное использование ЩД ц бактериологического исследования. После взятия пррбу ца анализ возможно ужэ через 20-24 часа судить не только о наличии контзутшацш S. aureus, но и по росту на WA получить точные количественные характеристики, а при необходимости продолжить иделтификация культура Более целесообразно, учитывая перечислецкыз особенности диагностики КФМ, использовать его для поиска ксточника загрязнения, особенно при приготовлении проектов с ¡длительным, многоступенчатым циклом обработки, например сура, для выявления больных животных (мастита у коров). Такое нсгадэзование метода удобно, так как позволяет обследовать с наболуглл- затратами больше количество проб (до 90 анализов на одни планшет).

С целью улзг-'пелиа точности метода последовательного разведения аатибютща в питательной среде, который чаще используется при проведении регулируемой антибпотикотерапии, нами предложено определять секрецию протеина А в культуралыгой среде как критер!!!} ^.^неспособности культуры. Это позволило устранить основной недостаток метода, который снижает его точность и радёзшость - визуальный учёт результатов. Используя в опыте 1£тамуы золотистого стафилококка различного происхождения, после 24 часовой инкубации при тешературе 37"С, совместно, с визуальным учетом результатов, определяли КФМ содержание свободного протегша А в надосадке. Ориентировочно МПК определяли по последней пробирке, в которой достоверно, отсутствовал белок А. Для более точного вычисления минимальной подавляющей концентрации антибиотика (МПК) протеин А определяли количественно. При этом ЬШК находили по графику зависимости количества протеина А в 1ШВ с пробой (ось У) от концентрации антибиотика

(ось X). На пересечении прямой, проведенной черев крайние точки (одна из которых соответствует содержанию бежа А в контрольной пробе без антибиотика, а другая - последней пробе в ряду в которой достоверно определяли белок А) с осью X находили ШК антибиотика в каздом конкретном случае. Дублирование проб повышало точность определения ШК, Подобным образом шето получить очень точные, объективные данные об устойчивости штамма к антибиотикам. Предложенный метод можно использовать во веек случаях как образец для сравнения воспроизводимости методик. Сравнение результатов предложенного наш метода для антибиотиков : бензшшенищшша, ампициллина, карбеницшшша, оксациллина, качамкцина, эритромицина, цефазолина со стандартными (метод бумажных дисков к методом двухкратных серийных разведений в гадкой питательной среде) в качественном варианте показало их совпадение с первым в 84,6%. а со вторым в 100% случаев. МПК, определенная нашим методом, была, как правило, выше и приближалась к МБК. Последнее связано с. определением белка А в пробе, в которой визуально не отмечался рост культуры стафилококка.

Необходимость быстрого и точного определения чувствительности к антибиотикам при стафилококковой нвфеюши побудило нас разработать ускоренный метод ее определения. Как сказалось, первоначальная концентрация микробных частиц в пробе не имеет решающего значения. Оптимальной является концентрация 200 млн частиц стафилококка. По нагим наблюдением-наилучше результаты наблюдались при 4-часовой инкубации. Наиболее доступным критерием определения чувствительноми являете^ сравнение проб с контролем. Если недержание протеина А в пробе в 2 и более раз меньше по сравнению с контролем, то к данной концентрации антибиотика культура стафилококка считалась чувствительной. При необходимости более точного определения ШК 'использовали график, а такие готовили боле .j трех разведений антибиотиков. При сравнении качественных результатов проведенных исследований для антибиотиков : бензштенищшшиа, ампициллина, оксацилли-на, канамицина оказалось полное совпадение с методом бумажных дисков. Очевидно, что ШК за счет использования в нашей методике сравнительно больших концентраций микроорганизмов в пробе была значите® ко вше» чем в методе двухкратных серийных разведений в гадкой питательной с-реде, в том числе и при исполь-

аованш нашей шдафгтащи., Однако результаты качественного определения чувствительности стаимов к антибиотикам по данным катодов совпадали. '

