Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика свойств белка Tag7 IN VITRO и IN VIVO

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Характеристика свойств белка Tag7 IN VITRO и IN VIVO"

^, -

лч На правах рукописи

^ Л v УДК 575.11.1:599.323.4 \

Коробко Елена Владимировна

ХАРАКТЕРИСТИКА СВОЙСТВ БЕЛКА Tag7 IN VITRO И IN VIVO

Специальность 03.00.26 - молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА Í998

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики рака Института биологии гена РАН

Научные руководители:

академик РАН, доктор биологических паук Г.П. Георгиев кандидат биологических наук СЛ. Киселев

Официальные оппоненты: доктор химических наук А. Г. Габибов доктор биологических наук С.М. Деев

Ведущая организация:

Биологический факультет Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится июня 1998 года в часов на

заседании Диссертационного совета Д. 200. 30. 01 при Институте биологии гена РАН по адресу : 117334, г. Москва, ул. Вавилова 34/5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 117334, г.Москва, ул. Вавилова 32

Автореферат разослан ",^!"*мая 1998 года

Ученый секретарь Диссертационного совета

канд.фарм.наук

Грабовская Л.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Важную роль в осушестачении иммунного ответа организма играют цитокины - белковые факторы, продуцируемые, в основном, клетками иммунной системы, которые действуют через рецептор-опосредованные пути и влияют на регуляцию как иммунных, так и неиммунных клеток организма. Данный термин используется для характеризации постоянно растущего числа белков, которые принимают участие в процессах активации, дифференцировки, уничтожения клеток-мишений и ряде других.

Ранее в нашей лаборатории была клонирована кДНК нового гена tag7 (Кустикова и др., 1996). Структура промоторной области данного гена сходна с соответствующими районами генов, кодирующих белки, принадлежащие семейству фактора некроза опухоли, что позволило сделать предположение о возможном функциональном сходстве продукта гена tag7 с другими членами этого семейства цитокинов, играющими важную роль в регуляции иммунных процессов организма.

В связи с этим, изучение свойств белка Tag7, которые могут быть сходными со свойствами других цитокинов, является актуальным и может способствовать пониманию действия защитных механизмов иммунной системы организма, в частности, направленных против опухолевых клеток.

Цель работы

Основная цель данной работы состояла в изучении свойств и характера экспрессии белка Tag7. В ходе исследования предполагалось решение следующих экспериментальных задач:

1. Определение характера экспрессии белка Tag7 в различных клетках и органах мыши.

2. Изучение свойств белка Tag7 in vitro и in vivo.

Научная новизна и практическое значение работы

В настоящей работе были исследованы характер экспрессии белка Tag7 и изучены его свойства in vitro и in vivo. Транскрипт гена tag7 был детектирован в клетках имунной системы мыши. Экспрессия белка Tag7 была обнаружена в спленоцитах, мышиной В-клеточной линии WEHI-23I, а также в опухолевых клеточных линиях аденокарцином молочной железы мыши КСМЛ-0 и ВМР-П, где ранее был детектирован транскрипт гена tag7. Иммуногистохимический анализ позволил детектировать белок Tag7 в ряде органов мыши, таких как тимус, мозг и толстый кишечник.

Было установлено, что белок Tag7 имеет секретируемую форму, которая образует мультимерные комплексы in vivo. Было показано, что секретируемый белок Tag7 обладает цитотоксической активностью по отношению к клеткам-мишеням линии L929. Цитотоксическое действие белка Tag7 вызывает апоптоз в данных клетках-мишенях.

Также было показано, что экспрессия белка Tag7 в опухолевых клетках аденокарциномы молочной железы мыши линии ВМР-0 приводит к значительному замедлению роста опухолей, образованных данными клетками. Действие белка Tag7 является паракринным и не зависит от присутствия Т-лимфоцитов. Эффект замедления роста опухолей, вызванный экспрессией tag?, может быть связан с активным привлечением CD45R+ клеток в сайт редукции опухоли.

