Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика морфологических, биохимических и молекулярных признаков аутофагии в корнях Triticum Aestivum при стрессе

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Характеристика морфологических, биохимических и молекулярных признаков аутофагии в корнях Triticum Aestivum при стрессе"

На правах рукописи

Рябовол Виктория Вадимовна

ХАРАКТЕРИСТИКА МОРФОЛОГИЧЕСКИХ, БИОХИМИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНЫХ ПРИЗНАКОВ АУТОФАГИИ В КОРНЯХ ТЫТ1СиМ Л£ОТКШ/НРИ СТРЕССЕ

03.01.05— физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

12 .Л 2013

Казань-2013

005543381

005543381

Работа выполнена в лаборатории окислительно-восстановительного метаболизма Федерального государственного бюджетного учреждения науки Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук (КИББ КазНЦ РАН)

Научный руководитель:

доктор биологических наук, заведующий лабораторией окислительно-восстановительного метаболизма КИББ КазНЦ РАН Минибаева Фарада Вилевна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор, заведующий лабораторией молекулярной биологии гена НИИ Физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, Москва Вартапетян Андрей Борисович

доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией молекулярных основ патогенеза КИББ КазНЦ РАН, Казань Чернов Владислав Моисеевич

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва

Защита состоится 23 декабря 2013 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д002.005.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук при КИББ КазНЦ РАН по адресу: 420111, г. Казань, ул. Лобачевского, д. 2/31, а/я 30, тел/факс (843)2927347, dissovet@mail.knc.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Казанского научного центра РАН.

Автореферат разослан «¿Ь» ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Пономарева Анастасия Анатольевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Постановка проблемы и ее актуальность. Аугофагия - универсальный катаболический процесс внутриклеточной деградации различных макромолекул и органелл. В начале 60-х годов XX века Кристиан де Дюв впервые описал этот процесс как образование одно- и двумембранных везикул (аутофагосом), содержащих фрагменты цитоплазмы и органеллы (по Yang, Klionsky, 2010). Процесс аутофагии консервативен и характерен для всех эукариот (Xie, Klionsky, 2007). Ранее изучение особенностей аутофагии у дрожжей при голодании позволило рассматривать аутофагическую деградацию в качестве компенсаторного механизма при недостатке энергетических ресурсов клетки (Tsukada, Ohsumi, 1993). Современные исследования расширили наше понимание о функциональной значимости аутофагии в различных эукариотических организмах. В связи с выявлением ключевой роли аутофагии при болезнях сердца, нейродегенеративных заболеваниях, инфекциях, старении и раке, интерес к исследованию аутофагии в организме человека в настоящее время значительно возрос. Были обнаружены различные типы аутофагии, показана возможность селективного удаления внутриклеточных компонентов. С открытием генов, контролирующих аутофагию, так называемых «аутофагических (ATG) генов», был начат новый этап в исследовании молекулярного механизма аутофагии. Наиболее подробно ATG гены изучены у дрожжей, где в настоящее время их насчитывается более тридцати (Nakatogawa et al., 2009). К сожалению, наше понимание относительно того, как аутофагия функционирует в растениях, остается достаточно ограниченным, однако сведения, полученные в последнее время, свидетельствуют о важности этого процесса в жизни растений. В организме растения аутофагия необходима для нормального развития в ходе органоморфогенеза и онтогенеза, а также при ответах на действие неблагоприятных факторов среды (Slavikova et al., 2008; Liu et al., 2009; Hayward, Dinesh-Kumar, 2010; Vanhee et al., 2011). Одной из универсальных стрессовых реакций растительных клеток является усиленное образование активных форм кислорода (АФК), обладающих как токсичными, так и регуляторными эффектами. Последствия окислительных модификаций высокомолекулярных соединений могут быть чрезвычайно токсичными, в связи с чем, своевременное изолирование и удаление окисленных структур и поврежденных органелл посредством аутофагии необходимо для выживания организма (Bassham et al., 2006). Предполагается, что индукция и интенсивность развития аутофагии во многом зависит от редокс-статуса клетки.

Расшифровка механизмов аутофагии в растениях на клеточном и молекулярном уровне представляется сложной задачей. Это связано, в частности, с тем, что до настоящего времени не выявлены этапы формирования аутофагосом, не определена природа фагофора в растениях, не выяснена роль в аутофагии основных АФК-генерирующих органелл - митохондрий. Актуальной проблемой является изучение структуры и функций ключевых аутофагических белков, в частности, молекулярного маркера аутофагии ATG8. Сведения о структуре ATG белков в клетках растений

представлены лишь в единичных работах (СЬае ег а1., 2004, 2005). Кроме того, информация о количестве, структуре и экспрессии А Ю генов в различных видах растений весьма ограничена.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилась характеристика морфологических, биохимических и молекулярных признаков аутофагии в клетках корней пшеницы при стрессе.

Были поставлены следующие задачи:

1. Анализ образования аутофагосом и активности генов Та А Тй4 и ТаАТ08% в корнях пшеницы при изменении редокс-статуса под действием прооксиданта параквата (Пк) и в условиях раневого стресса.

2. Изучение влияния ингибиторов митохондриальной электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) на образование аутофагосом и активность генов ТаАЮ4 и TaATG8g.

3. Идентификация и характеристика этапов образования аутофагосом в корнях пшеницы в условиях окислительного стресса.

4. Определение и анализ экзон-интронной последовательности гена TaATG8g.

5. Получение рекомбинантного белка ГаАТвв^ и анализ его структуры.

Научная новизна работы. Впервые идентифицированы и охарактеризованы

основные последовательные этапы образования аутофагосом в растительных клетках. Впервые показана индукция аутофагии в растениях при раневом стрессе, что подтверждается появлением в цитозоле аутофагосом и повышением уровня экспрессии аутофагических генов. Примечательно, что временная динамика образования аутофагосом в ходе раневого стресса совпадает с динамикой накопления АФК. Обнаружено, что митохондрии растений так же, как митохондрии животных, вовлечены в редокс-регуляцию аутофагии. Впервые показано, что нарушение работы переносчиков митохондриальной ЭТЦ растений, особенно комплекса III и альтернативной оксидазы, приводит к индукции аутофагии, интенсивность которой соотносится с повышенным содержанием Н202 и уровнем перекисного окисления липидов (ПОЛ). Впервые выявлено, что ген TaATG8g состоит из пяти экзонов и четырех интронов. Впервые получен очищенный препарат рекомбинантного белка ГяАТОохарактеризована его первичная, вторичная и третичная структуры, сконструирована трехмерная модель белка 7aATG8g и выявлены множественные мотивы, необходимые для его взаимодействия с лигандами. Эти данные свидетельствуют о том, что 7aATG8g обладает характеристиками, необходимыми для его вовлечения в биогенез аутофагосомальных мембран.

Практическая значимость. Разработан комплекс методических подходов для анализа аутофагии в клетках растений с целью выяснения роли этого процесса при стрессе. Эффективным подходом является изучение экспрессии аутофагических генов в сочетании с универсальными стрессовыми маркерами, в том числе уровнем АФК и жизнеспособностью клеток. Данные параметры могут быть использованы при оценке стрессовой устойчивости растений. Разработана система получения рекомбинантного

аутофагического белка в препаративных количествах. Отработана методика очистки и повышения растворимости нестабильного белка, которая может быть использована для предотвращения агрегации «проблемных» белков. Экспериментальные данные и методические приемы, изложенные в работе, могут быть применены в учреждениях сельскохозяйственного, биологического и биотехнологического профиля, а также при чтении курсов лекций по физиологии и биохимии растений и молекулярной биологии в ВУЗах.

