Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Химически модифицированные нуклеиновые кислоты как инструмент исследования структурно-функциональной организации генома эукариот
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология
Автореферат диссертации по теме "Химически модифицированные нуклеиновые кислоты как инструмент исследования структурно-функциональной организации генома эукариот"
-Ч И
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ
Институт цитологии и гэнётшси
на правах рукописи УДК 576.316;577,113.4
ДЫШИЦ Григорий Моисеевич
ХИМИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫЕ НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ КАК ИНСТРУМЕНТ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ГЕНОМА ЭУКАРИОТ
клеточная биология-03.00.25
Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада
Новосибирск 1992
Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО РАН , г.Новосибирск
Официальные оппоненты : доктор биологических наук,
профессор И.И.Кикнадзе, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск
доктор химических наук, Э.Г.Малыгин,
ВНИИ молекулярной биологии, п. Кольцово, Новосибирск
доктор биологических наук, профессор Н.К.Янковский, Институт Общей генетики РАН, г. Москва
Ведущее учревдение: Институт биологии развития
им.Н.К.Кольцова РАН, г. Москва
Защита состоится -Л- >/С( Сс^Ь 1992 г. на Ч-^Р , заседании специализированного совета по защите ^диссертаций на соискание ученой степени доктора наук ( Д-002.П.01 ) при Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск-90, проспект академика Лаврентьева, 10.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН
л
Диссертация в форме научного доклада разослана " с. " С1'й/)1992 г
Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук
А.Д.Груздев
ВВЕДЕНИЕ
¿агецк'Л Актуальность теш. Проблемы структурно-функциональной организации генома эукариот привлекают внимание исследователей на протяжении десятилетий и очевидно еще долго будут определять задачи молекулярной и клеточной биологии. Глубина наших знаний о структуре хромосом и конформационном состоянии ДНК при реализации ее генетических функций, таких как репликация, транскрипция, рекомбинация, в значительной степени зависит от совершенства и адекватности методов исследования. Одним из наиболее информативных методических подходов к решению этих задач является химическая модификация нуклеиновых гаюлот, незаменимая при анализе вторичной и пространственной структуры ДНК, конструировании меченых зондов для молекулярной гибридизации 1п зИи, направленном воздействии на геном. Сегодня химики располагают широким арсеналом реакций, с помощью которых можно вводить сигнальные соединения по различным модифицируемым компонентам нуклеиновых кислот (Кнорре, 1989).
В настоящей работе известные и разработанные автором метода химической модификации были использованы для создания системы нерадиоактивного мечения РНК- и ДНК-зондов, локализации в геномах млекопитающих и двукрылых определенных нуклеотидных последовательностей, изучения состояния ДНК при репликации.
Споры мехду сторонниками схемы непрерывной антипараллельной репликации (КогпЪе^,19бО) и приверженцами' модели параллельной репликации (Са1гпз,1963) разрешились с появлением работы Оказаки (Окагак! ег.а1.,1968), в которой был предложен механизм прерывистой антипараллельной репликации ДНК. Все три модели, несмотря на кардинальные отличия в направлении и характере синтеза дочерних цепей, предусматривали плавление матричной ДНК как необходимое условие для выполнения принципа комплементарное™. На основании результатов центрифугирования в градиенте СзС1, фракционирования в двухфазных системах, хроматографии на колонках с гид-роксилапатитом были получены данные о наличии одноцепочечных участков в репликативных молекулах ДНК. Большая часть таких исследований была выполнена на фагах и бактериях. Оставалась нере-
шенной проблема количественной оценки и характера нарушений дуплексной структуры ДНК в связи с репликацией. Избирательная химическая модификация азотистых оснований в неспаренных участках являлась с нашей точки зрения наиболее адекватным методом решения этой задачи. Принципиальным также был вопрос о том, касаются ли наблюдаемые изменения вторичной структуры ДНК лишь матричных или и вновь синтезированных молекул.
Неизвестны были и факторы, приводящие к плавлению матричной ДНК и поддержанию одноцепочечного состояния в репликативной вилке. С открытием Альбертсом белка 32 гена фага Т4 (Alberts,1968; Alberts, Prey, 1970), имеющего высокое сродство к одноцепочечным участкам, и установлением его способности снижать температуру плавления ДНК, казалось, что вопрос о денатурации дуплекса в связи с его репликацией был решен. К 1975 году белки типа SSB (single-strand binding proteins) были обнаружены у нескольких фагов, бактерий и двух эукариотических объектов - гриба Ustilago may di а и в сперматоцитах крысы. Истинная роль SSB и подобных им белков в репликации и рекомбинации стала проясняться после установления механизма работы ДНК-плавящих ферментов - геликаз (Abdel-Monem, Hoíímaim-Berling.1980) и топоизомераз (Wang,1982). Однако до сих пор нет четкой картины последовательности событий, приводящих к плавлению ДНК в многочисленных репликонах хромосом эукариот.
В настоящей работе был изучен белок, прочно связанный с репликативной ДНК регенерирующей печени крыс. С помощью разработанного автором метода двойной химической модификации репликативная ДНК была выделена и исследована под электронным микроскопом. Это стало возможным за счет присоединения к одноцепочечным участкам ДНК электронноплогного маркера.
Комплементарный синтез РНК, также как и ДНК, предусматривает наличие одноцепочечной ДНК-матрицы. Происходит ли изменение вторичной структуры ДНК при транскрипции на всем протяжении транскрипционной единицы, или локально в месте контакта с РНК-полимеразой - этот вопрос в 60-е годы оставался открытым.
Помимо анализа функционального состояния ДНК актуальной яв-
ляется задача локализации в геномэ определенных нуклеотидных последовательностей. Одним из наиболее эффективных способов картирования хромосом слухит метод молекулярной гибридизации in altu. Ключевой проблемой такого подхода является получение зондов, обеспечивающих. высокую чувствительность при гибридизации. Авторадиография, обычно используемая для этого, именно благодаря высокой чувствительности, имеет низкое пространственное разрешение и неприменима для одновременной локализации различных нуклеотидных последовательностей на метафазных хромосомах и в интерфазном ядре одной клетки. Кроме того, короткое время полураспада и опасность для здоровья ограничивают широкое использование радиоактивно меченых зондов для диагностических целей в медицине и сельском хозяйстве. Нерадиоактивные системы детекции открывают новые возможности как в ДНК-диагностике, так и в изучении структуры генома.
Методы химической модификации позволяют конструировать как РНК-, так и ДНК-зонды, несущие разные флуорохромы, гаптены, биотип. Флуорохромы как класс репортерных соединений привлекателен тем, что в отличие от радионуклидов они стабильны, могут быть обнаружены при непосредственном микроскопическом наблюдении, сокращая тем самым во много раз время эксперимента в сравнении с авторадиографией. Кроме того с its помощью можно одновременно локализовать несколько зондов-, несущих флуорохромы с отличающимися спектрами испускания. Высокая чувствительность и большая в сравнении с радиоактивно мечеными разрешающая способность биоти-нилированных зондов позволяет использовать их для локализации уникальных генов не метафазных хромосомах. Актуальность работ такого рода очевидна как для решения задач, поставленных мевду-народным проектом изучения генома человека, так и для изучения геномов других организмов.
Чувствительность гибридизации зависит как от способа выявления зонда, так и от количества в тем репортерных групп. В том случае, когда нужно определить положение на хромосоме короткой олигонуклеотидной последовательности, чувствительности прямой флуоресцентной и колориметрической детекции не хватает.
Если же регистрировать не репортерике группы, а сам факт образования комплементарной пары мишень-зонд, размер зонда значения не имеет. Сформулированный Н.И.Гриневой (1975) принцип комплементарно-адресованной модификации ДНК, открыл возможность использования олигонуклеотидов, несущих модифицирующую группу, в качестве зондов для гибридизации in altu.
Направленная модификация азотистых оснований в непосредственной близости от участка специфической гибридизации позволяет локализовать его в структуре генома. При этом размер комплементарной области может составлять всего несколько нуклеотидов.
Работа по получению высокочувствительных нерадиоактивных зондов для молекулярной гибридизации In vitro и In aitu с 1989 года проводится нами в рамках программы "Геном человека".
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было как исследование состояния ДНК в процессе реализации генетических функций, так и решение задач локализации в геноме нуклеотидных последовательностей различного размера и представительства. Для ее достижения был создан ряд;новых методов, основанных на принципах химической модификации нуклеиновых кислот',
В рамках поставленной цели для решения сформулированных задач было использовано три подхода. Первый состоял в избирательной химической модификации азотистых оснований в денатурированной ДНК карбодиимидом. Он позволил решить задачу количественной оценки^ содержания одноцепочечных участков в репликативной ДНК млекопитающих. С помощью разработанного автором метода двойной модификации ДНК карбодиимидом и фосфорновольфрамовой кислотой была решена задача электронномикроскопического анализа репликативной ДНК, в результате которого были определены размеры участков ДНК с измененной в связи с процессом репликации вторичной структурой.
Второй подход заключался в создании системы химической модификации рибо- и дезоксирибонуклеотидов, позволяющей вводить в них различные репортерше группы,и таким образом получать нерадиоактивно меченые зонды для молекулярной гибридизации. Одной из
практических задач было определение такого уровня мечония зондов флуорохромами и биотином, который обеспечил бы максимальную чувствительность при дот-, блот- и 1п з1Ш гибридизации. Возкоп-ность получения различных зондов, несущих флуорохромы, имещях эмиссию при разных длинах волн, открывает перспективу'одновременной локализации различных нуклэотидных последовательностей в интерфазном ядре и в составе политенных хромосом. Высокая чувствительность биотинилированных зондов, полученных по оригинальной методике, позволяет решать задачу локализации уникальных генов на метафазных хромосомах.
. Третий подход был основан на предлокенном Н.И.Гриневой принципе комплементарно адресованной модификации ДНК. Автором был разработан метод получения и люминесцентномикроскопической визуализации специфических разрывов ДНК в политенных хромосомах, позволяющий детектировать не зонд, несущий сигнальные группы, а результат молекулярной гибридизации. С его помощью в хромосомах слюнных желез СЬ. "Шшгл)1 были локализованы о лиге-Т последовательности.
Научная новизна и практическая ценность работы. Используя принципы химической модификации нуклеиновых кислот как инструмент для исследования структуры генома, автор создал несколько оригинальных методов, с помощью которых изучено состояние ДНК в процессе репликации,- определена локализация различных нуклэотидных последовательностей в политенных и метафазных хромосомах.
При сочетании метода избирательной модификации денатурированной ДНК водорастворимым Н-циклогаксил-М' -(3-(4-кэтихморфэлиний )-этилкарбодиимидом (ЦМЭ-карбодиимидом) с последующим ферментативным гидролизом и гель-фильтрацией оценено количество одно-цепочечных участков в репликативной ДНК животных. Сформулировано представление о метастабильном состоянии пострепликативной ДНК и обнаружен белковый фактор, обеспечивающий сохранение одноцепо-чечных участков в выделенных препаратах ДНК регенерирующей печени крыс.