Полученные результаты по изучению характера экспрессии и свойств белка Tag7 могут способствовать пониманию механизмов действия иммунной системы, а также могут иметь возможное практическое применение для терапии опухолей.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на следующих симпозиумах: Cell Signaling and Cancer Treatment (Telfs-Buchen, Austria, 1997); The 3rd International Engelhardt Conference on Molecular Biology (Volga River, 1997); Второй съезд биохимического общества РАН (Москва, 1997), конференции МНТЦ (Токио, Япония, 1997); Российско-французский симпозиум (Монпелье, Франция, 1997).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 3 печатные работы.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 109 страницах машинописного текста и состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты, обсуждение, выводы и список литературы. Библиография включает в себя 149 источников. Работа проиллюстрирована 14 рисунками и 1 таблицей.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Получение рекомбннантного белка Tag7.

Для получения рекомбннантного белка Tag7 (rTag7) кодирующая часть кДНК tag? была амплифицирована на матрице клонированной кДНК tag! с использованием специфических праймеров, содержащих сайты узнавания рестрикционных эндонуклеаз для клонирования в экспрессионный вектор. Продукт амплификации был клонирован в вектор pQE30 (Qiagen) и была определена его первичная последовательность с использованием внутренних специфических праймеров для того, чтобы убедиться в отсутствии ошибок в первичной структуре, которые могли возникнуть при амплификации. Определенная клонированная первичная последовательность полностью совпадала с опубликованной последовательностью кДНК tag7 (Кустикова и др., 1996). Экспресированный полипептид, кодируемый плазмидой pQE30-tag7, содержал аминокислотную последовательность белка Tag7 с 6 остатками гистидина на N-конце полипептидной цепи, которые были использованы для очистки

рекомбинантного белка из лизата клеток Е. coli с помощью металло-хелатной аффинной хроматографии на Ni-агарозе (Qiagen) в качестве носителя. Проведенный анализ локализации белка Tag7 в клетках Е. coli показал, что весь рекомбинантный белок находится в тельцах включения, поэтому очистка rTag7 проводилась в денатурирующих условиях. Очищенный рекомбинантный белок обладал молекулярным весом около 17 кДа, что соответствовало ожидаемому размеру продукта экспрессии (данные не приведены).

2. Получение и характеризация поликлопальных и моиоклональных антител к белку Tag7.

Поликлональные антитела были получены с использованием в качестве антигена рекомбинантного белка Tag7, экспрессированного в клетках Е. coli. Раствор очищенного rTag7 в мочевине использовался для иммунизации кролика. Полученная поликлональная антисыворотка к белку rTag7 обладала способностью специфически узнавать как рекомбинантный, так и нативиый белки Tag7 (Рис. 1А). Нативный белок Tag7 был детектирован в иммунопреципитатах лизатов клеток линии КСМЛ-0 и ВМР-П, в которых присутствует транскрипт гена tag7., и не был детектирован в иммунопреципитатах лизатов клеток линии ВМР-0 и КСМЛ-100, в которых транскрипт tag?отсутствует.

Рис. 1. Вестерн-блот анализ рекомбинантного и нативного белков Tag7. А -детекция белка Tag7 с использованием поликлональной антисыворотки к рекомбинантному белку Tag7 в разведении 1:5000. Б - детекция белка Tag7 с использованием моноклональных антител к рекомбинантному белку Tag7 в разведении 1:500. Дли анализа использовались лизаг клеток E.coli, продуцирующих рекомбинантный белок Tag7 (гТа$7) и иммунопрецепитаты с a»TH-rTag7 поликлональной антисывороткой белковых экстрактов клеток указанных линий. Разделение белков проводилось в 15% ДСН-ПААГ.

Полученная антисыворотка к белку Tag7 была использована для очистки поликлональных Таг7-спсцифичсских антител. Очистка проводилась методом аффинной хроматографии на CNBr-активированной сефарозе 4В с иммобилизованным белком rTag7. Очищенные поликлональные антитела обладали той же специфичностью, что и первичная антисыворотка.

Для получения моноклональных антител к белку Tag7 были использованы гибридомы, полученные при слиянии клеток селезенки иммунизированной белком rTag7 крысы и мышиной миелоидной клеточной линии Sp2/0. Среди полученных клонов был отобран клон ЗС1В6, который реагировал как с рекомбинантным, так и с нативным

белком Tag7 (Рис. 1Б). Очищенные с использованием хроматографии на Protein A Sepharose 4 Fast Flow моноклональные антитела, продуцируемые гибридомой ЗС1В6, были использованы для иммуногистохимического анализа экспрессии белка Tag7.

