Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика микросомных и изолированных форм цитохрома семейства Р-4501 из микросом печени мышей

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Характеристика микросомных и изолированных форм цитохрома семейства Р-4501 из микросом печени мышей"

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СССР СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ

На правах рукописи Дужак Татьяна Григорьевна

ХАРАКТЕРИСТИКА МИКРОСОМНЫХ И ИЗОЛИРОВАННЫХ ФОРМ ЦИТОХРОМА СЕМЕЙСТВА Р-4501 ИЗ МИКРОСОМ ПЕЧЕНИ МЫШЕЙ.

Специальность 03.00.04. - Биохимия Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Новосибирск - 1990

Работа выполнена в Иституте клинической и экспериментальной медицины СО АМН СССР.

Научный руководитель - доктор биологических наук

Цырлов И. Б.

Оффициальные оппоненты: доктор биологических наук

Ягужгаский Л С.

кандидат биологических наук Усынин И. Ф.

Ведущая организация: Всесоюзный Онкологический научный

центр АМН СССР, Институт канцерогенеза

.на заседании Специализированного совета К 001.37.01 в Новосибирском институте биохимии СО АМН СССР по адресу 630117, Нэвосибирск-117, ух ак. Тимакова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биохимии СО АМН СССР.

Защита состоится

/

Автореферат разослан

" П " 1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук Филатова Т. Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы: Возрастающая потребность в оценке влияния химических соединений на здоровье человека делает весьма актуальной задачу исследования ферментных систем, вовлеченных в биотрансформацию поступающих в организм ксенобиотиков. Функции инактивации химических веществ и метаболической активации через формирование из ксенобиотиков более реактивных продуктов несет на себе монооксмгеназная система, локализованная в мембранах зндоплазматического ре-тикулума клеток печени и других тканей. Проблемы токсифика-ции находятся в центре внимания, так как реактивные метаболиты инициируют репродуктивные аномалии, иммунопатологии, тератогенные и канцерогенные эффекты в тканах.

С проблемами токсификации тесно связаны эффекты индукторов МХ-типа ( полициклические ароматические углеводороды, полихлорированные бифенилы, нафтофлавоны ) и индуцируемые ими активности цитохромов Р-4501А1 и Р-4501А2 ( №Ьег1 е1 а1., 1987 ). Традиционным подходом в изучении роли форм ци-тохрома Р-450 в процессах биотрансформации ксенобиотиков является исследование гемопротеидов в изолированном из мик-росомальной мембраны состоянии. Это позволяет установить функциональные характеристики ферментов, охарактеризовать их физико-химические свойства и оценить вклад различных форм цитохрома Р-450 в метаболические процессы, происходящие в тканях.

На сегодняшний день достаточно полно охарактеризованы изолированные цитохромы семейства Р-4501 из печени крыс индуцированных ПАУ ( Биег^еПсЬ еЬ а1. , 1982, Иуап а1. , 1980, КтгаЬага еЬ а1. ,1984, Гуляева и др. 1985 ). Это позволило ряду авторов применить полученные функциональные характеристики изолированных .цитохромов Р-4501А1 и Р-4501А2 крыс для экстрополяции ряда параметров на процессы, катализируемые .монооксигеназной системой печени человека. В то же время не был проведен сравнительный анализ характеристик гомологичных форм цитохромов семейства Р-4501 и их функционирования в микросомной монооксигеназной системе у различных видов животных. Важность подобного анализа обус-

ловлена, во-первых, необходимостью подбора корректной модельной системы на животных, позволяющей экстраполировать полученные данные на функционирование цитохромов семейства Р-4501 в печени человека. Во-вторых, это важно для оценки участия гомологичных ПАУ-индуцируемых форм цитохрома Р-450 в процессах токсификации у различных видов животных.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было получение форм цитохрома семейства Р-4501 из печени мышей, индуцированных 3,4-бензпиреном, характеристика физико-химических и каталитических свойств изолированных ферментов, проведение сравнительного анализа полученных и имеющихся в литературе данных для гомологичных цитохромов семейства Р-4501 крыс и мышей, а также выяснение роли этих • форм гемопротеида в химически инициируемом канцерогенезе.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

а) разработать методы хроматографической очистки форм цитохрома Р-450 из печени ПАУ-индуцированных мышей и получить изолированные ферменты;

