Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация и характеристика гастрин/холецистокинин-связывающих белков головного мозга

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Идентификация и характеристика гастрин/холецистокинин-связывающих белков головного мозга"

днепропетровский ордена трудового красного знамени

государственный университет им. эоо-ЛЕТгия воссодаштя украины с россией

На правах ругописи

РУДЕНКО Ольга Анатольевна

НДЕНШИКАШЯ И ХАРАКТЕРИСТИКА ГАС-тШДОЛВДСТОЮЙШ-СВЯЗЫВЯЩОС БЕЛКОВ ГОЛОШОГО МОЗГА

( 03.00,04 - бнохиикЯ )

автореферат

диссертации на соискание ученой степени кшкпдата биологических наук

Днепропетровск - 1550

Работа выполнена ка кафедре биофизики и биохимии Днепропетровского Ордена Трудового Красного Знамени государственного университета имени ЭОО-лэтня воссоединения Украины с Россией

- доктор биологических наук профессор Березин В.Д.

- доктор биологических наук профессор Велик Я,В.

- доктор биологических наук ст.н.с. Шелекетина И.И.

- Центр психического здоровья АШ СССР (г. Москва )

Защита состоится 9/9" ПМО/МЛ 1990 года в часов

на заседании специализированного' совета К 053.24,0^ по присуждений ученой степени кандидата биологических наук при Днепропетровской государственном университете по адресу: 300625, г, Днепропетровск, ГСП-10, пр. Гагарина, 72, университет, биолого-вкологичеосий факультет, корп. 9, ауд. 101.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Днепропетровского госунивврситета.

Автореферат разослан "/5 9 ЦРЛоД Х-1990 года.

Научный руководитель Официальна оппоненты

Ведущее учреждение

Ученый секретарь специализированного совета доцент

Черпая В.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТУ

Актуальность проблемы. В посладнее десятилетие Епачятэльно возрос интерес исследователей к регуляторным пэптидвн. Регуляторы пептидной природы «вдаются не только наиболее многочисленной группой физиологически активных веществ, по и обладав* плейотропньм действием, а также полифункциоиалъш. Обнаружение традиционных гормонов желудочно-кишечного тракта в нервной системе, по-видимому, свидетельствует о существовании в организме единой по химической природе системы передачи информации. Одни и те же, либо подобные по структуре пептиды могут реализовать передачу соответствующей информации несколькими путями: эндокринным ( циркуляция в крови ), паракринньа ? влияние на соседние близко расположенные клетки ), найроэндокркнкш и нервным. Данные пептиды оказались непременными участниками передачи сигнала в синапсе, его модуляция и дистантной регуляции вне синапса. Не исключено, что спектр кх активности еще вире.

Холецистокинин и гастрин, обнаруживаем!» ка« в нервных окончаниях, так и в телах нейронов С Reofeld ,1979) обладаю* радом свойств, указывающих на их не Йроме дкаторку» и не ^модуляторную роль. Показано также, что холецистокинин взаимодействует с другими медиаторкыми системами и обладая? возбуядаяцим рлаянием на периферическую и цэктралънуп кэрвнув систему 4 Но Е Brodle,1987). Однако конкретные механизмы действия холэцистоки-иина в нервной ткани остаются невыясненными. В ввязи с втим значительный интерес вызывает изучение специфических рзцапторов холепистокинина. Показано, что холецистокиняновда рецепторы гетерогенны в пределах двух классов - А и Б. Рецепторы А класса t периферический тип ) локализована в клетках подкелудочиой железы, слизистой желудка, нелчном пузыре, пэкоторых птах гладких мышц (Diyk et.al.,1983, ЗгеоеяКа at.al., 1969 ) Эти рецепторы высокоаффинны для холецистокинкна н обладает наукой аффинностью к гастрину н С-концэвым фрагментам хояецкстоки-нина. Среди этих рецепторов набяэдается гетерогенность по отношен!© к связывание агониотов.

Для нервной системы характерен А-ияасо рецепторов. Они высоко аффинны для холепиотокинина й его аналогов. UewRosi авторадиз-графии выявлены участкк высокоаффинного связывлияя холэциоток*-нина в коре больших полушарий, обонятельной луговчгя.

рвтиау-вяркои ядре тала^са. Предполагается постсинаптическая *о-«алигацая хоюцвзтокшвшовш рецвптореэ. Однако одна лишь авуо-ргдаографичеегая визуализация на позволяв? относить все связн-эаяцш участка к истинно рядвпторнш бэлкау, без учета их свойств к структуры.

Низкая концентрация рзцэпторкых белков в клетке, их лабильность и способность х агрегации создают дополнительные трудности при очистке рецептора. Вместе с таи получение препарата рв-цептораых белков чрезвычайно ваяно для уточнения структурных характеристик родалторпо?, ыолеяула, изучения структура ов»зива~ 5кцзго центра, получения юпж-зз. Прстзи получение последних позволяет провести сравнительный аиалпз }Ейцукологичееких свойств рецзпгора, охарактеризовать его иолшгеятадныЕ состав, то есть белновда продукты генной энгпреееш, охрнять его количествзннда характеристик»;.

