Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммунобиологические свойства гибридного белка Т-ФНО-Т

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Иммунобиологические свойства гибридного белка Т-ФНО-Т"

Р Г Б (И 1 О ЯНВ

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ КОНТРОЛЯ, СТАНДАРТИЗАЦИИ И СЕРТИФИКАЦИИ ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРЕПАРАТОВ

На правах рукописи

ЗИНЧЕНКО ЕЛЕНА ВЕНИАМИНОВНА

ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ГИБРИДНОГО БЕЛКА Т-ФНО-Т.

Специальность 03.00.06 - Вирусология

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

Москва - 1995

Работа выполнена в лаборатории генно-инженерных препаратов Государа венного научно-исследовательского института Прикладной Микробиологии Ми нисгерства здравоохранения России

Научные руководители:

доктор ветеринарных наук, член- корреспондент РАСХН

А.Н. Папин

доктор биологических наук

К.Н.Груздев

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Л.Л. Фадеева (НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского, РАМН) кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник В.В. Парфенов (НИИЭМим. Н.Ф. Гамалеи, РАМН) Ведущее учреждение: Научно-исследовательский институ

ветеринарии (г. Казань)

Защита диссертации состоится " " 199 года в часов на зассданш

диссертационного совета Д 120.85.01 по защите диссертаций на соискание ученм' степени доктора наук при Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов

Адрес: 123022, Москва, Звенигородское шоссе, 5, ВГНКИ С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВГНКИ Автореферат разослан " " 1994 года

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат ветеринарных наук Ю.А. Козырев

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работа. Одним из важнейших путей решения задачи повышения сохранности и продуктивности сельскохозяйственных животных шляется разработка и внедрение в ветеринарную практику препаратов, повышающих общий иммунореактивный уровень организма. Решение этих проблем состоит их решения двух взаимосвязанных задач: изучение иммунопатологического действия инфекционных агентов на организм и создание комплексных иммунокорректн-рующих препаратов на основе знаний о их воздействии на иммунный статус здорового организма. (Урбан В.П., 1985, Пшеничников В.А, Грабарев П.А., Гарин Н.С,1991).

На основании изложенного целыо работы является Изучение иммунобиологических свойств гибридного белка, состоящего из фактора некроза опухолей а и тимозина а1.

Поставленная цель достигается решением следующих задач: 1. Изучение иммунобиологических свойств гибридного белка, состоящего из фактора некроза опухолей а и тимозина а1 (Т-ФНО-Т); 2. Отработка технологии получения сухой лекарственной формы Т-ФНО-Т для парентерального применения и изучение физико-биологических свойств готового препарата; 3. Отработка методов контроля готовой лекарственной формы; 4. Изучение безвредности готовой лекарственной формы; 5. Испытание иммунокорректарующих свойств препарата на сельскохозяйственных и домашних животных и птице.

Научная новизна работы: Изучено иммунобиологическое действие гибридного полипептида на все звенья иммунной системы и обоснована целесообразность применения гибридных белковых молекул в качестве иммуномодуляторов вследствие проявления ими общих регуляторных свойств при отсутствии побочного действия.

Практическая значимость работы заключается в том, что она явилась научной основой для разработки нммуномодулирующего препарата НЕОТИМ, предлагаемого для коррекции иммунного статуса сельскохозяйственных и домашних животных и птицы.

Апробация работы. По материалам диссертации сделаны сообщения на

- научных семинарах лаборатории генноинженерных препаратов ВНИИПМ (1993-1995 г.г.)

- заседаниях Ученого совета и проблемной научно-методической комиссии по химиотерапевтическим препаратам ВГНКИ ветпрепаратов (1993-1995)

- на Второй Городской конференции ветеринарных врачей (г.Санкт-Петербург, 1995 Г.)

Публикации. По теме диссертации опубликовано четыре аннотациошшх отчета, одна статья, подано две заявки на предполагаемые изобретения.

Объем работы: диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 114 страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц и 4 рисунка. Библиография включает 169 наименования, из них 112 составляют иностранные работы.

