Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммуноферментный анализ белка, связывающего жирные кислоты на основе рекомбинантных реагентов

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Иммуноферментный анализ белка, связывающего жирные кислоты на основе рекомбинантных реагентов"

На правах рукописи

АНДРЕЕВА ИРИНА ПЕТРОВНА

ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙАНАЛИЗ БЕЛКА, СВЯЗЫВАЮЩЕГО ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ РЕАГЕНТОВ

03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва- 2004

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета им. МЗ Ломоносова и в ЗАО "НВО

Иммунотех"

Научный руководитель:

доктор биологических наук, академик РАМН Егоров А.М. Научный консультант: кандидат химических наук Григоренко В.Г.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, член-корреспондент РАН Габибов А.Г. доктор химических наук, профессор Дзантиев Б.Б.

диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.ВЛомоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им. М.В Ломоносова

Автореферат разослан ^апреля 2004 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

Ведущая организация:

НИИ биомедицинской химии РАМН

Защита состоится «*^>> .-г-е-^г-Я— 2004 года в 1600 час на заседании

кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из актуальных проблем при разработке высокочувствительных методов иммуноферментного анализа (ИФА) является обеспечение качества и стандартизации получения необходимых иммунохимических реагентов. Развитие молекулярной биологии и биотехнологии дало возможность получать методами генной инженерии рекомбинантные антигены, ферменты, антитела и их фрагменты, а также рекомбинантные конъюгаты ферментов с антигенами и антителами. Генноинженерные подходы имеют ряд существенных преимуществ по сравнению с выделением белков из природных источников и получением конъюгатов традиционными методами химического синтеза, К ним относятся высокий выход готового препарата, его стоимость, воспроизводимость и технологичность получения; полученные препараты, как правило, имеют гомогенный состав.

Разработка методов ИФА связана с необходимостью получения конъюгатов ферментов-маркеров с антигенами или антителами, в которых антиген или антитело сохраняет иммунологическую активность и не происходит инактивации фермента. Однако, все основные подходы, используемые для химического коньюгирования белков и гаптенов, приводят к частичной инактивации ферментов и гетерогенности конъюгатов, что оказывает влияние на специфичность и чувствительность иммуноферментного анализа. С помощью методов генной инженерии можно получать рекомбинантные конъюгаты с белковыми антигенами или антителами, которые имеют ряд преимуществ, а именно, они гомогенны по составу, имеют стехиометрию 1:1 и сохраняют функциональную активность как белка-маркера, так и антигена.

Рекомбинантные конъюгаты представляют собой химерные белки, в которых объединены структурные части как фермента-маркера, так и антигена. Современные подходы биотехнологической науки практически решили проблему получения рекомбинантных ферментов, таких как щелочная фосфатаза, люцифераза, пероксидаза хрена (ПХ), использующихся в качестве маркеров в методах ИФЛ, и всевозможных антигенов белковой природы. Однако, получение рекомбинантных конъюгатов - задача довольно сложная и не тривиальная, поскольку

на сегодняшний день невозможно достоверно предсказать

I БИБЛИОТЕКА

з ; <

коныогата. В результате возможна потеря функциональной активности как фермента-маркера, так и антигена из-за неправильного фолдинга двух составных частей химерного белка.

Ранее были получены рекомбинантные конъюгаты с бактериальными ферментами - р-галактозидазой и щелочной фосфатазой, которые могут быть легко экспрессированы в растворимой форме в клетках E.coli, а также с некоторыми другими ферментами. Основной проблемой, связанной с использованием (3-галактозидазы и щелочной фосфатазы в составе конъюгатов, является их тетрамерная и димерная структуры, соответственно, что приводит к существенному увеличению аффинности конъюгата по сравнению со свободным антигеном. Это особенно нежелательно при разработке конкурентных схем ИФА. В то же время пероксидаза хрена, которая является одним из наиболее широко применяемых ферментов-маркеров для ИФА, может быть экспрессирована в клетках E.coli только в форме тел включения, что до недавнего времени затрудняло получение активного фермента. Достижения последних лет в гетерологической экспрессиии гена ПХ в клетках E.coli, реактивации и рефолдинга рекомбииантной ПХ из тел включения дают возможность получения рекомбинантных конъюгатов с ПХ в качестве фермента-маркера для методов ИФА. Это открывает новые перспективы применения широко используемого фермента-маркера ПХ в конкурентных схемах ИФА с использованием генноинженерных конъюгатов, в частности, в иммунохимических методах определения белка, связывающего жирные кислоты, из сердца человека (с-БСЖК; ЬН-FABP - human Heart Fatty Acid-Binding Protein).

с-БСЖК не так давно был предложен в качестве нового маркера ранней диагностики. острого инфаркта миокарда (ОИМ) - одной из актуальных проблем современной кардиологии. Этот небольшой цитозолический белок с молекулярной массой около 15 кДа является представителем семейства внутриклеточных липид-связывающих белков, участвующих в метаболизме жирных кислот. В настоящее время известно 9 типов БСЖК, различающихся по тканевой экспрессии (из сердца, поджелудочной железы, мозга, печени и др.). Сердечный тип БСЖК в большом количестве содержится в сердечных мышцах (0,56 мг/г сердечной ткани) и является

от других типов БСЖК. Небольшие размеры белка

обуславливают его быстрое высвобождение из поврежденных кардиомиоцитов в кровоток. Было показано, что при повреждении миокарда, подобно миоглобину (Мг), концентрация с-БСЖК в крови значительно повышается в течение 3 часов после появления симптомов ОИМ и возвращается к нормальному уровню через 12-24 часа. Это, а также хорошая тканеспецифичность в сравнении с Мг делают с-БСЖК перспективным маркером ранней диагностики ОИМ.

Клинические изучения требуют значительных количеств человеческого с-БСЖК для использования его в качестве белкового стандарта. Гетерологическая экспрессия данного белка имеет очевидные преимущества по сравнению с выделением его из тканей. Это касается выхода готового препарата, его стоимости, имеющегося в распоряжении материала, отсутствия загрязнения другими белками, а также юридических и морально-нравственных аспектов.

Цель исследования. Целью настоящей работы явилось получение рекомбинантного конъюгата на основе ПХ для ИФА, его применение в тест-системе для количественного определения с-БСЖК в сыворотке/плазме крови и установление диагностического значения теста на с-БСЖК в ранней диагностике ОИМ.

Задачи исследования.

1. Разработать методы получения рекомбинантных иммунохимических реагентов, необходимых для ИФА: рекомбинантного с-БСЖК и рекомбинантного конъюгата пероксидазы хрена с с-БСЖК (ПХ-БСЖК).

2. Разработать метод получения аффинно очищенных поликлональных антител, специфичных к с-БСЖК на основе сорбентов с иммобилизованным рекомбинантным с-БСЖК.

3. Провести сравнение иммунохимических свойств коньюгатов ПХ-БСЖК, полученных методами генной инженерии и химического синтеза.

4. Разработать тест-систему для количественного определения с-БСЖК в сыворотке и плазме крови на основе твердофазного конкурентного ИФА. Изучить стабильность всех компонентов, входящих в состав тест-системы.

5. Установить диагностическое значение разработанного теста определения с-БСЖК в ранней диагностике ОИМ.

Научная новизна. В результате выполнения данной работы впервые был получен рекомбинантный коныогат пероксидазы хрена с белковым антигеном (с-БСЖК), который был зкепрессирован в клетках КеоИ. Введение 6xHis в С-концевую область ПХ позволило оптимизировать процедуру рефолдинга и схему очистки рекомбинантной ПХ, давая возможность получать фермент с высоким выходом из разбавленных растворов рефолдинг среды. Рекомбинантный коныогат ПХ-БСЖК сохраняет функциональные свойства как фермента (удельная активность конъюгата сравнима с удельными активностями рекомбинантной и растительной ПХ), так и иммунологические свойства антигена (с-БСЖК). Было показано, что рекомбинаптный коныогат, имеющий гомогенный состав, стехиометрию 1:1 и уделыгую активность в два раза выше по сравнению с конъюгатом, полученным традиционным методом химического синтеза, имеет преимущества при использовании в конкурентной схеме ИФА.

Впервые предложена конкурентная схема иммуноферментного анализа для определения концентрации с-БСЖК, которая имеет преимущества по сравнению с существующими "сэндвич" методами ИФА. Широкий диапазон определяемых концентраций избавляет от необходимости предварительного разбавления анализируемых образцов, а также уменьшается общее время анализа вследствие только одной инкубации образцов и конъюгата с антителами.

Практическая значимость работы. В ходе работы были разработаны методы получения рекомбинантных иммунохимических реагентов, предложен метод аффинной очистки поликлональных антител, специфичных к с-БСЖК.

На основе полученных реагентов был разработан и оптимизирован метод твердофазного конкурентного ИФА для количественного определения с-БСЖК в сыворотке/плазме крови с использованием рекомбинантного с-БСЖК и рекомбинантного конъюгата ПХ-БСЖК. Данная тест-система характеризуется высокой чувствительностью (1,5 нг/мл) и специфичностью, имеет широкий диапазон определяемых концентраций (1,5-500 нг/мл) и позволяет количественно определять с-БСЖК в крови в течение 1 часа.

В проведенном исследовании показана возможность определения содержания с-БСЖК с помощью конкурентного метода ИФА в сыворотке крови практически

здоровых людей и пациентов с диагнозом острый коронарный синдром (ОКС). На основе полученных данных было показано, что разработанная тест-система обладает высокой чувствительностью и специфичностью для ранней диагностики ОИМ.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Международной конференции "Biocatalysis-2000" (Москва, 2000), Международной научной конференции "Biosensors for Environmental Monitoring" (Иркутск, 2000), IV Международном симпозиуме "Plant Peroxidase: Biochemistry and Physiology" (Murcia, Spain, 2002), II Московском международном Конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2003).

Публикации, По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (4 главы), экспериментальной части, описывающей материалы и методы исследования, результатов и их обсуждения (3 главы), выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 125 страницах, содержит 35 рисунков и 11 таблиц. Список литературы включает 183 ссылки.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2,2'-Азино-бис-(3-этил-бензтиазолин-6-сульфонат) диаммония соль (АБТС), о-фенилендиамин (ОФД), изопропил-Р-О-тиогалаетопиранозид (ИПТГ). п-нитрофенилфосфат, додецил сульфат натрия (ДСН), Трис, глицерин, окисленный глутатион, дитиотрейтол (ДТТ). Са02, гемин и другие компоненты буферных растворов и рефолдинг среды были приобретены в фирме "Sigma" (США). Бактотриптон и дрожжевой экстракт - в фирме "Difco" (США). В работе использовали нативный растительный фермент ПХ (изофермент С) ("Yarinvest Medical International", Россия). В работе использовали полистироловые 96-ти луночные планшеты фирмы "Nunc" (Maxisorb, Дания). В работе был использован субстратный водный раствор, содержащий 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМБ) и перекись водорода, готовый для использования в ИФА фирмы "Kem-En-Tec" (Дания).

В работе были использованы следующие буферные растворы: ФБС - 0,01 М К-фосфатный, содержащий 0,15 М NaCl (рН 7,4); ФБСТ - ФБС, содержащий 0,1 % Твин-20 (рН 7,4); ЦБ - 0,05 М Na-цитратный (рН 5,0); КБ - 0.01М Na-карбонатный (рН 9,6); ТВС - 10 мМ Трис-HCl, рН 7,4,0,15 М NaCl.