б) изучить физико-химические и каталитические свойства изолированных цитохромов Р1-450 и РЗ-450;

в) провести сравнительный анализ физико-химических и каталитических свойств изолированных цитохромов Р-4501А1 и Р-4501А2 из печени крыс и мышей;

г) на основании иммуноингибиторного анализа оценить вклад цитохромов Р-4501А1 и Р-4501А2 крыс и мышей в метаболизм таких специфических субстратов, как 7-этоксирезоруфин (7-ЭР) и 3,4-бензпирен (БП) в микросомах печени индуцированных животных;

д) оценить количество цитохромов семейства Р-4501 в микросомах печени мышей и их метаболическую активность при длительном введении Ш.

Научная новизна работы. В работе предложена оригинальная процедура хроматографической очистки форм цитохрома семейства Р-4501 из печени БП-индуцированных шшей в гомогенном состоянии, позволяющая получать изолированный цитохром РЗ-450 без потери им метаболической активности.

.В работе впервые определены каталитическая активность и спектральные свойства изолированных цитохромов Р1-450 и РЗ-450.

С помощью иммуноингибиторного анализа впервые показана разная субстратная специфичность гомологичных форм цитохро-мов Р-4Ь01Л1 (PI-450 И Р-450с) и P-450IA2 ( РЗ-450 И P-450d) крыс и мышей, соответственно.

Практи•ческая з н ачимост ь. Работа представляет собой экспериментальное исследование физико-химических и каталитических свойств изолированных и микросомальных форм цитохро-ма семейства P-450I мышей и носит преимущественно теоретический характер. Значимость ее заключается в получении новых фактов о субстратной специфичности гомологичных форм цитохрома Р-4501AI и P-450IA2 крыс и мышей по отношению к 7-ЭР и ЕЕ Проведенный сравнительный анализ характеристик каталитической активности гомологичных цитохромов семейства P-450I крыс и мышей имеет значение при решении вопроса о возможности использования грызунов как "модельной" системы отражающей процессы биотрансформации ксенобиотиков у человека.

Разработанный метод получения каталитически активных форм цитохрома Р-450 из печени ПАУ-индуцированных мышей в настоящее время используется в лабораториях СО АМН СССР при изучении микросомной монооксигеназной системы.

Работа выполнена в рамках Всесоюзной программы "Гид-роксилаза" в соответствии с плановой темой, утвержденной Государственным комитетом СССР по науке и технике ( N государственной регистрации 79040821 ).

Апробация работы. Материалы диссертации были' представлены на III Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и охрана окружающей среды" ( Новосибсрск, 1987 ), на II Международном симпозиуме "Ферментные системы и метаболизм химических веществ" ( Болгария, 1989 J, на III Европейском симпозиуме "Метаболизм чужеродных соединений" ( Лондон,198S ) Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ. Структура и объем диссертации. Работа изложена на 145 страницах, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части: описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы из 186 наименований, содержит 4 таблицы и 16 рисунков.

- б -МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В экспериментах были использованы крысы самцы Вистар массой 150-200 гр, мыиш линии С57В1/6 и DBA/2 весом 20-25 гр.

Индукторы микросомных монооксигеназ вводили внут-рибрю шинно: БП ежедневно в течении 3 дней ( 80 мг на кг веса ) в подсолнечном масле, фенобарбитал (ФБ) ежедневно в течении 4 дней ( 80 мг на кг веса ) в физиологическом растворе. Контролем служили животные, получавшие растительное масло или физиологический раствор. В экспериментах моделирующих химически индуцируемый канцерогенез БП вводили мышам в дозе 0,04 мг на животное с интервалом в 14 дней.

Микросомную фракцию выделяли методом дифференциального центрифугирования.

Определение белка в микросомах и препаратах цитохрома Р-450 проводили методом Лоури с соавт. ( Lowry et al., 1951 ). Определение количества цитохрома Р-450 проводили по методу Омура и Сато ( Omura & Sato, 1964 ). Электрофоретичес-кое разделение микросомальных белков и форм цитохрома Р-450 проводилось по методу Лэммли ( Laemmli, 1970 ) с использованием градиентного ( 7-15 % ) и гомогенного ( 7,5 % ) по-диакриламидного геля.