При изучении, фаршйишэтнки антибиотиков возникает необходимость. их количественного шшрения в биологических жидкостях, а при испытании новых антибактериальных препаратов или определении годности болыкз картйй проводить их стандартизацию по эталону для определения Оаолстйческой активности. Методы, которые используют для этой дели в настоящее время, не обладают необходимой точностью, и учет результатов, как правило, проводится визуально.. Предлагаемая нами методика основывается на методе о-врийных разведений, С целью построения стандартной кривой готовили два ряда серийнух двухкратных разведений антибиотика на ШБ по 10 пробирок по -!■ мл. Параллельно ставили два ряда разведений, исследуемой биологической жидкости или исследуемой партии/препарата. ;-В качестве тест-микроба использовали штаммы стафилококка,со значительной секрецией белка А," наприМер' Сс?¥ш-Ij' внося в каждую цроЗзрку 1СШ микробных частиц 18-часопоГг 'культура йзхэ 24 часовой инкубации при

температура S?®C «$й?щгй агачгатго протеина А в' пробах. По стандартной кривой! ■ »ете?зз носила характер линейной или зкс-понендаальвой содержания'бёлка А в надосадке от

концентрации аЕТйбг^таза, находили' по количеству .протеина А в пробе кояцентрет'.чэ рлтйййтяка. При необходимости рассчитавши ста б1а0гоиие'сш) 'активность отдасйтельно стандарта.

.широкое. .распространение стафилококковой инфекций* роог янфекцифйййх звдокнрднтоз, -остеошегитов к других прочего» стй^стюкгхеогэ геяева, -которнэ селро"2ождагатся бак-тсрпбУией* нзма: расраЗзтзЕй тест-система для выявлении S. aureus " а "крозтг. ' з&жтсовавке-в качестве экспериментального штеризда крсгд'',доноров., зарааэвной 'йташвмй Cowan 1. Шой-4б, Л-75 ¿швгало»'. 'что' -о подаць» на протеин А стафилококка даящо' выявлять 'до ID Ш5/мл S. aureus при суточной инкубации. Содержание : 'бедка'А -в пробе при'этом зависело от используемого з эксперименте штамма. Так, при-инокуляции крови штаммом Cowan. I в лизате обнаружено около 320 нг/мл, а при использовании иташов А-75 и Wood '43 приблизительно 50 нг/мл. Результаты па-, раллельного' 'бактериологического исследования (получено 60 колоний на 1 см2 чашки Петри в первом случае н около 40 колоний

- is -

иа см2 so вторам), подозердлвй ьозшиносп диагностика 3. aureus а крови ШИ но балку А в' первые сутки там взятия крови на анализ. Полученные результаты могут слудить зкеяеркмзн-дальним подашраданиом Еозыожаовти использования метода для диагностики бадари&иий и е&птицэмш», вызванных эолоткотш стафилококков

К наиболее1 интервент, на наш взгляд, относятся результаты, получении© при сравнении частоты встречаемости дефектных шгаммов, выделенных"с кожных покровов с культурами золотистого стафилококка с других источников ГГЦГЭ), исключая колу. Культуру, не секретирующе протеин А и не имеюаще плазмокоагулаз-шй активности, встречаются достаточно редко (у 16,7% и 10% етаммов, соответственно). Больше всего распространены штаммы, кэ имеющие лецитиназной (38,33%) и гиалуронидазной (25,3%) активности, не расщепляюшде маннит в анаэробных условиях (25%). Достоверный рост дефектных штаммов с 22,5% до 58,3% (р<0,001), а особенно резкое увеличение культур S. aureus с двумя и тремя дефектами, по нашему мнению, результат приспособления попуш-ции золотистого стафилококка к условиям существования биотопа кожах покровов при относительном дефиците питательных компонентой J! действия специфических местных защитных механизмов.