Экспрессионные вектора pEThH-FABP и pETHRP-FABPhis были предоставлены к.х.н. Григоренко ВТ. (МГУ, химический факультет, кафедра химической этимологии), к-ДНК с-БСЖК была предоставлена Dr. Torsten Borchers (Institute of Chemical and Biochemical Sensors Research, Muenster, Германия).

Поликлональные антисыворотки против с-БСЖК были получены иммунизацией кроликов рекомбинантным с-БСЖК по стандартной методике в ЗЛО "НПП Иммунотех".

Сыворотки здоровых доноров и пациентов, с сердечно-сосудистыми заболеваниями были предоставлены городскими клиническими больницами № 50, 67 (г. Москва) и Московской областной станцией переливания крови.

Методы исследования.

Клетки E.coli штамм BL21(DE3)pLysS (Novagen, США) использовались для трансформации. Трансформированные клетки выращивались на LB среде с ампициллином (100 мкг/мл) и хлорамфениколом (34 мкг/мл). Экспрессия индуцировалась ИПТГ (0,4 мМ) при оптической плотности ОП550=0.6.

Очистка рекомбинантного с-БСЖК была: проведена с помощью анионообменной хроматографии на Q-Sepharose FF (Pharmacia, Швеция).

Рефолдинг тел включения апо-белка ПХ-БСЖК-His, солюбилизированных в буфере с 6 М мочевиной, проводили в среде, содержащей 1,7 М мочевины, 20 мМ Трис-HCl, рН 8,5, 4 % глицерина, окисленный L-глутатион 0,7 мМ и 2 мМ СаС12. Очистка рекомбинантного конъюгата ПХ-БСЖК осуществлялась на Ni-NTA агарозе (Qiagen, США) и Sephadex G-25 (Pharmacia, Швеция).

Конъюгат растительной ПХ и рекомбинантного с-БСЖК был синтезирован на основе перйодатного окисления олигосахаридов пероксидазы.

Концентрация холо-ПХ-БСЖК определялась по поглощению света на 403 нм, используя коэффициент экстинкции для нативной, растительной ПХ (102000 М-1см-1).

SDS-PAGE электрофорез проводили в полиакриламидном геле 12 % (ПХ-БСЖК) и 15 % (с-БСЖК).

Измерение активности конъюгата ПХ-БСЖК проводили на спектрофотометре Shimadzu UV-1202 при 25°С по АБТС при 405 нм, используя коэффициент экстинкции

£405= 36800 Nî'cm"1. Удельная активность выражалась в единицах (мкмоль/мин) на мг белка.

Поликлональные антитела, специфичные к с-БСЖК, были получены с помощью аффинной хроматографии на CNBr-акгивированной сефарозе (Pharmacia, Швеция) с с-БСЖК в качестве лиганда.

Конкурентный твердофазный ИФА-БСЖК на поликлональных антителах.

Полистироловые планшеты были покрыты поликлональными антителами (0,15 мл/лунка, 2 мкг/мл в КБ) ночь при 4°С. Планшеты были промыты ФБСТ (3x0,15 мл).

В лунки планшета с сорбированными антителами, вносили по 0,05 мл стандартных растворов с-БСЖК или исследуемых проб и 0,05 мл раствора конъюгата ПХ-БСЖК в ФБСТ. После инкубации в течение 45 мин. при 37°С лунки промывались ФБСТ (3x0,15 мл) для удаления не связавшихся реагентов и по 0,10 мл субстратного раствора ТМБ добавляли в каждую лунку. Через 10-15 мин реакцию останавливали добавлением в лунки планшета по 0,1 мл 0,2 М раствора H2SO4 и измеряли оптическую плотность при 450 нм на многоканальном спектрофотометре для 96-ти луночных планшетов ("Anthos 2020", Anthos labtec instruments GmbH, Австрия). В экспериментах с плазмой крови в качестве субстрата был использован ОФД (492 нм).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕНИЕ ИММУНОХИМИЧЕСКИХ РЕАГЕНТОВ

1. Получение рекомбинантпого с-БСЖК.

Для получения рекомбинантного с-БСЖК был использован экспрессионный вектор рЕТ20 (Novagen,. США), в который был клонирован ген, кодирующий человеческий БСЖК сердечного типа (Рис. 1). Целевой белок был экспрессирован в цитоплазму клеток E.coli штамм BL21(DE3)pLysS с высоким выходом (около 30 % суммарного клеточного белка) в растворимом состоянии. После лизиса биомассы путем замораживания/оттаивания с последующим этапом озвучивания (Branson Sonifier 250, Англия) и осаждения ДНК стрептомицин сульфатом (1,5 %, в/о) с последующим диализом, очищенный препарат рекомбинантного с-БСЖК был получен с помощью анионообменной хроматографии на Q-Sepharose FF, где с-БСЖК элюируется в солевом градиенте (0-0,1 М) при концентрации NaCl порядка 30 мМ. Полученный белок был гомогенным в соответствии с SDS-электрофорезом (Рис. 2).

Общий выход очищенного препарата с-БСЖК составил около 32 мг с литра культуры клеток E. соД

2. Получение и свойства рекомбинантного конъюгата ПХ-БСЖК.

Для получения рекомбинантного конъюгата ПХ с. с-БСЖК был использован экспрессионный вектор pETHRP-FABPhis (Рис. 3), в котором участок ДНК, кодирующий с-БСЖК, находится в соответствующей рамке считывания после кодонов ПХ и перед 6xHis. Рекомбинантный конъюгат был экспрессирован в

Рис. 3. Экспрессионный вектор рЕТГОР-РАВРЫз.

цитоплазму клеток Е.евИ штамм ВЬ21(БЕ3)рЬу$8 с высоким выходом (около 30 % суммарного клеточного белка) в виде тел включения. Оба домена рекомбинантного химерного белка (ПХ и с-БСЖК) соединены коротким, гибким пептидным линкером (Л1а-Л1а-Л1а-01у-01у-8ег).

Тела включения, солюбилизированные в 6 М мочевине, давали несвернутый апо-белок ГГХ-БСЖК-Нв около 80 % чистоты в соответствие с 8Б8-электрофорезом (Рис. 4). Рефолдинг и реактивация проводились по схеме, разработанной ранее для рекомбинантной ГГХ с 6хШв на С-конце. Рефолдинг был проведен в присутствии 2 М мочевины, ионов Са2* и добавления окисленного глутатиона для образования дисульфидных связей ночь при +4°С, при этом концентрация ало- формы конъюгата составляла менее 0,1 мг/мл. Благодаря введению 6хНв на С-конце белка связьгоание ало- формы ПХ-БСЖК-Шв на №-КТЛ агарозе обеспечило концентрирование и очистку белка в одну ступень. После удаления остатков мочевины и имидазола с помощью диализа была проведена реконституция полученного конъюгата гемином, избыток которого был удален с помощью гель-фильтрации на 8ерИаёех 0-25 (Рис. 4).

Удельная пероксидазная активность полученного рекомбинантного конъюгата составила 650 Ед/мг по субстрату АБТС. Принимая во внимание разницу в молекулярной массе конъюгата (48 кДа) и ПХ (34 кДа), эта величина соответствует 920 Ед/мг части ПХ, что близко к значениям удельной активности, наблюдаемой для рекомбинантной ПХ с 6хШв (1150 Ед/мг) и растительной ПХ (1000 Ед/мг).

1 2 3 4 5 6 7 Рис. 4. Очистка рекомбинантного конъюгата ПХ-БСЖК. SDS-PAGE (12%), Coomassie G-250. Линии: 1 - белковые стандарты молекулярной массы; 2- ПХ с 6xHis на С-конце - тела включения; 3- 2, очищенная на Ni-NTA агарозе и реактивированная гемином; 4 и 5- ПХ-БСЖК - клеточный лизат до и после индукции ИПТГ; 6- конъюгат ПХ-БСЖК - тела включения, солюбилизированные в 6М мочевине; 7- 6, очищенная на Ni-NTA агарозе и реактивированная гемином.

Общий выход составлял порядка 12 мг на 1 литр культуры клеток E.coli, что несколько выше, чем для ПХ отдельно, что, скорее всего, обусловлено некоторым увеличением растворимости рекомбинантного конъюгата в отсутствии мочевины по сравнению с ПХ из-за гидрофильной поверхности с-БСЖК. Модель пространственной структуры полученного рекомбинантного конъюгата ПХ-БСЖК, выполненная на рабочей станции SGI Indy K4400 с использованием пакета Insight II.95 (BioSym Inc., San-Diego, СА, США), представлена на Рис. 5.

Рекомбинантный конъюгат ПХ-БСЖК имеет максимум поглощения пика полосы Сорэ - 403 нм, такой же как для рекомбинантной и нативной ПХ, свидетельствуя о неизменности микроокружения Fe3+ (координация гемом, дистальным и проксимальным гистидинами). Эти данные позволяют сделать вывод о том, что С-концевое "удлинение" ПХ 15 кДа белком (БСЖК) не имеет критического влияния на каталитическую активность ПХ. В то же самое время рекомбинантный конъюгат взаимодействует с антителами, специфичными к БСЖК, что свидетельствует о сохранении структурной целостности антигенных детерминант с-БСЖК. Отношение поглощений при 403 и 280 нм (Rz значение), являющееся характеристикой чистоты ПХ, было несколько ниже у конъюгата по сравнению с

рекомбинантной ПХ, что связано с увеличением (около 30 %) белкового поглощения при 280 нм вследствие наличия в конъюгате дополнительно части с-БСЖК.

Рис. 5. Модель пространственной структуры рекомбинантного конъюгата ПХ-БСЖК.

3. Получение конъюгата ПХ-БСЖК методом химического синтеза.

Конъюгат растительной ПХ с рекомбинантным с-БСЖК был получен химическим способом, используя перйодатный метод, наиболее используемый для синтеза конъюгатов антител и белков с ПХ. При окислении перйодатом натрия углеводных остатков пероксидазы, аминогруппы которой предварительно протонированы, образуются активные альдегидные группы, которые затем реагируют с аминогруппами молекулы с-БСЖК с образованием оснований Шиффа. Для стабилизации оснований Шиффа конъюгат был обработан боргидридом натрия.

Удельная пероксидазная активность полученного препарата по АБТС составила 300 Е/мг, около 30 % от первоначальной активности. В соответствие с электрофорезом в полученном препарате помимо конъюгата присутствует значительное количество свободной ПХ, а также олигомсры конъюгатов с более высокими молекулярными массами (Рис. 6).

Олигомеры ПХ-БСЖК

ПХ-(БСЖК): ПХ-БСЖК

ПХ

Рис. 6. Электрофореграмма БОЗ-РАСЕ (12%). Линии: 1 - химический конъюгат ПХ-БСЖК; 2 - рекомбинантный конъюгат ПХ-БСЖК; 3 - белковые стандарты молекулярной массы.

4. Получение аффинно очищенных поликлональных антител, специфичных к с-БСЖК.

Для получения поликлональных кроличьих антисывороток, специфичных к с-БСЖК, в качестве иммуногена был использован рекомбинантный с-БСЖК. На Рис. 7 приведены кривые титрования антисывороток от различных циклов иммунизации

1000 10000 100000 Разведение антисыворотки (14 раз)

Рис. 7. Кривые титрования антисыворотки К-10. 14

одного животного. В ходе иммунизации наблюдалось увеличение титра антисыворотки от 1/6500 до 1/12000. Для разработки метода была выбрана антисыворотка с наилучшими иммунохимическими характеристиками (К-10, 50 %-титр 1/12000).