Изучение взаимодействия холвздестояининя и его рецэпгора с дофаминовой ©иитбШЁ,, кгращзй »ездув рояь в патогенезе шизофрения; способности модулировать ввсгобсвдеияв ГАМК, а тагсге взаямодеЕв-твяя с спнапгдои сксгзраки при Головой кодуляции ксзет бить по-йэзнш б вк^снэяии механизмов возникновения патогенетических варузевай цэкгргакгй и'церЕферкиеегсоК взряссй системы.

Цель .;) угости эшаэчазаоь в едевтафякацви к харакха-

рис-тко гйй1рий/хсяаг#1сг01Гй1ГО4-08яанвбЩ5а белкоз головного шага человека и видов вивотннх* При выполнении данной работы биаи поставлены егодукщиэ оедг-чи:

1. 0чист:ггь ГаС7рШ!/х0ЛЗЩСТ05гкНИ1|-СГЯ.йиВО£Яг19 белкп головного ."озга свииы! я крх» к псмупяь спэцйфйчоскиз гиттпсыворотх;; к

2. Оырак?ёркгс£а»ь пся^пэд-гцдный еосшз гасгрин/холецисгскн-киа-евизываадих бежаоэ головного шага человека н различных ьидов

ЖИВОТНЫХ.

3. Охараэтеряссвать полжэкендннй состав гаетрин/холецивтоаи-пж-сглякяпацпх еЧлтов в реглаяавс <фгавах я твтх человека

и крысы.

4. Изучить региональное и з.лзтэпкэо распределении гастрия/ холецистоккнш-свяаывшцшс. белков.

5. Иеучйхь раепрэдалеи:;) и характеристику гюжшвптпдного сос-гайтря;|/хоцэийс-гокию;н-С15Лзывага,;1х балков в разл»шных отделах головного мэдга крш ирг.' оксп&ркдонгалькои невроза.

6. Охарактеризовать углеводную специфичность гастрт/холепксто-кинин-снязывшцих белков головного мозга крыс. *7. Выявить аутоантитела при некоторых патологических забалепа-ниях ( аутоишунном гастрите типа А, экспериментальном невроза) специфичные к гастрин/холзцкстокинин-связттгацим балкам головного мозга и других тканей и органов человека и крыс.

Научная новизна и практическое значений. Впервые получены данные о поляпептидком состава г&стрии/хоязпястокинин-евязываю-щих белков головного мозга свиньи, крыс и человека, счищзнных аффинной хроматографией на тетрагасгрип- и холэшстокшин-езфа-розэ; получены специфические антисиворотки к даикш бзлквм; впервые проанализирован полияэптядкай состав гастрииДолегшто-кингш-связывапцих белков 8 различных органах и тканях человека и крьгси; изучено регаскзльпое и клеточное рас-предэлэкиз зтнх бел ков. Показано, что отдельные полнгтзпткдвг гастркн/хелевксго-кинин-сеязьгаахщих белков характерна для определенных клэточтгкх типов ЦНС. Впервые изучена гликопротеидная природа гаетрап/холе-цистокитан-с&язываящих белков. Впервые изучая по^штепидашя состав и динамика изменений гастрин/холзпистокянин-сзязывшцих белков при экспериментальном неврозе ярые. Выявлены аутоантите-ла к изучаемым белкам при аутоиммунном гастрите типа А и при экспериментальном неврозе йриз.

Полученные специфические аитиеыворотяи против гастртгнДоя?-цистокинин-связыванднх ботов, а такко разработаапиз шзтсдогхи определения аутоянтител к гаетрт/ходадаетоктш-евязткекции белкам слизистой оболочки келудка ншпля применение в лаборатории патсморфологин НИК гастрсэитерологин ( г. Днепропетровск).

Апробация работы. Материалы диссертанта доложени на Воессвз-ном симпозиуме " Проблеет иоучоввч паследс?»5?з?ос?а человека на уровне белковых продуктов гдагаЯ экспрессии" ( Уооква, Г9Е9), 1-м Всесоюзном иммунологическом съзздз С Сочи, Г989); ¥11 научной конференции ЩШ Тбилисского ИУЗ " Кефальная регуляция вегетативных функций" { Тбилиси, 19395; 19-я кс.фреттш ¿Нг-0■ ( Рим, 1989); 20-й конференции ФЕБО { Будапззт, 15$0); этогог «к №уч(Ш конференциях ДГУ 1289, 1590.

На защиту выносятся еледущиэ положения:

I. Особенности полипегттадного ссогарл гасгрот/хглзгргзтспялэь евязывапцих белков головного иозга и других оррапов я гкакзЗ человека и животных.