Сштто корреляции диагностических признаков и вида для золотистого стафилококка, выделенного с кож;, особенно с наличием лецитиназной активности и расщеплением машшта в аназроб-нш условиях, Bbstmaef шгбходюдот* изменения диагностический критериев. Еольаую ышчшюсю при еяредшяш вида стафилококка, выделенного С КОЛЗШХ покровов, йрйобрбТШоТ ИйЛЙЧЙё плазмо-коагулази и продукции протеина А, гиалуронидазная актквность. Характерно, чте диагностическая роль определения белка А при oíom остается, хотя и относительно, такая значимая, как и при идентификации золотистого стафилококка из других источников. Его налччие позволяет в 8^,3% случаев правильно отнести выделенный штамм к S. aureus, что лишь незначительно уступает диагностическим возшэшоеадм ойредёЛенш шшшкэагуяазы» оео-seüiio учитывая близкие коэффициенты корреляции с ¡r-0,8574 и г-0,8208, соответственно).

Таким образем, с помощью предяодййного наш шАмуиофср* Нситкого метода иа протеин Л стафилококка удалось исейедГб-tari o5pa30t3HH9 протеина А у S, aureus и ярододить его иден-

тификацию; upедлотть методику определения золотистого стафилококка р щ-чевых продуктах; более тонн J определять биологическую активность антибактериальных препаратов по уровню продукции протеина А стафилококка и чувствительность штаммов к н.чтиологикам, осуществлять определение концентрации антибиотиков в биологической жидкости; ускорить диагностику S. aureus в крови и изучить циркуляцию золотист - го стафилококка на коже v больных онкологического диспансер.-».

ЕЫВШ

1.. Разработан иммувофэрмевтный метод последовательного каоыщенм на, пденште и нитроцеллшозной мембране, который можно исво&ьзрвзт]} для обнаружения микробной Ро-рецепции типа I (протеина Д) у, типа. 1U (протеина G) в различных биологическая средах с чувствитедшосп-к* не менее Ю нг/ыл для белка А и 5 НГ/ЫЛ ДЛЯ протеина, а

2. Протеин А стафилококка» выявляемый в иммунофэрментном анализе, является, наряду- о- наличием плазмокоагужшой активности, наиболее зиачимш признаком для идентификации s. aureus.

3. Штаммы золотистого стафилококка продуцируют в питательную среду различное количество свободного протеина А, что позволило разделись их на Ш<?еть классов и рексм?ндовать использовать этот матод для тширования стафилококков.

4. Применение ишунофермектного анализа на протеин А позволяет выявлять контаминацию пищевых продуктов с чувствительностью не менее, чем 1000 КОЕ/мл S. aureus- в течение 20-24 ча-сой.

5. Кммуноферментный метод определения протеина А стафилококка путем последовательного насыщения позволяет количественно определить чувствительность штаммов 5. aureus к антибиотикам, а ускоренный вариант метода - получать результат в течение 6 часов, включая время на выполнение методики.

6. ¿¡ля определения концентрации и биологической активности антибиотиков в биологических жидкостях можно использовать иммуяоферыентный метод на белок А с использованием штаммов золотистого стафилокоюсг - высоких продуцентов протеина А.

7. Большинство культур золотистого стафилококка (53,32} выделенных с кохных покровов больных онкологического диена;1' -

-гора, имеют дефекты по ряду факторов патогенности. Яаиболв! распространены штаммы,-, не продуцирующее лецитиназы (38,33%) : гиалуронидазы (£5,8%) и не расщепляющие маннит в анаэробны: условиях (25%). Культуры, не продуцирующие протеин А (16,7%) i не имеющие плазмокоагулазной активности (10%), встречаются реже.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИЯ.

Разработанный иммуноферментный метод последовательной насыщения в двух модификациях для обнаружения протеина А стафилококка и протеина G стрептококка предлагается использован для обнаружения микробной Fc-рецепции типа I (протеина - A) j типа III (протеина G) в различных биологических средах с высокой чувствительность®, а также с целью идентификации S. aureus.