^О-фракция антител была выделена из иммунной сыворотки с помощью двукратного осаждения Ка2804. Для получения высокоспецифичных антител была проведена аффинная хроматография на СКВг-активированной сефарозе с с-БСЖК в качестве лиганда. Элюция связанных антител проводилась понижением рН буфера до 2,8. Концентрация полученного препарата антител составила около 1 мг/мл.

РАЗРАБОТКА И ОПТИМИЗАЦИЯ ТВЕРДОФАЗНОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО МЕТОДА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ С-БСЖК В СЫВОРОТКЕ/ПЛАЗМЕ КРОВИ.

Для определения концентрации с-БСЖК был предложен метод конкуретного твердофазного ИФА, основанный на конкуренции с-БСЖК из измеряемой пробы и с-БСЖК, меченого пероксидазой, за центры связывания специфичных к с-БСЖК антител, иммобилизованных на поверхности лунок полистиролового планшета (Рис.8). Интенсивность окраски продуктов ферментативной реакции обратно пропорциональна концентрации с-БСЖК, содержащегося в анализируемом образце.

Б

Р

Условные обозначения:

антитела; ♦ - с-БСЖК; - конъюгат ПХ-БСЖК;

Б - субстрат ТМБ (ОФД); Р - продукты ферментативной реакции, 450 (492) нм

Рис. 8. Схема конкурентного твердофазного ИФА;

Кинетика связывания рекомбинантного и химически полученного конъюгатов ПХ-БСЖК с аффинно очищенными поликлональными кроличьими антителами против человеческого с-БСЖК примерно одинакова (Рис. 9), при этом связывания рекомбииантного конъюгата с поликлональными антителами против гомологичного типа БСЖК из поджелудочной железы (1-БСЖК) не наблюдалось (Рис. 9). В качестве оптимальных были выбраны концентрации конъюгатов порядка 4-5x10"'° М (2,5 нг/лунке, что соответствует 25 нг/мл) и антител 2 мкг/мл.

[ПХ-БСЖК], (хЮ10) М

Рис. 9. Связывание рекомбинантного (1) и химически полученного (2) конъюгатов ПХ-БСЖК с аффинно очищенными поликлональными антителами, специфичными к с-БСЖК ([ПАт<с-БСЖК>] = 2 мкг/мл). В качестве контроля рекомбинантный конъюгат был добавлен к поликлональным антителам, специфичным к БСЖК из поджелудочной железы (3) ([ПАт<1-БСЖК>] = 2 мкг/мл).

Типичные калибровочные кривые, представленные на рис. 1°, демонстрируют низкий предел детекции (1,5 нг/мл) и широкий диапазон измерения с-БСЖК (1,5 - 50° нг/мл). Эти результаты согласуются с литературными данными для разработанных ранее "сэндвич" методов ИФА с использованием моноклональных антител. При более высоких концентрациях с-БСЖК лучше конкурирует с рекомбинантным конъюгатом, чем с химически полученным конъюгатом, за связывание с поликлональными антителами. Это можно объяснить присутствием в химически полученном конъюгате молекул ПХ, связанных с несколькими молекулами с-БСЖК (Рис. 6), что приводит к

более высокой аффинности вследствие мультисвязывания с иммобилизованными антителами. Таким образом, в данном случае очевидно преимущество рекомбинантного конъюгата ПХ-БСЖК, имеющего 1:1 стехиометрию и гомогенный состав. Поэтому дальнейшие эксперименты проводились с использованием только реко-мбинантного конъюгата.

После оптимизации

условий проведения анализа в буферном растворе была проведена оптимизация ИФА для определения концентрации с-БСЖК в сыворотке и плазме крови, а также изучена стабильность всех компонентов, входящих в состав данной тест-системы.

Как известно, одним из недостатков конкурентных методов ИФА является так называемый матрикс эффект, т.е. влияние компонентов анализируемой жидкости, в частности, сыворотки или плазмы крови, на результаты анализа. Для сыворотки крови матрикс эффект был незначительным. Калибровочные кривые, полученные для стандартных растворов, приготовленных в буферном растворе ФБСТ, сыворотке крови и в коммерческом буферном растворе для приготовления стандартов (ЗАО "НВО Иммунотех") незначительно отличались друг от друга, и на результаты анализа это не оказывало существенного влияния (Рис. 11). В дальнейшем при определении концентрации с-БСЖК в сыворотке крови для приготовления стандартов мы использовали коммерческий буферный раствор, содержащий стабилизирующие компоненты. Как видно из Рис. 12 стандартные растворы с-БСЖК в данном буферном растворе показали хорошую стабильность при хранении в течение 12 месяцев при

[с-БСЖК], нг/мл

Рис. 10. Калибровочные кривые ИФА-БСЖК: 1 - рекомбинаитный конъюгат; 2 -химический конъюгат.

Рис. 11. Конкурентный метод ИФА для Рис. 12. Стабильность стандартных определения концентрации с-БСЖК в растворов с-БСЖК в коммерческом сыворотке крови. буферном растворе (хранение 12

мес. при 4°С).

4°С. Концентрация с-БСЖК в них меняется незначительно (не более 15 %) и на результаты анализа существенного влияния это не оказывает.

Также было изучено влияние плазмы крови на связывание рекомбинантного конъюгата с антителами в присутствии и отсутствии 10,0 нг/мл. с-БСЖК в конкурентной схеме ИФА (Рис. 13А). Как видно из Рис. 13А, добавление 20 % плазмы в ФБСТ приводит к более значительному уменьшению сигнала, дальнейшее же добавление плазмы (до 100 %) только незначительно уменьшает сигнал в конкурентном методе ИФА. Таким образом, при определении концентрации с-БСЖК в плазме крови мы использовали для приготовления стандартов буферный раствор (ФБСТ), содержащий 20 % плазмы, взятой у здоровых пациентов, свободной от с-БСЖК или с очень низким его содержанием. Калибровочные кривые, полученные в отсутствии и в присутствии 20 % плазмы показаны на Рис. 13Б.

плазма (%) [с-БСЖК], нг/мл

Инкубация 50 мил конъюгата (50 нг/ил) и 50 мил образца, Стандарты а ФБСТ

содержащего 0 ю*мп с-БСЖК (-•—) и 10 нКмп с-БСЖК (-♦-) —«— Стандарты а ФБСТ, содержащем Ю % ппамы

Рис. 13. Конкурентный метод ИФА для определения концентрации с-БСЖК в плазме крови. А - матрикс эффект плазмы; Б - калибровочные кривые, полученные для стандартных растворов в ФБСТ и в ФБСТ, содержащем 20 % контрольной плазмы.

Была также изучена стабильность рекомбинантного копъюгата ПХ-БСЖК. Как видно из Рис. 14 иммунохимическая активность рекомбинантного конъюгата ПХ-БСЖК в буферном растворе ФБСТ падала примерно на 45 % в течение 6 месяцев при хранении при 4°С и на 60 % за 1 год. При использовании коммерческого стабилизатора растворов конъюгатов "Иммуностаб" (ЗАО "НВО Иммунотех") стабильность конъюгата была выше, тем не менее потеря иммунохимической активности конъюгата составила около 35-40 % за год при хранении при 4°С. Это может быть связано не только с потерей активности ПХ, а также и с потерей иммунологической активности молекулы БСЖК. В качестве оптимального было выбрано • хранение конъюгата в течение 6 месяцев при 4°С в стабилизирующем растворе "Иммуностаб", потеря активности в течение этого срока составляет около 1520 %, что не оказывает существенного влияния на вид калибровочных кривых и результаты анализа (Рис. 15).

Для стабилизации антител, сорбированных на полистироловом планшете, использовался стабилизирующий раствор, содержащий 1 % сахарозы и 0,5 % гидролизата казеина. Калибровочные кривые, полученные с использованием свежесорбированного планшета и планшета, хранившегося 12 месяцев при 4°С, были практически идентичны. Полученные результаты свидетельствуют о стабильности поликлональных антител, сорбированных на полистироловом планшете, что позволяет производить диагностические тест-системы для определения с-БСЖК на основе заранее сенсибилизированных полистироловых планшетов.

Для тестирования разработанного метода был проведен анализ образцов плазмы крови, отобранных у одного пациента (№ 14) с диагнозом ОИМ в течение 24 часов после госпитализации (предоставлены Dr. Torsten Borchers, Muenster, Германия). Значения концентраций с-БСЖК, полученные конкурентным методом "ИФА-БСЖК" показали хорошую корреляцию с концентрациями, полученными параллельно с помощью "сэндвич" метода "MS", а также с данными, полученными

ранее другими исследователями в рамках проекта EUROCARDI с помощью "сэндвич" метода ИФЛ "ME" и электрохимического иммуносенсора "LS" (Рис. 16 и Табл. 1).

о-Г->-1-1-1-1-1 ' i —i

О 5 10 15 20 25

Время, ч'

Рис. 15. Сравнительный анализ методов количественного определения с-БСЖК в плазме крови (Профиль пациента № 14 в рамках проекта EUROCARDI, данные по "сэндвич" и электрохимическому методам были предоставлены Dr. Torsten Borchers (ICB, Muenster, Германия).

Таблица 1. Сравнение концентраций с-БСЖК, полученных разными методами, для образцов плазмы пациента № 14.

0 часов 1 час 3 часа 6 часов 12 часов 24 часа

ИФА-БСЖК [нг/мл] 23 880 513 204.5 61.5 23.5

Сэндвич MS [нг/мл] 23 >350 539 229 94 20

ME [нг/мл] 18.3 1057 511.3 172.1 46.6 11.6

LS [нг/мл] 14 949 276 126 45 12

ИФА-БСЖК: конкурентный метод ИФА; MS: сэндвич метод "Muenster-Sensor"; ME: сэндвич метод "Maastricht-ELISA"; LS: электрохимический иммуносенсор "Local Sensor".

В результате изучения специфичности анализа было показано, что данный, метод характеризуется высокой специфичностью к с-БСЖК. Перекрестная реактивность с-БСЖК с поликлональными антителами, специфичными к БСЖК из поджелудочной железы, не наблюдалась (Рис. 9). Кроме того, перекрестная

реактивность с миоглобином составила < 0,001 %, то есть диагностически значимая концентрация Мг около 200 мкг/мл не показывала перекреста в данном случае.

Разработанный метод позволяет определять концентрацию с-БСЖК в линейном диапазоне 1,5-500 нг/мл (1х10-10 М - 3х10-8 М). Предел обнаружения (0/7» —2а) составил 1,5 нг/мл (lxlO"10 M) с-БСЖК в анализируемом образце. Таким образом, конкурентный метод может быть использован для определения не только высоких концентраций с-БСЖК, измеряемых в сыворотке или плазме крови пациентов с ОИМ, но также нормальных уровней с-БСЖК (5-10 нг/мл).

Разработанный метод характеризуется хорошей воспроизводимостью результатов: коэффициенты вариации (КБ.) составили 2,4-5,9 %.- для одного дня и 4,3-7,7 % - между днями (Табл. 2). Линейность метода в диапазоне концентраций 10500 нг/мл составляла от 97 % до 105 % (Табл. 3); при определении концетрации с-БСЖК в сыворотке крови с заранее известным его количеством процент открытия составил 105-107 % (Табл. 4).

Таблица 2. Воспроизводимость метода ИФА-БСЖК.

Внутри одного дня (п=10) Между днями (п=8)

Образец Среднее значение К.В. Среднее значение К.В.

