Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ХАРАКТЕРИСТИКА ПШЕНИЧНО-РЖАНЫХ ЗАМЕЩЕННЫХ ЛИНИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ МАРКЕРОВ И ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ХРОМОСОМ РЖИ НА ПОКАЗАТЕЛИ АНДРОГЕНЕЗА IN VITRO

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "ХАРАКТЕРИСТИКА ПШЕНИЧНО-РЖАНЫХ ЗАМЕЩЕННЫХ ЛИНИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ МАРКЕРОВ И ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ХРОМОСОМ РЖИ НА ПОКАЗАТЕЛИ АНДРОГЕНЕЗА IN VITRO"

t

на правах рукописи

ДОБРОВОЛЬСКАЯ Оксана Борисовна

ХАРАКТЕРИСТИКА ПШЕНИЧНО-РЖАНЫХ ЗАМЕЩЕННЫХ ЛИНИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ МАРКЕРОВ И ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ХРОМОСОМ РЖИ НА ПОКАЗАТЕЛИ АНДРОГЕНЕЗА IN VITRO

Генетика — 03.00.15

I

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2003

Работа выполнена в секторе молекулярной генетики злаков и лаборатории хромосомной инженерии злаков Института цитологии и генетики СО РАН, г, Новосибирск

Научные руководители: д.б.н. Першнна Л.А,

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

К.б.н. Салина Е.А.

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: д.б.н. Агафонова О.В.

Центральный ботанически ft сад СО РАН, г. Новосибирск

к.б.н. Степочкин ГШ,

Сибирский НИИ растениеводства и селекции СО РЛСХН, г, Новосибирск

Ведущее учреждение: Сибирский институт физиологии и биохимии

растений СО РАН, г.Иркутск

Защта состоится 10 декабря 2003 г. на утреннем заседании диссертационного совета Д - 003.011.01 в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале института по адресу: 630090, проспект акад. Лаврентьева, 10, тел/факс: (3832)331278, e-mail: tlbsovifflhionel. nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН

Автореферат разослан/^ftW-ti^WB г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

А.Д. Груздев

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Метод культивирования пыльников in vitro ti эхолот широкое применение в генетике и селекции растений при получении гаплоидов с целью создания гомозиготных рекомбинантных линий (Bajaj, 1990; Barnabas, 2001). С помощью этого метода ускоряется селекционный процесс, >гго показано при получении новых сортов н перспективных линий мягкой пшеницы <De Buy ser et al., 1987; Pauk et al., 1995; Nu. 1996).

При кул ьтн виро вон ни изолированных пыльников на питательной среде в микроспорах происходит переключение с гамепофитнои про! рам\ш развития на спорофитную, в результате чего формируются не пыльцевые зерна, как в условиях in vivo, а эмбриоиды, и получают развитие гаплоидные растения. Этот процесс получил название андро1 енеза in vitro (Gulia, Maheshvari, 1964). Усыновлено, что среди факторов, определяющих особенности андрогснеза, основным является генотип растения-до нора (Foroughi-Wchr, Zell er, 1990). Получение у мягкой пшеницы анеуилоидных и замещенных лнпнй позволило использовать их для определения роли отдельных хромосом пшеницы в контроле признаков анлрогенеза in vitro (Szakacs et al., 1989; De Buyser et al., 1992).

Чю касается ржи посевной S. ci'rcatc L., то it настоящее ирсмя плияннс отдел ьшдх хромосом на а ¡орогенез in vitro изучено иедостаючно. В первую очередь это связано с использованием для этой цели ограниченною числа [спетичсских моделей, в основном сортов пшенниы с ншенично-ржаной трднелокацнен 1RS.1BL и пшенично-ржаних дополненных линий (Luckett et al., 1991; Martinez et al„ 1994). Кроме того, существующие на настоящий момент генетические модели не позволяют четко отделить эффект хромосом ржи в контроле признаков андрогснеза in vitro от влияния гснотипической среды пшенниы, а так же выявить зависимость этих признаков от сортового происхождения хромосом ржи. В связи с этим представляется целесообразным привлечение к данным исследования новых генетических моделей.

Пшенично-ржаные заметенные линии являются удобными молельными объектами в генетических и молекулярных исследованиях, в том числе для определения хромосомной локализации генов и молекулярных маркеров на хромосомах ржи (Cakmak et al., 1997; Vershinin et al., 2002). Замешенные линии, полученные сотрудниками НЦиГ СО РАН JI.Л. Крагшовой н Л.И. Щаповой на основе гибридизации пшеницы сорта Саратовская 29 и ржи сортов Онохойская, Вятка и Вьетнамская (Кравцова, Щапова, 1980), представляют интерес и как юнешческие модели (Снлкова и др., 1999), и как перспективный материал для селекции (Щапова, Кравцова, 1999).

Для точной интерпретации результатов экспериментов при использовании новых генотипов в качестве генетических моделей необходима надежная информация об их геномном составе. Применение наряду с иигогснетическими подходами современных молекулярных методов значительно расширяет возможности геномного анализа и позволяет более полно охарактеризовать исходный материал (Devos et al., 2000; Salina et al., 2003).

Мнкросагеллиты или SSR (simple sequence repeats), - сравнительно новый тип ДНК-маркеров, который широко используют в исследованиях геномов

1 : US MOXA

■ »-А! V 'Тг*гг( i г-,-

пшеницы (Röder et al., 1998) и других злаков (Becker, Heun, 1995; Panaud et al., 1996; Saal, Wriebe, 1999), представляют интерес и для изучения гибридных пшенично-ржаных геномов, в том числе заметенных линий.

Проведение SSR-анализа серии пшенично-ржаных замешенных линий по!волит уточнить типы замещения, определить геномный состав, что необходимо для широкого использования данных линий в качестве генетических моделей, п том числе и при изучении влияния отдельных хромосом ржи на особенности андрогенеза in vitro. Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы — охарактеризовать ншенично-ржаные линии по типам замещения и геномному составу с применением .микросателлитного анализа и изучить на примере данных линий влияние отдельных хромосом ржи на особенности анлр01«неза in vitro. Задачи:

1) провести анализ пшеннчно-ржаных замешенных линий с применением мнкросателлнтных маркеров пшеницы и ржи для уточнения типов замещения и определения ¡«ночного состава;

2) выявить особенности влияния отдельных хромосом ржи и целого генома ржи па отдельные этапы андрогенеза; индукнию at [дроге пи их эмбрион до в, регенерацию проростков, спонтанную дигаплонднзациео;

3) нзучшъ особенности андрогенеза у замешенных линий в зависимости от сортового происхождения хромосом ржи н типов замещения;

4) туши, реакцию пыльников но показателям андрогенеза r« vitro на варьирование кон не и грани и 2,4-Д. экзогенною индуктора эмбриоидогенеза in vitro, в культу рал ьи oií среде и выявить для каждою генотипа его оптимальные кон йен ipai шн;

5) провести сравнительный анализ влияния отдельных хромосом ржи на признаки анлрогенною и соматического эмбриоидогенеза и регенерации iti vitro',

6) охарактеризовать растения, регенерировавшие в культуре пыльников с применением микросателлитного анализа.