Разработан метод двойной модификации одноцепочечных участков ДНК водорастворимым ЦМЭ-карбодиимидом и электронноплотной
фосфорновольфрамовой кислотой (ФВК), обеспечившей их визуализацию. С его помощью впервые для эукариот был определен размер участков ДНК с измененной в связи с процессом репликации вторичной структурой.
Предложена двухстадийная схема получения РНК-и ДНК-зондов, основанная на введении в полинуклеотиды алкилированием или пере-аминированием аминогрупп с последующим присоединением к ним таких репортерша соединений, как биотин или различные флуорохро-мы. Продемонстрирована возможность одновременной гибридизации 1п з1Ш с разными ДНК-зондами, несущими флуорохромы, имеющими эмиссию при отличающихся длинах "волн. Использование высокочувствительного биотинилированного зонда позволило с большей точностью, чем при авторадиографии, локализовать уникальный ген соматомам-мотропина на метафазной хромосоме человека.
С помощью разработанного метода получения и люминесцентно-микроскопической визуализации специфических одноцепочэчных разрывов в ДНК политенных хромосом осуществлена локализация Т-трактов в хромосомах слюнных желез СМгопотиа ^шпт! thuInml.
Полученные в работе научные результаты используются при чтении курсов лекций в Новосибирском и Томском университетах. Разработанные автором методы введения в зонды нерадиоактивных репортерных групп были освоены участниками практического семинара в Институте медицинской генетики при Университете имени Эрнста-Морица Арндта (Грайфсвальд, Германия) в 1989 году и слушателями школы-семинара по современным методам цигогенетики животных и человека, проведенном в Институте цитологии и генетики СО РАН в 1991 году.
Возможность получения большого количества (до нескольких мг) биотинилированных зондов, модифицированных с любой заранее заданной интенсивностью, позволило использовать их при создании нерадиоактивных диагностикумов на микоплазму , тропическую малярию и лейкоз крупного рогатого скота . Кардиологический научный центр РАМН(Москва)использует приготовленные нами биотинилирован-ные ДНК-зонды в диагностических наборах для выявления микоплаз-менных контаминаций культур клеток.
Структура и объем работы. Работа была начата в 1966 году по инициативе и под руководством чл.-корр. РАН Р.И.Салганика и выполнялась в лаборатории молекулярных механизмов экспрессии генов Института цитологии и генетики СО РАН. По теме исследования имеется 45 публикаций в отечественных и зарубежных журналах и сборниках. Основные результаты работы и сделанные на основе их вывода изложены в обобщенном виде в настоящей брошюре в форме научного доклада.
Фактический материал,представленный в диссертации , получен автором лично и в коллективных исследованиях, все участники которых являются соавторами цитируемых работ.
Автор признателен своим соавторам, студентам, выполняшим дипломные работы под его руководством, всем сотрудникам лаборатории молекулярных механизмов экспрессии генов, коллегам из Института цитологии и генетики СО РАН и других институтов, оказавшим помощь на разных этапах исследования.
Апробация работы. Материалы диссертации были'доложены или представлены на различных международных и всесоюзных конгрессах, съездах, конференциях, симпозиумах и совещаниях: II Всесоюзный биохимический съезд (Ташкент, 1969); III, V, VI, VII, VIII Всесоюзные симпозиумы "Структура и функции клеточного ядра" (Киев, 1970; Новосибирск, 1975; Алма-Ата, 1977; Харьков, 1980; Пущино, 1984); IV Международный биофизический конгресс (Москва, 1972); IX Съезд федерации европейских биохимических обществ (Будапешт, 1974); II Всесоюзное совещание по вопросам строения и функционирования хромосом высших организмов (Пущино, 1976);III и IV съезды ВОГИС (Ленинград,1977¡Кишинев,1982 );XIV Международный генетический конгресс (Москва, 1978); IV Советско-Западногерманский симпозиум "Структура и транскрипция генома" (Ереван, 1981); Международная конференция "Мутагенез In vitro" (Колд Спринт Харбор, 1982); Международный симпозиум "Организация и экспрессия тканеспецифичных генов" (Новосибирск, 1982); Республиканский симпозиум "Ядерные белки и экспрессия генома" (Киев, 1983); I и II Всесоюзные совещания по использованию ДНК- и РНК-зондов (Москва, 1987, 1990); Всесоюзный симпо-
зиум "Вакцины, диагностические средства и новая биотехнология" (Пущино, 1988); VI Всесоюзное совещание "Структура и функции хромосом" (Пущино, 1988); I и II Всесоюзные конференции "Современные направления создания медицинских диагностикумов" (Москва, 1988, 1990); I и II Всесоюзные конференции "Геном человека" (Переславль-Залесский, 1990, 1991); Всесоюзная конференция "Использование достижений биотехнологии в животноводстве и ветеринарии" (Новосибирск, 1991); Всесоюзное совещание по использованию флуоресценции в реализации программы "Геном человека" (Москва, 1991).
Кроме того, автор делал доклады на семинарах и отчётных сессиях в Институте цитологии и генетики СО РАН , на Всесоюзной школе по молекулярной биологии (Звенигород, 1989; Пущино, 1991) и йа семинаре в Институте молекулярной генетики при Университете имени Эрнста-Морица Арндта (Грайфсвальд, Германия, 1989).
Предложенные автором проекты по получению высокочувствительных нерадиоактивно меченных зондов для молекулярной гибридизации In vitro и In situ прошли экспертную оценку и финансируются с 1989 года в рамках Государственной научно-технической программы "Геном человека" .
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Раздел I. АНАЛИЗ К0Ю0РМАЦИ0НН0Г0 СОСТОЯНИЯ ДНК В ПРОЦЕССЕ РЕАЛИЗАЦИИ ГЕНЕТИЧЕСКИ! ФУНКЦИЙ.
. В начале 60-х годов существовало представление о том, что процессы репликации и транскрипции связаны с различными физико-химическими состояниями.ДНК в клетке • (Goldstein, Brown, 1961). Рядом исследователей было показано, что при репликации фагов, бактерий и млекопитающих молекулы ДНК приобретают признаки, свойственные денатурированным молекулам (Ralie, 1963). Р.И.Сал-гаником (1963) было высказано предположение, что более высокая чувствительность одноцепочечных участков ДНК к химическим мутагенам может быть использована для включения в мутационный процесс определенных генов при их репликации и получения таким образом ограниченного предопределенного спектра мутаций.. В про-
ведбнншс им и сотрудниками (Воронина и др., 1968) генетических .опытах на синхронизированной культуре E.coll было установлено, что введение гидроксиламина в разные периоды лаг-фазы приводит к возникновению различных и довольно определенных в каждом периоде мутаций. Однако, вопросы, связанные с характером изменений кон-формации ДНК при репликации у высших и принадлежностью таких изменений матричным или вновь синтезированным молекулам, оставались открытыми.
I.I.Исследование вторичной структуры ДНК регенерирующий печени крыс при репликации методой химической модификации ЦМЭ-карСодшшидоу (I, 3, 5, 7, 9, 10).
В. работах B.C.Дашкевич и др.(1965, 1966) с помощью метода хлороформного фракционирования было показано, что ДНК, выделен, ная из регенерирующей печени крыс в период максимального синтеза (через 22-24 часа после частичной гепатэктомии) отличается признаками, характерными для одноцепочечных молекул, от ДНК, выделенной из интактной или регенерирующей печени через 12 и 48' часов после операции.
Метод, избирательной химической модификации одноцепочечных участков ДНК водорастворимым ЦМЭ-карбодиимидом позволил выделить и количественно оценить долю денатурированной в связи с репликацией ДНК. Присоединяясь по остаткам тимина (рис. I) и гуанина только в участках с нарушенной дуплексной структурой, ЦМЭ-карбодиимид ограничивает действие нуклеаз - ДНКазы и фосфоди-эстеразы (ФДЭ) на модифицированную ДНК. Последовательным действием этих гидролитических ферментов из молекулы ДНК удается "вырезать" модифицированные карбодиимидом одноцепочечяыв участки в виде олигонуклеотидных блоков, отделяемых гель-фильтрацией от мононуклеотидов, представляющих' гидролизованную двуцепочечную ДНК.
Немодифицированная ДНК как интактной, так и регенерирующей печени почти полностью расщепляется до мононуклеотидов под действием ДНКазы и ФДЭ. При гель-фильтрации на Сефадексе G-50 оли-гонуклеотидный пик составляет менее 2%. Модификация ДНК регене-
C.H1±-NH-C=N-CHa-CHa-fk» О
| | СИ3-СИ3"
VV
—о-сна | |
«" н сн-сн.
I
0
1
Ряс Л. Тимин в составе ДНК, модифицированный ЦМЭ-карбодиимидом.
рирущэй печени (в период репликации) приводит к увеличению доли олнгонуклеотидного пика до 1856; вся радиоактивность [С14]ЦМЭ-карбодиимида сосредотачивается в этом пике (рис.2). При модификации карбодиимидом ДНК интактной печени содержание олиго-нуклеотидной фракции, отражающей количество одноцепочечных участков, значительно меньше и составляет 8%.
Помимо чисто количественной оценки содержания одноцепочечных участков в репликативной ДНК, метод избирательной химической модификации карбодиимидом позволил определить, что нарушение дуплексной структуры свойственно не только матричным пререплика-тивным, но и вновь синтезированным пострепликативным молекулам. Крысам вводили [С14Этимидин через 22 часа после частичной гепат-эктомии (на пике синтеза ДНК ) и через 10 минут животных забивали. Обнаруживалось интенсивное включение меченого предшественника в ДНК регенерирующей печени. Такая ДНК после модификации карбодиимидом подвергалась ферментативному гидролизу и гель-фильтрации. Из рис. 3 видно, что [С143тимидин присутствует и в моно- и в олигонуклеотидной фракции. Удельные радиоактивности в них существенно не отличаются. Сам факт обнаружения метки [С14]тимидина в олигонуклеотидном пике позволил нам сделать за-
Рнс2. Гель-фильтрация ферментативных гидролизатов ДНК регенерирующей печени до и после модификации 1С1*]ЦМЭ-карбодиимидом. 1 - ^модифицированная ДНК, 2 - модифицированная ДНК, 3 - радиоактивность [С14]ЦМЭ-карОодиимида. Размер колонки 1x40 см.
имп/мм/м^
Рис.3. Гель-фильтрация ферментативных гидролизатов модифицированных ЦМЭ-карбодиимидом ДНК интактной и регенерирующей печени. 1 - ДНК регенерирующей печени, 2 - ДНК интактной печени, 3 - радиоактивность ДНК регенерирующей печени, меченой [С14]-тимидином. Размер колонки 1x50 см.
клвчение о том, что вновь синтезированная ДНК находится в мета-стабильном конформационном состоянии и содержит одйоцепочечные участки, доступные Для модификации карбодиимидом. Наличие метки в мононуклеотидном пике свидетельствовало о существовании совершенной дуплексной структуры, одна из цепей которой является вновь -синтезированной.
1.2. Отсутствие регистрируемых нарушений двуспиральной конфорыации ДНК пра усилении процесса транскрипции (2,3,4,10)
Известно, что при регенерации печени наблюдается индукция .ряда ферментов, обеспечивающих репликацию и деление клетки* происходит интенсивный синтез РНК. Нас интересовало,, не связана ли обнаруженная в период активного синтеза ДНК' дестабилизация двойной спирали также и с усилением процесса транскрипции.