Связь работы с научными программами. Работа проводилась с 2009 по 2013 г.г. в соответствии с планом научных исследований КИББ КазНЦ РАН по теме «Молекулярные механизмы антиоксидантной защиты растительных клеток» (государственный регистрационный № 01201357062). Исследования автора, как руководителя и исполнителя, поддержаны грантами РФФИ, ВНШ, ФЦП, FEBS. Научные положения и выводы диссертации базируются на результатах собственных исследований автора.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались автором на Российской школе молодых ученых «Актуальные проблемы современной биохимии и молекулярной биологии» (Казань, Россия, 2010); всероссийском симпозиуме «Растение и стресс» (Москва, Россия, 2010); третьем международном симпозиуме «Клеточная сигнализация у растений», (Казань, Россия, 2011); VII съезде физиологов растений России «Физиология растений — фундаментальная основа эколопш и инновационных биотехнологий (Нижний Новгород, Россия, 2011); международной конференции FEBS «Plant organellar signaling from algae to higher plants» (Примоштен, Хорватия, 2011); международной конференции ЕМВО «Autohagy in health and disease» (Ma'ale Hachamisha, Израиль, 2011); 10-ой международной конференции «Reactive oxygen and nitrogen species in plants» (Будапешт, Венгрия, 2011); международной конференции «Programmed cell death in biology and medicine» (Москва, Россия, 2012); итоговых конференциях КИББ КазНЦ РАН (2010,2011); международной конференции «South African Association of Botanists» (Дракенсберг, ЮАР, 2013); международном симпозиуме «Oxidative stress and cell death in plants: Mechanisms and implication» (Флоренция, Италия, 2013); 11-ой международной конференции «Reactive oxygen and nitrogen species in plants» (Варшава, Польша, 2013); международном симпозиуме «Молекулярные аспекты редокс-метаболизма растений» (Казань, Россия, 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 23 работы, из которых 2 статьи в рецензируемых изданиях, рекомендуемых ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложения. В работе представлено 5 таблиц, 38 рисунков. Список литературы включает 272 источников, в том числе, 257 - иностранных.

1. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1.1. Объекты исследований. В качестве объекта исследований использовали кончики корней (0,6-0,8 см) проростков яровой пшеницы (Triticum aestímm L.) сорта Казанская Юбилейная. Растения выращивали на 0,25 мМ СаС12 при температуре +22° С и освещенности 100 Вт/м2 с 12 ч фотопериодом в течение 4 суток. Затем растения перемещали на исследуемые растворы и выдерживали в течение 3-12 ч.

1.2. Определение содержания Нг02, уровня ПОЛ, протеазной активности, жизнеспособности. Содержание Н202 определяли в растворимой фракции гомогената с использованием ксиленола оранжевого (X = 560 нм). Концентрацию Н202 рассчитывали по калибровочной кривой. Интенсивность ПОЛ определяли в растворимой фракции гомогената по содержанию продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) (X = 560 нм). Уровень ПОЛ выражали в процентах, за 100% принимали количество ТБК-прореагировавших продуктов, содержащихся в клетках исходных корней. Жизнеспособность клеток определяли с помощью 0,25 % красителя Эванса синего (Baker, Mock, 1994). Общую протеазную активность измеряли в растворимой фракции гомогената с использованием азоказеина (X = 330 нм; Battelli et al., 2011).

1.3. Конфокальная и электронная микроскопия. Продольные срезы кончика корня окрашивали следующими флуоресцентными красителями: для детекции АФК - 20 мкМ 2',7'-Dichlorofluorescin diacetate (DCFDA, Sigma, X-áb 504 нм/ 529 нм), для визуализации аутофагосом - 1 мкМ LysoTracker Red DND 99 (LT, Invitrogen, ХлЪ Sil нм 1 Xcm 590 нм), для оценки жизнеспособности клеток — 0,0002 % йодидом пропидия (PI, Sigma, 537 нм/Я^, 617нм). Флуоресценцию клеток в зоне растяжения корня регистрировали с помощью конфокального микроскопа LSM 510 МЕТА (Zeiss, Germany). Ультраструктуру клеток паренхимы центрального цилиндра анализировали с помощью электронного микроскопа Jem 1200ЕХ (Jeol, Japan) по методу, описанному ранее (Пономарева, Полыгалова, 2012).

1.4. ОТ-ПЦР в реальном времени. Все праймеры и флуоресцентные зонды синтезировали в НПО «Синтол» (Москва). Тотальную РНК выделяли с помощью реагента TRIzol. Реакцию обратной транскрипции (ОТ) проводили в амплификаторе DNA Engine thermocycler (BioRad, USA) в реакционной смеси, содержащей 1 мкМ 01igo(dT)¡5 праймеров, а также 100 ед. обратной транскриптазы M-MuLV (Fermentas). Накопление ПЦР продуктов оценивали по эмиссии зонда TaqMan с помощью амплификатора с оптическим модулем ICycler IQ-4 (Bio-Rad, USA,). Для оценки изменения экспрессии генов использовали сравнительный метод (Pfaffl, 2001). В качестве референтного гена был использован ген фактора АДФ-рибозилирования (Paolacci et al., 2009).

1.5. Выделение ДНК растений и клонирование гена TaATG8g. Геномную ДНК пшеницы выделяли с помощью набора DNeasy Plant Maxi Kit (Qiagen) согласно протоколу производителя. Элекгрофоретическое разделение ДНК проводили в 1 % агарозном геле в горизонтальной камере SE-1 (Helicon, Russia) при напряжении 5-10

В/см. ПЦР проводили в амплификаторе С100°™ Thermal Cycler (Bio-Rad, USA). ПЦР-фрагменты очищали с помощью набора AxyPrep™ PCR Cleanup Kit (Axygen Biosciences) и встраивали в вектор pGEM-T Easy (Promega). Нуклеотидные последовательности ДНК определяли с помощью ДНК-анализатора 3130 Genetic Analyser (Applied Biosystems, USA).

1.6. Получение и очистка рекомбинантного белка. Тотальную РНК выделяли с помощью RNeasy mini kit (Qiagen). Реакцию ОТ проводили с использованием набора Mint (Евроген). ПЦР проводили в амплификаторе С100°™ Thermal Cycler. Для получения рекомбинантного белка кодирующую последовательность TaATG8g встраивали в экспрессирующий вектор рЕТ-51Ъ(+) Ek/LIC (Novagen), реципиентами которого служили клетки штаммов Е. coli NovaBlue и BL21 (DE3) pLysS (Novagen). Индукцию синтеза белка проводили путем инкубации культуры клеток с 0,5 мМ изопропил-ß-D-1 -тиогалактопиранозидом. Очистку рекомбинантного белка осуществляли методами металлоаффинной хроматографии в денатурирующих условиях и гель-фильтрации в хроматографической системе BioLogic LP (Bio-Rad, USA). Белок элюировали 20 мМ Na-фосфатным буфером, pH 7,5, содержащим 300 мМ NaCl, 0,5 M мочевины, 1 % глицерин и 300 мМ имидазола. Степень чистоты и молекулярную массу белка определяли электрофоретически в 15 % полиакриламидном геле по методу Laemmli (1970). Для подтверждения наработки рекомбинантного белка ATG8 в системе Е. coli проводили вестерн-блот анализ с применением специфичного антитела Anti-ATG8A (Abeam).