•Дня диагностики загрязнения пищевых молочных продуктов S. aureus предлагается использовать ИФА на протеин А стафилококка. Особенно целесообразно применение данной штодййя поиска источника контаминации при приготовлении продуктов 'с Шй-гос'тупенчатьм циклом обработки и браковки .'больных

Иммуноферментный метод ' последовательного насйщеййя протеин А стафилококка предлагается использовать ЯЛй 'бойеё точного количественного определения чувствительности - Штатов S. aureus к антибиотикам при проведении регулируемой анти'бйО-тикотерашш. Использование ускоренного метода ' ' определеШз чувствительности стафилококка к антибиотикам позеолиг'в течение 6 часов, .включая' Ёремя на выполнение ' методики, нолу<Ш|> ответ и назначить, рациональную терапию.

Ш продукции протеина А предложно определять ивдайацйр-та антибиотиков в 'биологических шдкостях ъщтяма&ш стандартизацию по эталону,' .что значительно определения 'по 'сравнению с ■■

Учитывая, что для болотистого стафилококка, ъ

биотопа кода: больных-'онкологй^ского дасщй&зг& большая дефектность ададмов по'' изучаемым' йризнака®,, ЪсоЫ&т для лещшшазной активности -и расщепления, маннкта а 'анаЗ'рйбйьпс условиях, предлагается использовать для идентификации таете диагностические критерии как наличие плазыокоагулазы, продукции протеина А и гиалуронидазной активности.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Окулич Е К. , Генералов И. Й. , Данющенкова Е М. Диагностика госпитальной инфекции иммуноферментным методом. // Профиластика и лечения гнойно-воспалительных осложнений в экстренной абдоминальной хирургии: Тез. докладов Пленума проблемной комиссии " Инфекция в хирургии" и республиканского семинара по внедрению достижений науки в практику здравоохранения. - Витебск, 1992. - С. 137-138.

2. Окулич В. К., Аэаренок К. С., Генералов IIИ., Даноденко-ва Е Е и др. Новый иммуноферментяьй метод диагностики стафилококковой инфекции при гнойных осложнениях органов брюшной полости. // Заболевания органов брюзкой полости. - Смоленск,

1992. - С. 127-130.

3. Окулич 3. К., Зэнщгккова К. Е , ПЗотлай Е С. Лутофяора кожи при опухолевой прогрессии в органах «глуцочяого-кишшгого тракта. - Деп. ЩЗ от 17.07.П

4 Окулич 3. К., Лгтгогцэккоьа Е И , Шн>:сл'лй Е С. ГССШ! Л при спполоптескст 8Г1бС.«?В8ККЗЯ

далугочнс-кпп^нгого тг-'^о. - "тп. о БЯПТИ от 33. СЗ. 93 К 3199-33:3.

П. Сигг:.'-:ког. 3. Е , Г.у:Р. С. , Окглгкч II Лучение ;; отработка -*:д изучения Рс-реи^пторон

муноглобулинся, с "л^гс-пю;; сг?кго:1 // - Е?п. г

ГЦМВ ОТ £9.07.93 « 23513.

5. 3:®йрнго 3. 1.1 , Окулич Е К , ДЕзпэнкова Е Л , Генералов II Е Нспохьаовгкле гай^ио^рмаятвого» кзтода для изучения Ре-рецепщ:и гр&упололигельвкх кокков. // Волросы патогенеза и терапии инфекционных я пзр&гктаршгх зоболэЕзниЛ. - Витебск,

1993. - С. 55-09.

7. Окулич В. К. Определение чувствительности стафилококков к антибиотикам и биологической активности антибактериальных препаратов по продугэдн! протеина А. // Вопроси патогенен л терапия янф?кционнкзс и паразитарных заболеваний. - ЕктеОск, 1993. - С, 09-39.

3. Романеико Г. В. , Окулич 3. к. Разработка методов экспресс-диагностики загрязнения продуктов питания стафидококка-ми. продуцентами белка А и ускоренной диагностики стафилококкового сепсиса. // Вопросы "••"■ог^неза и терапии инфекционных и паразитарных заболеваний. - Витебск, 1993. - С. 69-7,?.