3. Наличие секретируемой формы белка Tag7.

Аминокислотная последовательность белка Tag7 предполагает наличие сигнала секреции, что позволяет ожидать существование секретируемой формы этого белка.

Иммунопреципитация с использованием поликлональной антисыворотки к белку Tag7 и последующим Вестерн-блот анализом иммунопреципитатов показала, что в кондиционных средах клеток линий КСМЛ-0, ВМР-П присутствует белок Tag7 (Рис. 2). Данные результаты позволяют сделать вывод о секреции белка Tag7.

$ ВМР-П КСМЛ-0 f J1 К Л К

е» - £*. ^ Tag7

Рис. 2. Детекция секретируемой формы белка Tag7 в кондиционных средах клеток мышиных опухолевых клеточных линий КСМЛ-0 и ВМР-П. Вестерн-блот анализ иммунопрецепитатов с airni-rTag7 антисывороткой белковых лизатов (Л) и кондицонных сред (К) клеток линий ВМР-П и КСМЛ-0. rTagl - рекомбинантный белок Tag7.

4. Индукция экспрессии кДНК tag7 и белка Tag7 различными агентами в клетках иммунной системы мыши.

Для изучения экспрессии гена tag? в клетках иммунной системы мыши были получены первичные культуры тимоцитов, спленоцитов и перитонеальных макрофагов мыши. На первом этапе был проведен анализ уровней транскрипта гена lag! в первичных культурах упомянутых клеток иммунной системы мыши. Транскрипт гена tag7 был обнаружен во всех исследованных типах клеток (Рис. ЗА). При этом наибольший уровень транскрипта был детектирован в спленоцитах мыши. Белок Tag7 был детектирован в спленоцитах мыши и клеточной линии WEHI-231, которая является культурой клеток пре-В-лимфоцитов мыши. Таким образом, экспрессия Tag7 характерна для B-лимфоцитов как in vitro, так и in vivo.

Экспрессия гена tag7 и наличие белка Tag7 в ряде клеток иммунной системы позволила предположить его возможную роль в функционировании иммунной системы мыши.

Экспрессия ряда белков, секретируемых различными клетками иммунной системы, например, фактора некроза опухоли (ФНО) и лимфотоксина (ЛТ), может быть индуцирована различными агентами, такими как фетогемоаглютенин (ФГА), липополисахарид (ЛПС), интерлейкин-2 (ИЛ-2) и другими. Так как ген tag7 экс пресс ируется в клетках иммунной системы мыши и обладает гомологией в промоторной области с некоторыми членами TNF семейства, то было проведено исследование характера изменения уровней РНК tag7 и

Рис. 3. А - Нозерн-блот анализ )а°7 в препаратах РНК первичных культур клеток иммунной системы мыши. Для анализа использовалось 20 мкг тотальной РНК свежеизолированных перитонеальиых макрофагов, тимоцнтов и спленоиитов, а также спленоиитов, обработанных лииополисахарилом (5 мкг/мл) в течении указанных временных интервалов. В качестве положительного и отрицательного контролен были использованы препараты тотальной РНК опухолей ВМР-П и ВМР-0, соответственно. Ниже приведена гибридизация той же мембраны с пробой бета-актина. Б - Вестерн-блот анализ Tag7 в спленоцитах (Л), обработанных липополисахаридом в течении указанных временных интервалов, и их кондиционных средах (К). Для анализа были использованы иммунопрецепитаты с anni-rTag7 антисыеороткой белковых экстрактов клеток и их кондиционных сред.

белка Tag7 в клетках иммунной системы мыши в ответ на обработку различными индукторами.

Было обнаружно незначительное увеличение уровня транскрипта гена tag7 в спленоцитах мыши в ответ на обработку ЛПС (Рис. ЗА).

Кроме того, незначительная индукция уровня транскрипта tag7 наблюдалась во всех исследованных типах клеток иммунной системы мыши в ответ на обработку ФГА и ИЛ-2 (данные не приведены).