Приложения к работе включают акты об использовании препарата Неотим для профилактики вирусных заболеваний животных и птицы, отзывов на препарат, проекта технических условий на препарат Неотим, лабораторную инструкцию по приготовлению препарата Неотим, отчетов о физико-биологических свойствах препарата Неотим при его хранении в различных условиях.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы и методы.

В ходе выполнения диссертационной работы использовались следующие метода.

2.1.1. Трансформация штамма Е coli SG20050 [1081 плазмидой pThv325. кодирующей синтез белка «1 тимозин - фактор некроза опухолей к — тимозин gl.

2.1.2. Культивирование штамма Е coli SG20050. трансформированного плазмидой pThv325.

2.1.3. Обработка клеточной биомассы с целью выделения телец включения, содержащих гибридный белок.

2.1.4. Хроматографическая очистка.

Очистку белка проводят на носителях ДЭАЭ методами ионообменной хроматографии.

2.1.5. Приготовление препарата на основе хроматографически чистого белка.

2.1.5.1. Очистка раствора белка от мочевины.

Проводилась методом диализа.

2.1.5.2. Количество белковых примесей определялось методом диск-электрофореза в полиакриамидном геле, содержащем додецилсульфат натрия. Хроматографически чистым считается препарат, содержащий до 5 % примесных бактериальных белков.

2.1.5.3. Количество липополисахаридных примесей определялось методом измерения соотношения поглощений белкового раствора при длинах волн 280 нм и 256 нм на спектрофотометре (Schimadzu, Япония). Белок считался очищенным от липополисахаридных примесей при соотношении равном или большем 2.

2.1.5.4 Определение количества гибридного белка в растворе. Для определения количества белка в растворе определялось его поглощение при 280 нм и концентрация белка вычислялась по пропорции:

1,2-1000 мг/мл

полученное поглощение-х мг/мл

2.1.5.5. Стерилизация исходного раствора белка.

Раствор стерилизуют микрофильтрацией на ячейке (Амикон, США) или на полных волокнах с диаметром пор 0,22 мкм.

2.1.5.6. Приготовление смеси белкового раствора со стабилизатором и буферным раствором.

Хроматографически чистый днализованный стерильный раствор белка с содержанием Т-ФНО-Т не менее 300± 10 мкг/мл смешивают со стерильным раствором следующего состава:

полиглюкин. - (1,5-2,0) % На2НР04х12 Н20 - 1,44% МаН2Р04х2 Н20 - 0,15 % N30. - 8,87 %

в соотношении, обеспечивающем расчетную концентрацию белка в конечном растворе 11±1 мкг/мл или 102±5 мкг/мл.

2.1.6. Лиофильное высушивание белка.

Стерильный раствор фасуют в ампулы (11±1 мкг/мл) или флаконы (102±5 мкгДш) по 1 мл, замораживают при темпергпуре полок -40 -70° С и высушивают сублимационным методом до остаточной влажности 3-5 %.

2.1.7. Проверка стабильности лиофилизированного белка с различными крио-протектантами.

В качестве стабилизирующих добавок использовали полиглюкин, желатиноль и сахарозу в концентрации 1~2 %. Сроки хранения были от 3 до 24 месяцев при

температуре 5±2° С и 25±2° С. Активность белка после хранения определяли по индексу стимуляции антителопродукции (см. ниже)

2.1.8. Проверка стерильности лиофильного высушенного препарата.

10 флаконов вскрывают, растворяют каждый в 1 мл стерильной дистиллированной воды и высевают из каждого по 0,1 мл на 10 чашек Петри с мясо-пептонным агаром. Стерильным считается препарат, не дающий роста колоний на 3-й сутки при 37° С.

2.1.9. Испытания полученного препарата лиофильно высушенного гибридного белка с модификацией на С и N конце на общую и хроническую токсичность.

Исследования препарата проводили на белых беспородных крысах, кроликах породы шиншилла и обезьянах павианах гамадрилах. Раствор гибридного белка вводили животным в одно и то же время суток с 9 до 11 часов дня в дозах 10, 50, 200 и 500 мкг/кг массы тела (соответственно 2x10*; 1x10s; 4x10s; lxlO6 ед/кг) внутривенно (в/в), внутримышечно (в/м) или подкожно (п/к). Регистрацию показателей проводили через 2, 5, 24 часа и 14 дней после введения препарата.