1.7. ИК-спектроскопия. Измерения были выполнены на ИК-спектрофотометре IR-Affintyl (Shimadzu, Japan) с разрешением 4 см'1, количество сканов 256. Отнесение компонент проводили на основе работ (Susi, Byler, 1986; Dong et al., 1992). Белковые образцы переводили в буфер, приготовленный на D20.

1.8. ЯМР-спектроскопия. Спектры ЯМР 'H-15N-HSQC регистрировали на спектрометре Avance III 600 МГц (Bruker, Germany) с TXI датчиком 5 мм, оснащенным градиентной катушкой. Для обработки спектров и их последующей визуализации применялись программы Sparky.

1.9. Биоинформатический анализ. Поиск и сравнение гомологичных последовательностей поводили с помощью программы BLAST на сервере NCBI. Подбор праймеров, трансляцию и выравнивание последовательностей, определение расчетной массы предсказанного белка выполняли с помощью программы Vector NTI Suite 9. Поиск мотивов выполняли с помощью сервера MEME Suit. Предсказание вторичной и третичной структуры проводили с помощью сервера I-TASSER. Компьютерное моделирование пространственной структуры выполняли с помощью программы PyMol.

1.10. Статистическая обработка. Все опыты проводили не менее чем в 4-х биологических и аналитических повторностях. В таблицах и на рисунках данные представлены в виде среднеарифметических значений и их стандартных отклонений. Статистическую обработку результатов проводили с использованием ¿-критерия Стьюдента при Р < 0,05.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 2.1. Стресс-индуцированная аутофагия в корнях проростков пшеницы. 2.1.1. Активация аутофагии при окислительном стрессе. С целью индуцирования окислительного стресса в настоящей работе был использован «классический» прооксидант паракват. Токсичекое действие параквата (100 мкМ) на интактные корни проростков пшеницы в течение 12 ч приводило к накоплению АФК, небольшому повышению протеазной активности и гибели части клеток (рис. 1, табл. 1).

Рис. 1. Визуализация АФК в клетках корней пшеницы с помощью ОСТОА: а - контроль, б - Пк (100 мкМ). Масштабный отрезок - 50 мкм.

Таблица 1. Содержание Н2Ог, общая протеазная активность и жизнеспособность клеток при действии параквата (100 мкМ)

Варианты Содержание Н202, мкМ/мг сыр. в. Общая протеазная активность, (АЬз/мкг/мин)* 10"6 Количество живых клеток, % от контроля

Контроль 4,7 ± 1,2 3,9 ± 0,7 100 ±0

Пк 7,7 ±3,1 4,4 ± 0,1 79 ±7

Кроме того, нами обнаружено, что паракват индуцирует аутофагию, характеризующуюся образованием многочисленных аутофагосом (рис. 2 б). Аутофагосомы визуализировали как интенсивно окрашенные яркие точечные образования, локализованные по всему объему клетки. С целью выяснения, является ли образование аутофагосом следствием окислительного стресса, корни были предварительно обработаны тироном - ловушкой супероксидного анион-радикала. Предобработка растений пшеницы тироном способствовала значительному уменьшению количества аутофагосом при действии параквата (рис. 2 в-г). Специфичность окрашивания аутофагосом мы подтвердили с помощью ингибитора аутофагии 3-метиладенина (3-МА). Как известно, 3-МА ингибирует фосфатидилинозитол-киназную активность, подавляя, тем самым, развитие аутофагии (ЕЛоттааЛ е1 а1., 1997). При совместном действии Пк и 3-МА образования аутофагосом не наблюдалось (рис. 2 д-е).

Рис. 2. Визуализация аутофагосом (показаны стрелками) в клетках корней пшеницы: а - контроль, б - Пк (100 мкМ), в - тирон (10 мМ); г - тирон + ПК, д - 3-МА (10 мМ), е - 3-МА + Пк. Масштабный отрезок - 50 мкм.

контроль ЮОмкМПк

Рис. 3. Уровень экспрессии генов TaATG4 и TaATG8g при действии Пк (100 мкМ).

Формирование аутофагосом обеспечивается активностью многочисленных ATG белков. Белки ATG4 и ATG8 являются важнейшими компонентами убиквитин-подобного комплекса, необходимого для образования аутофагосомальных мембран (Mizushima, 2006). С помощью ОТ-ПЦР анализа нами было обнаружено образование транскриптов генов TaATG4 и TaATG8g у нестрессированных растений (рис. 3). Конститутивный уровень экспрессии ATG генов, по-видимому, необходим для поддержания клеточного гомеостаза растений в процессе их роста и развития. Оценка относительного уровня транскриптов этих генов в условиях окислительного стресса выявила повышение экспрессии исследуемых генов в несколько раз (рис. 3). Усиление экспрессии ATG4 и ATG8g генов в условиях окислительного стресса, вероятно, обусловлено недостаточностью исходного пула их мРНК и необходимостью синтеза de novo. Таким образом, наши данные подтверждают, что в растениях АФК индуцируют аутофагию.

2.1.2. Индукция аутофагии при раневом стрессе. Раневой стресс, индуцированный различными биотическими и абиотическими факторами, является одним из распространенных стрессов в растениях. Как известно, одной из универсальных стрессовых реакций растительных клеток, в том числе при поранении, является усиленное образование АФК (Минибаева и др., 1997). В настоящей работе показано, что уже через 2 ч после поранения корней, индуцированного их отсечением от проростков и инкубацией в 0,25 мМ СаС12, в клетках происходит образование многочисленных аутофагосом (рис. 4). Проведенный нами анализ динамики раневого стресса в отсеченных корнях пшеницы выявил зависимость между накоплением АФК и формированием аутофагосом. На начальном этапе раневого стресса (первые 2 ч) визуализировано образование АФК в апопласте и наличие небольшого количества

аутофагосом в цитозоле клеток корней (рис. 4). В течение 6-12 ч инкубации отсеченных корней накопления АФК не наблюдалось (рис. 4), что согласуется с полученными ранее данными о фазовом характере образования АФК при раневом стрессе (МниЬауеуа е! а1., 1998). Длительная инкубация отсеченных корней в течение 24 и 48 ч сопровождалась массивным образованием АФК внутри клетки, накоплением аутофагосом и гибелью большого количества клеток, о чем свидетельствует появление РЬпозитивных клеток (рис. 4). При исследовании динамики экспрессии генов ТаАТС4 и ТаАЮ8 с помощью ПЦР в реальном времени мы наблюдали значительное (в 6-9 раз) повышение уровня их экспрессии в 24-48 ч инкубации отсеченных корней (рис. 5).

Оч 2ч 6ч 24 ч

< а и. и а

а Н И В

51

Рис. 4. Визуализация АФК (ОСРОА), аутофагосом (ЬТ) и мертвых клеток (Р1) в отсеченных корнях пшеницы. Масштабный отрезок - 50 мкм.

Рис. 5. Динамика

экспрессии генов ТаАЮ4 и TaATG8g при раневом стрессе.

0 2 6 12 24 48

Время воздействия, ч

Таким образом, наши данные впервые продемонстрировали индукцию аутофагии в растениях при раневом стрессе. Анализ раневого ответа корней во временной динамике позволил нам выявить двойственную роль аутофагии при стрессе. На начальном этапе раневого стресса образование аутофагосом, вероятно, является составной частью стрессового ответа. На данном этапе аутофагия играет роль защитного механизма для обезвреживания и деградации окисленных макромолекул и поврежденных органелл. В условиях длительной инкубации отсеченных корней накопление АФК и окисленных структур, недостаток питательных элементов в изолированном органе сопровождаются усиленной аутофагической деградацией. Вероятно, что аутофагия при избыточном накоплении повреждений приводит к масштабной деградации внутриклеточного содержимого, что вызывает клеточную гибель. Таким образом, аутофагия находится на перекрестке между выживанием и гибелью клеток, и в зависимости от степени повреждения клеток и физиологического состояния организма она является либо защитным механизмом, либо способом гибели клеток.