Во всех Препаратах ДНК, выделенных как из интактной, так и -из регенерирующей . печени,. после обработки РНКазой остается около 3% так называемой •"гибридной" РНК,- которая может служить маркером транскрипции. Мы следили за бе судьбой по ^включению меченых предшественников.- При регенерации . печени наблюдается рост удельной радиоактивности гибридной РНК. Она. максимальна через 12-18 часов после частичной гепатэктомии (в • период интен-^ сивной транскрипции ) и достоверно снижается к 24 часам - пику синтеза ДНК. При этом она в несколько раз выше удельной радиол активности РНК интактной печени. При фракционировании в системе хлороформ: вода препаратов ДНК, выделенных из регенерирующей печени^в период максимального синтеза ДНК, гибридная РНК обнаруживалась в водной фазе, там же, где двуцепочечные молекулы ДНК. Если выделенные через 22 часа после частичной гепатэктомии препараты ДНК, содержащие [С14]гибридную РНК, последовательно подвергались модификации ЦМЭ-карбодиимидом, ферментативному гидролизу и гель-фильтрации, то меченые рибонуклеотида обнаруживались во втором, мононуклетидном, пике. Все это позволило заключить, что гибридная РНК .входит в структуру комплексов, не содержащих одноцепочечных участков.
Дополнительную информацию о состоянии транскрибируемой ДНК
мы получили в экспериментах, включающих субстратную индукцшэ тирозином синтеза FKK, программирующих тирозинвшнотрансферазу и другие ферменты. В отличие от регенерации, индукция не влияет на процесс репликации в гепатоцитах. Поэтому возможные изменения вторичной структуры ДНК можно отнести лишь на счет иядуцируекой транскрипции. Мы наблюдали двукратное увеличение удельной радиоактивности гибридной РНК в индуцированной печени в сравнении с интакгной, однако количество одноцепочечной ДК1С, переходящей в интерфазный слой при хлороформом фракционировании, или вырезаемой нуклеазани после подафзкацпи ВДЭ-карбодиимидом, не изменялось. Таким образом т пришли к заключению, что обнаруженное нарушение дуплексной структуры ДНК регенерирующей печени связано исключительно с процессом репликации. Если ке при транскрипции и происходит изменение конформации ДНК, то оно не регистрируется использованными нами методами.
В 70-е годы появились работы, указыващие на то, что ДНК в транскрибируемом участке переходит из B-формы в А-форму, отличающуюся тем, что плоскости пар оснований отклонены на 20° от нормали к оси спирали. Это позволяет FHK-полпмеразач осуществлять комплементарный синтез РНК в пределах короткого контактного участка без существенного нарушения дуплексной структуры ДНК (Иванов, Флорентьев, 1970).
1.3. Разработка метода дасЗпсЗ ХЕНзческсй ыодпЗэклцпп ДНК ЩЭ-карбодипкидоц н SBK п изучение структуры реплшштпвноа ДНЯ (5,6,7, 8, 10, 15).
С целью визуализации репликативной ДНК и оценки размеров участков с нарушенной дуплексной структурой нами был разработан метод двойной химической модификации одноцепочечных участков ДНК ВДЭ-карбодиимидом и электронноплотным маркером - фосфорноволь-фрамовой кислотой. Модифицированные нуклеотиды приобретают положительный заряд за счет четвертичной аммониевой группы ЦМЗ-карбодиимида и образуют прочный в кислой и нейтральной средах электростатический комплекс с отрицательными ионами ФВК -
H4[P(W20tf)g]3 . В специальных экспериментах с использованием
[С*^]карбодиимида и [P32]ÍBK было установлено, что, как в случае модификации мононуклеотидов (ТМФ), так и денатурированной ДНК, реакция между ФВК и остатками ЦМЭ-карбодиимида протекает в экви-молярных соотношениях.
. При гель-фильтрации дважды модифицированной ДНК регенериру-щей печени крыс, выделенной через 22 часа после частичной ге-патэктомии.в хроматографическом профиле помимо основного пика (ДНК I) была обнаружена фракция (ДНК II), задерживающаяся на сефадексе за счет большей сорбции. Она отсутствует в хроматогра-фических профилях образцов ДНК, выделенных в"периодыне связанные с интенсивной репликацией (интактная печень, регенерирующая печень через 12 и 48 часов после операции).
Существенным аргументом в пользу того, что ДНК II представлена реплицирующимися молекулами, служат данные по кинетике включения [ С ] тимидина in vivo во фракции ДНК I и ДНК II. В течение первых 10 минут удельная радиоактивность ДНК II в 2-3 раза выше, чем ДНК I; за 30 минут удельные радиоактивности ДНК I и ДНК II уравниваются, а через 60 минут меченые [С14]тимидином молекулы оказываются уже главным образом в составе ДНК I.
Сравнивая интенсивности реакции [С14]ЦМЭ-карбодиимида с ДНК II и денатурированной нагреванием ДНК (12,656 и 34,6% соответственно), мы заключили, что фракция ДНК II либо обогащена денатурированными молекулами в сравнении с нефракционированной ДНК, имеющей степень модификации 7,5%, либо содержит несовершенные дуплексы с доступными для модификации одноцепочечными участками.
Информацию о структуре репликативной ДНК мы получили при ее электронномикроскопическом изучении. Во фракции ДНК II были обнаружены двуцепочечные молекулы, которые при вхождении в тень, отбрасываемую шарами напыленного латекса после оттенения препаратов сплавом Pt-Pd, не видны, так как не обладают высокой электронной плотностью. В том случае, когда в тень латекса попадали одноцепочечные участки двуспиральной ДНК, они становились видимыми благодаря контрастированию их молекулами ФВК, обладающими
высокой электронной плотностью. Зная размер молекул ФВК, присоединяющихся в эквимолярных соотношениях к модифицированным нукле-отидам, мы имели возможность проанализировать распределение таких нуклеотидов в репликативных молекулах • и оценить размер участков с измененной вторичной структурой. Оказалось, что в пределах 400-600 пар нуклеотидов наблюдается частичное нарушение дуплекса. Расстояние между одноцепочечными участками, контрастированиями ФВК и имеющими размер не больше 8 нуклеотидов, колеблется от I до 7 витков двойной спирали. Подобные картины не наблюдались при микроскопии ДНК I или ДНК из интактной печени крыс.
Таким образом мы установили характер изменений вторичной структуры репликативных молекул ДНК. Через несколько лет появились работы, в которых был описан дискретный механизм сшивания фрагментов Оказаки, имеющих размер 200-400 нуклеотидов, в репликативных вилках ДНК эукариот (Kornberg, 1980). Возможно, мы фиксировали метастабильное состояние дуплекса, в котором замыкание водородных связей между сшиваемыми фрагментами Оказаки и матричной цепью ДНК еще не завершено.
I.4., Обнаружение в регенерирующей печени белка, дестобшизз-pyniero двойную спираль ДНК (II, 12, 13, 15, 18).
Мы предположили, что наблюдаемые нами кокформационные изменения структуры репликативных молекул поддерживаются In vltrö прочно связанными с ними белками. Во всех препаратах ДНК, выделенных как из интактной, так и из регенерирующей печени крыс, присутствовало до 2,5% белка, не отделяемого при фенольной де-протеинизации и обработке детергентом - додецилсульфатом-натрия. Эти белки удалось выделить после гидролиза ДНК иммобилизованными ферментами - эндонуклеазой Serratia тагсезсепз и фосфодиэстера-.зой яда гюрзы. Ацетоном осаждали комплекс белков с олигонуклео-тидами, отделение от которых проводили обработкойцетавлоном. Данные электрофореза в денатурирующих условиях- свидетельствовали о гомогенности выделенных таким образом белков из интактной и регенерирующей (22 часа) печени. Белок интактной печени - (БИП) имел молекулярную массу 8000 Дальтон, а- белок регенерирующей
печени (БРП) - 6500 Дальтон.
Было изучено влияние этих белков на дестабилизацию вторичной структуры гомологичной ДНК. Оказалось, что белок регенерирующей печени снижает температуру плавления ДНК с 75° до 50° при весовом соотношении 1:1. Белок интактной печени при том же соотношении не изменяет Т^ гомологичной ДНК. Наблюдаемый эффект дестабилизации дуплекса был возможен лишь в среде, не со-дерващей ионов Мз2"^ что характерно для широкого класса ББВ (белков, связывающихся с одноцепочечной ДНК). К моменту выполнения нашей работы подобные белки были обнаружены у фагов, бактерий, гриба из1;11а®э таусИз и в сперыатоцитах млекопитающих. Им приписывались различные функции при реализации таких генетических
Таблица I.
Влияние БИЛ и БРП на изменение вторичной структуры ДНК (инкубация I час при 37° в буфере 0,05 Ы трис-НС1, 0,002 М ЭДТА, рН 8,0)
Препарат Степень
модификации ДНК [С14 Зкарбодиимидом
М-ш
ДНК печени крыс 2,84-0,27
ДНК печени крыс + БИП (1:1) 2,74±0,78
ДНК печени крыс + БРП (1:0,1) 5,78-2,90
ДНК печени крыс + БРП (1:0,5) 22,45
ДНК печени крыс + БРП (1:1) 36,30-2,00
денатурированная нагреванием ДНК 34,62±1,82
ДНК печени крыс + БРП (1:1) + проназа 2,94
ДНК печени крыс + БРП, обработанный
проназой 3,54±0,75
ДНК тимуса теленка 1,11-0,20
ДНК тимуса теленка + БРП (1:1) 9,89-1,26
ДНК фага Т7 1,54±0,16
ДНК фага Т7 + БРП (1:1) 13,35-0,01
процессов, как репликация, репарация и рекомбинация. Ни один нз них не являлся ферментом и связывался с ДНК в стехиометрических количествах.
Регистрируя дестабилизирущее влияние БРП на двойную спираль ДНК по степени модификации ее [С14]ЦМЭ-карбодиимидом, мы установили зависимость глубины нарушения дуплексной структуры от количества белка (см.табл.1).
Полная денатурация дуплекса наблюдается при весовом соотношении ДНК:БРП, равном I. Обработка БРП проназой перед инкубацией с ДНК снимает его дестабилизирующее действие. Наблюдаемый эффект дестабилизации дуплекса носит обратимый характер, так как обработка проназой комплекса ДНК-БРП восстанавливает нативность ДНК. Это исключает возможное объяснение действия БРП на ДНК наличием примесных эндонуклеаз. Белок регенерирующей печени крысы не обладает видовой специфичностью - он дестабилизирует ДНК тимуса теленка и ДНК фага Т7, хотя и в меньшей степени, чем гомологичную ДНК.
Исходя из разницы в молекулярных весах и способности влиять на изменение вторичной структуры ДНК, можно заключить, что БИП и БРП - это разные белки. Однако, имея в виду, что количество примесного белка в препаратах ДНК, выделяемых в идентичных условиях из интактной и регенерирующей печени, одинаково, мы высказали предположение, что имеем дело с одним белком, активируемым в S-периоде. Такая активация может быть достигнута как за счет отщепления пептидного фрагмента, так и за счет модификации по различным аминокислотным остаткам.