Определение гематологических и биохимических показателей крови животных проводили согласно практического руководства к использованию наборов реактивов фирмы "Sigma" (США). Для патоморфологической оценки острой токсичности проводили микроскопическое исследование тканей легких, печени, селезенки, почек, сердца, семенников или яичников. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином.

2.1.10. Питотоксическая активность гибридного белка.

Исследовали на клетках перевиваемой культуры фибробластов мыши L-929.

2.1.11. Влияние гибридного белка на пролиферацию клеток.

3

Оценивали по включению Н -тимидина через 72 ч культивирования.

2.1.12 Влияние гибридного белка на процессы дифференнировки лимфоцитов

Использовали метод клеточного ELISA (СО). Реакцию с субстратом оценивали по оптической плотности при длине волны 429 нм. Индекс экспрессии рассчитывался по формуле:

(До ~ ДФ> — (Дк - ДФ)

(Дк-Дф)

где До — оптическая плотность в опыте при добавлении белка, моноклональ-ных и меченных антител;

Дф - оптическая плотность без добавления моноклональных антител;

Дк — оптическая плотность без добавления препарата белка.

2.1.13. Влияние гибридного белка на фагоцитоз.

Использовали спектрофотометрический метод регистрации уровня поглощения длины волны возбувдения гемоглобина фагоцитируемых эритроцитов. Данные выражали в относительных единицах как отношение показателей экстинкции опытной группы и контрольной.

2.1.14. Анализ влияния гибридного белка на реакцию гиперчувствительности замедленного типа.

Мышей внутрибрюшинно иммунизировали эритроцитами барана с одновременным введением исследуемого белка в дозе 10'7 М.. Для оценки модифицирующего действия исследуемого белка использовали коэффициент, представляющий собой отношение величины реакций в опытной группе (получавшей белок) к контрольной группе (белок не вводили).

2.1.15. Анализ интенсивности антителопродукции.

Проводили по методу Ерне.

2.1.16. Активность естественных киллерных клеток (ЕКК).

В качестве мишеней цитотоксической активности естественных киллерных клеток использовали клетки миелолимфомы YAC-1, меченные Н5-уридином. Цитотоксический индекс рассчитывали по формуле:

(сртК - сртО)хЮО %

сртК

где срт К — счет контрольных лунок с опухолевыми клетками-мишенями и спленоцитами.

2.1.17. Иммунокорректирующие свойства.

Оценивали на модели вакцинации против Yersinia pestis на белых мышах и морских свинках.

Действие препарата в качестве модулятора при вакцинации против вирусных заболеваний проводили на курах при интраназальном введении совместно 2 мкл/голову белка с вакциной Бор 74 ВГНКИ против ньюкаслской болезни кур на Чеховской птицефабрике (Московская обл.).

2.1.18. Статистическая обработка полученных результатов.

Проводилась по критерию Стьюдента.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Результаты получены совместно с сотрудниками НИИ Биоорганической химии Коробко В.Г. и ГосНИИ Прикладной Микробиологии Шмелевым В.А 3.1. Характеристика гибридного белка.

Гибридный белок, кодируемый плазмидой pThy325 представляет собой полипептид с молекулярной массой 23,78 кДа, имеющий следующую аминокислотную последовательность (рис.1)