(В +о), нг/мл (%) (В ±о), нг/мл (%)

1 6,3+0,4 5,9 6,2+0,5 7,4

2 33+2 5,4 35+3 7,7

3 111±3 3,0 105+7 6,8

4 197+5 2,4 189+8 4,3

Примечание: о - стандартное отклонение

Таблица 3. Тест на линейность (п=10)

Конц. с-БСЖК (нг/мл)/ разведение (праз) Концентрация с-БСЖК (С+о), нг/мл Линейность, %

рассчитанная найденная

25/2,5 10 10,1+0,5 101

200/8 25 24,3+0,4 97

■ 200/2 100 105+7 105

500/2,5 200 198+5 99

Таблица 4. Тест на открытие (п=10)

Образец, нг/мл Добавлено, нг/мл Концентрация с-БСЖК (С+а), нг/мл Открытие,

рассчитанная найденная %

6 10 16 16,8+0,5 105

11 10 21 22,5+2 107

54 70 124 132+4 106

Примечание: о - стандартное отклонение

Разработанная тест-система "ИФА-БСЖК" для количественного определения с-БСЖК в сыворотке крови стабильна в течение 6 месяцев при хранении при 4°С и может быть использована для определения концентрации с-БСЖК в клинической практике. Время проведения анализа составляет 1 час.

ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ с-БСЖК ПРИ ОСТРОМ КОРОНАРНОМ СИНДРОМЕ.

Целью дальнейшего исследования явилось определение диагностического значения уровня с-БСЖК, определяемого методом конкурентного ИФА в сыворотке крови больных с острым коронарным синдромом (ОКС).

В ходе проведенной работы был определен уровень с-БСЖК в сыворотке крови практически здоровых людей и у пациентов с острым коронарным синдромом при различных клинических вариантах его течения: инфаркте миокарда с зубцом Q, инфаркте миокарда без зубца Q и нестабильной стенокардии.

У практически здоровых людей (п=56) уровень с-БСЖК составил 7,8+2,5 нг/мл (4,3-15,5 нг/мл), а за диагностически значимый уровень была принята концентрация с-БСЖК 30 нг/мл (двукратное превышение 99 персентидя - 15,3 нг/мл).

На основании данных определения уровня с-БСЖК у пациентов с ОКС (п=61) были рассчитаны показатели чувствительности (доля больных с повышенной концигтрацией с-БСЖК среди пациентов с диагнозом ОИМ) и специфичности (доля больных с низкой концентрацией с-БСЖК среди пациентов с диагнозом нестабильная стенокардия, т.е. не имевших осложнений) результатов теста на с-БСЖК. Данные по диагнозам пациентов с ОКС были предоставлены к.м.н. Курбановой М.Д. (Городская

Таблица 8. Чувствительность и специфичность теста на С-БСЖК в зависимости от времени начала ангинозного приступа.

Время от начала ангинозного приступа, часы Количество пациентов,. п Чувствительность, % Специфичность, %

0-2 22 94 83

2-6 23 90 75

6-24 16 75 100

1(0-24) 61 87 86

клиническая больница № 50, г. Москва). Как видно из таблицы 5 тест на с-БСЖК обладает высокой чувствительностью и специфичностью уже в первые часы после начала ангинозного приступа и может быть использован для ранней диагностики ОИМ. Суммарно для всех пациентов, входящих в наше исследование, чувствительность теста составила 87 %, специфичность 86 %, что хорошо согласуется с ранее полученными литературными данными.

ВЫВОДЫ:

1. Разработан метод получения рекомбинантного белка, связывающего жирные кислоты, сердечного типа (с-БСЖК). Общий выход очищенного препарата составил 32 мг с 1 литра культуры клеток Е.еоИ.

2. Разработан метод получения рекомбинантного конъюгата белкового антигена (с-БСЖК) с пероксидазой хрена (ПХ) в качестве маркера для использования в конкурентном методе ИФА. Рекомбинантиый конъюгат ПХ-БСЖК обладает как каталитическими свойствами ПХ, так и иммуногенными свойствами с-БСЖК, что позволяет использовать его в иммуноферментном анализе. Выход целевого продукта составил 12 мг с 1 литра культуры клеток ЕеоИ.

3. Разработана методика выделения антител на основе сорбентов с иммобилизованным рекомбинантным с-БСЖК. Получены аффинно очищенные поликлональные кроличьи антитела, специфичные к с-БСЖК.

4. Разработана и оптимизирована тест-система для количественного определения с-БСЖК в сыворотке и плазме крови на основе твердофазного конкурентного ИФА с использованием рекомбинантного конъюгата. Данная тест-система характеризуется высокой чувствительностью (1,5 нг/мл с-БСЖК в анализируемом образце), широким диапазоном определяемых концентраций (1,5-500 нг/мл) и хорошей воспроизводимостью результатов анализа (К.В. не превышает 8 %).

5. На основе полученных данных измерений уровня с-БСЖК у пациентов с диагнозом острый коронарный синдром было установлено диагностическое значение уровня с-БСЖК в крови при ОИМ и получены следующие показатели: чувствительность теста составила 87 %, специфичность - 86 %. Было показано, что тест на с-БСЖК может быть использован для ранней диагностики ОИМ.

6. Изготовлена экспериментальная партия диагностической тест-системы "ИФА-БСЖК" для определения с-БСЖК в сыворотке крови и разработана научно-техническая документация.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Irina P. Andreeva, Vitaly G. Grigorenko, Torsten BOrchers, Friedrich Spener and Alexey M. Egorov. Competitive ELISA for Diagnostic of Acute Myocardial Infarction Based on Recombinant Fusion Protein with Horseradish Peroxidase as Marker Enzyme. International Conference "Biocatalysis-2000: Fundamentals and Applications", 2000, Abstracts, pp. 68-69.

2. Vitaly G. Grigorenko, Irina P. Andreeva, Torsten Borchers, Friedrich Spener and Alexey M. Egorov. Recombinant Technology in Production of Conjugates with Horseradish Peroxidase for analysis. International Scientific Workshop "Biosensors for Environmental Monitoring", 2000, Abstracts, p. 14.

3. Vitaly Grigorenko, Irina Andreeva, Torsten BCrchers, Friedrich Spener and Alexey Egorov. A Genetically Engineered Fusion Protein with Horseradish Peroxidase as Marker Enzyme for Use in Competitive Immunoassays. 2001, Analytical Chemistry, 73, pp.1134-1139.

4. Grigorenko V.G., Koliasnikov O.V., Andreeva I.P., BOrchers Т., Spener F., Lange S., Schmid R.D., Egorov A.M. Recombinant technology in production of horseradish peroxidase conjugates with antibodies and protein antigenes, 2002, Proceedings book of VI International Plant Peroxidasse Symposium. Editors: Acosta, M., Rodriguez-Lopez, J.N. and Pedreno, M.A. pp. 298-301, Murcia, Spain.

5. Андреева И.П., Григоренко ВТ., Рубцова MJO.» Егоров A.M. Белок, связывающий жирные кислоты - новый маркер для ранней диагностики острого инфаркта миокарда. 2003, II Московский международный Конгресс. Биотехнология: состояние и перспективы развития, Материалы Конгресса, часть 1, стр. 66.

6. М.Ю. Рубцова, ИЛ. Андреева, В.Г. Григоренко, AM. Егоров. Разработка мембранной тест-системы для определения белка-переносчика жирных кислот. 2003, Аллергия, астма и клиническая иммунология. № 9, стр. 193-196.

7. О.Б. Талибов, М.Д. Курбанова, АЛ. Верткин, М.И. Тишман, В.Г. Григоренко, И.П. Андреева. Биохимическая диагностика повреждения миокарда (от аспартатаминотрансферазы к белку, связывающему жирные кислоты). 2004, Неотложная терапия, № 5-6, стр. 65-71.

Принято к исполнению 20/04/2004 Исполнено 21/04/2004

Заказ № 142 Тираж:100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095)31840-68 www.autorefeiat.ru

* 7 36 4

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Андреева, Ирина Петровна

I. ВВЕДЕНИЕ.

И. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

Глава 1. РЕКОМБИНАНТНЫЕ КОНЪЮГАТЫ В АНАЛИЗЕ.

1.1. Получение рекомбинантных конъюгатов и их физико-химические свойства.

1.2. Конъюгаты фермент-антиген.

1.3. Конъюгаты белок А-фермент.

1.4. Конъюгаты ферментов с клонированными фрагментами антител.

Глава 2. БИОХИМИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ ОСТРОГО ИНФАРКТА МИОКАРДА.

2.1. Диагностика острого инфаркта миокарда.

2.2. Ферментные маркеры ОИМ.

2.3. Неферментные маркеры ОИМ.

Глава 3 СТРУКТУРА И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА с-БСЖК.

3.1. Структура и функции БСЖК.

3.2. Роль сердечного типа БСЖК (с-БСЖК) в диагностике ОИМ.

Глава 4. Методы определения с-БСЖК.

4.1. Количественные методы определения с-БСЖК.

4.2. Качественные методы определения с-БСЖК.

III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Глава 5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

5.1. Материалы и оборудование.

5.2. Методы исследования.".

5.2. Г Получение рекомбинантного человеческого с-БСЖК.

5.2.2 Получение рекомбинантного конъюгата ПХ с БСЖК.

5.2.3 Получение химического конъюгата ПХ с БСЖК.

5.2.4 Получение поликлональных антител, специфичных к с-БСЖК.

5.2.5 Тестирование антисывороток против с-БСЖК.

5.2.6 Проведение конкурентного ИФА-БСЖК на поликлональных антителах.

5.2.7 Проведение конкурентного ИФА-БСЖК на моноклональных антителах.

5.2.8 "Сэндвич" метод ИФА.

5.2.9 Определение характеристик ИФА-БСЖК.

5.2.10 Определение чувствительности и специфичности теста на с-БСЖК при ОКС.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 6. ПОЛУЧЕНИЕ ИММУНОСПЕЦИФИЧЕСКИХ РЕАГЕНТОВ

ДЛЯ ИФА-БСЖК.

6.1. Получение рекомбинантного с-БСЖК.

6.2. Получение и свойства рекомбинантного конъюгата

ПХ с БСЖК.

6.2.1 Введение.

6.2.2 Клонирование и экспрессия рекомбинантного конъюгата ПХ-БСЖК в клетках Е.соИ.

6.2.3 Физико-химические и иммунологические свойства рекомбинантного конъюгата ПХ-БСЖК.

6.3. Получение конъюгата ПХ-БСЖК методом химического синтеза.

6.4. Получение аффинно очищенных поликлональных антител, специфичных к с-БСЖК.

Глава 7. РАЗРАБОТКА И ОПТИМИЗАЦИЯ ТВЕРДОФАЗНОГО ИММУНО-ФЕРМЕНТНОГО МЕТОДА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ С-БСЖК В СЫВОРОТКЕ/ПЛАЗМЕ КРОВИ.

7.1 Оптимизация конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа для определения с-БСЖК.

7.2 Твердофазный ИФА для определения с-БСЖК в сыворотке или плазме крови (ИФА-БСЖК).,.

Глава 8. ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ С-БСЖК ПРИ ОСТРОМ

КОРОНАРНОМ СИНДРОМЕ.

8.1 Определение диагностически значимого уровня с-БСЖК для диагностики ОИМ.

8.2 Определение чувствительности и специфичности теста на с-БСЖК при остром коронарном синдроме.

V. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Иммуноферментный анализ белка, связывающего жирные кислоты на основе рекомбинантных реагентов"

Одной из актуальных проблем при разработке высокочувствительных методов иммуноферментного анализа (ИФА) является обеспечение качества и стандартизации получения необходимых иммунохимических реагентов. Развитие молекулярной биологии и биотехнологии дало возможность получать методами генной инженерии рекомбинантные антигены белковой природы; ферменты, такие как щелочная фосфатаза, ß-галактозидаза, люцифераза, пероксидаза хрена (ПХ), использующиеся в качестве маркеров в методах ИФА; рекомбинантные антитела и их фрагменты. Генноинженерные подходы имеют ряд существенных преимуществ по сравнению с выделением белков из природных источников. К ним относятся высокий выход готового препарата, его стоимость, воспроизводимость и технологичность получения; полученные препараты, как правило, имеют гомогенный состав.

Разработка методов ИФА связана с необходимостью получения конъюгатов ферментов-маркеров с антигенами или антителами, в которых антиген или антитело сохраняет иммунологическую активность и не происходит инактивации фермента. Однако, все основные подходы, используемые для химического коньюгирования белков и гаптенов, приводят к частичной инактивации ферментов и гетерогенности конъюгатов, что оказывает влияние на специфичность и чувствительность иммуноферментного анализа. С помощью методов генной инженерии можно, получать рекомбинантные конъюгаты с белковыми ■ антигенами или антителами, которые имеют ряд преимуществ, а именно, они гомогенны по составу, имеют стехиометрию 1:1 и сохраняют функциональную активность как белка-маркера,, так и антигена.

Ранее были получены рекомбинантные конъюгаты с бактериальными ферментами - ß-галактозидазой и щелочной фосфатазой, которые могут быть легко экспрессированы в растворимой форме в клетках Е. coli, а также с некоторыми другими ферментами. В то же время пероксидаза хрена может быть экспрессирована' в клетках Е.coli только в форме тел включения, что до недавнего времени, затрудняло получение активного фермента. Достижения последних лет в гетерологической экспрессиии гена ПХ в клетках E.coli, реактивации и рефолдинга рекомбинантной ПХ из тел включения дают возможность получения рекомбинантных конъюгатов с ПХ в качестве фермента-маркера для методов ИФА.

Это открывает новые перспективы применения широко используемого фермента-маркера ПХ в конкурентных схемах ИФА с использованием генноинженерных конъюгатов, в частности, в иммунохимических методах определения белка, связывающего жирные кислоты, из сердца человека (с-БСЖК; hH-FABP - human Heart Fatty Acid-Binding Protein). с-БСЖК не так давно был предложен в качестве нового маркера ранней диагностики острого инфаркта миокарда (ОИМ) - одной из актуальных проблем современной кардиологии. Этот небольшой цитозолический белок с молекулярной массой около 15 кДа является представителем семейства внутриклеточных липид-связывающих белков, участвующих в метаболизме жирных кислот, и в большом количестве содержится в сердечных мышцах (0,56 мг/г сердечной ткани). Развитие ОИМ сопровождается обширным разрушением кардиомиоцитов, и, следовательно, большим выбросом в кровь многих специфических белков, в том числе и с-БСЖК. Было показано, что при повреждении миокарда, подобно миоглобину (Мг), концентрация с-БСЖК в крови значительно повышается в течение 3 часов после появления симптомов ОИМ и возвращается к нормальному уровню через 12-24 часа. Это, а также хорошая тканеспецифичность в сравнении с Мг делают с-БСЖК перспективным маркером ранней диагностики ОИМ.

Настоящая работа посвящена получению рекомбинантного конъюгата на основе ПХ для ИФА; созданию метода для количественного определения концентрации с-БСЖК в сыворотке/плазме крови с использованием рекомбинантных реагентов (рекомбинантного конъюгата ПХ-БСЖК и рекомбинантного с-БСЖК) и установлению диагностического значения разработанного теста на с-БСЖК в ранней диагностике ОИМ.

И. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР ГЛАВА 1. РЕКОМБИНАНТНЫЕ КОНЪЮГАТЫ В АНАЛИЗЕ

1.1. Получение рекомбииаитиых конъюгатов и их физико-химические свойства.

Для высокочувствительных методов иммуноферментного анализа необходимы конъюгаты ферментов маркеров с антигенами (в дальнейшем речь пойдет о белковых/пептидных антигенах) или с антителами, в которых антиген или антитело сохраняет иммунологическую активность и не происходит инактивация фермента. Таким требованиям наилучшим образом отвечает конъюгат белок -фермент состава 1:1. При увеличении числа молекул фермента в конъюгате существенно уменьшается иммунологическая активность белка, так как при этом возрастают стерические препятствия для протекания иммунной реакции и увеличивается вероятность того, что фермент окажется связанным с активным центром антитела или антигенной детерминантой антигена. В то же время при уменьшении числа молекул фермента, связанных с белком, значительно понижается ферментативная активность по сравнению с ростом неспецифических взаимодействий, конъюгата. В этой связи можно сформулировать основные требования, которым должны удовлетворять методы получения конъюгатов [1,2]:

1. Должны сохраняться ферментативные, иммунологические или антигенные свойства конъюгата.

2. Конъюгат должен легко выделяться из реакционной смеси при использовании соответствующих методов очистки.

3. Полученный конъюгат должен быть стабильным при хранении.

4. Конъюгат должен быть гомогенным и определенного состава.

5. Выход конъюгата должен быть достаточно высоким.

Однако ни одна из имеющихся в настоящее время методик не удовлетворяют всем этим требованиям. Самыми распространенными методами получения конъюгатов являются химические методы, в которых используются бифункциональные химические сшивающие агенты, реагирующие с функциональными группами ферментов и антигенов или антител. Эти методы можно разделить на две группы по типу сшивающих реагентов гомобифункциональных (глутаровый альдегид, Н,Н'-о-фенилендималеимид) и гетеробифункциональных (М-оксисукцинимидные эфиры кислот, например, ммалеимидобензойной кислоты). Кроме того, для получения конъюгатов белков с пероксидазой хрена широко используется перйодатный метод [3]. Как правило, выбор подходящей методики связывания осуществляется методом проб и ошибок, при этом часто используются методы, которые ранее обеспечивали успешное получение конъюгата. Например, один из наиболее часто используемых гомобифункциональных сшивающих реагентов - глутаровый альдегид [4] - широко используется для конъюгирования щелочной фосфатазы, в то время как №104 и реагенты, содержащие малеимидные группы, рекомендуются для конъюгирования пероксидазы хрена и Р-галактозидазы, соответственно [5].

Однако, химическая сшивка может быть иногда затруднительной. Например, часто образуются большие, объёмные и гетерогенные конъюгаты, которые могут приводить к ухудшению иммунологических свойств, а также уменьшать активность ферментов. Кроме того, получение химических конъюгатов часто бывает очень трудоемким и дорогостоящим процессом, так как требует предварительного выделения и очистки как антигена, так и фермента маркера. Поэтому были исследованы альтернативные методы получения конъюгатов. В последнее время все большее распространение получают нехимические методы синтеза конъюгатов белок-фермент, основанные на образовании высокоспецифичекой: иммунологической связи антиген-антитело [6]. Например, для получения конъюгата антител с пероксидазой хрена используют антивидовые антитела к ферменту, которые образуют так называемый иммунопероксидазный комплекс (пероксидаза-антитела к пероксидазе, ПАП) [1]. Еще одним перспективным способом получения конъюгатов является метод с использованием комплекса авидин/стрептавидин-биотин, который образуется с Ка ~ 1015 М"1 [7].

С развитием генной инженерии появилась возможность создавать рекомбинантные конъюгаты фермента маркера с антителами и белковыми антигенами. Такие конъюгаты обладают рядом преимуществ по сравнению с химически полученными, в частности они гомогенны по составу, имеют 1:1 стехиометрию, воспроизводимы и достаточно легко получаются [2]. Кроме того, рекомбинантные конъюгаты, как правило, сохраняют 100 % как ферментативную, так и иммунологическую активность.

Генетически сконструированные рекомбинантные конъюгаты получаются с помощью объединения структурных генов антигена/антитела и фермента (Рис. 1).

Ген 1 Ген 2

Промотор Стоп Промотор Стоп

5'-1//Л I-3' 5*-1/ЛИ I-3'

Промотор

5'-777Г

Область линкера

Стоп

3' ДНК

Рис. 1. Трансляционный стоп-кодон на 3'-конце первого гена и область промотора на 5-конце второго гена удаляются и два гена затем лигируются в одной рамке. Оба гена транслируются в один химерный белок [2].

Полученный химерный ген кодирует первичную полипептидную цепь, обладающую как антигенной, так и ферментативной активностью. Выход получаемого рекомбинантного конъюгата зависит от ряда различных факторов, таких как выбор экспрессионного вектора, штамма экспрессии и конечной локализации продукта (цитоплазма, переплазма или культуральная среда), а также экспрессируется белок в растворимой форме или в телах включения. По литературным данным, как правило, получали от 5 до 15 мг очищенного конъюгата на литр клеточной культуры, продуцируемого внутриклеточно, и около 1-2 мг/л при продуцировании в переплазму клеток E.coli [2].

При экспрессии конъюгат может быть подвергнут протеолитическому расщеплению в зависимости от используемого штамма-продуцента. Этот нежелательный протеолиз может, однако, быть лимитирован использованием определенных штаммов-продуцентов, таких как /««-отрицательные бактериальные штаммы, которые, как было показано, заметно уменьшают протеолиз чужеродных белков [8]. На протеолитическую стабильность конъюгата также может оказывать влияние аминокислотный состав на N-конце белка и в области линкера. Было показано, что время полужизни белка может варьироваться от пары минут до более чем 10 часов в зависимости от природы аминоконцевого остатка, подтверждая тем самым, что успешная экспрессия чужеродных белков в бактериях зависит от "N-концевого правила", а именно N-концевые аргинин, лизин, лейцин, фенилаланин, тирозин и триптофан уменьшают стабильность белка, в то время как другие аминоконцевые аминокислотные остатки значительно увеличивают стабильность того же самого белка [9]. Другие сообщения показали, что удаление основных аминокислот в области линкера может защитить рекомбинантный белок от протеолитического расщепления в этой области [10].

На свойства рекомбинантных конъюгатов оказывает влияние структура линкера, разделяющего соответствующие домены бифункционального химерного белка. Проведённые исследования показали, что гибкость и гидрофильность линкера являются основными условиями, позволяющими сохранить функциональную активность связываемых доменов конъюгата [11-13]. Этот принцип успешно применяется при экспрессии рекомбинантных одноцепочечных антител (ScFv), где линкеры нерегулярной структуры способствуют беспрепятственному образованию активных комплексов между вариабельными доменами тяжелой и легкой цепей антитела. Однако, в некоторых работах при использовании гибкого линкера (например, [(Gly)4Ser]n, п=5) наблюдалась потеря функциональной активности одной из составных частей конъюгата (связывающая активность белка G в конъюгате с люциферазой), обусловленная по всей видимости возникающим взаимодействием двух субъединиц [14]. В таких случаях необходимо использовать линкеры с "жесткой структурой". Так, на примере конъюгата, состоящего из двух разновидностей зеленого флюорисцентного белка (EBFP и EGFP), была показана способность а-спиральных линкеров (Ala(GluAIaAlaAlaLys)nAla, п=2-5) эффективно

разделять в пространстве две его составные части, что препятствовало "залипанию" двух белков друг на друга с потерей активности конъюгата [15].