2.1.3. Активация аутофагии при действии ингибиторов ЭТЦ митохондрий.

Как известно, в нефотосинтезирующей растительной клетке основным сайтом генерации АФК является ЭТЦ митохондрий (Rasmusson et al., 2004). В этой связи, важным представляется изучение взаимосвязи между митохондриальным редокс-метаболизмом и индукцией аутофагии. Использование ингибиторов митохондриальной цепи позволяет оценить вклад определенного компонента ЭТЦ в активность митохондрий и образование АФК. В настоящей работе мы использовали следующие ингибиторы митохондриальных комплексов: 50 мкМ ротенон (комплекс I), 10 мкМ малонат (комплекс II), 1 мкМ антимицин А (комплекс III), 100 мкМ KCN (комплекс IV), а также ингибитор альтернативной оксидазы (АО) - 100 мкМ салицилгидроксамовая кислота (SHAM). Применение ингибиторов ЭТЦ митохондрий в течение 3 ч приводило к различным изменениям содержания Н202 и уровня ПОЛ (табл. 2). Так, применение ингибитора комплекса I ротенона не приводило к изменению редокс-с.татуса клеток. Отсутствие эффекта ротенона может быть связано с работой ротенон-нечувствительных NADH и NAD(P)H дегидрогеназ, локализованных с наружной и внутренней стороны внутренней мембраны митохондрий и передающих электроны на убихинон (M0ller, 2001). При действии малоната, антимицина А и цианида калия содержание Н202 и уровень ПОЛ были высокими (табл. 2). Наиболее яркий эффект проявлялся при блокировании комплекса III ЭТЦ с помощью антимицина А, что согласуется с данными литературы (Han et al., 2001; Morel et al., 2009). При одновременном блокировании основного и альтернативного пути переноса электронов происходило еще большее повышение содержания АФК, увеличение интенсивности ПОЛ и падение жизнеспособности клеток (табл. 2), что свидетельствует об антиоксидантной и цитопротекторной роли АО в стрессовых условиях.

Таким образом, нарушение работы ЭТЦ с помощью митохондриальных ядов приводит к накоплению АФК и способствует проявлению их токсических эффектов, приводящих, в результате, к гибели клеток. Полученные нами данные о значительном усилении токсических эффектов при одновременном блокировании основного и альтернативного пути передачи электронов подтверждают значимость АО в расширении адаптивных возможностей растительного организма при стрессе.

Таблица 2. Содержание Н202, уровень ПОЛ и жизнеспособность клеток при действии ингибиторов ЭТЦ митохондрий

Варианты Содержание Н202, мкМ/мг сыр. в. ПОЛ, % Количество живых клеток, % от контроля

Контроль 3,7 ± 0,9 99 ±9 97 ± 12

Ротенон 4,5 ± 0,6 111 ± 10 96 ± 15

Малонат 10,9 ±0,1 117 ± 7 89 ± 18

Антимицин А 16,4 ±0,8 157 ±7 68 ± 19

KCN 8,9 ± 0,6 124 ±13 84 ± 17

SHAM 5,1 ± 0,9 148 ±10 96 ± 14

SHAM + Ротенон 5,9 ± 0,6 137 ± 9 92 ± 19

SHAM + Малонат 12,6 ±0,1 154 ±8 74 ± 17

SHAM + Антимицин А 17,7 ±0,8 167 ± 10 59 ± 19

SHAM + KCN 11,2 ±0,6 124 ± 11 77 ± 18

о •«". • \ ч.,-'" } V . . ~с ; 1—I 59 pm ' в < " ■ 1—1 50 |ш) д # '/' y/.v' / Т h 50 pm ■ ,► ж ' - - -'Av ¿L, -V 50 pm > И Ш x; '*K'A 1—1 50 ЦФ

б Г - 50 pm \ е V Л" '' ' .' 1 г?* i 50pm ' '¿"Vi''' •* ■'iit 50 (jm к , A r . 50 pm • \ • v

Рис. 6. Визуализация аутофагосом в клетках корней пшеницы при действии ингибиторов ЭТЦ митохондрий. На рисунке: а - контроль, б - SHAM, в - ротенон, г -ротенон + SHAM, д - малонат, е -малонат +SHAM, ж - антимицин А, з - антимицин А + SHAM , и - KCN, к - KCN + SHAM. Масштабный отрезок - 50 мкм.

Известно, что митохондрии как основные АФК-образующие органеллы могут выступать в качестве триггера аутофагии в клетках животных (Scherz-Shouval, Elazar, 2007). До настоящего времени роль митохондрий в индукции аутофагии в клетках растений оставалась неизученной. В настоящей работе возможность вовлечения митохондрий в индукцию аутофагии в растениях была проанализирована при нарушении работы ЭТЦ митохондрий. Применение ингибиторов комплексов I, II и IV основной ЭТЦ в течение 3 ч не индуцировало образования аутофагосом в клетках корней (рис. 6 в,д,и). Однако при совместном ингибировании АО и комплексов I, II или IV наблюдали многочисленные аутофагосомы (рис. 6 г,е,к) и повышение уровня экспрессии генов TaATG4 и TaATG8g (данные представлены в диссертации). Наиболее интенсивное образование аутофагосом детектировали при блокировании комплекса III с помощью антимицина А как в отсутствие, так и в присутствии SHAM (рис. 6 ж-з).

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что митохондрии растительных клеток вовлечены в процесс аутофагии. Нарушение работы митохондриальной ЭТЦ сопровождается повышением уровня АФК и ПОЛ, что, в свою очередь, индуцирует аутофагию. Переносчики ЭТЦ митохондрий вносят различный вклад в продукцию АФК. Обнаружено, что степень окислительного стресса, как правило, соотносится с интенсивностью образования аутофагосом (табл. 2, рис. 6). Комплекс III является основным митохондриальным источником АФК и, по-видимому, играет решающую роль в активации аутофагии. Участие альтернативного пути транспорта электронов в контроле уровня АФК в митохондриях предполагает вовлечение АО в регуляцию аутофагии у растений.

2.1.4. Стадии образования аутофагосом. Образование аутофагосом в клетках растений представляет собой многоэтапный и многокомпонентный процесс, подобно тому, как это происходит в клетках других эукариотических организмов. Нами были выявлены следующие стадии образования аутофагосом в клетках корней пшеницы: везикулярная нуклеация, экспансия аутофагосомы, созревание аутофагосомы, слияние с вакуолью, деградация аутофагического тела (рис. 7).

Начальный этап формирования аутофагосомы начинается с обособления подлежащего удалению участка внутриклеточного содержимого мембраной, по форме напоминающей чашевидную структуру (рис. 7 а), которую называют фагофором (Seglen, 1987) или изолирующей мембраной (Locke et al., 1975; Yamamoto et al., 1990). Нами обнаружено, что шероховатый эндоплазматический ретикулум (ЭР) локализуется вблизи аутофагосомальной мембраны, причем, каналы ЭР окружают фагофор как снаружи, так и внутри (рис. 7 а-б). Примечательно, что такое «параллельное» расположение ЭР снаружи и внутри фагофора наблюдается на ранних (но не на поздних) стадиях образования аутофагосомы (рис. 7 а-б). Эти факты свидетельствуют о том, что в растительных клетках, подобно клеткам животных, ЭР может быть вовлечен в инициацию формирования аутофагосом.