5 10 15

1 Met Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu Ile Thr Thr Lys 16 Asp Leu Lys Glu Lys Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asp Pro 31 Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val 46 Ala AsnPro Gln Ala Glu Gly Gin Leu Gin Trp Leu Asn Arg Arg 61 Ala Asn Ala leu Leu Ala Asn Gly Val Glu LeuArg Asp Asn Gln 76 Leu Val Val Pro Ser Glu Glu Leu Туг Leu Ile Туг Ser Gln Val 91 Leu Phe Lys GlyGln Gly Cys Pro Ser Thr Yis Val Leu Leu Thr 106 His Thr lie Ser Arg lie Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn 121 Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg GluThr ProGlu 136 Ala Ala Glu Ala Lis Pro Trp Tyr Glu Pro lie Tyr Leu Gly Gly 151 Val Phe Gln Leu Gln Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn 166 Arg Pro Asp Тух Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe 181 Gly lie lie Ala Leu lie Asp Met Ser AspAla Ala Val Asp Thr 196 Ser Ser Glu Ile Thr Thr Lys Asp Leu Lys Glu Lys Lys Glu Aal 211 Val Glu Glu Ala Glu Asn Число аминокислот остатков - 216, из них 19 Ale, 8 Arg, 8 Asn, 13 Asp, 2 Cys, 10 Gln, 22 Glu, 11 Gly, 3 His, 11 Ile, 20 Leu, 14 Lys, 2 Met, 4 Phe, 11 Pro, 19 Ser, 12 Thr, 2 Trp, 7 Туг, 18 Val. Рассчетная изоэлектрическая точка pl=4,46. Синтез его в мик-

робной клетке происходит с формированием телец включения, растворимых в 6М мочевине.

3.2.Хроматогт>афическая очистка гибридного белка Т-ФНО-Т.

Эксперименты проводились с ионообменной группировкой ДЕАЕ, привитой

на агарозе, силикагеле и сфероните (латексный носитель, НИИОЧБ).

Элюция белка 95 % чистоты по белковым и липополисахаридным примесям происходит в 20Мм фосфатном буфере в одну стадию при повышении концентрации мочевины до 6 М и соли ИаО до 250 мМ.

3.3. Влияние состава защитной среды, температуры и сроков хранения препарата на сохранение мономерной формы и иммунобиологические свойстп белка.

Лиофилизированная форма белка с добавками 1% полиглюкииа или желати-ноля стабильно сохраняет его активность и иммуномодулирующие свойства при хранении в течение 2-х лет при температуре 5±2° С.

Другим важным выводом является то, что при утрате мономерной формы от 90±7 до 5±4 %, т.е. при полной деградации гибридного белка, индекс стимуляции антителопродукции падает только па 10 %. Это является основанием для рекомендации перорального применения препарата.

3.4.Результаты исследований гибридного белка на общую и хроническую токсичность.

Результаты по доклиническим исследованиям гибридного белка с модифицированным С или N концом получены совместно с сотрудниками Научно-исследовательского Центра Доклинических испытаний Дядшцевым АР., Михи-ной ЛА, Можаровой Т.И.

3.4.1. Влияние гибридного белка на сердечно - сосудисту систему.

Наблюдаемые колебания частоты сердечных сокращений для крыс находились в пределах 280±70, для кроликов 110125. Показания артериального давления было 110±25 и 115±25 соответственно, т.е. находились в пределах физиологической

нормы у здоровых животных. Профиль ЭКГ у крыс и кроликов в экспериментальных исследованиях не отличался от нормы.

3.4.2. Влияние препарата на массу тела животных.

При измерении массы тела животных контрольной группы и получавших препарат гибридного белка не выявлено тенденции к ее уменьшению или задержке, связанной с дозой или способом введения. Отмечен достоверный прирост массы тела к концу эксперимента (14 дней) у животных опытной группы. У крыс -50±5г, у кроликов - 100±10г, у гамадрилов - от 200 до 400 г.

3.4.3. Влияние препарата гибридного белка на температуру тела животных.

У крыс препарат в дозах 250 и 500 мкг/кг не изменял достоверно ректальную температуру. У кроликов доза препарата 500 мкг/кг при различных способах введения вызывала повышение температуры на 0,8-1,0° С, продолжающееся от 5 до 24 часов после введения препарата. У гамадрилов не выявлено влияния препарата на ректальную температуру.

3.4.4. Влияние препарата на поведенческие реакции животных.

Отмечено, что ни доза, ни способ введения препарата не влияли на характер динамики локомоторной активности и стереотипное поведение. Показано увеличение выносливости крыс на модели "вращающийся стержень".

3.4.5. Влияние препарата на биохимические показатели сыворотки крови.

Измеряли уровень общего белка, холестерина, кератина, мочевины, щелочной

фосфатазы, аспартаттрансаминазы и аланинаминотрансферазы сыворотки крови крыс, кроликов и гамадрилов. Отмечено изменение содержания глюкозы крови у самцов крыс до 260±20 мг/%. Через 5 часов эта величина не отличалась от контрольной группы. У самок крыс изменений уровня глюкозы в крови не наблюдалось.