Возможность связывания двух или более белков структурно посредством методов генной инженерии приводит к полному конъюгированию между ферментом маркёром и иммунореакционным антигеном/антителом. Это важно, поскольку даже небольшие количества свободных иммунореакционных молекул в препарате очищенного конъюгата может заметно уменьшать аналитический ответ. Кроме того, в данном случае повышается вероятность, что антигенный сайт сохраняет свою структуру, так как два белка связываются "конец к концу" с помощью стабильной пептидной связи, в отличие от химических методов получения конъюгатов, где, как правило, существует много точек конъюгирования. Это особенно важно, если антиген является небольшим пептидом.

Для многих рекомбинантных конъюгатов, изученных до сих пор, ферментативные и иммунологические свойства практически не изменялись. Обычно, более чем 50 % специфической ферментативной активности сохраняется после пересчета для более высокой молекулярной массы химерного белка. Было замечено, что для сохранения высокой активности фермента допустимы только незначительные изменения в первичной структуре белка [16, 17]. При соблюдении этого основного правила наблюдались только незначительные изменения в Км, рН оптимуме фермента, термостабильности и стабильности к денатурации. Кроме того, иммунологическая активность антигена/антитела обычно полностью сохраняется. Предполагается, что каждая часть химерного рекомбинантного белка подвергается: фолдингу независимо друг от друга в его нативную активную форму.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Андреева, Ирина Петровна

V. ВЫВОДЫ:

1. Разработан метод получения рекомбинантного белка, связывающего жирные кислоты, сердечного типа (с-БСЖК). Общий выход очищенного препарата составил 32 мг с 1 литра культуры клеток Е.соИ.

2. Разработан метод получения рекомбинантного конъюгата белкового антигена (с-БСЖК) с пероксидазой хрена (ПХ) в качестве маркера для использования в конкурентном методе ИФА. Рекомбинантный конъюгат ПХ-БСЖК обладает как каталитическими свойствами ПХ, так и иммуногенными свойствами с-БСЖК, что позволяет использовать его в иммуноферментном анализе. Выход целевого продукта составил 12 мг с 1 литра культуры клеток Е.соИ.

3. Разработана методика выделения антител на основе сорбентов с иммобилизованным рекомбинантным с-БСЖК. Получены аффинно очищенные поликлональные кроличьи антитела, специфичные к с-БСЖК.

4. Разработана и оптимизирована тест-система для количественного определения с-БСЖК в сыворотке и плазме крови на основе твердофазного конкурентного ИФА с использованием рекомбинантного конъюгата. Данная тест-система характеризуется высокой чувствительностью (1,5 нг/мл с-БСЖК в анализируемом образце), широким диапазоном определяемых концентраций (1,5-500 нг/мл) и хорошей воспроизводимостью результатов анализа (К.В. < 8 %).

5. На основе полученных данных измерений уровня с-БСЖК у пациентов с диагнозом острый коронарный синдром было установлено диагностическое значение уровня с-БСЖК в крови при ОИМ и получены следующие показатели: чувствительность теста составила 87 %, специфичность - 86 %. Было показано, что тест на с-БСЖК может быть использован для ранней диагностики ОИМ.

6. Изготовлена экспериментальная партия диагностической тест-системы "ИФА-БСЖК" для определения с-БСЖК в сыворотке крови и разработана научно-техническая документация.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Андреева, Ирина Петровна, Москва

1. Теория и практика иммуноферментного анализа. (1991) М., "Высшая школа", 288 с.

2. Lindbladh С., Mosbach К., Bulow L. (1993) Use of genetically prepared enzyme conjugates in enzyme immunoassay. Trends Biochem. Sci., 18,279-283.

3. Nakane P. K., Kawaoi A. (1974) Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugation. J. Histochem. Cytochem., 22, 1084-1091.

4. Avrameas S. (1969) Indirect irrimunoenzyme techniques for the intracellular detection of antigens. Immunochemistry, 6, 43-52.

5. Tijssen P. (1988) Laboratory Techniques in Biotechnology and Molecular Biology, Practice and Theory of Enzyme Immunoassay. Elsevier Science Publishers.

6. Mason D.Y., Sammons R. (1978) Alkaline phosphatase and peroxidase for double immunoenzymatic labelling of cellular constituents. J.Clin.Pathol., 31,454-460.

7. Ternynck Т., Avrameas S. (1990) Avidin-biotin system in enzyme immunoassays. Methods Enzymol., 184,469-481.

8. Gottesman S., Zipser D. (1978) Deg phenotype of Escherichia coli Ion mutants. J. • Bacterid., 133, 844-851.

9. Tobias J.W., Shrader Т.Е., Rocap G. Varshavsky A. (1991) The N-end rule in bacteria. Science, 254, 1374-1377.

10. Hellebust H., Murby M., Abrahmsen L., Uhlen M., Enforts S.O. (1989) Different approaches to stabilize a recombinant fusion protein. Bio/Technology, 7, 165-168.

11. Argos P. (1990) An investigation of oligopeptides linking domains in protein tertiary structures and possible candidates for general gene fusion. J. Mol. Biol., 211, 943958.

12. Robinson C.R., Sauer R.T. (1998) Optimizing the stability of single-chain proteins by linker length and composition mutagenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95,. 59295934.

13. Crasto C.J., Feng J.A. (2000) LINKER: a program to generate linker sequences for fusion proteins. Protein Eng., 13, 309-312.

14. Maeda Y., Ueda H., Kazami J., Kawano G., Suzuki E., Nagamune T. (1997) Engineering of functional chimeric protein G-Vargula luciferase. Anal. Biochem., 249, 147-152.

15. Arai R., Ueda H., Kitayama A., Kamiya N., Nagamune T. (2001) Design of the linkers which effectively separate domains of a Afunctional fision protein. Protein Eng., 14, 529-532.

16. Fowler A.V., Zabin I. (1983) Purification, structure, and properties of hybrid beta-galactosidase proteins. J. Biol. Chem., 258,14354-14358.

17. Bulow L. (1987) Characterization of an artificial bifiinctional enzyme, beta-galactozidase/galactokinase, prepared by gene fusion. Eur. J. Biochem., 163, 443448.

18. Peterhans A., Mecklenburg M., Meussdoerffer F., Mosbach K. (1987) A Simple Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Using Antigen-ß-Galactosidase Fusions. Anal. Biochem., 163, 470-475.

19. Lindbladh C., Persson M., Bulow L., Stahl S., Mosbach K. (1987) The Design of a Simple Competitive ELISA Using Human Proinsulin-Alkaline Phosphatase Conjugates Prepared by Gene Fusion. Biochem. Biophys. Res. Commun, 149, 607614.

20. Gillet D., Ezan E., Ducancel F., Gaillard C., Ardouin T., Istin M., Menez A., Boulain J.-C., Grogent J.-M. (1993) Enzyme immunoassay using a rat prolactin-alkaline phosphatase recombinant tracer. Anal. Chem., 65, 1779-1784.

21. Gillet D., Ducancel F., Pradel E., Leonetti M., Menez A., Boulain J.C. (1992) Insertion of a disulfide-containing neurotoxin into E.coli alkaline phosphatase: the hybrid retains both biological activities. Protein Eng., 5, 273-278.

22. Chanussot C., Bellanger L., Ligny-Lemaire C., Seguin P., Menez A., Boulain J.-C. (1996) Engineering of a recombinant colorimetric fusion protein for immunodiagnosis of insulin. J. Immunol. Methods, 197, 39-49.

23. Desai U.A., Wininger J.A., Lewis J.C., Ramanathan S., Daunert S. (2001) Using epitope-aequorin conjugate recognition in immunoassays for complex proteins. Anal. Boichem., 294, 132-140.

24. Lewis J.C., Daunert S. (1999) Dual detection of peptides in a fluorescence binding assay by employing genetically fused GFP and BFP mutants. Anal. Chem., 71, 43214327.

25. Lundin A., Rondahl H., Walum E., Wilcke M. (2000) Expression and intracellular localization of leptin receptor long isoform-GFP chimera. Biochim. Biophys. Acta, 1499, 130-138.

26. Kerschbaumer R. J., Hirschl S., Schwager C., Ibl M., Himmler G. (1996) pDAP2: a vector for construction of alkaline phosphatase fusion-proteins. Immunotechnology, 2, 145-150.

27. Witkowski A., Daunert S., Kindy M.S., Bachas L.G. (1993) Enzyme-linked immunosorbent assay for an octapeptide based on a genetically engineered fusion protein. Anal. Chem., 65, 1147-1151.

28. Schreiber A., Specht B., Pelsers M. M. A. L., Glatz J.F.C., Borchers T., Spener F. (1998) Recombinant Human Heart-Type Fatty Acid-Binding Protein as Standard'in Immunochemical Assays. Clin. Chem. Lab. Med., 36, 283-288.

29. Früh K., Muller H-M., Bujard H., Crisanti A. (1989) A new tool for the serodiagnosis of acute Plasmodium falciparum malaria in individuals with primary infection. J. Immunol. Methods, 122, 25-32.

30. Baneyx F., Georgiou G. (1989) Expression, purification and enzymatic characterization of a protein A-ß-lactamase hybrid protein. Enzyme Microb. Technol., 11,559-567.

31. Baneyx F., Schmidt C., Georgiou G. (1990) Affinity immobilization of a genetically engineered bifunctional hybrid protein. Enzyme Microb. Technol., 12, 337-342.

32. Strandberg L., Hober S., Uhlen M., Enfors S.-O. (1990) Expression and characterization of a tripartite fusion protein consisting of chimeric IgG-binding receptors and beta-galactosidase. J. Biotechnol., 13, 83-96.

33. Wienhausen G., Deluca M. (1982) Bioluminescent assays of picomole levels of various metabolites using immobilized enzymes. Anal. Biochem., 127, 380-388.

34. Jablonski E. (1985) The preparation of bacterial luciferase conjugates for immunoassay and application to rubella antibody detection. Anal. Biochem., 148, 199-206.

35. Lindbladh C., Mosbach K., Bulow L. (1991) Preparation of a genetically fused protein A/luciferase conjugate for use in bioluminescent immunoassays. J. Immunol. Methods, 137, 199-207.

36. Maeda Y., Ueda H., Hara T., Kazami J., Kawano G., Suzuki E., Nagamune T. (1996) Expression of a bifunctional chimeric protein A-Vargula hilgendorfii luciferase in mammalian cells. Biotechniques, 20, 116-121.

37. Skerra A. (1993) Bacterial expression of immunoglobulin fragments. Curr. Opin. Immunol., 5, 256-262.

38. Skerra A., Pluckhun A. (1988) Assembly of a functional immunoglobulin Fv fragment in Escherichia coli. Science, 240, 1038-1041.

39. Better M., Chang C.P., Robinson R.R., Horwitz A.H. (1988) Escherichia coir secretion of an active chimeric antibody fragment. Science, 240, 1041-1043.

40. Bird R.E., Hardman K.D., Jacobson J.W., Johnson S., Kaufman B.M., Lee, S.M., Lee T., Pope S.H., Riordan G.S., Whitlow M. (1988) Single-chain antigen-binding proteins. Science, 242, 423-426.

41. Neuberger M.S., Williams G.T., Fox R.O. (1984) Recombinant antibodies possessing novel effector functions. Nature, 312, 604-608.

42. Casadei J., Powell M.J., Kenten J.H. (1990) Expression and secretion of aequorin as a chimeric antibody by means of a mammalian expression vector. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87,2047-2051.

43. Huse W.D., Sastry L., Iverson S.A., Kang A.S., Alting-Mees M., Burton D.R., Benkovic S.J., Lerner R.A. (1989) Generation of a large combinatorial library of the immunoglobulin repertoire in phage lambda. Science, 246, 1275-1281.