Изолированные формы цитохрома Р-450 из микросом печени крыс индуцированных 3-метилхолантреном (МХ) или БП, а также из микросом печени мышей, индуцированных ФБ, получали методом Генгрича и Мартин ( Guengerich & Martin, 1980 ) с модификациями ( Гуляева и др., 1985, Мишин и др. , 1988 ).

Для очистки форм цитохрома Р-450 из печени мышей индуцированных ПАУ было предложено использовать на первом этапе Октил-сефарозу CL-4B (Октил-сефароза). Цитохром-со-держащую фракцию подвергали далее хроматографии на Ватман ДЕ 52 в буфере, содержащем 10 мМ калий/фосфата рН 7, 4, 0,1 мМ ЭДТА, 10 мМ меркаптоэтанола (МЭ), 20 % глицерина, 0, 5 % холата натрия и 0,2 % Эмульгена 911 (буферный раствор 1). Элюцию осуществляли линейным градиентом соли (0-0, 25 М NaCl). На третьем этапе, цитохром-содержащую фракцию диа-лизовали в буфере, содержащем 5 мМ калий/фосфата рН 7,4, 10 мМ МЭ, 20 % глицерина, 0,2 % Эмульгена 911 (буферный раст-

вор 2) и наносили на колонку с гидроксилапатитом (ГАП). Формы цитохрома Р-450 элюировались ступенчатым градиентом (45, 80, 130, 200 мМ) калий/фосфата в буферном растворе 2. Полученные цитохром Р1-450 и РЗ-450 рехроматографировали на ГАПе. Цитохром РЗ-450 элюировали 200 мМ калий/фосфатным буфером рН 7,4, содержащем 0, 8 X холат натрия (буферный раствор 3).

Антитела к изолированным формам цитохрома Р-450 получали иммунизацией беспородных кроликов, как рекомендовано Кама-таки с соавт. ( Kamataki et al. , 1976 ).

Тест двойной иммунодиффузии и иммуноистощение антител проводили по методам разработанным Томасом с соавт. ( Thomas et al. ,1977, Thomas et al. , 1979 ).

Иммуноферментный анализ проводили как рекомндовано Товби-ном ( Towbin et al., 1979 ).

Скорость гидроксилирования БП определяли в соответствии с методом, разработанным Цырловым и Ляховичем ( Цырлов, Ля-хович, 1979 ) с использованием в качестве стандарта 3-ОН-БП Скорость О-деэтилирования 7-ЭР определялась спект-рофлуориметрически по методу Бурке с соавт. ( Prough, Burke et al., 1978 ). Реконструкцию НАДФН-зависимой монооксиге-назной системы в растворе проводили по методу Лу и Веста ( Lu & Vest, 1978 ) с использованием изолированных форм цитохрома Р-450 ( 0,1-0,03 нмоль/мл ) и НАДФН-цитохром Р-450 редуктазы ( 0,2-0,6 ед/мл ) в присутствии синтетического дилаураилфосфатидилхолина ( 20 мкг/мл ).

Ингибирование монооксигеназных реакций, как в реконструированной, так и в микросомной системах проводилось в соответствии с рекомендациями Каматаки ( Kamataki et al., 1976 ).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Получение изолированных форм цитохрома Р-450 из печени мышей, индуцированных ПАУ.

Для изучения физико-химических и каталитических свойств цитохромов Р1-450 и РЗ-450, данные ферменты были получены в изолированном виде из печени мышей индуцирован-

- и -

ных ПАУ. Хроматографическая очистка включала 4 этапа ( Ок-тил-сефарозу , Ватман ДЕ 52 и две хроматографии на ГАПе ). Предложенный ранее Негиши с Нибертом ( Иее15|и & ИеЬегЬ, 1979 ) метод выделения цитохромов Р-4501 не удовлетворял нас-ввиду низкой очистки получаемых ферментов. На первом

ст -1 г з ^

;м ооо - —

Рис. 1. Электрофорез микросом печени мышей и фракций цитохрома Р-450 на этапах хроматографической очистки.