3.4.6. Гематологические показатели.

Не выявлено влияние препарата на гематологические показатели у всех исследуемых животных.

3.4.7. Патоморфологическая оценка острой токсичности гибридного белка.

В результате проведенных патоморфологических исследований путем макро- и микроскопических исследований тканей легких, печени, селезенки, почек, сердца, семенников и яичников каких-либо изменений, связанных с применением препарата гибридного белка, не обнаружено.

3.5. Результаты исследования иммунобиологического действия препарата гибридного белка.

Результаты получены совместно с сотрудниками Института Иммунологии (п. Любучаны, Моск. обл.) Галактионовым В.Г., Хромых Л.М., Шевяковой Л.Я, Ду-дич Е.И.

3.5.1. Цитотоксическая и цитостатаческая активность гибридного белка на линиях опухолевых клеток in vitro.

Результаты для клеток L-929 приведены в таблице 1

Из данных таблицы следует, что препарат не обладает цитотоксической и ци-тостатической активностью на клетках линии L-929.

Таблица 1

Цитотоксическая и цитостатаческая активность гибридного белка

Белок Единицы активности на мг белка Количество белка (мкг), вызывающего 50% лизис

ФНО 4-10 2,5-10

Т-ФНО-Т 0 -

3.5.2. Пролиферативная активность гибридного белка по отношению к клеткам лимфоидных органов.

Применение митогенов моделирует систему антиген-иммуномодулятор. Показано, что в этой системе наблюдается отчетливое усиление пролиферативного действия на клетки тимуса и селезенки.

Результаты приведены в таблице 2.

Таблица 2

Влияние гибридного белка Т-ФНО-Т на пролиферацию клеток тимуса в присутствии фитогемагглютинина, определяемое по включению Н3 тимидина (тыс. имп./мин)

Доза Т-ФНО-Т мкг/мл Доза ФГА (мкг/мл)

0 0 2,5 5,0 10,0

0,01 1,8 ±0,5 1,0 ±0,1 2,6 ±0,4 4,9 ±0,3

0,1 1,2 ±0,6 1,2 ±0,2 2,9 ±0,2 11,1 ±0,1

1,0 1,5 ±0,1 2,0 ±0,3 5,1 ±0,8 -

10 3,0 ±0,5 6,5 ±0,6 13,1 ±3,0 -

50 4,5 ±1,2 10,2 ±3,7 4,2 ±0,6 -

Оптимальной дозой митогена без применения Т-ФНО-Т является 10мкг/мл, так как при этой концентрации наблюдается наибольший индекс стимуляции митоза, определяемый по включению Н3 тимидика - 4,8 ± 3. Добавление в систему лимфоциты - митоген гибридного белка Т-ФНО-Т уменьшает необходимую дозу митогена дня получения стимуляции деления до 10,2 примерно в 4 раза.

Влияние гибридного белка на интенсивность деления клеток селезенки в присутствии гибридного белка показано в таблице 3. Данные результаты свидетельствуют о потенциальной способности препарата формировать иммунный ответ на Т-зависимые антигены, к которым относятся и вирусные антигены.

Таблица 3

Влияние гибридного белка Т-ФНО-Т на пролиферацию клеток селезенки в при сутствии конканавалина А (Соп А), определяемое по включению Н3 тимидина

(тыс. имп./мин)

Доза Т-ФНО-Т мкг/мл Доза Соп А (мкг/мл)

0 0 1,5 3,0

0,01 33,8 ±1,3 105,4 ±5,8 164 ±11,3

0,1 31,8 ±1,8 120,2 ±3,2 169,7 ±8,9

1,0 54,2 ± 3,4 141,8 ±3,0 226,0 ± 10,8

10 131,3 ±4,4 172,2 ±8,1 205,5 ± 24,0

50 154,3 ±5,1 205,9 ±21,8 214,7 ±15,6

В отсутствии митогенного стимула наибольшее стимулирующее действие гибридный белок оказывает на клетки лимфатических узлов. Данные приведены в таблице 4.