Научная новизна н практическая ценность полученных результатов

В настоящей работе впервые показано, что микросатсллнтный анализ является надежным методом для идентификации хромосом ржи и выявления 1енешческоП гетерогенности у генотипов, полученных на основе гибридизации мягкой пшеницы и ржи посевной. С применением SSR-маркеров пшеницы к ржи проведено геношпирование пшеннчно-ржаных замещенных линий, что ласт основание для использования данных линий в качестве адекватных генетических моделей для локализации на отдельных хромосомах ржи генов и маркеров. Впервые определена локализация на хромосомах ржи трех микросателлотных маркеров пшеницы, что позволяет интегрировать данные маркеры в моле кулярн ore л ел t4 ее ку ю карту ржи и использовать их наряду с другими маркерами в геномном анализе.

Впервые для изучения особенностей андрогенеза in vitro использована генетическая модель, позволяющая определить эффект отдельных хромосом ржи, функционирующих в одинаковой генотипической среде пшеницы, па отдельные этапы андрогенеза in vitro. Установлено что, функционируя в

i tnoiHimnecKofi среде сорта Саратовская 29, хромосомы ржи tR и 3R оказывают стимулирующее, а хромосома 5R - супрессируюшее влияние на показа!ели ai [Дрогеиного эмбриондогенеза. Показало, что на степень проявления эффекта хромосом ржи 1R и 5R на показатели эмбриондогенеза влияет сортовое происхождение хромосом ржи. Выявлено, что полож1ттельное влияние хромосомы ржи 2R на частоту регенерации зеленых проростков при культивировании пыльников in у ¡tro зависит от концентрации 2,4-Д в инициальной среле. Показано, что наличие отдельных хромосом ржи в геноме пшеницы не подавляет спонтанное образование андрогенных днгаллоидов.

Установлено, что индукшш эмбриондогенеза in vitro в соматических и гамстических клетках ишеннчно-ржаных замешенных линий находится под влиянием разных хромосом ржи. Впервые показано, что гены, контролирующие образование эчбриоидогенного каллуса в щитковой ткани незрелых зародышей, локализованы в хромосоме ржи 2R. Впервые обнаружено стимулирующее апияпне хромосомы ржи 2R на регеперационную способность и анлрогенных, и соматических эмСриоидов, Установлено, что изменение концентрации 2,4-Д в нншшхшюП среде при культивировании пыльников in vitro позволяет oititiMintipoBaib условия для регенерации зеленых растений. Л и роба щш работы

Результаты работы были представлены на II Съезде ВОГиС, Сан и-Петербург, 2000; 11« конференции EWAC, Новосибирск, 2000; Международных конференциях молодых ученых, Харьков, 2001,2003гг; II Конференции МОГиС, Москва, 2003 и обсуждались па отчетно П сессии ИЦнГ СО РАН (2001). Публикации

По результатам исследования опубликовало 9 работ, п том числе 3 статьи в реципируемых журналах. Объем н структура работы

Диссертация состоит из двух основных частей, выводов, списка литературы и приложения. Каждая часть содержит введение, обзор литературы, описание материалов и методов, изложение результатов и их обсуждения. Материал диссертации изложен на 201 странице печатного текста, включая 23 таблицы и 8 рисунков. Слисок цитированной литературы содержит 377 работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалом исследования послужили дисомные пшенично-ржаные замешенные линии (2м=42), полученные на основе гибридизации мягкой пшеницы сорта Саратовская 29 (Т. aestivum L., 2п~42) и ржи сортов Онохойская, Вятка, Вьетнамская (S. cercote L., 14), октоплоидное тритикале (Саратовская 29 х Онохойская, AABBDDRR, 2п=56), линия пшеницы сорта Саратовская 29 (AABDDD, 2п-42) и сорт ржи Онохойская (RR, 2л-14). Пшенично-ржаные замещенные линии и тритикале подучены сотрудниками ИЦиГ СО РАН JI.A. Кравцовой и Л.Н. Щаповой (Кравцова, Щапова, 1980). Замешенные линии по результатам дифференциального С-окрашивания хроматина ржи и телецентр) веского анализа были вденгпфипиронаны авторами следующим образом: JlMRo(lD), Л2-2Ко(20), ЛЗ-ЗКо, JI4-5Ro(5D), JI5-6Ro(6A), JI6-7R«, Jl7-IRo(lA), JI8-1Rb(1A), JI9-5Ro(5A), Л10-5КУ(5А). Индекс обозначает

принадлежность хромосом ржи сорту Онохойская, 'У* - Вятка и -Вьетнамская (Кравцова, Щапова, 1980; Краснова, 1985),

SSR-аиалт. Выделение суммарной ДНК из растений заметенных линий, линии пшеницы сорта Саратовская 29 н ржи сорта Онохойская осуществляли с применением прогенназы "К" (Дрейпер it др., 1991, с модификациями). ДНК выделяли in 2-6 индивидуальных растений каждой замещенной линии, линии пшеницы сорта Саратовская 29 и ржи сорта Онохойская, а так же из 35 растспнП-гаметоклонов, полученных в результате кульлгоирования in vitro пыльников заметенных линий J11, Л2, ЛЗ, Л5. Лб и липни пшеницы сорта Саратовская 29. SSR-анализ проводили с использованием 92 SSR-марксров пшеницы, Aginw и Xgdm (Rôder et al., 1998; Pcstsova et al., 2000), в среднем по 4 маркера на каждую хромосому пшеницы, а так же 10 SSR- маркеров ржи, Xscm и Xrms. (Saal, Wrickc, 1999; Korzun. Rôder, неопу бликованные данные), or одного до трех маркеров на каждую хромосому ржи. Г1ЦР проводили п реакционной смеси объемом 25 мкл, содержащей 50-100 нг ДНК-матрицы, по 0,2 мМ каждого д11ТФ, 1.5мM MgClj, но 0.25 мкМ прямого и обратного SSR-нраймеров, 1 ед. Tag-полимеразы, в следуют»« условиях; дсна1урация - 1 минута при 94сС, 01ЖНГ матрицы с прайм ером — I минута при 50сС, 55сС, inn 60°С (в зависимости от праймера), полимеризация - 2 мипуш при 72('С; всего 45 циклов; достраивание ПЦР-фрагмсшов - 10 минут при 12йС один цикл. Элеклрофорстнпескос разделение продуктов амплификации проводили в 6% денатурирующем полиакриамцдном геле толшнноП 0.35 мм в автоматическом лазерном флуорсспептном секвенаторс (ALF-sequenccr, Pharmacia). Pu мер амплифпциропаиных фрагменюп рассчитывали при помощи компьютерной нрофамми "I-'rapment Manager 1.2" (Pharmacia). Диализ проводили с индивидуальными ранениями каждой замешшиой лншш, а так же контрольной линией пшеницы сорта Саратовская 29 и ржи сорта Онохойская. Лндротенные регенераты Ro к R] поколений анализировали параллельно с растениями донорами, от которых Орали пылышки для культивирования in vitro.