Раздел 2. КОНСТРУИРОВАНИЕ НЕРАДИОАКТИВНО МЕЧЕНЫХ РНК- И ДНК-ЗОНДОВ ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ IN VITRO И IN SITU.
Приемы и методы химической модификации нуклеиновых кислот позволяют не только изучать их конформационные изменения, но и локализовать в геноме определенные нуклеотидные последовательности.
Для картирования хромосом используют метод молекулярной ги-
бридизации 1п а Ни. Ключевой проблемой является получение
зондов, обеспечивающих высокую чувствительность при анализе
результатов гибридизации. Широко распространено мечение зондов
радионуклидами, которые легко вводятся в РНК или ДНК с помощью
различных ферментов. Авторадиография обладает очень высокой
—?п
чувствительностью и позволяет регистрировать менее 10 моль репортерных соединений. Сегодня она является основным способом детекции при анализе гибридизации 1п а Ни, хотя очевидны ее недостатки - длительность и громозкость процедуры, низкое пространственное разрешение , невозможность использования препарата для повторной гибридизации и неприменимость для одновременной локализации на хромосоме различных нуклеотидных последовательностей. Кроме того, нестабильность изотопов и опасность для здоровья ограничивают использование радиоактивных зйндов для диагностики в медицине и сельском хозяйстве.
В последние 10 лет активно развиваются методы флуоресцентной и колориметрической детекции как в ДНК-диагностике, так и в исследовании структуры генома. Флуорохромы в отличие от радионуклидов стабильны и могут быть обнаружены при непосредственном микроскопическом наблюдении, что существенно сокращает время эксперимента по сравнению с авторадиографией. Использование нескольких зондов, несущих флуорохромы с отличающимися спектрами испускания, открывает возможность одновременной локализации в геноме различных нуклеотидных последовательностей. Высокая чувствительность (до Ю-18 моль) зондов, несущих биотин, выявляемый по образованию окрашенного продукта ферментом, конъюгиро-ванным с авидином или стрептавидином, и большая в сравнении с авторадиографией разрешающая способность колориметрии позволяют использовать биотинилированные зонды для локализации уникальных генов на метафазных хромосомах.
Существует несколько способов приготовления нерадиоактивно меченых зондов. Репортерше группы химическим или ферментативным путем вводятся статистически или по концу полинуклеотида. Все эти способы имеют ограничения либо по химической природе зонда -РНК или ДНК, либо по количеству сигнальных соединений, присоеди-
няемых на единицу длины полимера. Различен характер распределения метки вдоль полинуклеотидной цепи - кластерный или равномерный. При использовании ферментов для введения сигнального соединения очень высоки требования к чистоте препаратов нуклеиновых кислот.
Мы поставили перед собой цель - создание систеш химического мечения как РНК-, так и ДНК-зондов, позволяпцей в рамках одной схемы вводить в одинаковые зонды различные репортерные группы, такие как биотин или разные флуорохромы, и дающей возмоа-ность получать большие количества (>1 мг) стабильных в течение длительного времени нерадиоактигао меченых зондов, Еыявляегох при колориметрической или флуоресцентной детекции с высокой чувствительностью. В основу такой системы легла химическая модаЕа-кация"нуклеиновых кислот, позволяющая вводить в олиго- или полп-нуклеотид бензильные или алифатические аминогруппы, к которым затем могут быть присоединены производные биотина или различных флуорохромов.
2.1. Пути введения репкцзонноспособшх ензногрупп в РНК- п ДНК-зонды (19,20,22,23,24,25,26,31,33).
Статистическое введение в зонд аминогрупп кы осуществляли алкилированием 4-(К-2-хлорэтил-11-метиламино)-бензиламином (алки-лирукщим амином - АА) или переаминированием 4-ачинооксибутила'ги-ном (АБА). Оба реагента способны модифицировать азотистые основания как в составе РНК, так и ДНК. Алкилирование нуклеиновых кислот различными производными 2-хлорэтилшшюв хорошо изучено' (Гринева и др., 1970, 1974; Гринева и Мызина, 1975). При реакции ДНК с АА алкилированию подвергаются атомы N7 остатков гуанина; N1, N3 и N7 аденина; N3 цитозина. Мишенью для переачинирования в реакции с АБА является экзоциклическая С4 аминогруппа цитозина. Реакция переаминирования цитозина в составе нуклеозида и нуклео-тида гидроксиламином и его О-алкилпроизводными описана (Будов-ский и др., 1968; Петренко и Спирин, 1982). Модификацию двуцепо-чечной ДНК 4-аминооксибутиламином мы осуществили впервые.
Репортерные группы вводили в модифицированные поли- или олигонуклеотиды благодаря взаимодействию с бензильными (Рис.4)
ше алифатическими (Рис.5) аминогруппами реакциоыноспособншс производных: дансилхлорида, флуоресцеинизотиоцианата, тетраме-талродаминизотиоцианата, В-биотинил-е-аминокапроат-Ы-гидрокси-сукцинимида.
I II СН
о-сн
I
СН
СН
сн-сн
1 ч
о (он)
8ЛКЕШИрОВ &НИ6
С1 сн3 жа
и I! Т^О
СН3 МНа
нгГ^сГ'Ч
I II СН
—о-сна
СН
СН
сн-сн о (он)
флуорохромирование
нтг^с^ч
I II СН
-О-СН,
I ^
СН СН »» »»
СН-СН
СНа-СНа-М-^^-СН
о (он)
сн3
Рис.4. Схема введения репортерных груш в РНК- и ДНК-зонды. Алкилирование гуанина в составе полинуклеотида 4-(Ы-2-хлорэтил-М-метиламино)-Оензиламином и присоединение флуоресцеинизотиоцианата к бензильной аминогруппе.
О-(СНя)
ын3 I
ы^сн
I II л сн сг
мн
пере аминирование
-о-сн.
сн
кн2—о— (сна)
сн I II
уС СН
СН сн-сн
о (он)
сн сн сн-сн
о (он)
биотинилирование
о- (сна) „-МН-С- (сн2)
II I , ч ^
о кн—с— (СНа) ц—сн сн
о сн—сн
I I
НИ*. -МН
с
N4
I
М^0"4сн I II уС сн
-о-сн, I 0
сн сн сн-сн
о (он)
Рис.5 . Схема введения репортэрных групп в РНК- и ДНК-зонда. Переаминирование цитозина в составе полинуклеотида 4-амшюоксибутиламином и присоединение Б-биотинил-е-аминокапро-ат-№-гидроксисукцинимида к алифатической амшюгруппе.
На всех этапах процедуры мечения осуществляли контроль целостности полинуклеотидного зонда и определяли степень его модификации либо по радиоактивности [С ]АА или [Н3] биотинового производного, либо по коэффициенту молярного поглощения присоединенного флуорохрома при соответствующей длине волны.
Низкий уровень деградации, высокая чувствительность и способность к комплементарным взаимодействиям меченых FHK-зондов, полученных в результате двойной химической модификации как по схеме алкилирования, так и переаминирования, позволяют использовать их для молекулярной гибридизации in vitro и in attu. Однако лабильность РНК при высоких температурах и широкое распространение трудноудаляемых термостабильных РНКаз могут в ряде случаев снизить чувствительность анализа. Большая в сравнении с РНК химическая устойчивость ДНК и возможность получения клонированием значительных количеств ДНК-зондов любой специфичности делают более удобным использование для молекулярной гибридизации нерадиоактивно меченых молекул ДНК.
Алкилирупций амин, позволяющий вводить в полинуклеотид бензольные аминогруппы, предпочтительно атакует атомы Н 7 гуанина, не участвующие в образовании водородной связи и локализующиеся в большой бороздке двойной спирали. Репортерные группы, присоединяемые по этому положению гуанина, не должны препятствовать образованию комплементарных комплексов при гибридизации. Кроме того, атомы N 7 гуанина доступны для алкилирования в двуцепочеч-ной.ДНК. Однако известно, что более половины алкилированных пуринов элиминируется из ДНК уже в условиях модификации при рН 6. Препараты ДНК, содержащие большое количество апуриновых звеньев, непригодны для получения нерадиоактивно меченых зондов, так как в условиях флуорохромирования или биотинилирования (рН 8-9) может происходить расщепление ДНК по апуриновым сайтам.
Нами было оценено количество модифицированных оснований, остающихся в ДНК после процедур алкилирования при различных значениях рН, присоединения флуорохромов и инкубации в разных условиях гибридизации. Наименьшая (до 18%) элиминация модифицированных пуринов из ДНК происходит, если алкилирование проводить при рН 7,5, а гибридизацию и отмывки при таком же рН и температуре не выше 37°.
Обнадеживающе выглядят наши результаты, полученные при ал-килировании олиготимидилата (dT)9 при рН 10. Основным продуктом реакции является ИЗ-алкилтимин, не выщепляемый из ДНК в отличие
от алкилированных пуринов. Моено надеяться, что олиго- и полл-дозоксирибонуклеотиды, алкилированные при рН 10, найдут пржэпэ-ние в качестве нерадноактивно меченых зондов для молекулярзой гибридизации.
Альтернативной реакцией, приводящей к введению в состав п РНК и ДНК аминогрупп, является пере актирование цитозина 4- сглз-нооксибутиламином. В отличие от алкилированных пуринов производные АБА устойчивы в широком диапазоне рН и температуры. Поскольку нуклеофил, каковым является АБА, атакует азотистое основание перпендикулярно плоскости гетероциклического кольца, перэвнпнз-рование цитозина возмокно лишь в одноцепочечных участках пуклзп-новых кислот. Исходя из кинетики модификации ДНК 4- акпнооксибу-тиламином при различных условиях денатурации дуплекса глы ноет такие значения времени реакции, температуры, концентрации АБА и рН среды, которые обеспечивают получение любой (до 203) заранее заданной степени модификации двуцепочечной ДНК. Ваяно отметить, что деградация ДНК после модификации АБА -и присоединения рэпор-терных групп несущественна для дальнейшего использования зонда в молекулярной гибридизации. Биотинилированная на 42 ДНК имеет средний размер 2500 нуклеотидов, а минимальный - 500 нуклеоти-дов. Мы установили, что олигонуклеотида (48-меры) биотиншшруот-ся в рамках предлоненной схеш без деградации и детектируются с высокой чувствительностью до I пг.
Тагам образом, с использованием хкдгческой модификации по-линуклеотидов был разработан способ получения нерадиоактивпых зондов, позволяющий метить как РНК, так и ДНК, имеющий высокую воспроизводимость условий, гибкость при введении различных рэпо-ртэрных групп, дающий низкую деградацию полимеров и высокую чувствительность при флуоресцентной или колориметрической детекции.
2.2. Опрадалеппе чувствительности ОяуорозрсгззровпнЕых зондов и та использование в гибргугпзац:::! 1п в!Ли (19,20,22,23,24,25,26,29).
Репортерше группы вводятся в зонд преимущественно по тем атомам азотистых оснований, которые участвуют в образовании водородных связей с нуклеотидами комплементарной цепи. Большой
размер и гидрофобность таких груш объясняют и их влияние на стэкинг-взаимодействия азотистых оснований. Поэтому при работе с зондами, несущими репортерше группы, статистически распределенные вдоль полимерной цепи, необходимо определение степени модификации полинуклеотида, которая не сказывалась бы на его способности к комплементарным взаимодействиям.