Формирование «зрелой» аутофагосомы (рис. 7 в) происходит после расширения и «схлопывания» фагофора (рис. 7 б). Мы обнаружили, что аутофагосомы могут содержать различные органеллы: митохондрии, шероховатый ЭР, а также фрагменты цитоплазмы с рибосомами (рис. 7 в-г). В дальнейшем аутофагосомы доставляются в вакуоль, при этом их наружная мембрана сливается с тонопластом (рис. 7 г). Содержимое аутофагосомы, окруженное внутренней мембраной, образует так называемое «аутофагическое тело» (рис. 7 Э), которое в дальнейшем подвергается деградации внутри вакуоли (ВазвИат, 2009). Известно, однако, что деградация аутофагосомального содержимого может происходить и в самих аутофагосомах, поскольку они содержат гидролитические ферменты (Така1зика й а!., 2011). В наших экспериментах при действии на корни прооксидантов наряду с аутофагосомами, содержащими полупереваренные фрагменты, мы также наблюдали появление одномембранных электронно-прозрачных вакуолей (рис. 7 г). Таким образом, в ходе аутофагии деградация клеточного содержимого, вероятно, может осуществляться как путем слияния аутофагосом с центральной литической вакуолью, так и в аутофагосомах, локализованных в цитозоле.

Рис. 7. Стадии образования аутофагосом: а -нуклеация фагофора, б - экспансия фагофора, в - зрелая аутофагосома, г - слияние с вакуолью, д -аутофагическое тело. КС - клеточная стенка, ЦВ -центральная вакуоль, В - вакуоль, Мт - митохондрия, ЭР - эндоплазматический ретикулум, АГ - аппарат Гольджи, Аф - аутофагосома, АТ - аутофагическое тело. Стрелками показаны каналы шероховатого ЭР, выстилающие фагофор, треугольником - наружная и внутренняя мембрана фагофора.

2.2. Характеристика структуры аутофагического белка ATG8g пшеницы.

2.2.1. Особенности первичной структуры белка 7яATG8g. Формирование аутофагосом на этапах ее созревания обеспечивается активностью белка АТ08. Этот белок часто используют в качестве молекулярного маркера для мониторинга макроаутофагии (КаЬеуа е1 а!., 2000). Биоинформатический анализ первичной структуры белка 7aATG8g (рис. 8) показал, что Г<яАТ08£ является низкомолекулярным белком (13,5 кДа) из суперсемейства убиквитиновых белков. Белок консервативен среди эукариот и имеет 76 % идентичности с АТС8 5. сегеУ1я1ае. Основу первичной последовательности составляет убиквитиновый домен ОАВАЯАР (Р6-Оц7). На С-конце белка между аминокислотами Оц7 и Зц8 находится сайт разрезания, которое осуществляет белок АТ04. Глициновый остаток в этом положении высококонсервативен и обнаруживается в структуре всех изоформ семейства АТС8. Белок ГaATG8g обладает АТ07-связывающим сайтом (А37, Р80, Бщ), а также сайтом связывания с тубулином (К7, СЬб, Аго-Ягь К-гз-Езд), что косвенно указывает на взаимосвязь аутофагосомы с цитоскелетом.

1_¿0_20_30_40_¿0_¿0_¿0_30_¿0_100_119

MÄKTCFKTEHPLERRQAESARIREKYADRIPVIVEKADKSDVPEIDKKKYLVPADLTVGQFVYVVRKRIKLSPEKAIFVFVMSTLPPTASLMSAIYEENKDEDGFLYMTYSGENTFGSA

W-сайт 133 N F| ï8 f °]\ V5 L5 Y50 К49 L-сайт V64 L56F61 I 1 1 1 F105 С

Г;5 Убиквитиновый домен 6ABARAP

1 1 1 К7 Q16 А2(| R23 Д37 1 F80 1 S111 ^ 119

Тубулин - связывающий сайт АТб7-свяэывак>щий сайт

Рис. 8. Схема первичной структуры белка 7aATG8g.

На основе множественного выравнивания аминокислотных последовательностей белков семейства ATG8 различных представителей в структуре 7aATG8g нами были обнаружены W- и L-сайты, которые необходимы для взаимодействия ATG8 с различными лигандами. К таким лигандам относят белки ATG3 и ATG4, осуществляющие посттрансляционную модификацию ATG8, а также целый ряд белков, опосредующих селективную аутофагию (Nöda et al., 2010). W-сайт 7aATG8g состоит из аминокислот E]s, 122, Рзь 1зз, К49, L5b L-сайт включает Y50, V52, Р53, L56, F6, и V64 (рис. 8). С помощью сервера MEME Suit в аминокислотных последовательностях белков 7aATG4a-b мы обнаружили мотив WQIL (рис. 9) -потенциальный AIM-мотив связывания с белком 7aATG8g. Кроме того, наличие кислых аминокислот в положении Х_3, Х_2, X_i (в данном случае это аминокислоты EDE) и гидрофобной аминокислоты в положении Х2 (в данном случае аминокислота I) необходимо для дополнительного взаимодействия с белком ATG8 (рис. 9). Интересным представляется тот факт, что белок ATG4 является цистеиновой

Name

Hs clathrin HC_ NP_004850.1 ScATG19_ EEU08864.1 HsNix_ AAD03589.1

{TaATG4a_ AGW81779.1 TaATG4b_ AGW81780.1 Hs calreticulin_ AAB51176.1 Hsp62_ AAA59990.1

start p-value Sites

1150 8.28е-06 1ШШИН WESL ЖХЬаМЙККК

412 8.28е-0б DGDDNEKALT WEEL

36 3.10е-05 LPPPAGLNSS WVEL PMNSSNGNDN

483 3.396-05 DGSGETGEDE WQIL

481 3.39е-05 DGSGETGEDE WQIL

219 8.40е-05 KDPDASKPED WDER iKIDDPTDSK

209 1.15е-03 GKSSMRDKAK EEEL IKGGDPKYAH

X л\\ \:[

Рис. 9. Выявление AIM-мотива (выделен рамкой) в белках 7aATG4a-b с помощью выравнивания последовательностей белков с использованием МЕМЕ Suit.

протеазой и на данный момент является единственным известным редокс-регулируемым ATG белком (Scherz-Shouval et al., 2007).

Наличие в структуре белка 7aATG8g консервативных последовательностей подтверждает его принадлежность к семейству ATG8 убиквитиновых белков и может свидетельствовать о его связи с элементами цитоскелета и белками, вовлеченными в аутофагию.

2.2.2. Клонирование и секвенирование экзон-интронной

последовательности гена TaATG8g. До настоящего времени информация о локализации и структуре генов, кодирующих белки семейства ATG8 пшеницы, отсутствует. С этой целью нами была проведена работа по выявлению и определению нуклеотидной последовательности экзон-интронной области гена TaATG8g. Используя в качестве матрицы геномную ДНК и праймеры, которые сконструированы на 5'- и 3'-концевые участки кодирующей области гена TaATG8g, нами было обнаружено образование нескольких ПЦР-фрагментов, два из которых являлись высокомолекулярными. Один из ПЦР-фрагментов был встроен в вектор pGEM-T Easy, после чего определили его нуклеотидную последовательность.