При этом отмечено, что усиление действия прямопропорционально концентрации модулятора. Один из составных компонентов гибридного белка - фактор некроза опухолей практически не оказывает усиливающего действия на пролифе-

рацию интактных клеток исследованных органов при всех испытанных концентрациях.

Таблица 4

Влияние препаратов белков на пролиферацию лимфоидных клеток, определяемое по включению Н3 тимидина

Препарат белка

Орган Доза мкг/мл ФИО Т-ФНО-Т

Тимус - 1,2 ±0,2 1,8 ±0,5

0,01 1,1 ± ОД 1,2 ±0,6

0,1 0,9 ±0,1 1,0 ±0,1

1,0 0,8 ±0,1 1,5 ±0,1

10 - 3,0 ±0,5

50 - 4,5 ± 1,2

Селезенка - 9,6 ±0,4 33,8 ±1,3

0,01 9,7 ±0,7 31,8 ±2,1

0,1 10,4 ±0,5 38,3 ±2,1

1,0 9,3 ±0,7 54,2 ±3,1

10 - 131,0 ±4,4

50 - 154,0 ±5,1

Лимфатические узлы - 14,8 ±0,1 14,8 ±0,4

0,01 14,2 ± 0,6 12,9 ±3,2

од 11,3 ± 1,1 29,0 ±0,8

1,0 15,1 ±0,7 117,2+2,5

30 - 274,6 ± 5,5

50 13,2 ±0,5 193,0 ±7,7

100 8,6 ±0,1 253,1 ±34,9

3.5.3. Влияние препарата гибридного белка на экспрессию маркеров диффе-ренцировки тимоцитов.

Сравнительный анализ экспрессии маркеров дифференцировки тимоцитов свидетельствует, что тимозин al в испытанных концентрациях практически не влиял на дифференцировку антигенов первого класса главного комплекса гисто-совместимости. Не установлено предпочтительного воздействия на экспрессию маркеров CD4 и CD8. Результаты представлены в таблице № 5.

Таблица 5

Индекс стимуляции дифференцировки тимоцитов исследуемых белков

Антигенный маркер

Препарат Доза (М) Н-2к CD4+ CD8+

Тимозин al 5x10 1,39 ±0,17 1,4 ±0,3 1,29 ±0,28

5xl0"'z 1,9 ±0,6 1,22 ±0,12 1,39 ±0,28

5х10"ш - 1.75 ±0,1 -

5x10'" 1,6 ±0,5 1,26 ±0,22 1,42 ±0,32

ФНО 5хЮ"'4 1,44 ±0,22 1,58 ±0,26 1,59 ±0,22

5x10"" 1,7 ±0,6 1,11 ±0,07 1,21 ±0,22

5х10"'и 0,88 ±0,31 1,00 ±0,16 1,01 ±0,66

5x10"' 0,86 ±0,47 0,77 ±0,57 1,1±0,3

Т-ФНО-Т 5х10"и 1,77 ±0,28 1,91 ±0,16 0,97 ±0,14

5x10"" 1,5-±-,18 1,10 ±0,06 0,85 М 0,38

5х10-ш 1,7 ±0,3 1,01 ±0,07 0,7 ±0,2

5x10-" 2,32 ±0,05 1,07 ±0,12 0,7 ±0,3

Отсутствие прямого влияние тимозина а1 на экспрессию маркеров дифференцировки и антигенов главного комплекса гистосовместимости свидетельствуют о невозможности его использования в лечебных и профилактических целях в указанных концентрациях.

-14 -8

Препарат ФНО при повышении концентрации от 5-14 до 5-10 М отчетливо снижал число маркеров антигенов первого класса главного комплекса гистосов-местимости и снижал экспрессию маркеров дифференцировки как Т-хелперов и Т-супрессоров.Вследствие этого также можно считать исследованные дозировки ФНО непригодными для терапевтических целей.

