Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммунный ответ рыб - объектов аквакультуры на вакцинацию против бактериальных заболеваний

ВАК РФ 03.00.10, Ихтиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гусева, Наталья Владимировна, Москва

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ПРЕСНОВОДНОГО РЫБНОГО ХОЗЯЙСТВА

на правах рукописи

ГУСЕВА НАТАЛЬЯ ВЛАДИМИРОВНА

ИММУННЫЙ ОТВЕТ РЫБ - ОБЪЕКТОВ АКВАКУЛЬТУРЫ НА ВАКЦИНАЦИЮ ПРОТИВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Специальность 03. 00. 10 Ихтиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Юхименко Л.Н.

Москва 1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..........................................................................................................................................6

ГЛАВА!. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................................................10

1. Иммунная система рыб....................................................................................................................................10

2. Иммуномодулирующие факторы....................................................................................................................17

3. Вакцинация рыб как биологический способ модуляции иммунного ответа ..............................................................................................................22

4. Распространение подвижных аэромонад в природе и характеристика вызываемых ими заболеваний..........................................................................................................27

5. Факторы патогенности подвижных аэромонад......................................................................28

6. Иммунопрофилактика заболеваний, вызываемых подвижными аэромонадами ...........................................................................................31

7. Распространение Aeromonas salmonicida в природе и характеристика вызываемых ею заболеваний.............................................................34

8. Факторы патогенности Aeromonas salmonicida.........................................35

9. Иммунопрофилактика заболеваний, вызываемых A. salmonicida ..........37

10. Распространение Vibrio anguillarum в природе и характеристика заболевания................................................................................................41

11. Факторы патогенности Vibrio anguillarum.....................................................................43

12. Иммунопрофилактика заболевания, вызываемого

Vibrio anguillarum.......................................................................................44

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ..................................................................48

ГЛАВА III. ИММУННЫЙ ОТВЕТ РЫБ НА ВВЕДЕНИЕ ВЮС-2 И

(3-1,3-ГЛЮКАНА.................................................................................................60

1. Иммунный ответ карпа на введение препаратов..................................................60

Гематологические показатели......................................................................60

Иммунологические показатели...........................................................................................................61

Продукция антител......................................................................................61

Адгезия бактерий к эпидермальной слизи рыб .......................................66

Бактерицидная активность слизи и сыворотки рыб............................. 66

Фагоцитарная активность клеток селезенки рыб ............................... 68

Активность миграции макрофагов в слизистую конечного отдела

кишечника рыб....................................................................................... 74

Результаты гистологических исследований.............................................. 75

Результаты определения защитного эффекта препаратов..................... 76

Определение ЛД » культур A. hydrophila и A. sobria ......................... 76

Защитный эффект ВЮС-2 и (3 - 1,3 - глюкана при экспериментальном аэромонозе карпа .................................................................... 82

2. Иммунный ответ радужной форели............................................................ 86

Гематологические показатели.................................................................... 86

Иммунологические показатели .................................................................. 89

Продукция антител................................................................................... 89

Бактерицидная активность эпидермальной слизи рыб......................... 90

Адгезия бактерий к эпидермальной слизи рыб...................................... 91

Фагоцитарная активность клеток селезенки рыб................................... 95

Активность лизоцима сыворотки и слизи рыб......................................... 97

Активность миграции макрофагов в слизистую конечного отдела

кишечника рыб .....................„................................................................... 98

Результаты гистологических исследований............................:................... 98

Результаты определения защитного эффекта препаратов....................... 99

Заражение радужной форели высокими концентрациями

V. anguillarum ............................................................................................ 99

Заражение радужной форели низкими концентрациями

V. anguillarum ............................................................................................. 99

ГЛАВА IV. ИММУННЫЙ ОТВЕТ РАЗЛИЧНЫХ ВОЗРАСТНЫХ ГРУПП

КАРПА НА ВАКЦИНАЦИЮ ВЮС-2.......................................................... 108

Специфический иммунный ответ различных возрастных групп карпа на вакцинацию ВЮС-2 в экспериментальных условиях............ 108