2. Имцуногиэтохимическая характеристика гастрин/холецнстоки-ики-связыващих балков и их глккопротеидная природа.

3. Особенности регионального распределения и полипептидного состава гастрин/холэцистокинин-свизываидих балков при ркспери-кэитадьном неврозе.

4. Характеристика аутоавдител к гастрич/холецистокинин-св'1-зываящин балкам при аутоиммунном гастрите типа А и при экспериментальном невроза.

Структура и объем диссертационной работы. Диссертация состоит из б разделов! I- введение, II- обзор литературы по тема диссертации, III- материалы и методы исследование, ^-экспериментальная часть, У- заключение, YI- выводы. Работа изложена На 115 страницах машинописного текста, нлластрирована з таблицами и 27 рисунками. Списох литературы содержит Г?3 наименования ка русском и иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служил головной ыозг и различные органы ( печень, гелудок, поджелудочная келеза, сердце, мьгпцы) половозрелы* крыс линии wiatar и человека,' головной мозг свиньи. Мозг и органы человека получали от жертв несчастны* случаев; йутопскэ материала проводили не поаае чем через 8 часов после смерти. Образцы перевиваемых глиом головного мозга крыс любезно предоставлены ст.науч.сотр. A.C. Халанским (-НИИ морфологии чолотика АМН СССР, г. Москва), Сыворотки больных аутоиммунным гастритом типа А получена в лаборатории патоиорфологии НИИ гастроэнтерологии, г. Днепропетровск.

Из коры головного мозга свиньи и крысы получали грубую мембранную фракции. Ткань мозга гомогенизировали в 5-кратном объэ-гга 25 и! трнс-HCI буфера ( fil 7,4), содержащего IwM фенилметил-еулъфояшфгорид, ЭГТА, 5»й| Mgci^ , центрифугировав при 50 ООО g , 60 минут. Осадок трюеди отмывали в большом объеме »того ка буфера с посдедувщим цзнтрифугнрованнем для удаления растворимых белков. Белки мембранной фракции солюбилизировали буфером, содерка-яим %% трктоя X-ÎQ0, 25трнс-HCI î jiî.7,4), Iuiï феннлметилсульфогшлфторвд, Ы<! ЭГГА, 5Ш Kgci 2, 10% гли-цэрин при 0°С в течешш 12 часов, с посявдукцим цэнтрифугиро-ваииом Î 50 00Qg , SO минут).

Очистку гастршу'яолоцкстокинин-связыващия белков головного мозга проводяха аффинной хроматографией па иммобилизованных

T^fîfeî'acTtHîiK ( Рижский эксг"?рэдкктэяьяый завод органического ctffffSSa) и хоязтетот.пскда (sigaa ). Фракций солпбилизироваи-rffl? Мембранных белков головного ыозга крыс нт ееткьи наносили нт колонку, заполненную тетрагастрин-(хоязцйстовикз»-)сефарозой в-буфере, содержащем 25t/M трис-1'Cl pH ^,4, С,К тритон Х-100, 0,5V Nací , Ijа фенклметилсудьфонклфторид, Ii¿4 SITA, 5i¿lHgci2 , После нанесение образца колонку промывали еетеуказаиида буфзрса. Элюций проводили последовательно 0ДМ ацетатагш (рИ 4,0) и бикар-бонатнш (рИ 8,5) буферами, содаряецими IM¿íaCI , Для аффинной влюции использовали раствор тетрагастркиа С . Белок во фракциях опредэллли нетсдам Ермдфорд я спектрофотсязтр'.пескя.

Специфические анткснворотки я гаетрйк/хогвсигтоютт^евязыв&с-•цим белкам получали nyíew мшугтзашя кроликов препаратом тетрил/ холешсток [нин-свксшаащнх белков, подучэкнш псгяо аффинной хроматографии im тетрагястрнн-еефарозе. Иммутшацда проводили по методу Baske.

ПолипэптидзшЯ состав мембранных и очищенных аффгснной хроматографией гастрнк/холетстокянкя-свлзнвагацих бежов анализировал» с псмодьг злектрс-фореза в плоскости градиентного ( 5-20%) ПААГ в присутствии ДСН ;; дитиотрейтола п© Лэкили.

Гетерогенность гастрин/холеиистоишяш-связотзющю: белков по заряду анализировали изоялестрсфокус;фсваиием в пластинах ПААГ с амфолшамя в диапазонах рй 3-10; 4-6; 6-8.