Анализ поведения уровня белка Tag7 в клеточных лизатах и кондиционных средах спленоцитов мыши в ответ на обработку ЛПС показал, что липополисахарид вызывает незначительное увеличение уровня внутриклеточного белка Tag7, а также приводит к увеличению уровня секреции белка Tag7 (Рис. ЗБ). Таким образом, несмотря на сходство структур промоторных областей гена tag7 и генов ФНО и JIT, обработка индукторами, приводящими к значительному увеличению экспрессии ФНО и ЛТ, не вызывала такого эффекта в случае Tag7. Это предполагает различные механизмы регуляции экспрессии для гена tag! и генов ФНО и ЛТ.

5. Наличие мультимерных комплексов белка Tag7.

Хорошо известно, что белки TNF-семейства способны образовывать олиго- и гетеротримерные комплексы. Было показано, что секретируемый нативный белок Tag7 способен образовывать мультимерные комплексы. Используя гель-фильтрацию на колонке Superdex 75 HR 10/30 для анализа белков, содержащихся в кондиционной среде Л ПС-индуцированных мышиных спленоцитов, было обнаружено, что белок Tag7 существует как в форме мономера, так и в форме мультимерного комплекса с размером около 50 кДа. Молекулярный вес данного комплекса соответствует ожидаемому

t

45 кД

29 кД 14.2 кД

т—г Ф.

Т—Г- Г"Г

т—I—I—I—г

■Tag7

Рис. 4. Белок Tag7 образует мультнмерный комплекс. Кондиционная среда индуцированных липополисахаридом спленоцитов была сконцентрирована и белки кондиционной среды были разделены с помощью гель-фильтрации. Полученные фракции затем были проанализированы с помощью Вестерн-блот анализа с aHTH-rTag7 антисывороткой. Выше приведена хроматограмма маркеров молекулярных весов, соответствующая анализируемым фракциям.

молекулярному весу три мера Tag7 (Рис. 4). С помощью анализа белков в нередушруюшем ПААГ было показано, что дисульфидные связи не являются необходимыми для формирования данного мультимерного комплекса.

6. Цитотоксической активность белка Tag7 приводит к индукции апоптоза в клетках-мишенях линии L929.

Цитотоксическая активность является свойством ряда белков, секретируемых клетками иммунной системы. Наличие секретируемой формы белка Tag7 и его экспрессия в клетках иммунной системы мыши, позволили предположить существование у белка Tag7 цитотоксической активности.

В качестве источника нативного белка Tag7 была использована кондиционная среда клеток линии КСМЛ-0, которая содержит растворимый белок Tag7 (Рис. 2). В качестве клеток-мишеней были

использованы иммортализованные мышиные фибробласты линии L929, как стандартный объект для исследования цитотоксичности. Кроме того, для сравнения параллельно наблюдался цитотоксический эффект, вызванный действием хорошо известного цитотоксического агента, ФНО, на те же клетки-мишени. Было обнаружено, что кондиционная среда клеток опухолевой клеточной линии КСМЛ-0 обладает цитотоксическим эффектом по отношению к клеткам-мишеням линии L929 (Рис. 5А). Данный цитотоксмческий эффект обусловлен специфическим действием Tag7, поскольку лоликлональная антисыворотка или поликлональные антитела к белку Tag7 полностью блокировали этот эффект. В качестве контроля при блокировании цитотоксической активности была использована сыворотка неиммунизированного кролика. Кинетика цитотоксического действия Tag7 была отлична от кинетики действия рекомбинантного ФНО на клетки-мишени. Максимум значения цитотоксичности, вызванной действием Tag7, наблюдался во временной точке 5 часов, в то время как ФНО оказывал максимальной действие через 48 часов.

Цитотоксическим действием также обладал рекомбинантный белок Tag7, экспрессированный в эукариотических клетках (данные не приведены).

Полученные результаты по цитотоксическому действию белка Tag7 предполагают изучение механизмов гибели клеток-мишеней. Белки, обладающие цитотоксической активностью, такие как ФНО,

А

оно

ФНО+АЬФНО OHO+AbTag7 Tag7 Tag7+AbTag7 Tag7+Ab®HO

10 20 30

Процент погибших клеток

И кЬ

1.0 кЪ ► 805 Ьр ►

Рис. 5. Белок Tag7 облалает цитотоксической активностью и вызывает апоптоз в клетках-мишенях. А - иитотоксическое действие на клетки линии L929 кондиционной среды клеток линии КСМЛ-0, еекретирующих белок Tag? (TagT). ФИО - иитотоксическое действие фактора некроза опухоли на те же клетки-мишени. Цитотоксическое действие обоих белков было блокировано специфическими антителами (+АЬФНО и +AbTag7). Цитотоксическая активность измерялась через 5ч. по включению трипанового синего. Б - олигонуклеосомное расщепление хромосомной ДНК в клетках линии L929, вызванная действием кондиционной среды клеток КСМЛ-0 (TagT) и ФНО (ФИО). Контроль - необработанные клетки.