. В качестве модели, мы использовали полиинозиновую кислоту, модифицированную дансилхлоридом или флуоресцеинизотиоцианатом после введения бензильных аминогрупп алкилированием. Характер кривых смешения поли(Ц) с образцами поли(И), несущими до 1755 флуорохромированных нуклеотидов, позволили заключить, что комплементарные комплексы образуются при молярном соотношении поли-нуклеотидов 1:1, как и в случае с ^модифицированной полиинози-новой кислотой. Однако гипохромных эффект резко уменьшается после достижения 8% модификации (Рис.6). Отсюда следовало, что совершенные дуплексы образуются при меньших степенях модификации.
Рис.6. Зависимость гипохромизма комплексов поли(И)-поли (Ц) от степени модификации поли(И) флуopeсцеином.
При измерении флуоресценции комплекса с максимальным гипо-хромным эффектом мы установили, что она не ниже, а на 10% выше, интенсивности флуоресценции того же образца поли(И) вне комплекса с поли(Ц). Это объясняется уменьшением подвижности флуорохрома в составе дуплекса, что приводит к меньшему рассеянию энергии возбужденной молекулы и увеличению квантового выхода.
При сравнительном изучении флуоресценции образцов гРНК СЬ1-гопошз Ишви1, несущих дансил или флуоресцеин, мы определили выбор флуорохрома и границы, в которых имеет смысл модифицировать полинуклеотид для дальнейшего использования его в качестве зонда при молекулярной гибридизации. Регистрируя изменение интенсивности флуоресценции от степени модификации зонда, мы установили, что максимальные значения флуоресценции достигаются при уровне модификации РНК флуоресцеином, составляющем 5%. Чувствительность образцов, несущих дансил, на порядок ниже (Рис.7). 1/А
300-1
200-
100-
0-^—I—I "I | —1—I—I—I—I—I—|—I—'—1—1 I 1 1 1 I
1 3 5 7 9 11
Процент модификации
Рис.7. Зависимость чувствительности зонда от степени модификации флуоресцеином (I) или дансилом (II). На оси ординат величина пропорциональная чувствительности - 1/А, где I - интенсивность флуоресценции в отн.ед., А - поглощение РНК при 260 нм.
Гидролиз флуорохромировэнной РНК до нуклеотидов приводит к росту интенсивности флуоресценции, причем этот рост тем значительнее, чем выше степень модификации полимера. Это указывает на концентрационное гашение флуоресценции, объясняемое взаимным влиянием соседних остатков флуорохромов, расположенных на одной полинук-леотидной цепи. Гашение начинается уие при степенях модификации выше 1,5% (Рис.8).
о 2 4 0 8 10 12 Процент кодификации
Рис.8. Зависимость квантового выхода флуоресцэнтномеченой РНК от степени модификации флуоресцеином. На оси ординат величина пропорциональная квантовому выходу - 1/А, где I -• интенсивность флуоресценции в отн.ед., А - поглощение модифицированной РНК при длине волны 492 нм, соответствующей максимуму возбуждения флуоресценции.
Совокупность данных о способности флуорохромированнкх поли-нуклеотидов к комплементарным взаимодействиям, об отсутствии
гашения флуоресценции в дуплексе и об уменьшении квантового выхода в связи с концентрационным гашением, указывает на целесообразность использования в качестве зондов для молекулярной гибридизации полинуклеотидов, модифицированных флуоресцеином в диапазоне 4-8%.
Для определения чувствительности таких зондов была проведена дот-гибридизация [Р32]ДНК, в которую флуоресцеин был введен после ее реакции с АБА (степень модификации 4%),с немеченой гомологичной ДНК, иммобилизованной на нитроцеллюлозных фильтрах. Зонд позволял детектировать до 200 пг ДНК на I мм2. Большую чувствительность на поддонках получить невозмолпо из-за низкого соотношения сигнал/фон. Это связано как с собственной флуоресценцией фильтра, так и с рассеянием возбуждающего света микропористой структурой мембраны. В случае флуоресцентной микроскопии при том же количестве ДНК на единицу площади чувствительности зонда достаточно для наблюдения за ядрами и отдельными хромосомами.
Сегодня- существует несколько способов непрямой флуоресцентной детекции результатов гибридизации 1п эltu. Как правило, зонд выявляют либо, с помощью флуорохромированных антител, либо конъюгатов, включающих ферменты, образующие цветные продукты реакции. Предложенный нами.метод прямого флуоресцентного мечения зонда значительно ускоряет и облегчает процедуру гибридизацион-ного анализа.
Возможность получения различных зондов, несущих флуорохромы с отличающимися спектрами испускания, открывает перспективы исследований, в которых необходимо прослеживать взаимное положение определенных хромосом на разных этапах клеточного цикла, в разных тканях,на разных стадиях онтогенеза. О принципиальной возможности использования при решении такого рода задач ДНК-зондов, сконструированных в рамках предложенной схемы, говорят эксперименты, выполненные нами совместно с сотрудниками лаборатории генетики онтогенеза ИЦиГ Л.Д.Матяхиной и О.Л.Серовым. Мы провели гибридизацию 1п зttu смеси клеток из разных культур мыши и норки (линии ШГК~ и МУ соответственно) с тотальной ДНК мыши, меченной
тэтраметилродамином,и одновременно с ДЕК норки, меченной флуо-ресцеином. Под люминесцентным микроскопом были видны ядра мышиных клеток, имеющие желтую флуоресценцию, и зеленые ядра клеток норки (Рис.9). После гибридизации 1п аМи с этими же зондами клеток гибридом, содержащих хромосомы и мыши и норки, можно было дифференцировать по свечению хромосомы разных видов.
Рис.9. Гибридизация in situ смеси клеток мыши (1) и норки (2) с ДНК мыши, меченной тетраметилродамином. и ДНК норки, меченной флуоресцеином.
2.3. Биотинилированные ДНК-зонды в гибридизации in situ
(31, 33).
Чувствительность биотинилированных ДНК-зондов, полученных в результате двойной модификации АБА и сукцинимидным производным биотина, была определена при дот-гибридизации с гомологичной плазмидой. Она была максимальна при степени модификации ДНК 4% и позволяла выявлять 0,3 пг ДНК мишени колориметрически по образованию окрашенного продукта щелочной фосфатазой, входящей в состав конъюгата со стрептавидином. При этом отсутствовал сигнал от 1000 пг ДНК спермы лосося, что указывает на высокую специфичность сконструированных зондов (Рис.10). О высокой чувствитель-
1 - 1000,0 пг
2 - 100,0
W. 3 - 31,6
• 4 - 10,0
5 - 3,2
• 6 - 1,0
ф 7 - 0,3
Рве.10. Дот-гибридизация биоти-нилироваиного зонда с гомологичной ДНК. 1 - ДНК лосося. 2-7 - ДНК плазмиды.
ности биотинилированного зонда свидетельствует и результат блот-гибридизации с выявлением уникального гена хорионического сома-томаммотропина(рис.11). ДНК человека была гидролизована рестрик-тазой Eco RI, после гель-электрофореза и окрашивания EtBr перенесена и иммобилизована на капроновой мембране. Зондом служила биотинилированная плазмида hcs-З, содержащая часть гена сомато-маммотропина длиной 3 kb.
12 3 12 3
Рис.11. Выявление гена соматомам-мотропина блот-гибридизацией с биотинилированным зондом. А - Гель-электрофорез рестрикти-
рованной ДНК . Б - Гибридизация с биотинилированным зондом.
1 - биотинилированные маркеры.
2 - рестриктированная ДНК человека
10 мкг.
3 - рестриктированная ДНК человека
2 мкг.
А Б
Эта же плазкйзда была использована для гибридизации 1п зИи с препаратами хромосом из лимфоцитов периферической крови человека. Работа проводилась совместно с сотрудниками лаборатории ци-
тогбнвтики животных ИЦиГ Н.В.Воробьевой, А.С.Графодатским и О.В.Саблиной. При просмотре 40 метафазных пластинок ген сомато-маммотрошша с высокой точностью был локализован в районе <\2.2 хромосомы 17. Локализация высоко достоверна (%2=72,0) (Рис.12) До сих пор это ген был локализован авторадиографически с точностью до трех полос при С-окраске(Де1т1пв Хи ег а1,1988).
пгАт'кжтЮн^ипгУл! ЛЛ ■ ЬпА-жу-д-иягпу/и и«а! ш 12 3 4
5 6 7 8 9
>
гхК/Ип виагй ¿иМп ГЖ^Ш]
10| 11 12 13 14 15 16
НГХ/Н»»
17 18 19 211 21 22 X
Рис.12. Локализация гена соматомаммотропина на метафазных хромосомах человека при нерадиоактивной гибридизации 1п зНи.
Биотинилированные зонды можно локализовать при гибридизации 1п аИи, не только с помощью колориметрической детекции. После аффинного связывания флуорохромированного стрептавидина с зондами, несущими биотин, их можно наблюдать под люминесцентным микроскопом. Возможен и вариант, когда флуорохромированные зонды выявляются иммунохимически с помощью антител к тому или иному флуорохрому. Антитела можно биотинилировать или конъюгировать с ферментом, образующим окрашенный продукт.
2.4. Практическое приложение системы нерадиоактивной детекции в ДНК-диагностике (27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37).
Предложенная двухстадийная схема химического введения нерадиоактивных репортерных групп в полинуклеотид позволяет быстро (в течение 3 часов) получать большие количества (>1 мг) стабильных в течение длительного времени биотинилированных ДНК-зондов. Их чувствительность при гибридизации лежит в интервале 0,5-0,3
пг ДНК мишени при выявлении с помощью конъюгата стрептавидин-щелочная фосфатаза. Все это дает возможность препаративного приготовления нерадиоактивно меченых зондов для диагностических приложений.
Нами били оптимизированы все этапы нерадиоактивной ДНК-диагностики от процедуры мечения зонда до приготовления выявляющего конъюгата. Проведено сравнительное изучение различных методов иммобилизации ДНК на капроновых, нитроцэллюлозных и других микропористых мембранах. Критерием оценки эффективности иммобилизации служила эффективность гибридизации при разных видах детекции. Был предложен защищенный авторским свидетельством (30) способ фотоиммобилизации ДНК, позволяющий использовать различные, в том числе нетрадиционные, подложки, выбор которых определяется практической задачей, стоящей перед исследователем. Облучением мишени ультрафиолетом в оптимальной дозе можно получить максимальный гибридизационный сигнал на капроновых, тефлоновых, нитроцеллюлозных, пожстирольных и других подложках. Были подобраны условия эффективного блокирования фона на различных мембранах и найдены способы уменьшения времени гибридизации и отмывок от нескольких до одного часа.
Располагая методом получения высокочувствительных зондов и эффективными способами иммобилизации ДНК и гибридизации на фильтрах, мы разработали тест-системы для нерадиоактивной ДНК-диагностики микоплазм, малярии и лейкоза крупного рогатого скота. (По соображениям патентной защиты эти работы не опубликованы в открытой печати, а лишь лаконично изложены в тезисах).