Иммунный ответ различных возрастных групп карпа на

вакцинацию ВЮС-2 в производственных условиях............................... 108

ГЛАВА V. ОСОБЕННОСТИ ИММУННОГО ОТВЕТА РЫБ НА ВАКЦИНАЦИЮ БАКТЕРИНОМ FUROGEN * И ВАКЦИНОЙ ВЮС-2................ 112

Продукция агглютинирующих антител сыворотки крови рыб............... 112

Продукция преципитирующих антител эпидермальной слизи рыб...... 113

Уровень преципитирующих антител сыворотки иммунизированных

рыб к экстраклеточным продуктам A. salmonícída ................................. 114

Защитный эффект вакцины и бактерина при экспериментальном

фурункулезе................................................................................................ 114

ГЛАВА VI. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ИММУННОГО ОТВЕТА

РАДУЖНОЙ ФОРЕЛИ НА ВВЕДЕНИЕ ВАКЦИНЫ ВЮС-2 И . р - 1,3 - ГЛЮКАНА ПРИ ПОДОСТРОМ И ХРОНИЧЕСКОМ.

Т-2-МИКОТОКСИКОЗЕ............................................................................ И 8

Гематологические показатели................................................................. 118

Гематологические показатели "чистых" контрольных групп............... 113

Гематологические показатели при подостром Т-2-м и кото кс и козе........ 121

Гематологические показатели при хроническом Т-2-микотоксикозе ... 122

Активность фагоцитоза клеток селезенки радужной форели................. 125

Активность фагоцитоза клеток селезенки рыб "чистых" контрольных

групп......................................................................................................... 125

Фагоцитарная активность клеток селезенки рыб при подостром

Т-2-микотоксикозе..................................................................................... 131

Фагоцитарная активность клеток селезенки рыб при хроническом

Т-2-микотоксикозе..................................................................................... 134

ГЛАВА VII. ПРОТЕКТИВНЫЕ СВОЙСТВА ВАКЦИНЫ ВЮС-2 ПРОТИВ

НЕКОТОРЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ................................ 138

Протективные свойства вакцины ВЮС-2 против экспериментального вибриоза лососевых, вызванного V. anguillarum.................................. 138

Протективные свойства вакцины ВЮС-2 при энтеросептическом заболевании смешанной этиологии ремонтно-маточного стада

канального сома ...........................................................................................................140

ЗАКЛЮЧЕНИЕ................................................................................................................................................................................................142

ВЫВОДЫ....................................................................................................................................................................................................................155

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ..................................................................................................................................157

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................................158

ВВЕДЕНИЕ

За последние десятилетия во многих странах мира заметно увеличилось использование рыбы, являющейся важным источником обеспечения человека легко-усваиваемой белковой пищей. Усилившийся промысел в морях привел к оскудению рыбных запасов и уменьшению в нем отдельных наиболее ценных объектов, ранее доминировавших в уловах. В то же время лишь 5 % от общего объема добываемой рыбы и морепродуктов используется в наиболее ценном свежем виде (Мамонтов и ДР-, 1997).

В современных условиях четко обозначилась необходимость активного развития как пресноводной, так и морской аквакультуры .

Однако выращивание рыбы в промышленных условиях сопряжено с воздействием разнообразных стрессовых факторов, таких как резкие колебания температуры воды (физические); дефицит кислорода, накопление в воде аммиака и других метаболитов, высокие уровни органического загрязнения, сублетальные дозы тяжелых металлов и токсических веществ (химические); использование кормов низкого качества, недокорм, частая смена рациона (кормовые); травмы, ушибы (травматические); стресс, вызванный хендлингом - перевозка, переуплотненные посадки, тотальные обловы и другие рыбоводные операции ( Ведемейер и др., 1981; Головин, 1987, Конев, 1997).

Любые изменения, происходящие в среде обитания, отражаются на физиологическом состоянии и общей резистентности рыб и способствуют развитию возбудителей инфекционных и инвазионных болезней (Ванятинский и др., 1979; Бауер и др., 1981). В аквакультуре все чаще появляются новые, ранее не известные заболевания, приводящие не только к снижению общей продуктивности, но и к массовой гибели рыбы (Рудиков, Грищенко, 1985; Каховский, 1990; Борисенко, 1991). Потери в случае возникновения эпизоотии бактериальных заболеваний, таких как фурункулез, вибриоз, иерсиниоз и других, достигают 70-100 % (Бауер, 1983; Austin, Austin, 1993; Newman, 1993; Noga, 1995).