Культура пыльников in vitro. Растения выращивали в условиях гидропонной теплины. По достижении микроспорами одноядерной стадии колосья срезали и хранили при t*=5°C в течение 5-9 суток. Пыльники вычленяли в асептических условиях и помешали на агарнзовакную картофельную среду PII (Chuang et а!„ 1978) Сез ре!уляторов роста или с содержанием 2,4-Д (0.25, 0.75 и 1.0 мг/л). В качестве источника углеводов использовали сахарозу (90 г/л). Пыльники культивировали при /=29 С в темноте. Развившиеся из микроспор эмбрнокды кассировали па безгормональную среду Гамборга (В5) {Gamborg, tîveleigh, 1968) и культивировали при /=25 С и непрерывном освещении. Зеленые регенераты (Ro) на стадии трех листьев высаживали в ве[«тационные сосуды с верм и кулитно-керамзит ной смесью. Зерновки, завязавшиеся от самоопыления у растений Rg, проращивали в тех же условиях. Число хромосом растений Ro определяли на давленых препаратах кончиков корешков растений. Особенности андрогенсза оценивали по следующим показателям:!) частоте продуктивных пыльников (часто ге пыльников, образовавших эчбриоиды); 2) частоте образования эмбриондов к 100 пыльникам; 3) частоте регенерации всех проростков к 100 эмбрноидам; 4) частоте регенерации зеленых проростков к

общему числу регенерировавших проростков; 5) эффективности регенерации зеленых растений, оцененной по соотношению числа зеленых проростков к 100 пыльникам; б) соотношению разе] пня три гаплоидов («=21) и гексаплоилов (Лг-42).

Кп-глусная культура незрелых зародышей in vitro. Для культивирования in vitro незрелые зародыши диаметром от 0.5 до 2 мм вычленяли из зерновок, развивавшихся после самоопыления в течение 12-14 дней, н помещали вверх щитком на агаризованную среду Мураснге н Скуга (Murasliige, Skoog 1962), содержащую 2 мг/л 2,4-Д, 100 мг/л мезоиноигта и 30 г/л мальтозы. В течение первых 15 суток культивирование проводили в темноте при t=25°C, затем при непрерывном освещении. Через два месяиа от начала культивирования зародышей каллусы пассировали на среду того же состава, но не содержащую ростовых регуляторов. Частоту' образования каллусов оценивали по их отношению к числу культивированных зародышей, а частоту каллусов с регенерацией проростков-к общему числу каллусов.

Полученные данные обрабатывали статистически, в том числе методом дисперсионного анализа по однофакторной схеме (Лакнн, 1980).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика пшеннчно-ржанмх замешенных лиtittit с применением SSR-ана.ипа. Прн выполнении SSR-аиализа отсутствие продуктов амплификации всех SSR-мэрксров, локализованных на определенной хромосоме пшеницы, и наличие маркеров томеологичной хромосомы ржн оценивали как замещение соответствующей хромосомы пшеницы хромосомой ржн. Опенка степени гетерогенности ieiютнпнческой среды пшеницы и ржн проводилась на основании сравнения длины .мнкросагеллптов, картированных на хромосомах пшеницы и ржи, замешенных линий и контрольных линий пшеницы и ржи.

Результаты SSR-аналнза восьми из десяти замешенных лшшй: Л1-П<о(11>), J[2-2Kfl(2D), Jt4-5Ro(5D), JI5-<5R0(6/Y), J17-1R„(1A), Л8-1К„(1Л), Л9-5Ко(5Л), Л 10-5R\,{5A) 1фодемонстрировали соответствие типов замещений, )станокленных ранее на основании дифференциального С-окраншвания и телоисшрического анализа (Кравцова, Щапова, 1980). В отношении линий ЛЗ и Лб применение SSR.-маркеров позволило впервые определить тип замещения и уточнить идентификацию хромосом ржн. Так, у всех анализируемых растений линии JI3 показано наличие маркера хромосомы ржи 2R и отсутствие всех пяти маркеров, локализованных на хромосоме пшеницы 2D, что указывает на замещение 2R(2D). На Рис. 1 приведено схематическое изображение хромосом данной линии. Замешенная линия Л б по результатам SSR-анализа была определена как 3R(3B).

Оценка ютерогенности гспотипической среды пшеницы ишенично-ржаных замешенных линий Саратовская 29/Онохойекая показала, что линии Л1, JI4, Л5 и Л7 незначительно отличаются от контрольной линии пшеницы аллельным составом SSR-локусов пшеницы (0-2.1% анализируемых локусов). В то же время для линий Л2 и ЛЗ процент локусов с аллелями отличными ог контрольных составил 13.7% и 26.0%, соответственно. Между собой данные линии с однотипным замещением, 2R(2D), отличаются аллельным составом 24.7% исследуемых SSR-локусов, что позволяет различать их на молекулярном уровне

.icriw 1A

JlBClX

. Vft—tTJ i'p-"' I ?

iiacJi?

IB

ID

2A 2B

2D

Xciim

VfTTf.m

ltKn777

Xryr-17<

ice^JIJJ

.ica^Ji'i

.tei1»

5A

5B

5D

6A

№

6D

XttJiS

Iticii)

ii'tSitl

iCSi^.. tp-i»

, rr>-l»l

«tejtl)

3A 3B 3D

0

< r--—j la

/ .lanjM

4A 4»

feci S!

SaaJS.