1 - микросомы печени контрольных мышей (20 мкг),

2 - микросомы печени БП-индуцированных мышей,

3 - солюбилиэированные микросомы печени индуцированных мышей, 4 - цитохром-содержащая фракция, элюированная с Октил-сефарозы СЬ-4В, 5 - цитохром -содержащая фракция, элюированная с Ватман ДЕ 52. СТ - белки-стандарты. Слева цифрами обозначены

м. м. белковых полос.

этапе была произведена замена традиционно используемого при выделении цитохрома Р-450 сорбента 1,8-диаминооктан-ВгСИ-сефарозы 4В ( 1,8 -ДАО-сефар.оза ) на Октил-сефарозу. Это позволило, вопервых, увеличить выход цитохром-содержа-щей фракции до 60-70 X ( с 50 % ). Во-вторых, степень очистки цитохрома Р-450 на Октил-сефарозе достигает 10-12 нмоль/мг белка ( рис. 1 ) по сравнению с 6-8 нмоль/мг белка при использовании 1,8-ДАО-сефарозы.

К преимуществам Октил-сефарозы можно также отнести: большую емкость сорбента - 15 мг белка на 1 мл сорбента, высокую скорость элюции - 100-150 мл/час. На следующем этапе очистки достигалось эффективное отделение цитохром-со-держащей фракции от примесных белков. В то же время при хроматографии на Ватман ДЕ 52 цитохром Р1-450 и РЗ-450 элю-ировались как один хроматографический пик ( Рис. 2 ) . Раз-

Рис. 2 Хроматограмма разделения форм цитохрома Р-4501 на Ватман ДЕ 52. Заштрихованная область - фракция, содержащая цитохромы Р1-450 и РЗ-450.

деление форм цитохрома Р1-450-И РЗ-450 проводилось на ГАПе. Анализ различных хроматографических процедур на ГАПе и элюируемых фракций позволил выявить оптимальные условия для разделения цитохромов Р1-450 и РЗ-450. Наиболее полное разделение достигалось при применении градиента молярности калий/фосфата в буферном растворе 2. Выход цитохрома РЗ-450 после трех хроматографических процедур состовлял в среднем 10 % от взятого в опыт микросомного цитохрома Р-450, а цитохрома Р1-450 не превышал 1 X.

- 10 -

Анализ каталитической активности в реконструированной монооксигеназной системе исследуемых хроматографических фракций цитохрома Р1-450 и РЗ-450 выявил следующее факты. Для цитохрома Р1-450 не наблюдается резких колебаний значений метаболической активности при различных условиях элюции с ГАИ Для цитохрома РЗ-450 отмечается невысокая каталитическая активность при его элюции с ГАП буферным раствором 1 и фактически полное отсутствие активности в реконструированной системе, как после диализа данной фракции ( 10 мМ калий/фосфата рН 7,4, 20 % глицерина ), так и при элюции цитохрома РЗ-450 с ГАП буферным раствором содержании один детергент. Можно было предположить, что цитохром РЗ-450 образует в отсутствии ионных детергентов конгломераты не способные эффективно метаболизировать определенные субстраты. Это предположение подтверждается данными гель-хроматографии, где м. м. фракции, содержащей цитохром РЗ-450 составляла 770 кДа. Для предотвращения образования олигомеров во все используемые буферы, начиная с Октил-сефарозы Евели 10 мМ МЭ. Кроме того, цитохром РЗ-450 рехроматографировали на ГАПе буферным раствором 3, что позволило получить данный фермент в метаболически активном состоянии.

Таким образом, предложенный метод хроматографической очистки ПАУ-индуцируемых форм цитохрома Р-450 из печени мышей позволяет получить изолированные формы цитохрома Р-450 в препаративных количествах и метаболически активном состоянии.

2. Физико-химические и каталитические свойства изолированных форм цитохрома Р-4501.

Абсолютные спектры изолированных форм цитохрома Р-450 использовались для характеристики гемопротеидов с 1973 г. ( Stern et al., 1973 ) и были определены для цитохромов Р-450с и P-450d < Табл. 1 ). В то же время подобные характеристики отсутствовали для гомологичных форм цитохрома Р-4501 из печени мышей индуцированных ПАУ. Абсолютные спектры изолированных цитохромов Р1-450 и РЗ-450 имеют отличия по максимуму абсорбции в окисленном состоянии. Цитох-' ром РЗ-450 имеет максимум абсорбции в окисленном состоянии

при 392 нм, а цитохром Р1-450 - 417 нм. Высокоспиновое состояние цитохрома РЗ-450 ( Табл. 1 ) использовалось для отслеживания элюции данного цитохрома при хроматографиях.