На основании вышеизложенного, можно сделать вывод, что в условиях высокоинтенсивной аквакупыуры контроль инфекционных заболеваний приобретает особо важное значение. В настоящее время с этой целью используется шесть основных методов, включающих в себя : высокую культуру выращивания рыбы (Austin, Austin, 1989); получение генетически устойчивых к тому или иному заболеванию породных групп и отдельных видов (Илясов 1989; Cipriano, 1998); полноценное кормление (Щербина, 1975; Durve, Love!!, 1932; Щербина и др., 1992); предотвращение распространения заболеваний посредством введения карантинов и наложения ограничений на перемещение инфицированной рыбы; вакцинация (Ellis, 1988; Newman, 1993); использование широкого спектра антибактериальных препаратов (Austin, Austin, 1993).

Из всех известных методов наиболее широкое распространение до последнего времени имело использование антимикробных препаратов как для наружного (формалин, малахитовый зеленый, хлорамин Т и др.), так и для внутреннего применения (антибиотики, нитрофураны, сульфаниламиды и др.) ( Бауер и др., 1977,81; Warren, 1980; Рудиков, Грищенко, 1985). Однако, в связи с высокой стоимостью препаратов, краткосрочной защитой, существующими ограничениями по продаже рыбы, подвергавшейся лечению, снижением их эффективности в результате появления антибиотикоустойчивых микроорганизмов и существованием явной опасности для человека и окружающей среды, в последние десятилетия все большее внимание уделяется вакцинации, как. одному из наиболее эффективных и экологически чистых методов профилактики заболеваний рыб.

Многочисленные работы по изучению иммунитета рыб, факторов патогенное rw возбудителей и иммунопрофилактике позволили создать высокоэффективные внкцины и иммуностимулирующие препараты (Anderson, 1997; Evelyn, 1997). В настоящее время в мировой рыбоводной практике широко используются бакгерины против таких заболеваний лососевых как вибриоз, вызываемый бактериями Vibrio anguHlarum, V. ■ ordafii, V. salmonicida, и фурункулез, вызываемый Aeromonas salmonicida. Ведутся работы над созданием вакцин против бактериальной почечной

болезни (Renibacterium salmortinarum) w риккетсиальной септицемии (Pisciíick&ísm salmonis) лососевых, кишечной септицемии канального сома (Edwardsiella híaluri), энтерококковой септицемии (Ent&rococcus seríolicida) и пастереллеза (Pasteur&lla pisíicída) морских рыб. В 1988 году в лаборатории ихтиопатологми ВНИИПРХ совместно с биохимиками Карельского научного центра РАН создана вакцина ВЮС-2 против аэромоиоза (бактериальной геморрагической септицемии) рыб, показавшая высокую степень защиты как в лабораторных, так и производственных испытаниях (Юхименко и др., 1396, 1998). Несмотря на полученные положительные результаты;, влияние отдельных антигенов и вакцин на иммунную систему рыб, а также специфичность вызываемого ими иммунитета остаются до конца не изученными, а зачастую и неизвестными. Имеющиеся es доступной нам литературе данные в большинстве случаев характеризуют лишь продукцию специфических антител на введение» той или иной вакцины и уровень вызываемой ею защиты. Не менее важным, на наш взгляд, является изучение эффективности вакцинации на фоне стрессовых факторов, связанных с искусственным выращиванием рыбы.

На основании вышеизложенного, цель работы заключалась в изучении имму-ногоикых спийстн вакцины ВЮС-2 при оптимальных условиях содержания рыбы м на фоке иммуносупрессирующих факторов мкчм^ t ього ответа различных водов рыб на ее введение, а также в оценке защитно« о н чедокта вакцины против некоторых бактериальных заболеваний в сравнении с широко используемыми в зарубежной аква-культуре коммерческими иммуностимулирующими препаратами

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

1. Изучить неспецифический иммунный ответ карпа ( Cyprinus carpió L) w радужной форели (Oncorhynchus rnykiss) к<* пгмдепие вакцины ВЮС-2 и (3 -1,3 глюкана.

2. Оценить специфический и ивыiei мифический иммунный ответ различных возрастных групп карпа на вакцинацию ВЮС-2 в экспериментальных и производственных условиях.