Vf*—11C2

in

4D

li^Jfi

'•jw:

tr-nptt

Xi^A)

.ICKSfrll

iii^;«

i Tpi-wa SasL'ft____

((«-am

7A

7B

7I>

2R 3R

Phc. 1. CxeMannecKoe hjoCpaateisae > powocou ,-jittmi J13. C - nempovqu; > - a,ne,™ MHKpocaie.xuimux jioKyooa, or.nrwtie or Koiirpo.uj nxemmu; | - orcjiciBKe npo,i>Kia awiL-iiiiitKaiw»t

и обозначить как 2R(2D)' и 2R(2D)3. Наличие у замещенных линий отличий в аллельном составе микросателлитных локусов, по-видимому, отражает высокий уровень полиморфизма внутри исходного сорта пшепины Саратовская 29. Уровень полиморфизма SSR-локусов заметенных линий и контрольной линии пшеницы, обнаруженный в нашей работе, соответствует внутрнеортовому и не препятствует использованию данных линий для определения роли отдельных хромосом ржи в контроле признаков.

Суммируя данные цитогенетического (Кравцова, Щапова, 1980) и молекулярного SSR-анализа (Добровольская и др., 2003), замещенные линии были окончательно идентифицированы следующим образом: Л1 -IRo(1D), Л2 — 2Rt/2P)'. ЛЗ -2^2РГ, Л4— 5Ro(5D), Л5 - 6Ro(6A), Лб -1ЕоОШ, Л7 - 1ЗДА), Л8 - I Rb (1 А), Л9 - 5Ro(5A), Л10 - 5Rv<5A), Эта номенклатура использовалась нами для обозначения линий при изучении влияния отдельных хромосом ржи на особенности андрогенеза in vitro на примере данных линий.

Микросагеллнтный анализ замещенных линий позволил впервые определить локализацию на хромосомах ржи SSR-маркеров пшеницы -Ygum 960 (5В), .Yyum 334 (6AS) и .Ygivm 1016 (5BL), Показано, что Xgivm 334 и XgH'm 1016 являются маркерами хромосомы ржи 6R, a Agww 960 - хромосомы 5R. Маркеры Ajnvm 334 и Ai,ivm 960 локализованы па гомеологнчных хромосомах пшеницы и ржи, шестой и пятой групп соответственно, а маркер Xgwn ¡016 - на ни омеологичных хромосомах (6R и 5В). На Рис. 2 приведены результаты амплификации локуса Xgwm 334 у пшенично-ржаных замещенных линий Саратовская 29/Онохойская, контрольных линий пшенииы и ржи. 1'ис. 2. Результат амплификации локуса Xgwm 334 у пшенично-ржаных замешенных линии Саратовская 29/ Онохойская, контрольных линий пшеницы и ржи.

^—-.y.crrtjU

лаял

Стрелками обозначены маркирующие фрагменты, Слева и справа в каждой дорожке расположены фрагменты ДНК-стандартов длины (73 пни 196 пн).

Влияние отдельных хромосом ржи на показатели андрогенеза ш vitro Андрогенный эмбриоидогенез. При культивировании пыльников замешенных линий, тритикале и контрольной линии пшеницы на индукционной среде с разной концентрацией 2,4-Д обнаружили, что время появления первых автономных эмбрногенных структур, или эмбриондов в соответствии с классификацией Т.К. Батыгиной (Батыгина, 1974), не зависит от генотипа растений-доноров пыльников. Изучая ответ пыльников замешенных линий, тритикале и линии пшенииы сорта Саратовская 29 на условия культивирования

7

in vitro up» разных концентрациях 2,4-Д в инициальной среде, обнаружили неодинаковую реакцию различных генотипов по способности к андрогенночу эмбриоидогспезу. Так, у линии 5K(5D) на среде с 1 мг/л 2,4-Д (Табл. 1) и средс без 2,4-Д (Табл. 4) развития эмбриондов не происходило. На средах с 0.75 мг/л 2,4-Д (Табл, 2), 0.25 мг/л 2,4-Д (Табл. 3) и частота продуктивных пыльников, и частота образования эмбриондов у этой линии по сравнению с линией сорта пшеницы Саратовская 29 были досюверно ниже.

Линии 1R(1D) и 3R(3B), напротив, отличались высокой способностью к андр01«нному эмбриоидогенезу: и но частоте продуктивных пыльников, и но частоте образования эмбриондов они достоверно превышали контрольную линию пшеницы практически во всех экспериментах (Табл, 1-4).

У линий 2R(2D)', 2R(2D)2 и 6R(6A) частота продуктивных пыльников во всех экспериментах была на уровне контроля. Что касается частоты образования эмбриондов, то этот показатель андрогенного эмбрноцдогенсза у линии 2R(2D)1 при культивировании пыльнико» на всех средах, содержащих 2,4-Д, был достоверно выше, чем у линии сорта Саратовская 29. Значения частоты образования эмбриондов у линии 2R(2D)' на среде без 2,4-Д (Табл. 4) и средс с 0.75 мг/л 2,4-Д (Табл. 2), а у линии 6R(6A) на среде с 1 мг/л 2,4-Д (Табл, 1) были достоверно выше, чем у контроля.

Изучая способность пыльников тритикале к андрогенному эмбриоидогенезу, обнаружили, что по частоте продуктивных пыльников на средах с 0.75мг/л и 0.25 мг/л 2,4-Д и СезгормоналыюМ среде тришкале не отличается от кошроля. Но показа1елям частоты образования эмбриоилов зга линия была достоверно выше линии пшеницы сорта Саратовская 29 на среде без 2,4-Д (Табл. 4) и среде с 0,75 мг/л 2,4-Д. При максимальной в данной работ« концентрации 2,4-Д (1 мг/л) тришкале достоверно уступала контролю и по частоте продуктивных пыльников, и по частоте образования эмбриоидов (Табл. 1). Регеперационная способность андрогенных эмбриоидов. Эмбрнонлы, сформировавшиеся на инициальной среде с разным содержанием 2,4-Д, затем переносили на без гормональную среду и культивировали в одинаковых условиях, изучая их способность к регенерации проростков.

Установлено, что по способности к регенерации всех проростков эмбриоиды замещенных линий и тритикале либо достоверно уступали контролю (Табл. 1, 2), либо были на уровне контрольной линии пшеницы (Табл. 3, 4). Сопоставляя экспериментальные данные но регенераиионной способности эмбриондов замешенных линий, сформировавшихся на среде с различной концентрацией 2,4-Д (Табл. 1-4), установили, что наличие и определенная концентрация фитогормонов в индукционной срсде оказывает воздействие не только на уровень пнзукинн эмбриопдогенеза, но и на регенерационную способность сформировавшихся эмбриондов. Эмбриоиды всех замешенных линий и тритикале обнаружили тенденцию к уменьшению регенераиионной способности по сравнению с контрольной линией пшеницы при повышении от 0 до I мг/л концентрации 2,4-Д н индукционной среде.