В результате сопоставления идентифицированной нами последовательности (1948 п.н.) с кодирующей последовательностью (360 п.н.) нами обнаружено, что ген TaATG8g состоит из пяти экзонов и четырех интронов (рис. 10). Анализ идентифицированной последовательности выявил, что этот ген соответствует структуре гомологичных генов семейства ATG8 растений.

Рис. 10. Схема структуры гена TaATG8g. Прямоугольниками показаны экзоны, линией - интроны. Цифры указывают на длину экзона/интрона, п.н.

2.2.3. Получение и очистка рекомбинантного белка 7aATG8g. На основе нуклеотидных последовательностей (GenBank No: FJ750848.1 и AF542187.1) были сконструированы Ek/LIC праймеры, комплементарные 5'- и З'-концам кодирующей области гена TaATG8 и содержащие вспомогательные последовательности, комплементарные одноцепочечным концам вектора. С помощью ПЦР был получен продукт с молекулярной массой 360 п.н., который с использованием технологии безлигазного клонирования был встроен в вектор для экспрессии pET-51b(+) Ek/LIC, после чего секвенирован. Клонированная нами последовательность была идентифицирована как TaATG8g. Белок TaATG8g экспрессировали в бактериальной системе Е. coli. Вестерн-блот анализ с применением специфичного антитела Anti-ATG8A подтвердил получение целевого белка. В дальнейшем белок подвергался двойной очистке с помощью металлоаффинной хроматографии и гель-фильтрации. Было обнаружено, что белок 7aATG8g подвергается агрегации, что сопровождается выпадением его в осадок. Для получения стабильного нативного белка были протестированы различные агенты и условия (данные представлены в диссертации). Наилучшие результаты были достигнуты при использовании Na-фосфатного буфера (20 мМ, pH 7,5), содержащего 300 мМ NaCl, 1 % глицерин и 500 мМ мочевины при концентрации белка 2-2,5 мг/мл.

2.2.4. Пространственная структура белка 7aATG8g. Уникальные свойства и функциональное многообразие белка АТ08 во многом определяются его пространственной структурой. Однако до настоящего времени в литературе не было ни одной работы, посвященной полной расшифровке трехмерной организации белков АТС8 в растениях. В связи с этим, изучение особенностей третичной структуры и физико-химических свойств TaATG8g представляется целесообразным. Результаты ИК-спектроскопии свидетельствуют, что рекомбинантный белок 7aATG8g содержит

значительную долю

упорядоченной вторичной Таблица 3. Содержание элементов вторичной структуры (41 Содержание

структуры (в %) белка 7аАТС8ё, определенное с а_спиралей составило 23 %, помощью ИК-спектроскопии и сервера ЬТАББЕЯ структур - 18 % (табл. 3). В то

же время быстрый Н-Б обмен пептидных групп белка, практически завершившийся за время эксперимента, указывает на то, что третичная структура белка довольно подвижна по сравнению с глобулярными белками близкой массы (лизоцим, РНКаза А, миоглобин).

Тип структуры ИК-спектроскопия I-TASSER

а-спирали 23 23-28

ß-структура 18 11-15

ß-повороты 17 -

агрегационная ß-структура 9 -

неупорядоченная структура 33 -

Нами был проведен сравнительный анализ полученных экспериментальных данных по вторичной структуре ГаАТ08§ и результатов, предсказанных с помощью сервера Г-ТАБЗЕК. В целом, экспериментальные данные согласуются с предсказанными расчетными результатами, однако содержание Р-структуры несколько различается (табл. 3). Такое расхождение, вероятно, обусловлено тем, что при компьютерном анализе учитывается статистическая вероятность нахождения того или иного аминокислотного остатка в структуре определенного типа. Кроме того, расхождение экспериментальных и предсказанных данных может быть обусловлено нестабильностью белка и, вследствие этого, наложением поглощения не только мономерного, но и частично агрегированного белка в ИК-спектре. Действительно, при сравнении ИК-спекгров белка в растворе и осадке после центрифугирования агрегированного белка было обнаружено, что агрегация белка 7aATG8g сопровождается уменьшением относительного содержания а-спиралей и повышением доли (З-структуры.

Результаты одномерного ('Н) и двумерного ('Н-'Н-ГГОЕЗУ) ЯМР-анализа (данные представлены в диссертации) свидетельствуют, что для белка 7aATG8g характерно наличие химического обмена, который может быть обусловлен внутримолекулярной подвижностью отдельных участков белка и процессом его олигомеризации и/или агрегации.

С целью дальнейшего изучения особенностей пространственной структуры нами был получен рекомбинантный белок 7aATG8g> обогащенный изотопом 15М. В 'Н-15!^-Ш(ЗС спектре образца, содержащего стабилизирующие агенты (1% глицерин и 500 мМ мочевину), мы обнаружили 127 пиков из 147 ожидаемых (рис. 11). Дисперсия пиков, наблюдаемая в спектре, характерна для структурированного белка (рис. 11). В спектре присутствуют сигналы с химическими сдвигами больше 9 ррт, что характерно для Р-структур, и менее 7 ррт, что, как правило, соответствует а-спиралям. Для спектра 'Н-'5М-Н5С>С характерна некоторая неоднородность интенсивности сигналов (рис. 11). В нем присутствуют как интенсивные и узкие сигналы, обычно

обусловленные наличием

подвижных, несвернутых Т\Г- и С-концов, так и уширенные сигналы с низкой аплитудой. Известно, что уширение сигналов характерно для аминокислот, вовлеченных в обменный процесс между

Рис. 11. ['Н-15^ ИБС^С спектр рекомбинантного белка ГяАТ08^ 25 °С.

различными конформационными состояниями белка и/или различными агрегатами белка в растворе. По данным литературы, белок ATG8 S. cereviciae может находиться в закрытой и открытой конформации. Показано, что в комплексе с лигандом белок ATG8 становится более стабильным, что связано с ограничением подвижности а2 спирали, которая участвует в межмолекулярных взаимодействиях (Kumeta et al., 2010).

Таким образом, анализ структурной организации 2aATG8g указывает на то, что этот белок характеризуется значительной долей упорядоченной вторичной структуры. Дисперсия пиков, наблюдаемых в ЯМР-спектрах, свидетельствует о фолдинге и хорошей структурированности белка. Полученные результаты указывают также на высокую структурную подвижность белка 7aATG8g, что, вероятно, обуславливает его функционирование при межмолекулярном распознавании и взаимодействии с функциональными лигандами при формировании аутофагосом. Такая структурная особенность характерна и для других аутофагических белков данного семейства (Chae et al., 2005; Kumeta et al., 2010).

2.2.5. Трехмерная модель белка 7uATG8g. С помощью сервера I-TASSER и программы PyMol нами была построена модель трехмерной структуры белка 7aATG8g. В целом, сконструированная трехмерная модель белка TaATG8g (рис. 12 а) продемонстрировала классическую трехмерную структуру белков семейства ATG8 (Paz et al., 2000; Stangler et al., 2002; Kumeta et al., 2010). Структура 7aATG8g включает в себя четыре а-спирали и четыре р-слоя. С-терминальный (убиквитиновый) домен TaATG&g состоит из сложенных вчетверо центральных р-листов, из которых два центральных Р-листа параллельны друг другу (01, 04) и два наружных Р-листа (Р2, 03)

- антипараллельны центральным листам. Между этими листами лежат две а-спирали (аЗ и а4). Кроме С-терминального домена, белок 7aATG8g обладает двумя дополнительными а-спиралями на N-конце белка (al и а2) (рис. 12 а).