3. Сравнить эффект бактерина Furogen* и ВЮС-2 на иммунный ответ кумжи

(Salmo trutta) и защитное действие препарат oí * про i иш фурункулеза.

4. Изучить иммуннный ответ радужной форели на введение вакцины ВЮС-2 и Э -1,3 глюкана при подостром и хроническом Т-2-микотоксикозе.

5. Определить защитный эффект вакцины ВЮС-2, против вибриоза лососевых, вызываемого бактерией \ffbm апдиШагит, и знтеросептического заболевания смешанной этиологии ремонтно-маточной группы канального сома.

Я до глубины своего сердца благодарна своим родителям |Гусгпу Нпадимиру Сергеевичу и Гусевой Галине Семеновне, а также своей сестре

Одинцовой Елене Владимировне, оказавшим мне огромную помощь в подготовке и выполнении работы и поддержавших меня в этот период.

Я выражаю признательность своему руководителю Юхименко Людмиле Никольские, предоставившей мне возможность работы с вакциной ВЮС-2 и вдохновившей меня на ее выполнение.

Я выражаю особую благодарность Циприано Рокко Кармин и Форд Ларисе Анн, давшим мне правильное представление об иммунологии и вакцинологии рыб и оказавшим мне большую помощь при выполнении и написании диссертации, а таюке Галашу Владимиру Тимофеевичу за помощь в проведении экспериментов, подготовке и чтении гисгопропарелог'.

Мне также хотелось бы поблагодарить всех сотрудников лаборатории ихтио-патологии ВНИИПРХ, национальной лаборатории здоровья рыб США, кафедры охраны рыб и дикой природы и экспериментальной базы Хагерман университета штата Айдахо (США) за всестороннюю помощь и поддержку в период проведения экспери ментальн ых работ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Иммунная система рыб

Устойчивость рыб к разнообразным инфекционным агентам определяется деятельностью многих органов и их систем, а также образуемых ими гуморальных факторов врожденного и приобретенного иммунитета (Грищенко, Рудиков, 1985). Эта сложная система защитных факторов включаются под влиянием антигенного раздражителя и направлена на его разрушение и выведение из организма.

Прежде всего микроорганизмам необходимо преодолеть физические и химические барьеры, составляющие первую линию защиты против инвазии патогена. Особая роль здесь отводится эпителиальным покровам кожи, жабр и пищеварительного тракта, которые в норме, наряду с осморегуляцией, играют важную роль в качестве механических средств противомикробной и противовирусной защиты (Lamers, 1985; Лукьяненко, 1989).

Не менее важной функцией эпителиальных слоев является продукция слизи локализованными в них слизистыми клетками (Harris et at., 1973; Pickering, 1974). Слизь механически препятствует колонизации микроорганизмов на эпителиальных поверхностях, о чем свидетельствует усиление ее продукции в стрессовых условия и под воздействием возбудителей инфекций (Pickering, Массу, 1977). Кроме этого, она имеет сложный биохимический состав, благодаря которому приобретает бакте-риолитическое, антивирусное и противогрибковое свойства (Ourth, 1980; Lamers, 1985). Подобные характеристики слизи объясняются присутствием в ней лизоцима, С-реактивного протеина, иммуноглобулинов и комплемента (Ramos, Smith, 1978; Dorson, 1981; Itami et al., 1988; Takahashi et alM 1992; Rombout et al., 1993).

Все механизмы первой линии защиты неспецифичны и не обеспечивают развитие памяти к антигену в иммунной системе хозяина.

Процессы, обеспечивающие вторую линию защиты, активизируются только при внедрении патогена. Подобные механизмы функционируют на низком уровне специфичности и способны обеспечить развитие кратковременной памяти к антиге-

ну (Lamers, 1985).

Кровь, лимфа и ткани рыб содержат множество различных веществ, обладающих выраженным противомикробным действием (интерферон, хитиназа, С-реактивный белок и др.). Они различаются по химической природе и структуре и характеризуются определенной избирательностью. Комплекс данных веществ создает мощный гуморальный "барьер" (Лукьяненко, 1989). Так, например, бактерицидная активность сыворотки крови обеспечивается комплексным действием пропердина, комплемента, лизоцима и ß-лизина.

Интерферон - низкомолекулярный клеточный белок, который синтезируется под влиянием различных индукторов, получивших название интерфер