По величине показателей частоты зеленых проростков, регенерировавших из ' эмбриоидов, развившихся на среде с 1 мтУл 2,4-Д, все замещенные линии были достоверно ниже контроля (Табл. I). На средах с более таким содержанием

Таблица 1. Результаты культивирования пыльников замешенных линий

Саратовская 29 / Онохойская, линии сорта Саратовская 29 (Сар. 29) и тритикале (Трнт.) на среде Р1[ с I мг/л 2.4-Д____

Линии Культивировано пыльников Частота, % Частота зеленых проростков к 100 пыльникам, %

продуктивных пыльников1 эмбриоидов' всех проростков2 зеленых проростков1

1R(1D) 504 25.0- 74.6"' 30,1("'J 2 4('"J 1.яГч

2R(2D)' 447 5.4 15.9 42 •>("*) 33.8<"> 5.3*'>

2R(2D)2 444 6.6 24.9*** 30.0('"> 21.8*'"> 5.4П

3R(3B) 633 8,2 16.3 42.8<*"> 21.41"*> 3.4»*"'

5R(5D) 415 о<*"> 0 0 0 0

6R(6A) 515 б.б 24.1"' 19.31"*> 17.7('"> 4.2<">

Cap. 29 354 6.8 15.3 77.8 61.1 9.3

Триг. 524 о.8<"'> 1.1<'"> О1'"' 0 0

Примечание £).<я таблиц 1-4. Разница сто сравнению с линией сорта пшеницы Саратовская 29 (Сар.29) достоверно больше^ при *Р<0.05, "Р<0.01 "*Р<0.001, достоверно меньше при 1*'Р<0.05, ( ''Р<0.01 и ("*>Р<0.001. 1К ] 00 культивированным пыльникам. 1К 100 культивированным эчбриоидам.

Таблица 2. Результаты культивирования пыльников замешенных линий Саратовская 29 / Онохойская, линии сорта Саратовская 29 (Сар. 29) и тритикале (Трнт.) на среде P1I с 0.75 мг/л 2,4-Д __

Линии Культивировано пыльников Частота, % Часто 1а зеленых проростков к 100 пыльникам, %

продуктивных пыльников1 эмбриоидов1 всех проростков1 зеленых проростков3

1R(1D) 1524 g 2....." 32.3"' 31.8l"J 3.7 1.2

2R(2D)' 1262 3.1 6.6*' 33.7t") 12.0 0.8

2R(2D)2 318 3.1 7.6* 29.2("> 0 0

3R(3B) 1454 11.0"* 52.4"* 24.5("') 7.2 3.8

5R(5D) 851 O.lt'"' 0.71"*' 0 0 0

6R(6A) 1141 1.7 4.2 25.01**'1 18.8 0.8

Cap. 29 580 i -> 3.6 66.7 9.5 0,3

Трит. 420 2,1 12.1 "* 31.41**' 21.6 2.6**

Примечание как в Табл. 1

2,4-Д у замещенных линий сформировались эмбрноиды, которые достоверно не отличались от контроля по величине этого признака (Табл. 2-4). Только одна из замешенных линий, 2Я(2В)1, по способности эмбриоидов к регенерашш зеленых проростков достоверно превысила контроль пшеницы и остальные генотипы, что наблюдалось при культивировании пыльников на среде с 0,25 мг/л 2,4-Д (Табл. 3).

Таблица 3. Результаты культивирования пыльников заметенных линий Саратовская 291 Окохойская, линии сорта Саратовская 29 (Сар. 29) и тритикале {Трит.) на среде PII с 0.25 мг/л 2,4-Д _

Линии Культивировано пыльников Частота, % Частота зеленых проростков к 100 пыльникам, %

продуктивных пыльников1 эмбрио-идов1 всех проростков1 зеленых проростков2

1R(1D) 383 14.Г" 35.8'" 24.8 6.6 2.3

2R(2D)' 300 5.0 17.7"* 18.9 9.4 1.7

2RÎ2D)1 305 4.9 28.9*" 45.5 40.9*" 11.8'"

3R(3B) 353 13.0*" 42.5*" 13.3 6.0 2.5*'

5R(5D) 283 0.35("> 0,351"') 0<*"> 0 0

6R(6A) 300 3.0 3.0 22.2 0 0

Cap.29 320 3.4 9.4 26.7 10.0 0.9

Трит. 387 4.7 10.6 4.8п 4.8 0.5

Примечание как л Табл. 1

Таблица -1. Результаты культивирования пыльников замешенных линий Саратовская 29 / Онохойская, линии сорта Саратовская 29 (Сар,29) и тритикале (Трит.) на среде РП без 2.4-Д___

Линии Культивировано пыльников Частота, % Частота зеленых проростков к 100 пыльникам, %

продуктивных пыльников1 эмбрио-идов1 всех проростков1 зеленых проростков2

1R(ID) 186 11.8"' 29.6'" 5.5 5.5 1.6

2R(2D)' 200 6.0 21.0'" 7.1 4,8 1,0

2R(2D)' 90 0 0 0 0 0

3R(3B) 166 14.5*'* 46.4*** 6.5 5.2 2.4'

5R(5D) 250 0 0 0 0 0

6R(6A) 116 0.9 0.9 0 0 0

Cap.29 134 2.2 5,2 0 0 0

Трит. 225 3.1 18.2"* 0 0 0

Примечание как в Табл. 1

Оценка эффективности андрогенеза in vitro, как частоты зеленых регенерантов по отношению к 100 пыльникам, показала, что - при культивировании пыльников на инициальной среде с 0.25 мг/л 2,4-Д линии 3R(3B) и 2R(2D)1 достоверно превышают контрольную линию пшеницы (Табл. 3). Аналогичные результаты получены в отношении липни 3R(3B) при культивировании пыльников на среде без 2,4-Д (Табл. 4) н тритикале - на среде с 0,75 мг/л 2,4-Д (Табл. 2). Значения эффективности андрогенеза при культивировании пыльников на среде с 1 мг/л 2,4-Д у всех замешенных линий были достоверно ниже контрольной линии пшеницы.