Известно, что.микоплазменная контаминация является серьезной проблемой клеточной биологии и биотехнологии. Заражение ми-коплазмами приводит к ошибочным результатам в экспериментах с клеточными культурами и даже к потере клеточных линий. В настоящее время при публикации работ свобода культур клеток от микоплазм является необходимым требованием. Существует ряд методов для тестирования микоплазменных контаминаций - окрашивание ин-теркалирукщими красителями, биохимическое выявление специфических ферментов, бактериологическое тестирование на специальных
средах. Однако они либо обладают недостаточной чувствительностью и зачастую дают ложно положительные результаты, либо, как в случае с бактериальным тестированием, сложны и доступны лишь в специализированных лабораториях. Гибридизационный тест с использованием радиоактивно меченых зондов не может быть применен в клинике и в сельском хозяйстве.
Для нерадиоактивной детекции микоплазменных контаминаций гибридизацией, мы приготовили биотинилированный зонд на основе плазмиды рМ& 16, содержащей ген 23Б гРНК и часть гена 163 гРНК Ы1сор1аата ваШаерИсш. Этот зонд является универсальным при детекции разных видов микоплазм. При гибридизации с ДНК И.дЛИаерИсит, иммобилизованной на нитроцеллюлозном фильтре облучением ультрафиолетом, он позволяет выявлять 5-10 нг ДНК мишени, что соответствует 5-10 микоплазмам на клетку. Такая чувствительность дает возможность использовать Сиотиншшрованную плазмиду для рутинного скрининга клеточных линий. В настоящее время кардиологический научный центр РАМН (Москва) включает этот и другие биотинилированные нами зонды в состав диагностических наборов.
Существует несколько способов выявления одного из наиболее патогенных паразитов человека - малярийного плазмодия - световая микроскопия, иммунологические методы, ДНК-диагностика. Гибриди-зационная техника имеет такие преимущества, как возможность быстрого анализа большого числа образцов крови одновременно, высокую достоверность и способность идентифицировать различные виды плазмодиев. Широкое применение в клинической практике гибридиза-ционных тестов на малярию тормозится отсутствием как недорогих и технологичных способов подготовки образцов крови для анализа, так и простого метода получения нерадиоактивно меченых зондов.
В качестве зонда мы использовали рекомбинантную плазмиду, содержащую видоспецифичный повтор Нер2, выделенный из танзанийского изолята РгаатсхИит /а1с1рсгит. Он составляет 1% генома паразита и не имеет гомологии с ДНК человека, что позволяет использовать такой зонд в варианте дот-гибридизации без освобождения от ДНК лейкоцитов крови. Биотинилированный зонд при колори-
метрической детекции результатов гибридизации позволяет выявлять 100 пг ДНК плазмодия, что соответствует 250 паразитам.
При скринировапии образцов крови пациентов (Вьетнам) на разных стадиях заболевания и здоровых людей независимо двумя методами - микроскопическим анализом и дот-гибридизацией на капроновых мембранах, была изучена корреляция между плотностью заражения и величиной гибридизационного сигнала (рис.13). Наблюдалось хорошее совпадение результатов, при этом надежность гибридизационного теста остается высокой даже в случае малой парази-тэмии, когда микроскопический анализ становится трудоемким и занимает много времени. Настоящий нерадиоактивный тест на выявление тлалярийного плазмодия может найти применение при эпидемиологическом обследовании населения, в клинике, для анализа чисто-
Рис.13. Зависимость величины гибридизационного сигнала (по оси ординат в ед. оптической плотности) от плотности заражения малярийным плазмодием (по оси абсцисс количество кольцевых форм паразита на 1000 лейкоцитов).
Современные методы выявления заражения крупного рогатого скота вирусом бычьего лейкоза (ВЬУ) основаны на серологических
реакция^. Различные РИД, ИФА-диагностикумы обнаруживают антитела к структурным белкам вируса.Однако уровень антител в крови инфицированного животного может быть столь низок, что заражение невозможно определить иммунологическими методами. В некоторых случаях, при развитии лимфосаркомы, злокачественные клетки теряют способность к продукции вирусных белков, и животные с таким развитием болезни дают в ИФА или РИД.ложные результаты.
Мы предложили трехзондовую гибридизационную схему выявления провируса ВЬУ в геноме животного. Два олигонуклеотидных зонда, фланкирующих фрагмент гена Хц^, определящего патогенность вируса, использовали в качестве праймеров полимеразной цепной реакции. О наличии специфического амплифицированного фрагмента судили по . результату блот-гибридизации . с: биотинилированным третьим зондом, комплементарным его внутреннему району. Чувствительность выявления провируса при таком способе детекции позволяет обнаруживать I инфицированную из .более чем 1000 клеток крови. Тест может быть, применен при скринировании элитных животных.
Раздел 3. ИНДУКЦИЯ НАПРАВЛЕННЫХ ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫХ РАЗРЫВОВ В ДНК ПОЛИТШШ ХРОМОСОМ Ш Б ГШ ДЕЙСТВИЕМ АЛКНЛИРУЩИХ ПРОИЗВОДНЫХ ОЛИГОАДЕНИЛАТОВ (14,16,17,19,21,22).
; При анализе результатов молекулярной гибридизации 1п зИи и авторадаография, и приемы нерадиоактивной детекции, с разной •точностью и чувствительностью позволяют локализовать меченый .зонд на хромосоме. Чувствительность гибридизации зависит как от способа выявления, так и от количества репортерных групп в зонде, то есть при неконцевом мечении от . его длины. : Надежно локализуются зонды не короче I кЬ. В том .случае, когда нужно определить положение на' хромосоме короткой олигонуклеотидной последовательности'. , чувствительности колориметрической и прямой'флуоресцентной детекции не хватает:. -
Возможен принципиально^иной подход к. анализу молекулярной гибридизации 1п аИи - регистрировать не репортерные группы зонда,а факт возникновения пары мишень-зонд.'Если специфическая гибридизация не прошла," то нет и. предмета детекции.
Мы разработали метод получения и-визуализации специфических одноцепочечных разрывов в ДНК политенных хромосом, • .являющихся результатом гибридизации In situ с модифицированными.олигонукле-. отидами. Такие разрывы расширялись под действием экзонуклеаз . и образовавшиеся в районе специфической гибридизации одноцепочеч-ныв участки ДНК детектировались после окрашивания хромосом флуо-рохромом.
В основу метода лег предложенный Н.И.Гриневой принцип комплементарно адресованной фрагментации ДНК in vitro (Гринева и др., 1975). Его суть состоит в том, что в результате гибридизации с алкилирувдими производными олигонуклеотидов происходит модификация пуринов ДНК. При этом, алкилируются не произвольно расположенные пурины, а лишь те, что находятся в непосредственной близости от несущего алкилиругацую группу конца олигонуклео-тида, входящего в комплементарный комплекс .Скорость алкилирова-ния ДНК в комплементарном комплексе на 3-5 порядков выше, - чем вне комплекса. После элиминации алкилированных оснований. ДНК расщепляется по апуриновым сайтам в специальных условиях.
-v с,
— у Ln^vn jl^ I
CAp)5A-RCL
2)3-0— [4- (и-2-хлорэтил-^метиламино )-бензилидефвое производное гексааденилата
3"-T-T-T-T-T-T-G-A-G- 5 5 A-A-A-A-A-A-RCL 3
Рис.14. Схема комплементарно адресованной модификации пуринов в составе ДНК.
В качестве алкилирупцего агента мы использовали 2*,3'-О-[4-(N-2-хлорэтил-1*)-м9тиламино)-бензилиден]овое производ-
нов гексааденилата ((Ар)5АЙС1). Адресующая часть реагента, оли-го(А)-последовательность, рассматривалась нами как зонд, позволяющий локализовать Т-тракты в геноме СЬ1готютиа íhuшí thuшi (Рис.14).
Работа была выполнена на политенных хромосомах слюнных желез личинок IV возраста лабораторной культуры этого вида двукрылых. Она включала в себя следующие этапы: I) выделение изолированных политенных хромосом и их фиксацию; 2) денатурацию ДНК хромосом; 3) комплементарно адресованную фрагментацию ДНК (получение специфических одноцепочечных разрывов); 4) расширение разрывов под действием экзонуклеаз в денатурирующих условиях; 5) ренатурацию ДНК; 6) флуорохромирование хромосом акридиновым оранжевым (АО) и 7) люминесцентную микроскопию.
При взаимодействии АО с двуцепочечной ДНК образуется мономерный. комплекс, люминесцирувдий зеленым светом с А^^ = 530 нм; адсорбция красителя на одноцепочечных участках ДНК сопровождается его димеризацией. При- этом зеленая флуоресценция тушится и появляется красное свечение димерных комплексов АО с
Атах=640
Контролем специфичности адресованной фрагментации ДНК служили препараты хромосом, прошедшие все этапы обработки, но без добавления (Ар)5АНС1. Зеленые хромосомы с четкой дисковой структурой были видны на всех 26 препаратах, каждый из которых содержал по 20-25 изолированных хромосом. Красных участков на них не наблюдалось .Случайные одноцепочечные разрывы ДНК, приводящие после расширения экзонуклеазами к появлению одноцепочечных участков, не могут повлиять на флуоресцентный портрет хромосомы. Только в том случае, когда тысячи молекул ДНК, составляющие по-литенную хромосому, разрываются благодаря комплементарно адресованной фрагментации в одном и том же месте, и эти разрывы расширяются, образующиеся одноцепочечные участки видны за счет красного свечения на фоне зеленой флуоресценции хромосомы.
Были подобраны условия денатурации ДНК в составе политенных хромосом, приемлемые как для молекулярной гибридизации с алкили-руюцими производными олигоаденилатов, так и для работы экзонук-
лэаз - щелочной фосфомоноэстеразы Е. coli (ФМЭ) и фосфодиэстера-зы яда кобры (ФДЭ). Эффективность денатурации определяли по изменению флуоресценции окрашенных АО хромосом с зеленой в контроле на красную после инкубации препаратов в денатурирующих условиях. Лучшие результаты были получены при инкубации хромосом в течение 30 мин при 50°С в буфере, содержавшем 20% формамида. Активность использованных нами экзонуклеаз при 50° оказалась выше, чем при 37° (<ЖЭ в 1,2 раза, а ФДЭ в 1,6 раза), но 20%-ный формамид снижал активность <ЖЭ на 60%, а ФДЭ на 40%.
После.окрашивания АО препаратов, подвергшихся йлкилированию за счет образования комплементарных комплексов с (АР)^АНС1, пикированию ДНК по апуриновым сайтам и действию экзонуклеаз, мы наблюдали хромосомы, имеющие зеленую флуоресценцию, часть из которых содержала участки, флуоресцирующие красным. Половина из ,50 красных участков локализовалась в теломерных районах. Имеются литературные данные о преимущественной локализации Т-трактов в теломерах политенных хромосом другого вида двукрылых Bhynchosclara angelae (Jones et al., 1973).