JIT, FasL, и другие вызывают апоптоз в клетках мишенях. Было установлено, что цитотоксическое действие белка Tag7 также вызывает апоптоз в клетках линии L929. Цитотоксическое действие нативного белка Tag? вызывает олигонуклеосомное расщепление геномной ДНК клеток-мишеней~(Рнс. 5Б);'что является характерным маркером апоптоза.

Таким образом, как рекомбинантный, так и нативный белок Tag7 обладает цитотоксической активностью по отношению к клеткам-мишеням линии L929- Белок Tag7 является новым белком, обладающим цитотоксической активностью и вызывающим апоптоз в клетках-мишенях линии L929.

6. Иммуногистохимический анализ экспрессии белка Tag7 в органах мыши.

Используя специфическиегмоноклональные антитела, узнающие нативный белок Tag7, был проведен иммуногистохимический анализ на срезах мозга, кишечника и тимуса мыши, с целью исследования характера экспрессии белка Tag7 в этих органах, в которых ранее был детектирован транскрипт гена tag7 методом Нозерн-гибридизации и методом in situ РНК-гибридизации.

Результаты иммуногистохимического анализа представлены на рисунке 6. Было обнаружено, что в мозге мыши белок Tag7

А.

клетки Пуркинье

кора мозжечка

Рис. 6. Иммуногистохимический анализ белка Tag? на парафиновых срезах головного мозга (мозжечок; А) и толстого кишечника (Б) мыши. Для анализа использовались моноклональные антитела к белку iTag7 и вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой. Детекция иммобилизованной пероксидазы (отмечена стрелками) проводилась с использованием SIGMA FAST DAB с металлическим усилителем. Контрольные гибридизации без первичных антител <не приведены) были отрицательными.

детектируется в клетках Пуркинье, а также в коре и подкорковой зоне мозжечка и больших полушарий мозга (Рис. 6А). Белок Tag7 также был детектирован в лимфатических протоках и окончаниях крипт толстого кишечника мыши (Рис. 6Б). В тимусе мыши был детектирован дисперсный характер экспрессии белка Tag7 (данные не приведены).

Таким образом, белок Tag7 присутствует во всех исследованных иммуногистохимически тканях мыши, где ранее был детектирован транскрипт гена tag 7, что позволяет говорить о корреляции транскрипции и присутствия белкового продукта в данных тканях.

Данный характер экспрессии белка Tag7 в исследованных органах мыши, а именно наличие белка в тимусе, лимфатических протоках толстого кишечника, а также описанная ранее экспрессия tag7 в селезенке мыши, подтверждают его экспрессию в клетках иммунной системы мыши.

7. Замедление скорости роста опухолей, вызванное экспрессией tag7.

Принимая во внимание вышеизложенные данные, а именно экспрессию белка Tag7 в клетках иммунной системы и наличие у него цнтотоксической активности, было сделано предположение о возможном участии белка Tag7 е противоопухолевом иммунитете.

Для этого были использованы клетки мышиной опухолевой клеточной линии ВМР-0, не экспрессирующей tag7. Клетки данной опухолевой клеточной линии вызывают образование опухоли в сингенных мышах линии A/Sn при подкожной инъекции. В результате

A. t

< s

12

10

в о

a. о S

8 § А "

В

□ 8 о

ДНИ

о

Б.

12

S S

О £

а о о.

V

S

«

я а.

10 6 □

£ о А

8 □S а А е

6 а А 9

" А «

i

I

J_

8 10 недели

Рис. 7. Влияние экспрессии tag7 на скорость роста опухолей на коротких (А) и длительных (Б) временах. □ - опухоль ВМР-0, ■*• - опухоль контрольных клеток (трансфецированных плазмидой pBK-CMV), • - опухоль клеток клона 4SX, Л -опухоль клеток клона !2SX,Q - опухоль клеток клона 4SX при повторных инъекциях aHTH-rTag7 поликлональных антител, в - опухоль смеси клеток ВМР-0 и клеток клона 4SX.