ATG8 способен взаимодействовать с различными белками. Большинство белок-белковых взаимодействий осуществляется, в основном, посредством образования комплекса между аминокислотами WXXL-сайта белка ATG8 и AIM-мотива белка-рецептора (Noda et al., 2010).

Рис. 12. (а) Модель трехмерной структуры белка 7aATG8g. Красным цветом обозначены а-спирали, синим - 0-слои, белым -неупорядоченная структура; (б) Иллюстрация W-сайта (зеленый) и L-сайта (оранжевый) на поверхности белка 7aATG8g.

Нами обнаружено, что WXXL-аминокислоты конформационно сближены (рис. 12 б) и формируют на поверхности белка 7aATG8g два гидрофобных кармана. W-сайт белка 7iiATG8g локализован между а2 и ß2, L-сайт - между ß2 и аЗ.

Таким образом, сконструированная нами трехмерная модель белка 7aATG8g продемонстрировала классическую трехмерную структуру, характерную для белков семейства ATG8. Наличие в структуре этого белка множественных мотивов, необходимых для взаимодействия с лигандами, свидетельствует о том, что 7aATG8g обладает характеристиками, необходимыми для его вовлечения в биогенез аутофагосомальных мембран.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время изучение физиологической роли аутофагии при стрессе является одной из актуальных проблем биологии, поскольку в зависимости от степени повреждения клеток этот процесс может способствовать либо выживанию, либо гибели клеток (Baehrecke, 2005). Результаты настоящей работы продемонстрировали, что в клетках растений индукция аутофагии, сопровождающаяся образованием аутофагосом и усилением экспрессии аутофагических генов, происходит при действии стрессовых факторов, прямо или опосредованно влияющих на редокс-статус клеток. Так, активация аутофагии наблюдается при действии типичного прооксиданта параквата и при раневом стрессе. Кроме того, нами обнаружено, что митохондрии как основные АФК-образующие органеллы вовлечены в редокс-регуляцию аутофагии в клетках растений (Minibayeva et al., 2012). По нашим данным, комплекс III митохондриальной ЭТЦ вносит наиболее значительный вклад, по сравнению с другими переносчиками, в образование АФК и формирование аутофагосом. Другой возможный механизм, контролирующий аутофагию, осуществляется посредством альтернативной оксидазы митохондрий. Об этом свидетельствуют данные наших экспериментов по одновременному ингибированию основной и альтернативной ЭТЦ в митохондриях. Таким образом, комплекс III митохондриальной ЭТЦ и альтернативную оксидазу можно рассматривать как механизмы митохондриальной регуляции аутофагии у растений.

Нами показана двойственная роль аутофагии при стрессе. Так, анализ раневого ответа корней во временной динамике выявил, что на ранних этапах повышение уровня АФК сопровождается образованием аутофагосом, однако не приводит к гибели клеток. Можно полагать, в начальную фазу стресса аутофагия играет роль защитного и антиоксидантного механизма, вследствие эффективного удаления образовавшихся окисленных макромолекул. Однако при длительном воздействии стрессового фактора и избыточном накоплении повреждений происходит масштабная аутофагическая деградация внутриклеточного содержимого, что, в свою очередь, приводит к гибели клеток. Таким образом, аутофагию можно рассматривать как компонент стрессового ответа растительных клеток. В зависимости от степени повреждения клеток и

физиологического состояния организма аутофагия является либо защитным механизмом, либо способом гибели клеток.

«Белым пятном» в исследовании аутофагии в клетках растений до настоящего времени являлись морфологические характеристики стадий формирования аутофагосом. С помощью ультраструктурного анализа нами были идентифицированы и охарактеризованы основные этапы формирования аутофагосом. Одной из дискутируемых в настоящее время проблем аутофагии является вопрос о происхождении аутофагосомальных мембран. Нами обнаружено, что в растительных клетках, подобно клеткам животных, эндоплазматический ретикулум вовлечен в инициацию формирования аутофагосом.

Формирование аутофагосом на различных этапах обеспечивается активностью многочисленных ATG белков, среди которых особую роль играет белок ATG8 -молекулярный маркер макроаутофагии (Kabeya et al., 2000). Обнаруженная в наших экспериментах стимуляция экспрессии гена TaATG8g может свидетельствовать о его вовлечении в регуляцию стресс-индуцированной аутофагии в корнях пшеницы. Сконструированная нами трехмерная модель белка 7aATG8g продемонстрировала классическую трехмерную структуру, характерную для белков семейства ATG8. Учитывая полученные нами экспериментальные данные с помощью ИК- и ЯМР-спектроскопии о значительной доле упорядоченной вторичной структуры, фолдинге и высокой подвижности белка 7aATG8g и in silico данные о наличии в структуре этого белка можественных мотивов, необходимых для взаимодействия с лигандами, можно полагать, что 7VjATG8g обладает характеристиками, необходимыми для его вовлечения в биогенез аутофагосомальных мембран. Полученные результаты открывают новые возможности в исследованиях молекулярных механизмов аутофагии в клетках растений.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что в клетках корней пшеницы активные формы кислорода индуцируют аутофагию. Образование аутофагосом при действии прооксиданта параквата предотвращается антиоксидантом тироном и ингибитором аутофагии 3-метиладенином.

2. Впервые показана индукция аутофагии в растениях при раневом стрессе. Начальный этап раневого стресса (2 ч) характеризуется незначительным увеличением содержания АФК и появлением аутофагосом. При длительной инкубации отсеченных корней (24 и 48 ч) масштабное накопление АФК и образование аутофагосом сопровождаются гибелью части клеток.

3. Впервые показано, что нарушение работы основной и альтернативной митохондриальной ЭТЦ растений приводит к индукции аутофагии. Блокирование комплекса III с помощью антимицина А является наиболее эффективным митохондриальным индуктором окислительного стресса и аутофагии.

4. Впервые идентифицированы и охарактеризованы основные последовательные этапы образования аутофагосом в растительных клетках.

5. Выявлено, что ген TaATG8g состоит из пяти экзонов и четырех интронов. В условиях окислительного стресса происходит повышение уровня экспрессии генов TaATG4 и Та A TG8g, что свидетельствует о вовлечении этих генов в регуляцию аутофагии.

6. Показано, что белок 7<xATG8g имеет значительную долю упорядоченной вторичной структуры (41 %). Дисперсия пиков, наблюдаемая в спектре ['H-15N]-HSQC, свидетельствует о наличии хорошо структурированного белка.

7. Созданная трехмерная модель белка 7aATG8g продемонстрировала классическую пространственную структуру, характерную для белков семейства ATG8. In silico данные выявили наличие в структуре 7aATG8g множественных сайтов его взаимодействия с лигандами. Обнаружено, что 7aATG8g обладает характеристиками, необходимыми для вовлечения этого белка в биогенез аугофагосомальных мембран.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи, опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК

1. Дмитриева, С. А. Эффекты окислительного стресса на ультраструктуру и функциональную активность митохондрий in vivo / С.А. Дмитриева, А.А. Пономарева, В.В. Рябовол, Ф.В. Минибаева // Биологические мембраны. - 2012. - Т. 29. - № 4 - С 267275.

2. Minibayeva, F. Oxidative stress-induced autophagy in plants: The role of mitochondria / F. Minibayeva, S. Dmitrieva, A. Ponomareva, V. Ryabovol // Plant Physiology and Biochemistry. -20I2.-V.59.-P.9-11.