В целом для щученных renom пои показана возможность увеличения конечного выхода зеленых проростков за счет изменения в инициальной среде концентрации 2,4-Д, индуктора эмбриондогенеза. Так, в наших экспериментах для линий Саратовская 29, 2R(2D)' и 6R(6A) оптимальной оказалась концентрация 2.4-Д 1.0 мг/л, для тритикале - 0,75мг/л н для линии 2R(2ÍJ)Z -0.25 мг/л.

Такнм образом, варьирование концентрации синтетического ауксина. 2,4-Д, в индукционной среде приводит к изменению способности микроспор пыльников замешенных линий к эмбрнондогенезу и позволяет полнее пияпить эмбрноилогенный потенциал каждой линии, а так же оказывает влияние на регенерацлонпую способность сформировавшихся эмбриоидов каждого генотипа. Тем не менее, дисперсионный анализ, выполненный по однофакгорной схеме, продемонстрировал, что в меняющихся условиях культивирования основной вклад в определение способности микроспор пыльников формировать эмбрионлы н их рсгенерацнонную способность вносит генотип растения-донора (Табл. 5).

Таблица 5. Влияние генотшшческого разнообразия шпеничпо-ржалых ичешешгих лишШ Саратовская 29/Онохойская, линии copia лшенини Саратовская 29 и зригнкале па показатели анзрогенеза при кулыивироидпн» пыльников in vitro_

Источник Показатели d.f. SS mS Гф Доля

варьирования аплрогенеза in vitro вклада

Генотипы замешенных линий 1 7 731.24 78.20 6,81*" 0.66

2 7 7969.05 774.68 4.87'* 0.56

3 7 5732.20 Я 18.89 4.81+* 0.56

4 7 5231.66 234.84 1.96 -

Примечание. ] - частота продуктивных пилы ¡и ко в; 2 - частота образования эмбрионов; 3 - часюта регенерации всех проростов; 4 - частота peieitepamitt зеленых проростков

У замешенных линий можно выделить генотипы со значительно выраженным эффектом хромосом ржи на проявление признаков эмбриондогенеза при любом уровне 2,4-Д в индукционной среде. Так. на частоту образования андрогенных эмбриоидов положительное влияние оказывают хромосомы ржи сорта Онохойская 1R и 3R, функционирующие в генотинической среде мягкой пшеницы сорта Саратовская 29. Супрессирующес действие на андрогенный змбриоилогенез оказывает хромосома ржи 5R сорта Онохойская. Следуег отметить, что сгимулнруюшсе влияние хромосомы ржн 2R у линии 2R(2D)* на регенерационную способность эмбриоидов определяется генотипической средой пшеницы, в которой она функционирует, >гго видно из сравнения показателей ре генерационной способности двух линий с одно1инным замещением, но оглнчной генотнпи ческой средой пшеницы (Табл. 3). На других генетических молельных объектах подобного влияния данной хромосомы ржи обнаружено не было, но было показано, что гомеологичная хромосома пшенитш 2D так же положительно влияет на формирование зеленых проростков в культуре пыльников in vitro (Szrakacs ct al., 1988).

Изучение влияния типов замещения и сортового происхождения хромосом ржи на показатели андрогенеза in vitro пшеиично-ржаных замешенных л инн it.

Изучение особенностей андрогенеза in vitro у серии замещенных линий Саратовская 29/Онохойская позволило показать влияние отдельных хромосом ржи одинакового сортового происхождения п единой генотниической среде пшеницы на отдельные этапы андрогенеза in vitro. Вместе с тем, можно предположить, что на способность микроспор пыльников развиваться по спорофнтному пути при культивировании in vitro пыльников замешенных линий может оказывать влияние не только наличие хромосом ржи, но и отсутствие вследствие замещения хромосом пшеницы.

Для того чтобы учесть влияние тина замещения и рши сортового происхождения хромосом ржи в определении признаков андрогенеза г'м vitro, в работу были дополнительно вовлечены линии с замещением по первой и пятой группам хромосом: с одинаковым сортовым происхождением, но различными типами замещения - lRo(ID) и lRo(lA), 5Ro(5D) и 5Ro(5A), а так же с одинаковым типом замещения, но отличающиеся сортовым происхождением хромосом ржи - IRq(IA) и ШП(1Л), 5Ro(5A) и 5RV(5A).

Рис. Влияния типов замещения и сортового происхождения хромосом ржи на показатели зллрогешюго эмбрноидогенеза in vitro пшеиично-ржаных заметенных

ЛИНИЙ.

ЕЗ- частота продукп:в-' них пылышков;М -■ частота образования

. ЭЧбрИОНДОВ

Примечание, За ноль приняты показатели контрольной линии ншешшы сорта Саратовская 29, Разница по сравнению с контрольной линией: достоверно больше при Р< 0.001, ** Р< 0.01; достоверно меньше при (*)/•< 0.05, ("*)/>< 0.001

Установлено, 'гго на признаки эмбрноидогенеза у линий с замещением no 1 группе хромосом тип замещения не оказывает влияния, но степень выраженности этих признаков зависит от сортового происхождения хромосом ржи. Аналогичные результаты были получены и в отношении влияния сортового происхождения хромосом ржи 5R (Рис. 3). Основываясь на полученных нами данных (Добровольская и др., 2003) и учитывая результаты проведенных ранее исследований (Foroughi-Wehr, Zeller, 1990; Martinez ct al., 1994), можно заключить, что гены, контролирующие индукцию и супрессию формирования эмбрнондоп, локализованы на хромосомах ржи 1R и 5R, соответственно.

■I

IRiJfUr IRo tlApiRaJTAJ

•■at—r--Ca^iS—3

Сравнительный анализ влияния отдельных хромосом ржн на проявление признаков андрогемеза н соматическою эмбриондогсиеза in vitro

Таким образом, определены хромосомы ржн, влияющие на индукцию эмбрпоидогенеза в гаметнческих клетках. Возникает вопрос, оказывают ли данные хромосомы ржн влияние на индукцию эмбриондогснеза в соматических клетках.

Рис. 4. Влияние хромосом ржн на показатели соматического эмбрион д or енсга (а) и регенерации (0) в каллусной культуре незрелых зародышей пшеннчно-ржаных замененных линий Саратовская 29/ Онохойская

ж

s

. - îy 1

*t _________ J

ш

К

С) частота риеперашш зеленых проростков (Го)

а} частота "образовали я эмбриондогенных

КЗЛЛуС0В(П)

Прииечшше. I-IR(ID), 2-2R(2D)\ 3-2IU2D):.5-5R(5D), 6- 6R(6A). Показатели контрольно ft линии пшеницы copia Саратовская 29 (К) приняты за ноль. Разница по сравнению с линией Саратовская 29; достоверно больше при ***/*< 0,001, ** Р< 0.01; достоверно меньше при <")Р< 0.01

С начала культивирования незрелых зародышей наблюдались различия по способность линий к типу и динамике образования эмбрноидо(енного каллуса (Перши на, Добровольская и др„ 2003). Так, но частоте образования эмбриоидогенных каллусов достоверно превысили контроль замешенные линии c2Rn 3R хромосомой, достоверно ниже ко!ГТроля была линия 1R(1D) (Рис. 4).