Ни • в одном случае мы не обнаружили внутренние красные участки на II хромосоме. Чаще всего они локализовались в прицен-тромерном районе I . хромосомы (ВЗ) и III хромосомы (LB3) (рис.15). Известно, что в последнем находится■структурный интер-калярный гетерохроматин, гибридизующийся с С1а-повторами.
ir с ." il
РисЛ5. Схема локализации Т-трактов в политенных хромосомах Chironomus twrnl tvrnil.
При использовании алкилирувдего реагента с более длинным адресом (Ар)16АЕС1 в этих же районах I и III хромосом наблюдалась фрагментация. Это возможно в том случае, когда Т-тракты расположены тандемно в обеих нитях ДНК. Одноцепочечные разрывы, возникающие в непосредственной близости от них, при расширении экзонуклеазами перерастают в смыкаемые бреши, что и приводит к фрагментации хромосомы.
Известно, что константа связывания олигонуклеотидов с ДНК понижается более, чем на порядок, при исключении из реакционной среды ионов В том случае, когда мы проводили гибридизацию
in at tu с алкилирующими производными олигоаденилатов в отсутствии ионов Mg2"1", все хромосомы не отличались от контрольных, то есть не были фрагментированными и не содержали красных участков. Такая же картина наблюдалась, когда гибридизацию проводили в присутствии ионов и 8-кратном избытке олигонуклеотидов
(Ар)пА, не несущих алкилируицей группы ( содержание в смеси олигонуклеотидов с п=5-6 - 42%, п=7-8 •- 17%, п=19-24 - 29%, п=25-80 - 12»).
Отсутствие одноцепочечных разрывов в случае конкурентной гибридизации с (Ар)пА и влияние ионов на действие алкилирую-щих производных олигоаденилатов свидетельствуют об алкилировании ДНК политенных хромосом в комплементарных комплексах. Одноцепочечные разрывы возникают лишь в непосредственной близости от Т-трактов и тем самым служат специфическими маркбрами для их локализации на политенных хромосомах.
Таким образом, модифицирущие производные олигонуклеотидов были применены не только как инструмент комплементарно адресованной модификации ДНК, но впервые в качестве зонда для молекулярной гибридизации In situ. Также впервые было использовано явление двухцветной флуоресценции при анализе результатов гибридизации in aitu. Одновременно с нами выполнили работу Радкин и Столлар, которые получали специфические антитела, меченые рода-.мином, для выявления гибридов поли(А)-поли(Т) (Rudkln, Stollar, 1977).
Помимо всего прочего, наша работа является одним из первых
примеров направленного воздействия на эукариотический геном.
Сегодня существуют как возможности химического синтеза олигонуклеотидов с любой первичной структурой, так и способы присоединения к ним различных модифицирущих груш. Использование в качестве адреса модифицирующего реагента определенных олигонуклеотидов, tPHK, гРНК, индивидуальных шРНК или их частей открывают широкие возможности для изучения структурно-функциональной организации генома эукариот.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Используя химическую модификацию как инструмент изучения структурно-функциональной организации генома, автор получил результаты, позволяющие в той или иной мере ответить на конкретные вопросы, поставленные во введении к данной работе.
Методом избирательной модификации азотистых оснований в одноцепочечных участках ДНК карбодиимидом была количественно оценена доля таких участков в репликативных молекулах. Используемые до этого методы центрифугирования, фракционирования в двухфазных системах и хроматографии на гидроксилапатите лишь косвенно свидетельствовали о наличии одноцепочечных районов в ДНК в период еб синтеза. Кроме того нам удалось определить, что нарушение дуплексной структуры свойственно не только матричным пре-репликативным, но и вновь синтезированным пострепликативным молекулам. Это привело к представлению о метастабильном состоянии вновь синтезированных молекул ДНК.
При дальнейшем изучении состояния ДНК с помощью разработанного метода двойной химической модификации карбодиимидом и ФВК одноцепочечные участки были визуализированы за счет введения в н их электронноплотного маркера. Непосредственное микроскопическое наблюдение позволило установить характер изменений в структуре репликативных молекул - частичное нарушение дуплекса было видно в пределах 400-600 пар нуклеотидов.
Что позволяет сохраняться in vitro одноцепочечным участкам в препаратах репликативной ДНК из регенерирующей печени крыс? Из этих препаратов был выделен прочно связанный с 'ДНК белок. При
изучении влияния его на дестабилизацию вторичной структуры ДНК было установлено,. что он снижает температуру плавления гомологичной ДНК и в стехиометрических количествах способствует плавлению дуплекса как гомо-, так и гетерологичной ДНК. Строгие правила номенклатуры не позволяют нам отпасти этот белок к SSB-белкам. Определение места выделенного белка в сложном репли-кативном комплексе эукариотической клетки может составить предмет отдельного исследования.
Обнаруженное нарушение дуплексной структуры ДНК связано исключительно с процессом репликации. Изменения конформации ДНК при транскрипции мы не смогли зарегистрировать использованными в работе методами,', что может говорить об ограниченном характере таких изменений.
Конструирование нерадиоактивно меченых .зондов для молеку-. лярной гибридизации in vitro и in altu составило содержание второй части работы. Была создана система химического мечейия.как РНК-, так и ДНК-зондов, позволяющая в рамках одной схемы получать одинаковые, зонда с различными репортерными группами. В основу такой системы легла двустадийная химическая модификация нуклеиновых кислот. На первой стадии в полинуклеотид вводились бензильные или алифатические аминогруппы, на второй стадии - к ним присоединялись производные биотина или различных флуорохро-мов. Были изучены условия двойной химической модификации, позволяющие получать большие количества стабильных нерадиоактивно меченых зондов, выявляемых при колориметрической или флуоресцентной детекции с высокой, чувствительностью.
Продемонстрирована возможность прямой флуоресцентной детекции разных геномов при одновременной гибридизации in situ с различными ДНК-зондами, несущими флуорохромы с отличающимися спектрами испускания. Использование высокочувствительного биотинили-рованного зонда позволило с большей точностью, чем при авторадиографии, локализовать на метафазной хромосоме 17 человека уникальный ген соматомаммотропина.
Существование гибкой системы мечения и большого арсенала способов выявления нёрадиоактивно меченых зондов открывает новые
возможности исследования структурно-функциональной организации эукариотического генома. Флуорохромированными зонда:,и, представляющими различные повторяющиеся элементы генома -сателлитную ДНК, А1и-повторы и т.п., можно маркировать хромосому. Такая маркировка в отличие от дифференциальной окраски будет непосредственно привязана к первичной структуре генома. При удачном подборе маркеров можно будет увязывать -цитогештические карты с генетическими,, получаемыми с помощью НР1Р-маркеров, а также создавать системы опорных точек для реконструкции карт из геномных библиотек и при получении энциклопедий генов.
Проблема локализации в геноме коротких олигонуклеотидных последовательностей была решена в работе, выполненной на поли-тенных хромосомах Ch.iron.omu3 Мишенью для химической мо-
дификации служили азотистые основания, находящиеся в непосредственной близости от участка специфической гибридизации. Модифицирующим действием алкилирущих производных олигоаденилатов была осуществлена индукция направленных одноцепочечных разрывов в ДНК хромосом. После их расширения экзонуклеазами и специфического окрашивания образующихся одноцепочечных участков флуорохромом было определено положение в геноме Т-трактов. Впервые при анализе результатов молекулярной гибридизации 1п эИи была использована двухцветная флуоресценция, а так же проведена локализация очень коротких последовательностей. Данный подход может оказаться весьма перспективным для определ&ния положения в геноме эн-хансеров, промоторов, терминаторов транскрипции, районов связывания рецепторных комплексов и других функциональных сайтов.
ВЫВОДЫ
I. Установлен характер изменений вторичной структуры ДНК регенерирующей печени крыс в связи с репликацией:
а) методом избирательной химической модификации одноцепочечных ' участков ДНК водорастворимым ВДЭ-карбодиимидом определена доля таких участков в репликативных молекулах. В период активного синтеза ДНК (22 часа после час-
тачной гепатэктомии) содержание одноцепочечных участков составляет 18%;
б) показано что нарушение дуплексной структуры свойственно не только матричным, но и вновь синтезированным молекулам;
в) репликативная ДНК была выделена и визуализирована под электронным микроскопом благодаря разработанному методу двойной химической модификации ЩЭ-карбодиимидом и ФВК. Частичное нарушение структуры дуплекса наблюдалось в пределах 400-600 пар нуклеотидов.
2. Выделен и охарактеризован белок регенерирующей печени крыс, прочно связанный с репликативной ДНК. Показано, что:
а) он способен снижать температуру плавления ДНК печени
. крысы на 25°. Полная денатурация дуплекса наблюдается
при весовом соотношении ДНК:белок, равном 1:1;
б) он не обладает видовой специфичностью - дестабилизирует ДНК тимуса теленка и фага Т7.
3. Создана система химического нерадиоактивного мечения как РНК-, так и ДНК-зондов для молекулярной гибридизации, основанная на введении в полинуклеотиды алкилированием или переаминированием аминогрупп с последующим присоединением к ним репортерных соединений. При этом:
а) найдены условия реакции ДНК с алкилируицим амином и 4-аминооксибутиламином, обеспечивающие получение полимерных (со средним размером 2500 нуклеотидов) зондов с любой (до 20%) заданной степенью модификации;
б) определен уровень мечения зондов биотином и флуорохро-мами, дающий максимальную чувствительность при дот-, блот- и 1п зИи гибридизации;
в) продемонстрирована возможность прямой флуоресцентной детекции результатов одновременной гибридизации 1п зИи с различными ДНК-зондами, несущими флуорохромы с отличающимися спектрами испускания;
г) использование высокочувствительного биотинилированного
зоцца позволило с большей точностью, чем при авторадиографии, локализовать на метафазной хромосоме 17 человека уникальный ген соматомаммотропина.
4. Разработан метод получения и люминесцентномикроскопичес-кой визуализации направленных одноцепочечных разрывов в ДНК по-литенных хромосом, основанный на принципе комплементарно адресованной модификации.
5. Установлена локализация Т-трактов в хромосомах слюнных желез Chironc/тиз thmnl tftumt при использовании алкилирущего производного гексааденилата в качестве зонда для молекулярной гибридизации in attu.
6. Возможность быстрого (в течение 3 часов) получения большого количества (>1 мг) стабильных и высокочувствительных( до 0,3 пг ДНК мишени) биотинилированных зондов в сочетании с эффективным и простым способом фотоиммобилизации ДНК на подложках позволила разработать тест-системы для нерадиоактивной ДНК-диагностики лейкоза крупного рогатого скота, тропической малярш человека и микоплазменных контаминаций культур клеток.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Salganik R.I., Dashkevich V.S., Dymshits G.M. Studies of replicating DNA of regenerating rat liver using chemical modifications with water-soluble carbodiimide. Biochim. Biophys. Acta, 1967, v. 149, p. 603-606.
2. Дымшиц Г.М., Дашкевич B.C., Салганик P.И. Исследование некоторых свойств "гибридной" РНК в составе ДНК печени крыс. Молекулярная биология, 1968, том 2, вып. 4, стр. £08-512.
3. Дашкевич B.C., Дымшиц Г.М., Салганик Р.И. Изучение состояния ДНК регенерирующей печени крыс при репликации и транскрипции. Молекулярная биология, 1968, том 2, вып. 4, стр. 562567.