стабильной трансфекции клеток линии VMR-0 полной кДНК tag 7 под контролем CMV промотора, были получены клоны 4SX и 12SX, обладающие различным уровнем мРНК tag 7. Скорость пролиферации клеток данных клонов не отличалась от скорости пролиферации клеток исходной опухолевой клеточной линии ВМР-0, а также контрольных клеток.

Характер роста опухолей, образованных клетками этих клонов, был проанализирован на сингснных мышах линии A/Sn. Было обнаружено значительное замедление скорости роста опухолей, образованных клетками данных клонов, по сравнению со скоростью роста опухолей, образованных нетрансфецированными клетками линии VMR-0, или клетками, трансфецированными плазмидой pBK-CMV (Рис. 7А). Было обнаружено, что замедление скорости роста опухолей коррелирует с уровнем транскрипта tag7, детектированным в данных клонах. Клон 4SX, в котором был детектирован наибольший уровень транскрипта гена tag7, обладал наименьшей скоростью образования опухоли. Данный эффект замедления роста опухолей был блокирован на коротких временах инъекцией в сайт образования опухоли поликлональных антител к белку Tag7 (Рис. 7Б), что позволяет сделать вывод о том, что именно экспрессия белка Tag7 ответственна за замедление скорости роста опухолей.

Эффект замедления роста опухоли также наблюдался при инъекции сингенным мышам смсси клеток линии VMR-0 и клеток клона 4SX (Рис. 7А). Интересно отметить, что совместная инъекция

lxlO6 клеток линии ВМР-0 и 1х106 клеток клона 4SX приводила к замедлению роста опухоли по сравнению с опухолью, образованной в результате инъекции lxlO6 клеток линии ВМР-0, что позволяет сделать вывод о влиянии клеток клона-трансфектанта 4SX на нетрансфецированные опухолевые клетки. Этот факт делает потенциачьно возможным использование трансфекции кДНК tag? ex vivo в опухолевые клетки для противоопухолевой терапии.

Так как одним из механизмов действия противоопухолевого иммунитета является направленное уничтожение опухолевых клеток цитотоксическими Т-лимфоцитами, то для определения роли опухоле-специфических CTL в процессе замедления роста опухолей в сингенных мышах, вызванного трансфекцией кДНК tag7, был проведен анализ скорости роста опухолей, образованных клетками данных клонов, в бестимусных мышах.

Было обнаружено, что характер роста опухолей в бестимусных мышах соответствует характеру роста опухолей, обнаруженному в сингенных мышах. При этом наблюдалось еще более значительное различие в замедлении скорости роста между опухолями, образованными клетками клоноп 4SX и 12SX, и опухолями, образованными клетками линии VMR-0, трансфецированными пустым вектором.

Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что эффект замедления скорости роста опухолей, обусловленный

А.

Рис.8. Световая микроскопия срезов опухолей, окрашенных гематоксилином/эозином. А - опухоль, образованная клетками клона 4БХ. Стрелками отмечены апоптозы. Б - опухоль ВМР-0. Стрелками отмечены митозы.

трансфекцией кДНК fog 7, не зависит от действия опухоле-специфических Т-лимфоцитов.

8. Изучение возможных мехаиизмоз замедления роста опухолей.

Замедление роста опухолей, образованных клетками, трансфецированными кДНК tag7, может быть обусловлено прямым цитотоксическим действием белка Tag7. Однако, так как in vitro клетки линии ВМР-0 не проявляли чувствительности к цитотоксическому действию Tag7, а также клетки клонов-трансфектантов 4SX и 12SX не замедляли скорости роста в культуре по сравнению с клетками линии ВМР-0, то наблюдаемый эффект замедления скорости роста опухолей не обусловлен непосредственным цитотоксическим действием белка Tag7.

Световой и электронно-микроскопический анализ срезов опухолей ВМР-0 и 4SX выявил ряд различий между ними. Было обнаружено, что опухоли 4SX являются менее некротизированными по сравнению с опухолями ВМР-0. Однако, в опухолях, образованных клетками клонов-трансфектантов число апоптозов преобладает над числом митозов, которые достаточно редки по сравнению с опухолями образованными клетками линии ВМР-0 (Рис. 8; Таблица I).