Сравнивая эти данные с показателями андрогенною эмбриоилогенсза, мы обнаружили, что у линии 1R(ID) с высоким потенциалом к образованию эмбриоилов из микроспор при культивировании пыльников, показатели соматического эмбрпоидогенеза были очень низки. Наличие хромосомы ржи 5R, су премирующей частоту аидрогенного эмбриоилогенсза, не оказывает такого влияния на частоту соматического эмбрпоидогенеза in vitro. Линия 3R(3B) продемонстрировала высокий эмбриоидогенный потенциал и при культивировании пыльников, и при культивировании незрелых зародышей. На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что на индукцию эмбриоидогенеза in vitro в гаметнческих и соматических клетках растения оказывают влияние разные хромосомы ржи, н, вероятно, процессы индукции эмбриоидогенеза in vitro в гаметаческих и соматических клетках находится под контролем различных генетических систем.

Рассматривая показатели регенерации соматических эмбриоилов, обнаружено, что наличие хромосом ржи 2R и 3R у замешенных линий вызывает

достоверное увеличение частоты регенерашш проростков (Рис. 4). При этом наиболее выраженным было влияние хромосомы ржи 2R.

Стимулирующий эффект хромосомы ржи 2R на показатели регенерации m соматических эмбриоидов в культуре незрелых зародышей in vitro показан впервые (Нсршнна, Добровольская и др., 2003). Полученные результаты согласуется с имеющимися в литературе данными об аналогичном влиянии гомеологичной хромосомы ячменя 2Н (Mano et al., 1997) и хромосом 2*" группы пшеницы; 2Л, 2В и 2D (Kaleikau, Sears, 1989; Henry et al., 1994; Ben Amer et al., 1997).

Характеристика андрогенных p e re к ера i tro» Растения, регенерировавшие в культуре пыльников in vitro, изучали с применением микросагеллитных маркеров и цитологического анхтнза чисел хромосом на мнгогических препаратах кончиков корней.

Цитологический анализ обнаружил, что все андрогенные pereHcpairru были эуилоидными растениями: либо тригаплоидам (п=21), либо гексаплоидамн Доля гексаплоидов среди регенератов замещенных линий варьировала ог 13.6% до 25.8% в зависимости от генотипа (Табл. б). Уровень образования спонтанных дп гаплоидов у липии пшеницы сорта С арат опекая 29 и замещенных линий достоверно не отличался, слсдоваюльно, наличие отдельных хромосом ржи в геноме замещенных линий не су пресс ируст спонтанное образование ai upo генных дн гаплоидов.

Таблица 6. Частота гаплоидных («=21) и тексаллоцдных (2п-42) андрогенных растс-

Лшши Шучено андроген-ных растений fr=21 ¿n-42

число частота, tí число частота, %

№(Ш) 67 55 82.1 12 17.914.6

2R(2I))' 24 19 79.2 5 20.S*S.3

2K(2D)' 31 23 74.2 8 25.St7.S

3R(3B) 68 59 S6.8 9 13.2 £4.1

6Rf6A) 13 13 100 0

Cap 29 16 12 75.5 4 25,01.10,5

Мнкросателлитный анализ растений-гаметоклонов был выполнен с тем же набором маркеров, коюрый использовали ятя характеристики замешенных линий. Обнаружили, что амплификационные спектры всех 104 маркеров у всех анализируемых растенnfi-регенерантов, соответствовали спектрам доноров пыльников. Следовательно, условия культуры пыльников ш vitro не привели к изменениям анализируемых микросателлитиых' последовательностей генома, которые считают пшервариабельными (Brown et al„ 1996), Кроме того, наличие на хромосомах всех SSR-маркеров, исключает возможность существования у гаметоклонов крупных делеций и транслокаций.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенного SSR-онализа были впервые установлены типы замещения и уточнена идентификация хромосом ржи у двух замещенных линий и, таким образом, все десять замещенных линий были однозначно

идентифицированы. Определение геномного состава замешенных линий Саратовская 29/Онохойская позволило на молекулярном уровне отличить две линии с однотипным замещением, 2R(2D), но различным аллельным составом ряда микроезтелллитиых локусов, И рассматривать их как отдельные, 2R(2D)1 и 2R(2D)J. Полученные нами результаты показали, что ишепично-ржаные замещенные линии являются адекватной теистической моделью для локализации на отдельных хромосомах ржи генов и .маркеров. При помощи замешенных линий серии Саратовская 29/Онохойская впервые определена локализация на хромосомах ржн ipex SSR-маркеров пшеницы. Использованная теистическая модель позволила определить эффект хромосом ржи, функционирующих п единой ген оптической среде пшеницы, на отдельные этапы анлрогенеза in vitro. Так, было выявлено положительное влияние хромосом ржн 1R и 3R и отрицательное - хромосомы 5R на показатели андрогенного эмбриоидоигнеза. Установлено, что степень пыражепностн признака "частота образования анлро генных эмбрион лов" определяется сортовым происхождением хромосом ржи 1R и 5R. Показан стимулирующий эффект хромосомы ржи 2R на регенераинонную способность андрогенных эмбриоидов. При сравнении показателей андрогенного и соматического эмбрноидотенеза in vitro у замещенных линий показано, что процессы эмбрИ0Ид01Снеза и [амсшчсскнх и соматических клетках находятся под контролем различных гснсшческнч систем. Обнаружили одинаковый стимулирующий эффект хромосомы ржи 2R па регепераннонную способность и андроЕенных, и соматических эмбриоидов. Результаты SSR-анализа гаметоклонов показали, что условия культивирования пыльников in vitro не вызывают заметной нестабильности 1«нома получивших развитие растеннй-регеперангов, использованный протокол культивирования можег применяться в дальнейшем для массового получения д »гаплоидов пшенично-ржаных замещенных линий.