Действие гибридного белка, в состав которого входят оба описанных выше полипептида, проявляется в усилении экспресс™ антигенов первого класса главного комплекса гистосовместимости и уменьшении экспрессии маркеров Т-супрессоров при увеличении концентрации, увеличении экспрессии маркеров Т-хелперов при увеличении концентрации. Эти свойства дают возможность формировать определенный иммунный ответ путем изменения действующих концентра--14

ций. Так, в дозе 510 М можно усилить ответ на Т-независимые антигены, стимулировать антибактериальный ответ и восстановить состояние иммунного

-8

дефицита. Увеличивая дозы препарата до 5-10 М, можно модулировать адекватный противовирусный ответ при вакцинации и лечении:

3.5.4. Влияние гибридного белка на активность естественных киллерных клеток (ЕКК).Результаты представлены в таблице 6

Таблица 6

Влияние гибридного белка на активность естественных киллерных клеток

Белок Коэффициент активности ( отношение эффектор: мишень)

25:1 50:1

Контроль 1 1

Тимозин 1,11 -

ФНО 0,96 1,09

Т-ФНО-Т 1,31 1,51

Сравнительный анализ действия исходных полипептидов и их гибрида показывает, что только гибридный белок Т-ФНО-Т оказывает усиливающее действие на активность естественных киллерных клеток.

3.5.5. Влияние гибридного белка на активность макрофагов. Усиливающее действие гибридного белка на активность макрофагов проявляется при двух оптимальных концентрациях: 0,32-10 М и 0,32-10 6 М.

3.5.6. Влияние гибридного белка на интенсивность антителопродукции.

Изучение влияния гибридного белка на накопление антителообразующих клеток показало, что действие гибридного белка при его концентрации 0,32х10"7 примерно на порядок выше, чем у ФИО и в два раза выше, чем у химозина al в тех же концентрациях.

Введение в культуру клеток селезенки гибридного белка Т-ФНО-Т в дозе 10 и 50 мкг/мл в качестве костимулятора митогена пролиферации В-клеток - липопо-лисахарида Е. coli приводит к увеличению ЛПС-огвета в 7-8 раз.

Пролиферация клеток B-клеток селезенки, примиронапных поверхностным антигенным комплексом Francisclla lularensis совместно с гибридным белком в концентрации 5,5х10~7, увеличивается по сравнению с контролем в 7,5 раз..

3.5.7. Влияние белков на реакцию гиперчувствитслыюсти замедленного типа.

Данные по влиянию гибридного белка показывают, что в его присутствии в

исследованных концентрациях она увеличивается на 70 %.

3.5.8. Исследование влиянии гибридного белка па эффективность вакцинации.

Т-ФНО-Т достоверно повышают LI)^ вирулентного штамма Y. pcslis при нп-

гратрахеалыюм заражении в 100 раз (Р<(),001).

3.5.9. Исследование влияния гибридного белка па защитные реакции при ип-траиазальной вакцинации.

Результаты приведены в таблице 7.

Таблица 7

Распределение по титру (%) антител в РТГА против болезни Ньюкасла после вакцинации

Количество (%) птицы в опыте и контроле

титр сывороток в РТГА но группам Вакцина + Т-ФНО-Т Вакцина

0 0 16

1/2 - 1/4 8 24

1/8 - 1/32 80 44

1/64 и более 12 16

Введение иммуномодулирующего препарата в дозе 2 мкг на голову практически выровняло иммунный статус опытной группы. Эффективность вакцинации в опытной группе составила 92%. В контрольной группе птицы у 16% поголовья практически не выработалось антител на введение вакцины, в опытной группе таких особей не было.

5. ВЫВОДЫ

1. Отработаны методы выделения и очистки гибридного белка Т-ФНО-Т па ПЕЛЕ носителях, обеспечивающие одиостадийиость процесса и получение раствора белка с концентрацией 300-1000 мкг/мл 95% хромагографичсской чистоты и 70-95% чистоты но бактериальным липополисахаридом.

2. Сухая лекарственная форма препарата для парентерального введения стабильно сохраняет биологические свойства при хранении в лиофилшировапном состоянии в течение двух лет, в регидратированном - н течение десяти суток при 4°С.

3. Оптимальная дозировка препарата определена 10 мкт на 10 кг массы животного. Препарат безвреден для лабораторных и сельскохозяйственных животных, у него не установлены побочные эффекты в дозировках, пс превышающих ста действующих концентрации.