Полипвлтидннй состав гястрин/хоаацис?ок:пм1^с?лздаащ;*х белков в различных органах и тканях человека и хизотюгх изучали ивтодо« иммуноблотонга с примерлтесч «тексыворотаи к данным бзякан. Наличие оутсаитптзл tr парк® та льны»« клеткам желудка у большие ay?o-юкуияж мстрктси ваапляяг рсаясяэй непрямой ишунофжзоресп^нш!;! ( гастяровапиэ проездили в лаб. патоморфслогкя НШ гастроэнтерологии, г. Днепропетрззв*). &та жлуноблетаига кспольэоралгвь «уто-антисыворотки с полоккгелшоЯ рсакц:-;зй йа пяриэтэяьнт» кяот-кя.

Для анализа угАввэдкоЗ с匿й$ячпсетн п«в»оие!»оп гаетряи/зсо-леиистокиюгн-связь^ещжс белков ксполъсоваля еффдапутз хромато^а-фчв на ташобилизоглтшк локтиках различной споифгадостк ( Кои á, лветия вшг ) и бдатккг о«вя;»!пж

кой хроматографией гдйГри;гДолз1гло1снин:«г--сЕ.''31п;к'.;'.п: tfe.Tton о лектинами, кечзнними перокеидааой.

Региональное распределение

- б -

белков изучали шмуногистохимическими методами световой и електронной микроскопии.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБОТЦЕНИЗ

Очистка и полипзптидный состав гастрик/холюцистокинин-свдзы-ваащих балков головного мозга крыс и свиней.

Очистку соявбилиэироваитк тритоном Х-ГОО гастрин/холацисто-кинин-связывавщнх белкоь проводили методом аффинной хроматографии. Для хроматографии использовали иммобилизованные на сефарозе тетрагастрии и холзцистокияин. Эффективность пришивки лиганцов к сефарозному носители составила 30^ для тетрагастрина и 35-38$ для холзцистокинина. Использования оксиранактивированной сефаро-аы вместо вгсн -сефарозы позволило повисеть эффективность пришивки до 40-42$.

На рис. I представлены результаты аффинной хронатогрэфиа солэ-билизированных тритоном Х-100 белков мембранной фракции мозга крысы на тетрагастршьсефароза. При сгеаении рН буфера до 4,0 в присутствии I М элоируетсл только часть сорбированного

белка. Повышение буфера до 8,5 приводит к дополнительному снятии белка с аффинного сорбента. Введение в инкубационную среду ионов г®2* и ЭГГЛ значительно повьваает эффективность аффинной хроматографии.

Электрофорезом в градиентном ПАЛГ в присутствии ДСН охарактеризован пзлипептцдкый состав гастрин/холецистокинтнсвязывавщих белков, очищенных аффинной хроматографией. В высокомолекулярной области оо'наругейы подипентиды 120, срзднемолзяулярной - 62 и 52 тЛа, кроме того выявлены миноркш полипоптиды с Мм 100,85 , 45, Ь3-35 кДа. Полипептидгай состав белков, элвированных с тотрагаст-рин-сефарозы, идентичен такогому с холецистокнвдн-сефарооы. Идентичность результатов аффинной хроматографии на тетрагастрин- и зсолэцистокинин-сэфарозо связана с тем, что последовательность из пяти аминокислотных-остатков гастрина и холецистокинииа анало-гич1ш. Благодаря секвенциальной гомологии активного С-коицзвого участка гастрин и холецистокинии обладают сходством в широком спектре биологических ¡эффектов. При вляции только кислш буфером выявляются только полипаптиды с Ки 62 и 52 кДа. Обнаруживаемая гетерогенная группа полипелтидов, элвируедах с аффинного носителя , по-видимому, отражает гетерогенность данных рецепторов б головном мозге.

Рис. I Аффинная хроматография гастрик/холецистокинкн-евязывающих белков на тетрагастркн-еефарозэ. Объем колонки - 20 мл, скорость элвции - Змл/час

I-рлюиия 0,1 И ацетатным буфером рН 4,0 , содержащим I МЛЬс1.

II- элопил 0,1 М бикарбонаткым буфером рН 6,5, содержащим I М //аС1.

И309лектричэскиз точки гастрин/холецистокинин-связывяющих белков голодного мозга крыс.

' Гетерогенность гастрин/холециетокинин-свясываззщнх баллов по заряду анализировали изоэлектрофокусированием в пластинах ПААГ с амфолинами в диапазонах рН 3-10, -5-6, 6-0, с последующим иммуно-блотингом со специфическими антисьгаоротками против гастрт/хо.П')-цистокинин-связывэвщих белков. Изучаемые белки представляв? собой преимущественно кислые белки с р1- 0, р1 4,3-4,5; . 5,6-5,8. Кроме того выявлены изоформы с рГ -6,8; р1 8,-1.

По-видимому, в составе группы кислых белков мокет находится и непосредственно рэгагттор гаетрина я холепистоккнина, так как репепториые белки чаще всего представлены кислыми белками.