ВЫВОДЫ

1, С применением микросателлитных маркеров впервые определен тип замещения н идентифицированы хромосомы ржн у двух пшенично-ржаных замешенных линий Саратовская 29/Онохойская. Подтверждены ранее полутенные данные телоцснтрического анализа и дифференциального С-окрашивания хромосом ржи в определении типов замещения у восьми из десяти изученных замещенных линий. Установлен полный геномный состав и дана оценка степени гетерогенности гснотипической среды пшеницы у серии замешенных линий Саратовская 29/Онохойская. По степени выявленных различий аллелъного состава SSR-локусов пшеницы выделены как независимые две замещенные линии с однотипным замещением 2R(2D}' и 2R(2D)i.

2, При изучении замещенных линий Саратовская 29/Онохойская впервые определена хромосомная локализация на хромосомах ржи SSR-марксров пшеницы Л^нти 960, Xgn-m334, Xgwm 1016.

3, Показаны достоверные различия по влиянию отдельных хромосом ржи на реакшно пыльников в условиях культивирования in vitro.

3.1. Хромосомы ржи 1R и 3R оказывают стимулирую шее, а хромосома 5R - супрессируюшее влияние на частоту продуктивных пыльников и частоту образования эмбриоидов,

3.2. При определенной концентрации 2,4-Д в инициальной среде хромосома ржи 2R может оказывать положкгсльное влияние на способность эмбрнондоа к регенерации зеленых проростков.

3.3. Геном ржи при функционировании в составе октоплондного тритикале не оказывает су пресс ируюшего влияния на показатели частоты эмбриондогенеза и регенерации проростков в культуре пыльников in vitro.

3.4. Наличие отдельных хромосом ржн в геноме замешенных линий не супресспрует спонтанное образование андрогенных днгаплоидов.

4. Особенности аидрогенеза in vitro у замещенных линий завися г от

сортового происхождения хромосом ржи и влияния генотипической среды пшеницы. Установлено, что степень выраженности признака - образование аюрогенных эмбриоидов, определяется сортовым происхождением хромосом ржи 1R и 5R. Показано, что у замещенных линий с однотипным замещением 2R(2D), но различающихся аллелг.ным составом микросатсллнтпых локусов пшеницы, эффект хромосомы ржи 2R на регенерацию зеленых проростков в культуре пыльников неодинаков.

5, Экспериментально показана возможность увеличения конечного выхода зеленых проростков прн культивировании пыльников за счег изменения в ш пищальной среде концентрации индуктора эмбрноидогенеза, СНН1С1ИЧССК0Г0 ауксина — 2.4-дихлорфеноксиуксусной кислот.

6, Проведен сравнительный анализ влияния отдельных хромосом ржи из проявление признаков шцрогенного и соматического эмбрнондо1енеза и регенерацию зеленых проростков в культуре изолированных нылышков н незрелых зародышей. Показано, что индукция андрогеиного и соматического эмбрноидогенеза находятся под влиянием разных хромосом ржн. Выявлено, что на процессы регенерации зеленых проростков и в культуре нылышков, и в каллусной культуре незрелых зародышей стимулирующее влияние оказывает хромосома ржн 2R. Впервые установлено, что гены, контролирующие образование эмбрноидогенного каллуса в щитковой ткани незрелых зародышей, локализованы на хромосоме ржи 2R.

7, Показано, что условия культивирования in vitro ие вызвали нестабильности мнкросагеллктных последовательностей ДНК у растений, регенерировавших в культуре пыльников шненично-ржаных замешенных линий.

Список публикаций по теме диссертации

1. Перши на Л.Л., Белова JI.II., Девяткина Э.П„ Дырокол ьск.рл О.Б. 2000. Особенности создания гомозиготных линий у генотипов пшеницы с реконструированными геномами. Тезисы II съезда ВОГИС, Сан кг-Петербург, с.221.

2. Dohrovolskava О.В., Pershina Lj\., Kravtsova L,A, Shchapova Л.Г, 2000. The peculiarities of androgenesis in wheat-rye substitution lines, Abstr, II" of EWAC Conf. Novosibirsk, p.l 15.

3. Добровольская О Б,, Першина Л,А.. Крапнова Л.Л., Снлкова О.Г., Щапова Л,И. 2001. Влияние хромосом ржи на особенности андрогенеза у пшенично-ржаных замешенных линий Triticum aestiviim L. copra Саратовская 29/ Sácale cércalo L. сорта Онохойская и Тритикале. Генетика 37; 624-630,

4. Dobrovoskaya О.В.. Pershina L.A., Kravtsova L.A., Shchapova A.I. 2001. The peculiarities of andre genesis in wheat-rye substitution lines, EWAC Newsletter 11 : 105-108.

5. Добровольская O.E.. Першина Л.А., Кравцова Л.А., Снлкова О.Г., Щапова А,И, 2001, Андрегснез in vitro у шпеннчно-ржаных замещенных линий, Тезисы междунар. конф. *' Современные проблемы генетики, биотехнологии н селекции растении". Харьков, С. 18-19.

6. Добровольская О.Б., Першина Л.А., Кравцова Л.А., Щапова А.И, 2003. Сравнение эффекта ÎR и 5R хромосом ржи на особенности андрогенеза при культивировании пыльников пшеничио-ржаных замещенных линий в зависимости от происхождения линий. Генетика 39: 570-574,

7. Першина Л.А., Добровольская О.Б.. Раковцева Т.С., Кравцова Л.А., Щапова А.И., Шумный В,К. 2003, Влияние хромосом ржи на особенности каллусогенеза и регенерации в каллусной культуре незрелых зародышей ншенично-ржаных замещенных линий Triticum aestivum L. сорта Саратовская 29/ St'cale cereaU' I„ сорта Онохойская. Генетика 39; 1073-1080,

8. Лобровольская ОБ.. Першина. Л.А., Родер М. Салнна Е.А. 2003. Молекулярная идентификация серии пшенцчно-ржаиых замешенных .пиний и изучение эффекта хромосом ржи и генотипнчсской среды пшеницы на показатели андрогенеза in vitro. Тезисы 2В конф. МОГнС "Актуальные проблемы генетики", Москва. Т.2. С. 120-121.

9. Добровольская О.Б.. Салнна Е,А„ Кравцова Л.А., Щаиова А.И., Першина Л,А, 2003, Идентификация ирн помощи S S [i-анализа серии пшенично-ржанмх замешенных линий Саратовская 29Юнохойская и гомозиготных ли гаплоидных линий, полученных на их основе. Тезисы междунар. конф. "Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений", Харьков, 2003г.

Подписано к печати 26.09.03

Формат бумаги 60x90 1/16 Печ.л.1. Уч. и зд л.0,7

Тираж 100 экз. Заказ 91

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр.акад. Лаврентьева, 10

р 16 1 6 А