Работы, опубликованные в материалах научных мероприятий

1. Рябовол, В.В. Индукция аутофагии в клетках корней пшеницы в условиях окислительного стресса / В.В. Рябовол, А .А. Пономарева, Ф.В. Минибаева // Всероссийский симпозиум «Растение и стресс»: тезисы докладов. - Москва, 2010. - С. 305-306.

2. Рябовол, ВЗ. АФК-индуцируемая аутофагия в клетках корней пшеницы. / В.В. Рябовол, А.А. Пономарева, Ф.В. Минибаева // Российская конференция «Актуальные проблемы современной биохимии и молекулярной биологии»: тезисы докладов. - Казань 2010.-С. 51.

3. Minibayeva, F.V. Oxidative stress-induced autophagy in wheat roots: the role of mitochondria / F.V. Minibayeva, S.A. Dmitrieva, V.V. Ryabovol, A.A. Ponomareva // 10th International conference on reactive oxygen and nitrogen species in plants: Book of abstracts. -Budapest, Hungary, 2011. - P. 118.

4. Ryabovol, V. Redox regulated autophagic proteins ATG4 and ATG8 in Triticum aestivum roots / V. Ryabovol, A. Ponomareva, Y. Gogolev, F. Minibayeva // FEBS workshop «Plant organella! signaling from algae to higher plants»: Book of abstracts. - Primosten, Croatia 2011 - P 113.

5. Minibayeva, F. Oxidative stress-induced autophagy in wheat roots: a case study of mitophagy / F. Minibayeva, S. Dmitrieva, V. Ryabovol, A. Ponomareva // EMBO conference series «Autohagy in health and disease»: Book of abstracts. - Ma'ale Hachamisha, Israel, 2011. — P. 94.

6. Ryabovol, V. Oxidative stress induces autophagosome formation in wheat roots / V. Ryabovol, A. Ponomareva, Y. Gogolev, F. Minibayeva // EMBO conference series «Autohagy in health and disease»: Book of abstracts. - Ma'ale Hachamisha, Israel, 2011.-P. 99.

7. Дмитриева, C.A. Митофагия как защитная реакция клетки в условиях окислительного стресса / С.А. Дмитриева, А.А. Пономарева, В.В. Рябовол, Ф.В. Минибаева // Третий международный симпозиум «Клеточная сигнализация у растений»: тезисы докладов. — Казань,2011.-С. 50-51.

8. Минибаева Ф.В. Окислительный стресс и аутофагия в растительных клетках / Ф.В. Минибаева, В.В. Рябовол, С.А. Дмитриева, А.А. Пономарева // Третий международный симпозиум «Клеточная сигнализация у растений»: тезисы докладов. - Казань, 2011. - С. 110111.

9. Рябовол, В.В. Окислительный стресс как индуктор аутофагической гибели клеток корней пшеницы / В.В. Рябовол, А.А. Пономарева, Ф.В. Минибаева // Третий международный симпозиум «Клеточная сигнализация у растений»: тезисы докладов. — Казань, 2011.-С. 161-162.

10. Пономарева, А.А. Ультраструктурные изменения в клетках корней пшеницы при индукции аугофагии активными формами кислорода / А.А. Пономарева, В.В. Рябовол, Ф.В. Минибаева // Третий международный симпозиум «Клеточная сигнализация у растений»: тезисы докладов. - Казань, 2011.-С. 144-145.

11. Дмитриева, С.А. Блокирование митохондриального транспорта электронов индуцирует аутофагию в растительных клетках / С.А. Дмитриева, А.А. Пономарева, Ф.В. Минибаева, В.В. Рябовол // VII съезд Общества физиологов растений России «Физиология растений — фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий»: материалы докладов в двух частях. - Нижний Новгород, 2011. - Ч. 1. - С. 214-215.

12. Рябовол, В.В. Редокс регулируемые аутофагические белки Triticum aestivum L. / В.В. Рябовол, Ю.В. Гоголев, Ф.В. Минибаева // VII съезд Общества физиологов растений России «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий»: материалы докладов в двух частях. - Нижний Новгород, 2011. - Ч. 2. - С. 600-601.

13. Minibayeva, F. Autophagic cell death in plants induced by mitochondrial poisons / F. Minibayeva, S. Dmitrieva, V. Ryabovol, A. Ponomareva // International Conference «Programmed Cell Death in Biology and Medicine»: Book of abstracts. — Moscow, 2012. — P. 39.

14. Ryabovol, V. Autophagic cell death in wheat seedlings in response to oxidative stress / V. Ryabovol, A. Ponomareva, F. Minibayeva // International Conference «Programmed Cell Death in Biology and Medicine»: Book of abstracts. - Moscow, 2012. - P. 43.

15. Ryabovol, V. Oxidative stress-induced autophagosome formation and expression of ATG4 and ATG8 genes in wheat plants / V. Ryabovol, F. Minibayeva // SEB plant symposium «Oxidative stress and cell death in plants: Mechanisms and implication»: Book of abstracts. - Florence, Italy, 2013.-P. 48.

16. Minibayeva F. Oxidative stress- and wounding-induced autophagy in Triticum aestivum roots / F. Minibayeva, V. Ryabovol, A. Ponomareva, S. Dmitrieva // SEB plant symposium «Oxidative stress and cell death in plants: Mechanisms and implication»: Book of abstracts - Florence, Italy, 2013.-P. 47.

17. Minibayeva, F. Oxidative stress induced autophagic cell death in plants / F. Minibayeva, V. Ryabovol, A. Ponomareva, S. Dmitrieva, A. Sulkamayeva // 11th International POG conference «Reactive oxygen and nitrogen species in plants»: Book of abstract. — Warsaw, Poland, 2013. — P. 184.

18. Minibayeva, F. Oxidative stress-induced autophagy in wheat seedlings / F. Minibayeva, V. Ryabovol, A. Ponomareva // 39th Annual conference «South African Association of Botanists»: Book of abstract. - Drakensberg, South Africa, 2013. - P. 83.

19. Рябовол, B.B. Аутофагический белок TaATG8: идентификация гена, анализ экспрессии, характеристика структуры / В.В. Рябовол, Д.А. Файзуллин, Ю.Ф. Зуев, Ф.В. Минибаева // Первый международный симпозиум «Молекулярные аспекты редокс-метаболизма растений»: тезисы докладов. - Казань, 2013. — С. 82.

20. Дмитриева, С.А. АФК-индуцируемая митофагия в клетках растений при блокировании электрон-транспортной цепи митохондрий / С.А. Дмитриева, А.А. Пономарева, В.В. Рябовол, Ф.В. Минибаева // Первый международный симпозиум «Молекулярные аспекты редокс-метаболизма растений»: тезисы докладов. — Казань, 2013. — С. 29.

21. Пономарева, А.А. Морфологические характеристики аутофагии в клетках корней пшеницы в условиях окислительного стресса / А.А. Пономарева, В.В. Рябовол, С.А. Дмитриева, Ф.В. Минибаева // Первый международный симпозиум «Молекулярные аспекты редокс-метаболизма растений»: тезисы докладов. - Казань, 2013. - С. 48.

Подписано в печать 22.11.2013. Форм. бум. 60x84 1/16. Печ. л. 1,5. Тираж 100. Заказ № 2211/2. Отпечатано с готового оригинал — макета в типографии «Вестфалика» (ИП Колесов В.Н.) 420111, г. Казань, ул. Московская, 22. Тел.: 292-98-92 e-mail: westfaIika@inbox.ru