- о

1'""" """ 1

120

= 100 98 85 юг

—- 62 = 67 65

52 45 — 52

35 —■ 30

чг

102

6"' 66

44

МО

102 100

67 ■

Г

НО

ТОО

31

3 4 5 Т Ркс. 2 а. Схема нммуноблотхнга тритоновых фракций различных органов и тканой чьяовекс со специфическими антисыворотками против ГДСГр1Ш/*0Л9П!!СТ0КИНИН-СВ'151»-ВаГПИХ бэлков: I- головной ыоог; 2- слизистая оболочка голудка; 3-сердцэ; 4- поджелудочная ¡кэлзза; 5-печень; 6-жвячиыЙ пузырь; 7-мшца. Цифрами указана молекулярная масса полипяптидоа, кДа.

12С

50

45

35 33

108

66 65

32

Т20(

82 64

35

120 ПО

32

1 2 3 4 5 6 Рис. 2 б. Схема иьэдуноблотинга тритоновкх фракций различных органов и тканой крыс со специфическими антисшзоротками против хвдтрин/хогавдстопинивдводыгавдих бэлков: 1-головкой коэг; 2-слизистай оболочка желудка; 2~ поджелудочная железа; 4-пзчэпь; 5-серднэ; 6- мышца.

6'

Характеристика полипептндного состава гастрия/холацисто-кинкн-связывавщюс белков в различных органах и тканях человека и животных.

Анализ полипептвдного состава гастрин/холвцистокикия-связи-ващих белков головного иозга различных задов организмов ( человек, крьюп, свинья, кипгь) показал, что дакнш белки ввдо-иэспэшгфячни. Сходство полипептндного состава позволяет предположить, -гто дашда белки филогенетически достаточно консервативны.

Методом иммуноблот?нга охарактеризована полкпептида гаетрип/ холецистояинкй-сЕЯэшгшщях белков в различит» органах п тканях человека н храпи ( ряо, 2 ). В аолчяом пугнрэ» подаелудочйоЯ Еэлэзе, слизистой йаадза паакпепгида в Мм БО-85 кДа» 40-45кДа, 65-6"кДa соствететвуэу ( хпбо близка) oirecassass раиэв рэцзпто-рам холзпкстокнтша, a я nosro полипоптнд 52 t$a соответствует ранее охарактеризованному рецептору холецистокинина,

Высококолекуяярт?й поаетэотвд обпаруяивается н минорных количествах практически во всех органах и тканях ярыен, но кэ человека, что,во®1отао,евяде^эльс7вуз? о довольно шеокой скорости деградации давнего поляпетяяда э различных органах я тканях человека ( за исмаоченкен головного мозга) в результата посмертного аутоляэа.

При использовав яотсщвтзаас снзеро?он npcsns гаетр®*/холэ-цистокиний-свяэыва^их белков Í истощение _ проводили njreea 1ммуноаффинноЙ хроматограф^ на иммобилизованных иа еефарозз трет оно вых экстр<*етоз различны« тканей, исключая мозг) изяз-лэн только полнпаптзд 65 ^Ца.

Иимунегистохтагнчебкоэ рыязлеийэ гастрин/холдзртсгокияпн-свлзнввцзих белкоз

■ Проведению газ^сморфо^опивсзгэ исследования путан инкуба« цни ааусрояепных срезов е ай-гисиворотеами' к гяеурйн/холэцяето-кикна-связываицЕМ белка« позволим» обпаруввдь гаотрни/холе-адетокинин-овяэнващне ба л?гя на париетаяызхс клетках яелудка, которое,как известно, ответственна за кислотопродуцирусг'уп <5уккпип -ялудкз.. С использовал«« аг?орадлогр«фяи ранеэроо! ot.ai продвмо!:стр>рсвали наличие спецяфичоского связывагшя меченных гастрина и холециетокикита с рецепторами кэкбрап париетальных клеток. По данным икмукогистохкмичесяого электрон- v

- ю -

но-микроскопического исследования полученные нами антитела против гастрин/холецистокинин-связывающих белков гаявлллл на плазматических мембранах париетальных клеток структуры, расположенные в виде кластеров. На соседних мышечных клетках и контрольных срезах агрегаты меченных антител отсутствовали. Специфически окрашиваются окаймленные везикулы внутри париетальной клетки. Это может свидетельствовать о том, что среди очищенных нами белков Находится и рецептор гастрина, который подвержен внутриклеточной интерналиэации.

Гастрин/холецистокиник-связывающие белки выявляют»! на клеточной поверхности и в цитоплазме тел и отростков нейронов коры мозжечка ( молекулярного и зернистого слоев ), нейронах оливы и аксонов пирамидного пути. Расположение имцуНоцитохимической метки по периферии нейронов, а не глиальных клеток может свидетельствовать о наличии гастрин/холецистокинин-связываищих белков преимущественно в нейрональных мембранах.