Так, суммарная фракция цитохрома Р1-450 и РЗ-450, элю-ируемая с Ватман ДЕ 52 имеет характерный окисленный спектр с пиком абсорбции при 417 нм и вторым пиком на 392 нм, что характерно для одновременного присутствия во фракции гемоп-ротеидов в низкоспиновом и высокоспиновом состоянии. Изолированные цитохромы Р1-450 и РЗ-450 не имеют дополнительных пиков, несоответствующих их максимуму абсорбции в окисленном состоянии. ПАА-гель электрофорез, используемый для оценки чистоты получаемых изолированных форм цитохрома Р-450 и их молекулярной массы, широко применяется для исследования микросомных препаратов. Так, денситометричбским анализом электрофореграмм индуцированных.микросом было выявлено, что при введнии ПАУ индукторов в микросомных препа-

3 ст

«и»«- 94000 «« &5 000

ООО

50 ООО

Рис. 3. Электрофорез цитохромов Р1-450 и РЗ-450 изолированных из печени мышей индуцированных БП.

1 - цитохром РЗ-450, 2 - цитохром Р1-450, 3 - микросомы из БП-индуцированной печени . мышей ( 25 мкг ). СТ - белки-стандарты. Цифрами обозначены м. м. белковых полос.

- 12 -

ратах печени мышей су щественно увеличивается количество полипептида е м. м. 55,0 кДа. При введении ФБ-индукторов -полипептида с м. м. 51 > 0 кДа. Возрастание количества полипептида, как правило, связывали с экспрессией соответствующих МХ- или ФБ-семейству форм цитохрома Р-450. В то же время изолированный цитохром Р450ФБ из печени мышей имеет м.м. по данным гель-электрофореза 54,5 кДа. Для ПАУ-индуци-рованных микросом печени мышей данные денситометрического . анализа совпадают с определенной м. м. изолированных форм цитохрома Р-4501. Цитохром Р1-450 и РЗ-450 имеют равные м.м. - 55,0 кДа ( рис. 3 ) при разгонке в градиентном ПАА-геле. В большинстве литературных источников цитохромы И-450 и РЗ-450 ( Ые^зГи & Nebeгt, 1979, Мазис1а & УаБОБЫша, 1988, Бегаиа е1 а1., 1988 ) обладают одинаковой м. м. - 55,0 кДа. Исключение составляет работа Томаса с соавт., где Вестерн-блот анализом детектировали две близко отстоящие друг от друга белковые полосы, идентифицированные антителами как цитохром Р1-450 и РЗ-450 ( ТЬотаэ еЬ а1., 1984 ). Использование гомогенного ПАА-геля в сочетании с более длительной разгонкой образцов, позволили определить молекулярную массу: цитохром Р1-450 - 55,0 кДа, цитохром РЗ-450 - 54,5 кДа.

Для определения каталитической активности изолированных форм цитохрома Р-4501 было выбрано два субстрата: БП и 7-ЭР. Еыбор субстратов был обусловлен следующим: О-дезтилирование 7-ЭР является маркерной реакцией на присутствие цитохрома Р-450с ( виепгеПсЬ et а1., 1982 ) в микросомных препаратах печени крыс. БП считается специфическим субстратом для цитохрома Р1-450 ( & ЙеЬеН, 1979 ), а гидроксилирование БП в целом, тестовой реакцией для форм цитохрома Р-4501А1 у различных млекопитающих. Из табл.1 видно, что цитохром Р-450с из печени крыс------

с высокой скоростью катализирует окисление БП и 7-ЭР. Гомологичная форма фермента из печени мышей - цитохром Р1-450 гидроксилирует БП со сравнимой скоростью образования продукта, но практически не обладает О-деэтилазной активностью. Еще более существенные различия наблюдаются у гомологичной пары: цитохромов РЗ-450 и Р-450с1. Так цитохром Р-450с1 характеризуется крайне низкой метаболической актив-

ностью по отношению к выбранным субстратам. Нйтохром РЗ-450 гидроксилирует БП со скоростью в 1,5-2,0 раза меньше выявленной для цитохромов Р-4501А1 и с высокой скоростью 0-деэ- : тилирует 7-ЭР.