Таблица 1. Число апоптозов и митозов в опухолях ВМР-0 и 45Х. Подсчет апоптозов и митозов проводился с использованием световой микроскопии срезов опухолей, окрашенных гематоксилином/эозином.

Опухоль Митозы Апоптозы

ВМР-0 6-8% 0.5-1%

4SX 2-3% 8-10%

Рис. 9. Иммуногистохимическое окрашивание С D4 5 R - позитн в н ы х клеток на парафиновых срезах опухолей 4SX (А) и ВМР-0 (В). Для анализа использовались моноклональные aHTH-CD45R антитела и вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой. Детекция иммобилизованной пероксидазы (отмечена стрелками) проводилась с использованием SIGMA FAST DAB с металлическим усилителем. Контрольные гибридизации без первичных антител (не приведены) были отрицательными.

Для понимания возможных механизмов иммунного ответа организма в случае эффекта замедления роста опухолей, вызванного экспрессией ta°7, был проведен иммуногистохимический анализ на срезах опухолей, образованных клетками линии ВМР-0 и клетками клона-трансфектанта 4SX. Было обнаружено, что в опухолях, образованных клетками клона-трансфектанта 4SX в сингённых мышах, присутствуют обширные инфильтраты, образованные CD45R+ клетками (В-лимфоциты), в то время как в контрольных опухолях ВМР-0 присутствовали только единичные CD45R+ клетки. Эти инфильтраты детектируются преимущественно на границе опухоли и около кровеносных сосудов (Рис. 9). Иммуногистохимический анализ с использованием антител Ly6 (гранулоциты) показал, что в обоих типах опухолей присутствует незначительное количество Ly6+ клеток (данные не приведены). При иммуноокрашивании срезов опухолей с антителами к маркерам CD4, CD8 и Macl иммуноположительные клетки не были обнаружены.

Полученные результаты позволяют сделать предположение о том, что эффект замедления роста опухолей, вызванный экспрессией tag7, связан с активным привлечением CD45R+ клеток в сайт редукции опухоли, а также обусловлен их возможным противоопухолевым действием.

выводы

1. Впервые был детектирован белок Tag7 в ряде клеток и органов иммунной системы мыши и была обнаружена его секретируемая мультимерная форма.

2. Показана цитотоксическая активность белка Tag7 по отношению к клеткам-мишеням линии L929, что вызывает апоптоз в клетках-мишенях.

3. В опытах in vivo показано, что опухоли, образованные клетками линии ВМР-0, модифицированными геном tag7, проявляют замедленную скорость роста, что приводит к увеличению продолжительности жизни животных.

4. Установлено, что замедление скорости роста опухолей, вызванное экспрессией tag7, связано с увеличением числа апоптозов опухолевых клеток, что может быть обусловлено В-клеточными механизмами иммунитета.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Киселев С.Л., Коробко Е.В.. Прохорчук Е.Б., Кустикова О.С. (1997) Новый цитокин, относящийся к классу растворимых лигандов TNF-семейства. Тезисы симпозиальных докладов II Съезда биохимического общества РАН, стр. 35.

2. Korobko E.V., Sashchenko L.P., Gnuchev N.V., Prokhortchouk E.B., Korobko I.V., Kiselev S.L. (1997) Differential action of TNFa and factors secreted by LAK cells on mouse cell lines with different metastatic potential. Cell Signaling and Canccr Treatment. An AACR Special Conference, p. D-

3. Коробко E.B., Прохорчук Е.Б., Коробко И.В., Георгиев Г.П., Киселев С.Л. (1998) Секреция цитотоксического белка Tag7 в ответ на обработку клеток липополисахаридом. Докл. Акад. Наук, т. 360, №6, стр. £ £2

4. Kiselev S.L., Kustikova O.S., Korobko E.V., Prokhortchouk E.B., Kabishev A.A., Lukanidin E.M., Georgiev G.P. (1998) Molecular Cloning and Characterization of the Mouse tag7 Gene Encoding a Novel Cytokine. J. Biol. Chem., in press

12.

Отпечатано АОЗТ

12.05.98 Тираж 100 экз. Заказ № 0181