Пояипептидный состав гастрин/холецистокинин-связывадщих белков в культурах перевиваемых крысиных глиом и культуре астро-цитов. > •

Глкалькая локализация гастрин/холециотокинин-связывающих белков изучалась в культурах перевиваемых крысиных глиом. Проанализирован полипептндкый состав изучаемых белков в 19 образцах перевиваемых опухолей; Выявлен только один полипептид с Мм 62нДа.

В культуре астроцитов мозга крысы г&стрин/холецистокинин-свяаываицие белки мембранной тритоновой фракции представлены более широким спектром полипвптидов с Мм 62, 45, 35-38 «Да.

Иммуногистохимические данные, а также результаты изучения полипептидного состава гастрин/холецистокинин-связывающих белков в культурах глиальных клеток позволяют заключить, что отдельные полипептиды гастрин/холецистокинин-связывающих белков характерны для определенных клеточных типов ЩС.

Характеристика углеводной специфичности гастрин/холецистоки-ккн-связывающих балков головного мозга крысы.

Для анализа углеводной специфичности гастрин/холецистокинин-свяаывающиг белков головного мозга крысы использовали хроматографию на иммобилизованных лектинах различно^ специфичности: *оа - специфичен к я -ацетилглокозамичу; Кон А, пектин чччэвиш - к м&нноашм остаткам, ИогоЮе тах - кв -галактозе

н ^-ацетил-о -галаятоз®. Мембранные фракции гликоггротеииов,

очищенные аффинной хроматографией на соответствующих лектинах подвергали иммуноблотингу со специфическими антисывороткамя против гастрин/холеиистокинин-связываищих белков. Выявлены полипептиды 62 и 35 кДа. Полит7ептид 35 кДа проявляет сродство практически ко всем исследуемым лектинам. Полипептид 62 кДа обогащен преимущественно маннозньми терминалънши остатками, ток как связывал машгазоспецифичнъга лектины- Кон А и лектин чечевицы. Гетерогенность по углеводной части полипептида 35 кДа,вероятно, обусловлена характером гликозилирования белка.

Кроме того, для характеристики >тлэводкой специфичности гаст-рин/холеггостокинин-связывавщих белков головного мозга крыс использовали прямое связывание очищенных аффинной хроматогрйфией ка тетрагастрии-сефарозе белков с меченными пероксидазой лекти-нами. В лектиновом блотинге выявлены полипептиды, аналогичню вышеназванным.

Содержание и полипеггтодный состав гпстрин/холепистокиния-свяэываготх белков в различных отделах головного мозга крыс при пкспвриментальном неврозе.

Невротизадаю животных проводили ежедневно по 2 часа в течении одного месяца путем создания ситуации неопределенности, в основе которой лежит "конфликт афферентных возбуждений" I Козловская, 1986). Еыбор исследуемых отделов головного мозга ( кора больших полушарий, полосатое тело, средний мозг, ггатпокамп) обусловлен тем, что эти образования обеспечивают рефляции формирования он-гракм памяти, состояния дезадаптации, наступающего после нэвроти-зации, сопровождающееся наруиением мностических процессов.

Общепризнанной в настоящее время является ключевая роль ГАМК-ергических процессов, особенно ГАМК-бензодиаэепинового-барбиту-ратиого механизма тревеяных состояний. Кроме того, исследования последних лет свидетельствуют об антагонистическом характере взаимодействия между холецистсяиником и ГАМН. Показано, что антагонисты холзцистокяякновых рецепторов - дарулеин и пэнтагает-рют оказывая? при системном введении в низких дозах анксиогенноэ , действие, которое устранияеся введением проглумида ( Харро и др., 1989). Очевидно, холецистокининовыэ рецепторы участвуют в механизме фортарозания состояния страха и тревожных состояний.

Длительная нэвротизация оказывает существенное влияние на по-липептидиый состав гастринДолэцистоккдан-связывающих белков

а)

--------52

I 2 3 4 5 6 7

б)

----- 65

-------52

1 2-3 4 5 6 7

Рис. 3.Схема иммуноблотинга растворимой (а) и мембранной (б) фрак цай различных отделов головного мозга крыс при экспериментальном неврозе: кора больших полузарий-К контроль) ,4; полосатое тело-2 (контроль)средний мозг- 3(контроль),7; гиппокамп-5 • Цифрами указана молекулярная масса полипептидов, кДа.

4 5 6

Рнс. 4.Схема иммуноблотинга гритонових экстрактов различных орг&нов в г капе Л сэлов-эка с аутоаятисыворотками больных аутоиммунным гастргтом типа А: I- мозг, 2-подгалудочкая железа,

дудок, 4~сардцЭ, Б-мъшцы, б-желчкый пузырь. Цяфрами укявана молекулярная масса полипептидов,

в отдельны* : ШС крыв. В мембранной фракция поло-

сатого тела ч срлк^т мозге ( рис. 3 б ) не выявляются полипептиды с Ум 25 кйя „шнорный 85 кДа. Наблюдается снижение интенсивности окрашивания ряда других полипептидов во всех отделах головного мозга невротизированных крыс.