Таблица 1. Основные характеристики изолированных форм цитохрома Р-4501 из печени животных индуцированных БП.

Форш цитохрома Р-450С Р-450й Р1-450 РЗ-450

Каталитическая

активность, 7-ЭР 6,0±0,02 нмоль продукта

в мин на •нмоль БП 4,2±0,03 цитохрома.

Молекулярная масса, кДа 56,0

СО-восстановленный

0,2±0,03 0,5±0,03 4,1±0,02 0,7±0,04 3,6+0,02 2,1±0#05

54,0 55,0 54,6

максимум, нм 448,0 448,0 447,5 447,5

Полученные данные подтверждаются анализом ингибйрова-ния метаболической активности с применением иммуноистощен-ных антител к цитохромам Р-450й и Р-450с [АТ Р-450сЦ-с) и АТ Р-450с(-(!)]. На рис. 4 представлены результаты ингиби{ювания реакции О-деэтилирования 7-ЭР цитохромами РЗ-450 и Р-450с. Из представленных рисунков видно, что реакция окисления 7-ЭР катализируемая цитохром РЗ-450, ингибируется почти полностью антителами к цитохрому Р-450с1 и практически не ингибируется АТ Р-450с(-1). Подобная картина ингибирования наблюдается и для цитохрома Р-450с. Полное ингибирование реакции О-деэтилирования 7-ЭР наблюдается при Инкубации с АТ Р-450с (-<!), а отсутствие ингибирования можно наблюдать при инкубации с АТ Р-450й(-с).

Таким образом, полученные характеристики изолированных форм цитохрома Р-4501 указывают на различные физико-химические и каталитические свойства цитохромов Р1-450 и

РЗ-450.

МР-ШсН-с,

ат р-тс(-с<)

нг

Рис. 4. Ингибирование 0-деэтилазной активности изолированных форм цитохрома Р-4501 в реконструированной моноок-сигеназной системе антителами к цитохромам Р-450с и р-45(М.

По оси а&цисс количество антител на 0,1 нмоль цитохрома Р-450. По оси ординат скорость оксиления 7-ЭР ( за 100 % принята скорость окисления, указанная в табл.1 ).

*-* - метаболическая активность цитохрома Р-450с.

« • - метаболическая активность цитохрома РЗ-450.

Сравнительный анализ каталитической активности гомологичных форм цитохрома Р-4501 крыс и мышей выявил существенные различия между гомологичными формами цитохрома Р-4501А1 (Р-450с и Р1-450) и Р-4501А2 (Р-450с1 и РЗ-450) по гидрокси-лированию и О-деэтилированию субстратов в реконструированой монооксигеназной системе.

3. Иммунологические свойс.тва форм цитохромов семейства Р-4501.

Получение и характеристика антител к формам цитохрома Р-450, изучение и анализ иммунологических свойств изолированных форм цитохромов Р-450 позволили разрешить ряд вопросов. В работе использовались АТ Р-450с, АТ Р-450с1,-АТ РЗ-450, а также иммуноистощенные АТ Р-450с1(-с) и АТ Р-450с(-<1). Реакцией Оухтерлони была показана полная иммунологическая идентичность гомологичных пар цитохромов Р1-450 и Р-450с, ци-

тохромов Р3-4Ь0 и Р-4й0с1. Реакцией Оухтерлони и Вестерн-блот анализом выявлено, что АТ Р-45СИ обладают большей ¡фоссреактивностью, чем антитела, полученные к цитохрому РЗ-450. Так АТ Р-450с1 образуют полосу преципитации с гетеро-логичным цитохромом Р-450с в обеих реакциях, а АТ РЗ-450 не выявляют гетерологичных форм цитохрома. Возможно это результат меньшего количества общих антигенных детерминант у

1 2 3 4

Рис. 5. Иммуноблот контрольных и индуцированных микросом печени мышей и крыс. В реакции использованы АТ Р-450с1(-с). 1 - микросомы печени контрольных мышей, 2 - цитохром РЗ-450, 3 - ФБ-индуцированные микросомы печени мышей, 4 - МХ-индуцированные микросомы печени крыс.