4. Дымшиц Г.М. Исследование состояния ДНК в печени крыс в процессе транскрипции. Известия СО АН СССР, серия биол. наук, 1969, N5, вып. I, стр. 135-137.
5. Дашкевич B.C., Дымшиц Г.М., Салганик Р.И. Выделение
фракции репликативной ДНК из регенерирующей печени крыс. Тезисы докл. III Всесоюзн. симп. по структуре и функциям клеточного ядра, Киев, 1970, стр. 233-234.
6. Уланов Б.П., Маторина Т.И., Дымшиц Г.М. Получение комплекса модифицированной водорастворимым ЦМЭ-карбодиимидом ти-мидин-5'-монофосфорной кислоты с фосфорновольфрамовой кислотой. Молекулярная биология, 1971, том 5, вып. I, стр. II8-I2I.
7. Dashkevlch V.S., Arshinova T.Y., Dymshits G.M., Tltenko A.M., Ulanov B.P., Salganik R.I. Ail Investigation of replicative state of DNA in regenerating rat liver. IV Internat, biophis. congr., abatr. of contributed, papers, Moscow, 1972, v. 2, p. 307-308.
8. Дашкевич B.C., Дымшиц Г.М., Салганик P.И., Уланов Б.П. О дестабилизации вторичной структуры ДНК регенерирующей печени крыс в процессе репликации. Молекулярная биология, 1972, том 6, вып. 5, стр. 689-697.
9. Салганик Р.И., Воронина E.H., Дашкевич B.C., Древич В.Ф., Дымшиц Г.М., Морозова Т.М., Панфилова З.И., Посло-вина A.C. Возможность контролировать мутационный процесс путем локального изменения состояния ДНК и чувствительности ее к химическим мутагенам. В сб. "Проблемы теоретической и прикладной генетики" , Новосибирск, 1973, стр. 65-74.
10. Salganik R.I., Dashkevlch V.S., Dymshits G.M., Arshlnova T.V. Investigation of animal DNA structure during replication and transcription. Abstr. Commun. 9th Meet. Fed. Europ. Biochem. Soc., Budapest, 1974, p. 133.
11. Дымшиц Г.М. Обнаружение в препаратах ДНК из регенерирующей печени крыс белкового фактора, вызывающего денатурацию ДНК. Тезисы сообщ. V Всесоюзн. симп. "Структура и функции клеточного ядра", Новосибирск, 1975, стр. I3I-I32.
12. Дымшиц Г.М. Дестабилизирующий ДНК белковый фактор из регенерирующей печени крыс. В сб. "Вопросы теоретической и прикладной генетики", Новосибирск, 1976, стр. 87,-88.
13. Дымшиц Г.М., Фет В.Я. Белковый фактор из регенерирующей печени крыс, дестабилизирующий вторичную структуру ДНК. Молеку-
лярная биология, 1977, том II, вып. 3, стр. 531-536.
14. Dymsiiita G.M., Rumiantcova G.V., Zalniev G.A., Shilova I.E., Gruzdev A.D., Karpova G.G., Grineva N.I. Luminescence microscopic visualization of specific one-strand Incisions in polythene chromosome DNA. XIV Internat. Congress of Genetics. Contributed paper sessions abstr.,part II, Moscow, 1978, p. 224.
15. Дымшиц Г.М. Молекулярные механизмы репликации хромосом. ДНН-плавящие белки (обзор). II рабочее совещание по вопросам строения и функционарования хромосом высших организмов, Пущино, 1978, стр. 187-194.
16. Дымшиц Г.М., Румянцева Г.В., Фрумгарц Л.А., Груздев А.Д., Зайниев Г.А., Шилова И.Э., Карпова Г.Г., Гринева Н.И. Метод получения и люминесцентно-микроскопической визуализации специфических одноцепочечных разрывов в ДНК изолированных политэнных хромосом. Цитология, 1981, том XXIII, N1, стр. 31-37.
17. Дымшиц Г.М., Румянцева Г.В., Фрумгарц Л.А., Груздэв А.Д., Зайниев Г.А., Шилова' И.Э., Карпова Г.Г., Ямковой В.И., Гринева Н.И. Индукция направленных разрывов в ДНК политен-ных хромосом Chironomus thumml in situ при действии.алкилирувдих производных олигоаденилатов. Молекулярная биология, 1981, том 15, вып. I, стр. 86-95.
18. Dymshits G.M. Helix-destabilizing protein in preparations of DNA from regenerating rat liver. IV symp. USSH-FRG "Structure and transcription of genome", Thes. of reports, Yerevan, 1981, p. 47-48.
19. Дымшиц Г.М., Фрумгарц Л.А. Методические подходы к изучению структуры генома путем гибридизации ДНК хромосом с модифицированными поли- и олигорибонуклеотидами. IV съезд ВОГиС, Тезисы докл., часть I, Кишинев, 1982, стр. 78.
20. Salganik R.I., Dymshits G.M., Frumgarts L.A. Identification of DNA restricts by complementary polynucleotides earring fluorescent groupings. Abstr. of papers presented at the meeting on "In vitro mutagenesis", Cold Spring Harbor, New York, 1982 p. 37.
21. Dymshits G.M., Rumiantseva G.V., Frumgarts L.A. Gruz-
dev A.D., Zainiev G.A., Shilova I.E., Karpova G.G., Grineva N.I. Visualization of oligo-dT sequences in polythene chromosomes oi Chironomua thummi by means of alkylating ollgoadenylate derivatives. Internat, sympos. "Organization and expression of tissue-specific genes", abstr., Novosibirsk, 1982, p. 12.
22. Дымшиц Г.M., Румянцева Г.В., Фрумгарц Л.А., Салганик Р.И. Выявление участков комплементарного связывания модифицированных олиго- и полинуклеотидов на ДНК с использованием флуорохромов. В сб. "Успехи теоретической и прикладной генетики", Новосибирск, 1982, стр. 8-10.
23. Дымшиц Г.М., Фрумгарц Л.А. Введение флуоресцентной метки в полинуклеотида, используемые для локализации определенных участков генома методом молекулярной гибридизации. Тезисы докл. VIII Всесоюзн. симп. "Структура и функции клеточного ядра", Пу-щино, 1984, стр. 204-205.
24. Фрумгарц Л.А., Калачиков С.М., Дымшиц Г.М. Введение флуоресцентной метки в поли нуклеотиды и исследование влияния их модификации на способность к комплементарным взаимодействиям. Молекулярная биология, 1985, том 19, вып. 5. стр. 1394-1399.
25. Фрумгарц Л.А., Киприянов С.М., Калачиков С.М., Дударова Н.А., Дымшиц Г.М., Карпова Г.Г., Салганик Р.И. Получение флуоресцентно меченной ДНК и использование ее в качестве зонда при молекулярной гибридизации. Биоорг. химия, 1986, том 12, N II, стр. I508-I5I3.
26. Адаричев В.А., Дымшиц Г.М., Калачиков С.М., Поздняков П.И., Салганик Р.И. Получение ДНК, несущей алифатические аминогруппы, и использование ее флуоресцентного производного в качестве зонда при молекулярной гибридизации. Биоорг. химия, 1987, том 13, N 8, стр. 1066-1069.
27. Фрумгарц Л.А., Калачиков С.М., Дымшиц Г.М., Добриков М.И., Шишкин Г.В. Перенос и фотоиммобилизация фрагментов ДНК на п-азидобензоилцеллюлозе. Известия СО АН СССР, серия хим. наук, 1988, N 2, вып. I, стр. 81-87.
28. Адаричев В.А., Калачиков С.М., Дымшиц Г.М. Высокотемпературная гибридизация нуклеиновых кислот. Известия СО АН СССР,
серия биол. наук, 1988, N 14, вып. 2, стр. II3-II6.
29. Дымшиц Г.М., Калачиков С.М., Адаричев В.А. Конструирование нерадиоактивных ДНК-зондов для молекулярной гибридизации In situ. Тезисы докл. Всесоюзн. конф. "Современные направления создания медицинских диагностикумов", Москва, 1988, стр. 113.
30. Калачиков С.М., Дымшиц Г.М., Адаричев В.А., Салганик Р.И. Способ гибридизации дезоксирибонуклеиновых кислот. Авторское свидетельство N 1640995, 1990.
31. Дымшиц Г.М., Адаричев В.А., Калачиков С.М., Киселева A.B., Мишина Е.С., Попов А.Н. Получение нерадиоактивно меченых ДНК-зондов для молекулярной гибридизации и разработка системы их выявления. Первая Всесоюзн. конф. "Геном человека -90", тезисы докл. и стендов, сообщ., Переславль-Залесский, 1990, стр. 213.
32. Адаричев В.А., Мишина Е.С., Соханенкова Т.Л., Калачиков С.М., Дымшиц Г.М., Салганик Р.И. О возможности нерадиоактивной диагностики тропической малярии методом молекулярной гибридизации. Тезисы докл. II Всесоюзн. конф. "Современные направления создания медицинских диагностикумов", Москва, 1990, стр. 60.
33. Дымшиц Г.М., Адаричев В.А., Калачиков С.М., Киселева A.B., Мишина Е.С., Попов А.Н. ДНК-зонды и система нерадиоактивной детекции для медицинской диагностики. Тезисы докл. II Всесоюзн. конф. "Современные направления создания медицинских диагностикумов", Москва, 1990, стр. 68.
34. Калачиков С.М., Дымшиц Г.М., Кель А.Э., Попов А.Н., Борхсениус С.Н. Универсальные ДНК-зонды для тестирования мико-плазменных контаминаций. Тезисы докл. II Всесоюзн. конф. "Современные направления создания медицинских диагностикумов", Москва, 1990, стр. 70.
35. Мишина Е.С., Адаричев В.А., Калачиков С.М., Дымшиц Г.М. Трехзондовая схема выявления провируса BLV. Тезисы докл. II Всесоюзн. конф. "Современные направления создания медицинских диагностикумов", Москва, 1990, стр. 73.
36. Калачиков С.М., Дымшиц Г.М., Кель А.Э., Борхсениус С.Н. Зонды для тестирования микоплазменных контаминаций методом моле-
кулярной гибридизации. Вторая Всесоюзы, конф. "Геном человека -91", Тезисы докл. и стендов, сообщ., Переславль-Залесский, 1991, стр. 177-178.
37. Калачиков С.М., Адаричев В.А., Дымшиц Г.М. Иммобилизация ДНК на микропористых мембранах с помощью УФ-облучения. Биоорг. химия, 1992, т.18, N I, стр. 52-62.
-
Дымшиц, Григорий Моисеевич
-
доктора биологических наук
-
Новосибирск, 1992
-
ВАК 03.00.25
- Ферменты биосинтеза нуклеиновых кислот, рестриктирующие нуклеазы и организация генома экстремально термофильных архебактерий
- Изучение взаимодействий белков с ДНК в интактных хлоропластах методом ковалентной фиксации
- Молекулярная организация и транскрипция генома теплокровных животных
- ДНК-белковое узнавание
- Молекулярная характеристика локусов, содержащих динуклеотидные микросателлиты, генома партеногенетической ящерицы Darevskia unisexualis