В растворимой фракции ( рис. 3 а ) во всех изучаемых отделах у невротизированных крыс выявляется высокомолекулярный полипептиц, который в норме отсутствует; возрастает интенсивность окраяивяния полипептида Ж кЦа.

Результаты по количественному определению гастрин/холецис-токинин-связывавщих белков в различных отделах мозга невротизированных крыс в целом соответствуют изменениям, наблюдаемы* в иммуноблотингэ. Практически не изменяется содержание гастрин/холецистокинин-связывающих белков в коре головного мозга, мозжечке. Достоверные изменения наблюдаются в полосатом телэ, среднем мозге, гиплокампе.

В мембранной фракции полосатого тела при экспериментальном неврозе крыс содержаниегястрин/холецистокииин-связывающих белков резко спитано ( до 23Й в среднем мозге и 14% в полосатом теле). В то же время в гтлокампе наблюдается повьтениэ содержания мембранных гастрин/х0л8пист0кинин-связива1гдих белков до 1601?. Соответственно резко возрастает количество изучаемых белков растворимой фракции полосатого тела и среднем мозге у невротизированных крыс. Во всех остальных отделах этот показатель изменялся незначительно.

В случае прекращения невротиоации уяэ на 4 сутки у животных количественное содержание п полшептиднйЯ состав гастряи/ холепистокинин-связывевщих белков становится близким к норме. Зто может свидетельствовать о довольно еьтоокой лабильности системы холецистотшннновых р-энептсров и наличии тонких механизмов регуляции концентрации рецэпторных белков.

Наблюдаемые изменения, по-видимому, отражает яяиь часть сложного механизма взаимодействия холецистокинина с его рецептором и с другими рецепторными системвми головного мозга в пропоем невротизацпи. Вполне воемопго, что "сброс" гастрин/хо-лепистокинин-свяэывыощих балков £ среди которых находятся и "истинно" решпторнш белки) с поверхности клетки и и* внутриклеточная интеряалиэация могут выступать в роли компенсаторно-^ го механизма регуляции функциональной активности клетка.

Анализ аутоантител к гастрин/холецистокинин-связывавщим белкам при различных видах патологии

а) Аутоантитела к гастрин/холепистокинин-связывагкц'/'м белкам при аутоиммунном гастрите типа А

При хроническом атрофичееком гастрите типа А с выраженшми гистологическими изменениями, особенно в сочетании с пернициоз-ной анемией, повышена циркуляция аутоантител к обкладочнш париетальным клеткам желудка. 6 качестве аутоантигёна выступает рэпеп-тор гастрина париетальных клеток.

В результате анализа 20 сывороток больных аутоиммунным гастритов типа А нами подтвержден факт наличия аутоантител в сыворотках и проанализирован полтвгтидный состав яятиг-гиов,' которьп могут участвовать в аутоиммунной реакции. Аутологичннэ сыворотки реагировали не только непосредственно с экстрактами слизистой оболочки желудка, но и с рядом других тканей ( рис, 5). Очевидно, что полипептиды,перекрестно реагирующие с аутсантителамигсоответствуют либо близки гастрин/холепястокинин-свлзывающчм полигептидам, охарактеризованным нами. Кроме того, нами показано сходство антигенных детерминант для полипептидов Эби В5кДа, вццэленных из мозга и перекрестно реагирующих с аутологическими сыворотками.

Синтезируемые аутоантитела потенииально могут вступать в реакцию на только с антигеном одного органа, но и способствовать возникновению или прогрэссированию патологического процесса в других тканях, содержащих гастрин/холецистокинин-связызающие белки. Не исключена возможность взаимодействия циркулирующих в крови аутоантител со структурами головного мозга в случае нарушения гемато-энпефалического барьера при различного рода поражениях. Обнаружение аутоантител « гастрин/холзцястокинин-связывагацим белкам в крови больных может рассматриваться в определенной степени как фактор риска развития невропатологии.

б) Аутоантитела к гастрин/холешстокииин-связывагщим белкам при экспериментальном неврозе у крыс

Методом иммуноблотинга в сыворотке невротизированных крыс ( яо не контрольных) нами обнаружены аутоантитела к гастрин/хо--яэнистокииин-связывающим белкам. Перекрестно рэагирчзт с «аннши вутоаятителами полипвптиды ^ й 85 к Дя очищедных гастрин/холз-даотокиния-связываюарос белков.

По-видимому, синтэзируемыэ при неврозе аутоантитела могут оке-эывать санногенный аффект, предотвращая избыточную гиперактивность холепистокининовых НЗЙТЮНОВ.