44. Barbas C.F., Kang A.S., Lerner R.A., Benkovic S.J. (1991) Assembly of combinatorial antibody libraries on phage surfaces: the gene III site. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 7978-7982.

45. Clackson Т., Hoogenboom H.R., Griffiths A.D., Winter G. (1991) Making antibody fragments using phage display libraries. Nature, 352, 624-628.

46. Ducancel F., Gillet D., Menez A., Boulain J.C. (1992) Recombinant colorimetric antibodies: genetic construction and production in E. coli. С. R. Acad. Sei. Paris, 315, 221-224.

47. Suzuki C., Ueda H., Tsumoto K., Mahoney W.C., Kumagai I., Nagamune T. (1999) Open sandwich ELISA with V(H)-/V(L)-alkaIine phosphatasefusion proteins. J. Immunol. Methods, 224, 171-184.

48. Rau D., Kramer K., Hock B. (2002) Single-chain Fv antibody-alkaline phosphatase fusion proteins produced by one-step cloning as rapid detection tools for ELISA. J. Immunoassay Immunochem., 23, 129-143.

49. Arai R., Ueda H., Tsumoto K., Mahoney W.C., Kumagai I., Nagamune T. (2000) Fluorolabeling of antibody variable domains with green fluorescent protein variants: application to an energy transfer-based homogeneous immunoassay. Protein Eng., 13, 369-376.

50. Kerr D.E., Vrudhula V.M., Svensson H.P., Siemers N.O., Senter P.D. (1999) Comparison of recombinant and synthetically formed monoclonal antibody-beta-lactamase conjugates for anticancer prodrug activation. Bioconjug. Chem., 10, 10841089.

51. Чазов Е.И. (1997) Пути повышения эффективности лечения больных ИБС. Терапев. архив, 69, № 9, 5-10.

52. Ischaemic Heart Disease Registers: Report of the fifth working group. Copenhagen, WHO, 1971

53. Tamberella M.R. 3rd, Warner J.G.Jr. (2000) Non-Q wave myocardial infarction. Assessment and management of a unique and diverse subset. Postgrad. Med., 107, 87-93.

54. Wellford A.L., Ashcom T.L., Whitney E.J., Rubal B.J., Wellford L.A., Moody J.M. (1993) Changing presentation of coronary hearth disease in an inpatient population within the U.S. military health care system. Mil. Med., 158, 598-603.

55. Сапрыгин Д.Б., Романов М.Ю. (2000) Миокардиальные маркеры. Лабораторная медицина, 3, 13-18.

56. Карпищенко А.И., Бутко А.Л., Принцев Н.Д. (1997) Инфаркт миокарда. Медицинская лабораторная диагностика, под ред. Карпищенко А.И., С-Пт., 2129.

57. Сапрыгин Д.Б. (1982) Ферментная диагностика при заболеваниях сердца. Руководство по кардиологии, под ред. Чазова Е.И., М., 506-521.

58. Сыркин А.Л. (1998) Инфаркт миокарда. МИА, М., 180-196.

59. Ферментная диагностика острого инфаркта миокарда. Метод, рекомендации. (1992) Министерство здравоохранения России, Саратов, 24 с.

60. Внутренние болезни. Под ред. Браунвальда Е. (1995) Кн. 5, М., Медицина, 415 с.

61. Loughlin J.F., Krijnen P.M., Jablonsky G., Leung F.Y., Henderson A.R. (1988) Diagnostic efficiency of four lactate dehydrogenase isoenzyme-1 ratios in serum after myocardial infarction. Clin. Chem., 34, 1960-1965.

62. Шурыгин Д., Шишмарев Ю., Грачев А. (1983) Динамика изменения содержания миоглобина и активности креатинфосфокиназы в сыворотке крови больных инфарктом миокарда и стенокардией. Терапевт. Архив, 15, №5, 7-11.

63. Fisher M.L., Carliner N.H., Becker L.C., Peters R.W., Plotnick G.D. (1983) Serum creatine kinase in the diagnosis of acute myocardial infarction, Optimal sampling frequency. JAMA, 249, 393-394.

64. Creatine kinase enzymes. Ed. by Lang H. (1981) Springer Verlag, 317.

65. Douglas P.S. (1993) Cardiovascular health and disease in women. Philadelphia, 3539.

66. Pesce M.A. (1982) The CK isoenzymes: findings and their meaning. Lab. management, 20, 25-37.

67. Mercen D. (1974) Separation of tissue and serum creatine kinase isoenzymes by ion -exchange chromatography. Clin.Chem., 20, 36-40.

68. Gerhardt W., Waldenstrom J., Horder M., Hofvendahl S., Billstrom R., Ljungdahl R., Beming H., Bagger P. (1982) Creatine kinase and creatine kinase B-subunit activity in serum in cases of suspected myocardial infarction. Clin. Chem., 28, 277-283.

69. Clerico A., Del Chicca M.G., Mariani G. (1982) Radioimmunological determination of mioglobin in biological fluids and tissues: A critical review of technical procedures and clinical usefulness. J. Nucl. Med. Allied Sci., 26, 117-134.

70. Mair J., Smidt J., Artner-Dworzak E., Lechleitner P., Dienstl F., Puschendorf B. (1991) Rapid diagnosis of myocardial infarction by immunoturbidimetric myoglobin measurement. Lancet, 337, 1343-1344.

71. Leavis P., Gergely J. (1984) Thin filament proteins and thin filament-linked regulation of vertebrate muscle contraction. CRC Crit. Rev. Biochem., 16, 235-305.

72. Zot A.S., Potter J.D. (1987) Structural aspects of troponin-tropomozyn regulation of skeletal muscle contraction. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem., 16, 535-559.

73. Gerhardt W., Nordin G., Ljungdahl L. (1999) Can troponin T replace CK MB mass as "gold standard" for acute myocardial infarction (AMI)? Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl., 230, 83-89.

74. Katus H.A., Remppis A., Neumann F.J., Scheffold T., Diederich K.W., Vinar G., Noe A., Matern G., Kuebler W. (1991) Diagnostic efficiency of troponin T measurements in acute myocardial infarction. Circulation, 83, 902-912.

75. Jaffe A.S., Ravkilde J., Roberts R., Naslund U., Apple F.S., Galvani M., Katus H. (2000) It's time for a change to a troponin standard. Circulation, 102, 1216-1220.

76. Филатов B.JL, Катруха А.Г., Буларгина T.B., Гусев Н.Б. (1999) Тропонин: строение, свойства и механизм функционирования. Биохимия, 64, 1155-1174.

77. Perry S.V. Troponin I: inhibitor or facilitator. (1999) Mol. Cell. Biochem., 190,9-32.

78. Anderson P.A., Greig A., Mark T.M., Malouf N.N., Oakeley A.E., Ungerleider R.M., Allen P.D., Kay B.K. (1995) Molecular basis of human cardiac troponin T isoforms expressed in the developing, adult, and failing heart. Circ. Res., 76, 681-686.

79. Затейщикова А.А., Затейщиков Д.А. (1997) Кардиоспецифический тропонин T в диагностике поражений миокарда. Кардиология, 37, 53-57.

80. Jaffe A.S., Landt Y., Parvin C.A., Abendschein D.R., Geltman E.M., Ladenson J.H. (1996) Comparative sensitivity of cardiac troponin I and lactate dehydrogenase isoenzymes for diagnosis of acute myocardial infarction. Clin. Chem., 42, 1770-1776.

81. Mair J., Artner-Dworzak E., Lechleitner P., Smidt J., Wagner I., Dienstl F., Puschendorf B. (1991) Cardiac troponin T in diagnosis of acute mocardial infarction. Clin. Chem., 37, 845-852.

82. Mach F., Lovis C., Chevloret J.C., Urban P., Unger P.F., Bouillie M., Gaspoz J.M. (1995) Rapid bedside whole blood cardiospecific troponin T immunoassay for diagnostic of acute myocardial infarction. Am. J. Cardiol., 75, 842.-845.

83. Smith S.C., Ladenson J.H., Mason J.W., Jaffe A.S. (1997) Elevation of cardiac troponin I associated with myocarditis. Experimental and clinical correlates. Circulation, 95, 163-168.

84. Veerkamp J.H., Peeters R.A., Maatman R.G.H.J. (1991) Structural and functional features of different types of cytoplasmic fatty acid-binding proteins. Biochim. Biophys. Acta, 1081, 1-24.

85. Glatz J.F.C., Schaap F.G., Binas B., Bonen A., van der Vusse G.J., Luiken J.J.F.P. (2003) Cytoplasmic fatty acid-binding protein facilitates fatty acid utilization by skeletal muscle. Acta Physiol. Scand., 178, 367-371.

86. Gordon J.I., Alpers D.H., Ockner R.K., Strauss A.W. (1983) The nucleotide sequence; of rat liver fatty acid binding protein mRNA. J. Biol. Chem., 258, 3356-3363.

87. Alpers D.H., Strauss A.W., Ockner R.K., Bass N.M. Gordon J.I. (1984) Cloning of a cDNA encoding rat intestinal fatty acid binding protein. Proc. Natl. Acad: Sci. USA, 81,313-317.

88. Kanda T., Nakatomi Y., Ishikawa H., Hitomi M., Matubara Y., Ono T., Muto T. (1992) Intestinal fatty acid-binding: protein as a sensitive marker of intestinal ischemia. Digest. Dis. Sci., 37, 1362-1367.

89. Gollin G., Marks C., Marks W.H. (1993) Intestinal fatty acid binding protein in serum and urine reflects early ischemic injury to the small bowel. Surgery, 113, 545-551.

90. Matarese V., Bernlohr D.A. (1988) Purification of murine adipocyte lipid-binding protein. Characterization as a fatty acid- and retinoic acid-binding protein. J. Biol. Chem., 263, 14544-14551.

91. Dutta-Roy A.K., Huang Y., Dunbar B., Trayhum P. (1993) Purification and characterization of fatty acid-binding proteins from brown adipose tissue of the rat. Biochim. Biophys. Acta, 1169, 73-79.

92. Peeters R.A., Veerkamp J.H., Van Kessel A.G., Kanda T., Ono T. (1991) Cloning of the cDNA encoding human skeletal-muscle fatty acid-binding protein, its peptide sequence and chromosomal localization. Biochem J., 276, 203-207.

93. Offner G.D., Troxler R.F., Brecher P. (1986) Characterization of a fatty acid-binding protein from rat heart. J. Biol. Chem., 261, 5584-5589.

94. Offner G.D., Brecher P., Sawlivich W.B., Costello C.E., Troxler R.F. (1988) Characterization and amino acid sequence of a fatty acid-binding protein from human heart. Biochem. J., 252,191-198.

95. Claffey K.P., Herrera V.L., Brecher P., Ruiz-Opazo N. (1987) Cloning and tissue distribution of rat heart fatty acid binding protein mRNA: Identical forms in heart and skeletal muscle. Biochemistry, 26, 7900-7904.

96. Knowlton A.A., Burrier R.E., Brecher P. (1989) Rabbit heart fatty acid-binding protein. Isolation, characterization, and application of a monoclonal antibody. Circ. Res., 65, 981-988.

97. Borchers T., Hojrup P., Nielsen S.U., Roepstorff P., Spener F., Knudsen J. (1990) Revision of the amino acid sequence of human heart fatty acid-binding protein. Mol. Cell. Biochem., 98, 127-133.

98. Sacchettini J.C., Hauft S.M., Van Camp S.L., Cistola D.P., Gordon J.I. (1990) Developmental and structural studies of an intracellular lipid binding protein expressed in the ileal epithelium. J. Biol. Chem., 265, 19199-19207.