4. Препарат Нсотим имеет иммунобиологические свойства, отсутствующие у его компонентов и являющиеся результатом синергизма входящих в пего цитоки-нов. При этом были сохранены положительные свойства входящих в гибридный белок компонентов.

5. На эксперимептшшпых моделях интенсивности антителоиродукции, экспрессии поверхностных иммуноглобулинов классов О и М, пролиферации клеток селезенки и в реакции бласпраисформации показано усиливающее влияние гибридного белка Т-ФНО-Т на гумормыюе звено иммунитета.

6. При изучении пролиферации интактных и нримироваппых клеток тимуса и лимфатических узлов, дифференцировки тимоцитов и реакции гн-перчупствителыюсти замененного типа показано зависимое от концентрации гибридного белка усиление или ослабление клеточного звена иммунитета, что даст широкие возможности его использования.

7. Эксперименты по изучению поглотительной функции макрофагов и активности естественных киллерпых клеток показали наличие у гибридного белка Т-ФНО-Т активности, усиливающей пусковые механизмы захвата и презентации тимусзависимых и тимуснсзаиисимых антигенов.

8. На моделях лабораторных, домашних и сельскохозяйственных животных и птицы показало иммуномодулирующее действие препарата "Нсотим" при вакцинации и восстановлении иммунного статуса при инфекционных заболеваниях.

6. ПРАКТИЧЕСКИЙ ВЫХОД.

Результаты исследований, изложенные н дисеергацин, использованы при разработке препарата с нммуномодулируюпшми спопсмшш Нсошм и включают:

Техническое задание па разработку продукции нопого вида: "Иммуномодулирующий препарата НЕОТИМ"

- Технические условии производства: Иммуномодулирующий препарат НЕОТИМ"

- Временную инструкцию по изготовлению и контролю препарата Нсошм.

- Временное наставление по применению препарата Неопш.

Указанная техническая документация утверждена директор^ ВГНКИ вешре-наратов.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

1. Разработка технологии получения рекомбинантного белка на основе фактора некроза опухолей и и тимознна al и качестве препарата для лечения детских онкологических заболевании. Анпотациоиный отчет по теме БС-25/92. Архип Гос НИИ ПМ на нравах рукописи, 1992, 103 с. Шмелев H.A., Бунина З.Ф., Зинченко E.Ii. Кудрявцева Т.И.

2. Разработка технологии получения рекомбинантного белка па основе фактора некроза опухолей а и тимознна al в качестве препарата для лечения детских онкологических заболевании. Аннотационпый отчет по теме БС-25/92. Архив Гос НИИ ПМ па правах рукописи, 1993, 150 с. Шмелев H.A., Бунина З.Ф., Кудрявцева Т.И., Зинченко E.H.

3. Схема лечения и профилактики вирусных заболевании собак препаратами "Бактоиеотим" и " Неофсрон". Договор ИПМ 05/93, на правах рукописи, архив "Биоцептр", 1993. Зинченко Е.Н

4. 0|чст о стабильности препарата гибридного белка при различных условиях и сроках хранении. Договор ИПМ 05/93, этап 2, па правах рукописи, архив "Биоцептр", 1993. Зинченко E.H., Зинченко Н.Б.

5. Получение группы белков, состоящих из ([(актора некроза опухолей а и тимознна <х1.//Мол. генетика, микробиология, вирусология.-N1.- 1995.-е 9-14. Шмелев H.A., Бунина З.Ф., Зинченко E.H., Кудрявцева Т.Н., КороГжо Н И.

По теме диссертации поданы и приняты к рассмотрению дне заявки па предполагаемые изобретения:

А 61К 39/00 Препарат с иммупомодулирующими свойствами. А.Н.Панин, Зинченко Е.В., В.Б.Зинченко, В.А Шмелев, В.М.Колышкип. Номер rocpcruciрации 9501728, дата приоритета 20 феврали 1995г.

А61К 39/00 Иммупопробиотичсский препарат. Зинченко Е.В., Зинченко В.В., Папин АН., Серых H.H., Малик Е И. Номер гоерегистрации 95107090, дата приоритета 5 мая 1995г.

Соискатель

Е.В. Зинченко