вывода

1. Методом аффинной хроматографии на иммобилизованных лиган-дах очищены гастрин/холецистокинин-связывающче бэлки головного мозга ¡фыс и свиньи. Получении специфические ан-.'исыворотки позволили охарактеризовать полипэптидный состав лигацц-с вызывающих белков головного мозга человека и животных. В высокомолекулярной области обнаружены полипептиды - 120 кДа, среднемолеку-лярноЯ- 62 и 52 кДа, низкомолекулярной -35цЦэ, кроме того, выявлены минорнш полипептиды Ю0,85,45,38кДа.

2. С использованием специфических антисуворотон методом им-мукоб.чопгпгп, ттсаптио ткани голодного мозга, гастрин/холэиистоки-vr.m-c »лаеташ.ие бчлки въя члены и л .тругкх органах и тканях человека и гриси:поджелудочной железе, слизистой оболочке желудка, печени,сердт.ждлчном пузырэ.В подяэлудочной железа, слизистой жэлудкя, зелчном пузыре политгептиды 85, 65-67 40-45,52,78 кДа соответствую? равдо описанным рецепторам холэпистокиника,

3. HMíJiynorüeroxiíMJrtecKire даннш, а также результаты изучения полипептпдного состава гастрин/холэтютоктглн-СБЯзкзающих балкой а культурах глиальных клеток позволяют заключить, что отдельные полипептиды гастрин/холешстокшин-связыващия бэлков характерны для определенных клеточных типов ЩС.

4. Гзстрин/холециетокинйн-свясывшощие полипептиды Ж и 62 пДа являются глияополютептидами с концевыми галактозными, л'-ацэтчл-галактозкши, //-аштилглакознши и маннозпши остатками соответственно.

5. Длительная нзвротивация яявотнгя оказытаэт существенное в.чичние на полипэптидный состав гастрик/хслзгистояинин-связы-гяющчг белков 'в отдельных стуктурах ШС. В мембранной фракции полосатого тола и среднего мозга т шявл-зни лолкпэптидн да и 85 кДа, резко сниг/эно общее содержание гастрян/холецистояинин-свя-зывающих белков. В растворимой фракции есзх изучаемых отделов выявлен высокомолекулярный полипептид 120 кД а, отсутствующий в корме.

6. Б сыворотке больньх аутоиммунным гастргггоч т.та А, а тэк-ж.в в снгоротке нэвротизироэанних крыс методом кммуноблотинга выявлены аутоантитела к гастрин/ходазгглстокиний-еэязывапщям белхкм.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕ№ ДИССЕРТАЦИИ

1. Березин В.А., Руденко О.А., Ьсйко И .И., Гайдар Е.А., Лепехин Е.А.. Изучение мембра нигде гликопротеинов мозга крысы с использованием Р-галактозеспепифичного лектина// Укр. биохим. журн.-1983.-Т.60, 3)6.-С.9-14.

2. Березин В.А., Руденко О.А., Гайдар D.A., Ващенко Р.Г. Взаимодействие аутоантител из крови больных аутоиммунным гастритом с рецепторами слизистой желудка и центрально!} нервной сис темы// Тез.докл.I Всесоюз. иммун.съезда.-Сочи,1989.-Т.2.-С.115.

3. Гайдар D.A., Косько К.В., Березин В.А., Руденко О.А. Распределение гастрин-связывающих белков в головном мозге и слизистой желудка// Тез. докл. УН научной конферен. ЦНИЛ Тбилисского ИУВ " Центральная регуляция вегетативных функцийТ-Тбилиси, 1969 .-С.63.

4. Березин В.А., Руденко О.А., Шевченко Г.М., Гайдар Ю.А. Иммунохимические подходы к выявлению и идентификации новых белков мозга человека// Тез. докл. Всесоюз.симпоз. "Проблемы изучения наследственности человека на уровне белковых продуктов генной экспрессии".-М.1 1989, С.7

5. Руденко О .А., Березин В.А., Гайдар Ю.А. Характеристика гастрин/холецистокинин-связыватацих белков головного мозга// Укр. биохим.журн.-1990. -Т .62, №4. -С.26-30.

6. В eresin V.A. Shevohenko G.M., hudenko О.А. Use of rnan-aoae and galaotoaa opeoifio la о tins for purification and investigation of human brain protein // 10 International leotin nesting, July 'Э-в, 1966.

7. fiudanko O.A., Gaidar У.A.,Vaahenko R.Q., Beresin V.A. Gharaaterization of gaatr in-binding polypeptides purified fro» gaatrio шиоова and brain // Abatraot 19-th Meeting

of federation of Europ.Bioohem. Sooieties.- Ноше, 1989.10 419.

6. ^udenko O.A., Heruah P.A., Berezin V.A. Characterization of oholeoyetokinin/gaatrln-bindlng proteins in the brain of rata eubjeoted to long-term experimentally lnauoed neurosis // 20th FEES Ueetlng, 14-24 August l990,Budapest, ¿betraote Г-И0-0} J, Р.Э2.