99. Kaikaus R.M., Bass N.M., Ockner R.K. (1990) Functions of fatty acid-binding proteins. Experientia (Basel), 46, 617-630.

100. Jones T.A., Bergfors T., Sedzik J., Unge T. (1988) The three-dimensional structure of P2 myelin protein. EMBO J., 7, 1597-1604.

101. Sacchettini J.C., Gordon J.I., Banaszak L.J. (1989) Crystal structure of rat intestinal fatty-acid-binding protein. Refinement and analysis of the Escherichia coli-derived protein with bound palmitate. J. Mol. Biol., 208,327-339.

102. Scapin G., Spadon P., Mammi M., Zanotti G., Monaco H.L. (1990) Crystal structure of chicken liver basic fatty acid-binding protein at 2.7 A resolution. Mol. Cell. Biochem., 98, 95-99.

103. Muller-Fahrnow A., Egner U., Jones T.A., Ruedel H., Spener F., Saenger W. (1991) Three-dimensional structure of fatty-acid-binding protein from bovine heart. Eur. J. Biochem., 199,271-276.

104. Xu Z., Bernhlor D.A., Banaszak L.J. (1992) Crystal structure of recombinant murine adipocyte lipid-binding protein. Biochemistry, 31 j 3484-3492.

105. Zanotti G., Scapin G., Spadon P., Veerkamp J.H., Sacchettini J.C. (1992) Three-dimensional structure of recombinant human muscle fatty acid-binding protein. J. Biol. Chem., 267, 18541-18550.

106. Haunerland N.H., Jacobson B.L., Wesenberg G., Rayment I., Holden H.M. (1994) Three-dimensional structure of the muscle fatty-acid-binding protein isolated from the desert locust Schistocerca gregaria. Biochemistry, 33, 12378-12385.

107. Benning M.M., Smith A.F., Wells M.A., Holden H.M; (1992) Crystallization, structure determination and least-squares refinement to 1.75 A resolution of the fatty-acid-binding protein isolated from Manduca sexta L. J. Mol. Biol., 228,208-219.

108. Lucke C., Zhang F., Ruterjans H., Hamilton J.A., Sacchettini J.C. (1996) Flexibility is a likely determinant of binding specificity in the case of ileal lipid binding protein. Structure, 4, 785-800.

109. Hohoff C., Borchers T., Rustow B., Spener F., Van Tilbeurgh H. (1999) Expression, Purification, and Crystal Structure Determination of Recombinant Human Epidermal-Type Fatty Acid Binding Protein. Biochemistiy, 38, 12229-12239.

110. Balendiran G.K., Schnutgen F., Scapin G., Borchers T., Xhong N., Lim K., Godbout R., Spener F., Sacchettini J.C. (2000) Crystal Structure and Thermodynamic Analysis of Human Brain Fatty Acid-binding Protein. J. Biol. Chem., 275,27045-27054.

111. Esteves A., Portillo V., Ehrlich R. (2003) Genomic structure and expression of a gene coding for a new faty acid binding protein from Echinococcus granulosus. Biochim. Biophys. Acta, 1631,26-33.

112. Eads J., Sacchettini J.C., Kromminga A., Gordon J.I. (1993) Escherichia coli-derived rat intestinal fatty acid binding protein with bound myristate at 1.5 A resolution and I

113. FABPArg 106~>Gln with bound oleate at 1.74 A resolution. J. Biol. Chem., 268, 26375-26385.

114. Kleinfeld A.M., Storms S., Watts M. (1998) Transport of long-chain native fatty acids across human erythrocyte ghost membranes. Biochemistry, 37, 8011-8019.

115. Ockner R.K. (1990) Historic overview of studies on fatty acid-binding proteins. Moll. Cell Biochem., 98, 3-9.

116. Srimani B.N., Engelman R.M., Jones R., Das D.K. (1990) Protective role of intracoronary fatty acid binding protein in ischemic and reperfused myocardium. Circ. Res., 66, 1535-1543.

117. Weisiger R.A. (2002) Cytosolic fatty acid-binding proteins catalyze two distinct steps in intracellular transport of their ligands. Mol. Cell Biochem., 239, 35-43.

118. Glatz J.F., Paulussen R.J., Veerkamp J.H. (1985) Fatty acid binding proteins from heart. Chem. Phys. Lipids, 38, 115-129.

119. Crisman T.S., Claffey K.P., SaouafR., Hanspal J., Brecher P. (1987) Measurement of rat heart fatty acid binding protein by ELISA. Tissue distribution, developmental changes and subcellular distribution. J. Mol. Cell. Cardiol., 19,423-431.

120. Paulussen R.J., Van Moerkerk H.T., Veerkamp J.H. (1990) Immunochemical quantitation of fatty acid-binding proteins. Tissue distribution of liver and heart FABP types in human and porcine tissues. Int. J. Biochem., 22, 393-398.

121. Borchers T., Unterberg C., Rudel H., Robenek H., Spener F. (1989) Subcellular distribution of cardiac fatty acid-binding protein in bovine heart muscle and quantitation with an enzyme-linked immunosorbent assay. Biochim. Biophys. Acta, 1002, 54-61.

122. Tanaka T., Hirota Y., Sohmiya K.-I., Nishimura S., Kawamura K. (1991) Serum and Urinary human heart fatty acid-binding protein in acute myocardial infarction. Clin. Biochem., 24, 195-201.

123. Kleine A.H., Glatz J.F.C., Van Nieuwenhoven F.A., Van der Vusse G.J. (1992) Release of heart fatty acid-binding protein into plasma after acute myocardial infarction in man. Mol. Cell. Biochem., 116, 155-162.

124. Glatz J.F.C., Kleine A.H., Van Nieuwenhoven F.A., Hermes W.T., Van Dieijen-Visser M.P., Van der Vusse G.J. (1994) Fatty acid-binding protein as a plasma marker for the estimation of myocardial infarct size in humans. Br. Heart J., 71, 135140.

125. Glatz J.F.C., Van der Vusse G.J., Simoons M.L., Kragten J.A., Van Dieijen-Visser M.P., Hermes W.T. (1998) Fatty acid-binding protein and the early detection of acute myocardial infarction. Clin. Chim. Acta, 272, 87-92.

126. Knowlton A.A., Apstein C.S., SaoufR., Brecher P. (1989) Leakage of heart fatty acid binding protein with ischemia and reperfusion . in the rat. J. Mol. Cell. Cardiol., 21, 577-583.

127. Wodzig K.W.H., Pelsers M.M.A.L., Van der Vusse G.J., Roos W., Glatz J.F.C. (1997) One-step enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for plasma fatty acid-binding protein. Ann. Clin. Biochem., 34,263-268.

128. Watanabe K., Wakabayashi H., Veerkamp J.H., Ono Т., Suzuki Т. (1993) Immunohistochemical distribution of heart-type fatty acid-binding protein immunoreactivity in normal human tissues and in acute myocardial infarction. J. Pathol., 170, 59-65.

129. Zschiesche W., Kleine A.H., Spitzer E., Veerkamp J.H., Glatz J.F.C. (1995) Histochemical localization of heart-type fatty acid-binding protein in human and murine tissues. Histochemistry, 103, 147-156.

130. Haastrup В., Gill S., Kristensen S.R., Jorgensen P.J., Glatz J.F.C., Haghfelt Т., Horder M. (2000) Biochemical markers of ischaemia for the early identification of acute myocardial infarction without ST segment elevation. Cardiology, 94, 254-261.

131. Rump R., Buhlmann С., Borchers Т., Spener F. (1996) Differentiation dependent expression of heart-type fatty acid-binding protein C2C12 muscle cells. Eur. J. Cell. Biol., 69, 135-142.

132. Schaap F.G., Specht B., van der Vusse G.J., Borchers T., Glatz J.F.C. (1996) One-step purification of rat heart-type fatty acid-binding protein expressed in Escherichia coli. J. Chromatogr. B Biomed. Appl., 679, 61-67.

133. Specht B., Oudenampsen-Kruger E., Indendoh A., Hillenkamp G., Lezius A.G., Spener F. (1994) N-termal variants of fatty acid-binding protein from bovine heart overexpressed in Escherichia coli. J. Biotechnol., 33, 259-269.

134. Schreiber A., Feldbrugge R., Key G., Glatz J.F.C., Spener F. (1997) An immunosensor based on disposable elrctrodes for rapid estimation of fatty acid-binding protein, an early marker of myocardial infarction. Biosens. Bioelectron., 12, 1131-1137.

135. Siegmann-Thoss C., Renneberg R., Glatz J.F.C., Spener F. (1996) Enzyme-immunosensor for diagnosis of myocardial infarction. Sensors Actuators B, 30, 71m 76

136. Roos W., Eymann E., Symannek M., Duppenthaler J., Wodzig. K.W., Pelsers M., Glatz J.F. (1995) Monoclonal antibodies to human heart fatty acid-binding protein. J. Immunol. Methods, 183, 149-53.

137. Speiger H., Laterveer-Vreeswijk R.H., Glatz J.F.C., Nieuwenhuizen W., Hermens W.T. (2004) One-step immunoassay for measuring protein concentrations in plasma, based on precipitate-enhanced ellipsometry. Anal. Biochem., 326, 257-261.

138. Watanabe T., Ohkubo Y., Matsuoka H., Kimura H., Sakai Y., Ohkaru Y., Tanaka T., Kitaura Y. (2001) Development of a simple whole blood panel test for detection of human heart-type fatty acid-binding protein. Clin. Biochem., 34, 257-263.

139. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, 680-685.

140. George P. (1953) The chemical nature of the second hydrogen peroxide compound formed by cytochrome с peroxidase and horseradish peroxidase. Biochemical Journal, 54, 267-271.

141. Childs R.E., Bardsley W.G. (1975) The steady-state kinetics of peroxidase with 2,2'-azino-di-(3-ethyl-benzthiazoline-6-sulphonic acid) as chromogen. Biochem J., 145, 93-103.

142. Dunford H.B., Stillman J.S. (1976) On the function and mechanism of action of peroxidases. Coordination Chemistry Reviews, 19, 187-251.

143. Ishikawa E., Imagawa M., Hashida S., Yoshitake S., Hamaguchi Y., Ueno T. (1983) Enzyme-labeling of antibodies and their fragments for enzyme immunoassay and immunohistochemical staining. J. of Immunoassay, 4,209-227.

144. Grigorenko V.G., Chubar T.A., Kapeliuch Yu.L., Borchers Т., Spener F., Egorov A.M., (1999) New approaches for functional expression of recombinant horseradish peroxidase С in Escherichia Coli., Biocatal. Biotransform.,17, 359-379.

145. Grigorenko V., Andreeva I., Borchers T., Spener F., Egorov A. (2001) A genetically engineered fusion protein with horseradish peroxidase as a marker enzyme for use in competitive immunoasays. Anal. Chem., 73, 1134-1139.

146. Hamm C.W. (1998) Progress in the diagnosis of unstable angina and perspectives for treatment. Eur. Heart J., 19, 48-50.

147. Pagani F., Bonora R., Bonetti G., Panteghini M. (2002) Evaluation of sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for the measurement of serum heart fatty acid-binding protein. Ann. Clin. Biochem., 39,404-405.

148. De Groot M.J.M., Muijtjens A.M.M., Simoons M.L., Hermens W.T., Glatz J.F.C. (2001) Asessment of coronary reperfusion in patients with myocardial infarction using fatty acid binding protein concentrations in plasma. Heart, 85, 278-285.