4

Рис. 6. Иммуноблбт изолированных форм цитохрома Р-4501 и микросомальных препаратов печени мышей. В реакции использованы АТ Р-450с. 1 - цитохром Р-450с, 2 -цитохром Р-450с1, 3 - БП-индуцированные микросомы печени мышей, 4 - цитохром РЗ-450, 5 - микросомы печени контрольных мышей, пары цитохромов Р1-450 и РЗ-450,чем у цитохромов р-450с и

Р-450с1. Отсутствие кроссреактигшооти, характеризует и имму-ноистощенные АТ Р-450с!(-с).

На рис.5 видно, что АТ Р-450с1(-с) выявляют в индуцированных микросомах печени мышей и крыс цитохром Р-4501А2. В свою очередь АТ Р-450с обладали наиболее высокой кроссреактивностью среди исследованных антител. На рис. 6 представлена картина иммуноблота изолированных форм ци-тохрома Р-450 и индуцированных микросом печени мышей. Используя именно эти антитела удалось подтвердить данные о разной электрофоретической подвижности цитохромов Р1-450 и РЗ-450. Проведенное тестирование антител на наличие или отсутствие кроссреактивности было необходимо для последующего проведения ингибиторного анализа в реконструированной и микросомальной монооксигеназной системе.

АТ Р-450

АТ РЗ-Ш

2 нг

Рис. 7. Ингибирование О-деэтилазной активности в микросомах печени прединдуцированных крыс и мышей антителами к цитохрому Р-4501А2.

По оси аСщисс количество антител на 0,1 нмоль ци-тохрома Р-450. По оси ординат скорость окисления 7-ЭР ( за 100 % принята скорость окисления в микросомах печени мышей - 12,0 нмоль. продукта в мин на мг белка , в микросомах печени крыс - 8,0 ). *-к - 0-деэтилазная активность в микросомах печени крыс,

■ • - 0-деэтилазная активность в шкросомах пече-' ни мышей.

- 17 -

На рис. 7 и рис. 8 приведены данные ингибирования реакции О-деэтилирования 7-ЭР и гидроксилирования БП в индуцированных микросомах печени крыс и мышей. Как видно из рис. 7 О-деэтилирование 7-ЭР в БП-индуцированных микросомах печени мышей ингибируется на 70-80 % АТ РЗ-450 и АТ Р-450с1(-с). В то же время эти антитела не сказывают какого-либо ингибиру-ющего влияния на реакцию окисления 7-ЭР в БП-индуцированных микросомах печени крыс. Таким образом, учитывая данные о каталитической активности в реконструированной системе ци-тохромов РЗ-450 и Р-450(1, можно утверждать, что цитохрому РЗ-450 принадлежит по крайней мере 80 % метаболизма 7-ЭР, в

50

ат р-тан)

АТ РЗ-450

50

1 с "Г 7 г нг

Рис. 8. Ингибирование гидроксилазной активности в микросомах печени прединдуцированных крыс и мышей антителами к цитохрому Р-4501А2.

По оси а(^дасс количество антител на 0,1 нмоль ци-тохрома Р-450. По оси ординат скорость гидроксилирования БП ( за 100 % принята скорость окисления в микросомах печени мышей - 6,0 нмоль продукта в мин на мг белка, в микросомах-печени крыс - 6,0 ). *-ц гидроксилазная активность в микросомах печени крыс.

. . - гидроксилазная активность в микросомах печени мышей.

то время как цитохром Р-450с1 не участвует в его биотрансформации. На рис. 8 приведены данные ингибирования АТ РЗ-450 и АТ. Р-450с!(-с) реакции гидроксилирования БП. Из представ-

-ленных графиков видно, что реакция ингибируруется на 20-25 % в микродомных препаратах печени мышей и практически не ингибируется в микросомах печени крыс.

Таким образом, данные иммуноинигибиторного анализа подтверждают факты полученные в реконструированной монооксиге-наэной системе о различной субстратной специфичности цитох-ромов семейства Р-4501 крыс и мышей.

4. Динамика изменений микросомных монооксигеназ печени мышей при длительном введении БП.

В качестве экспериментальной модели для оценки роли цитохромов семейства Р-4501 в печени животных, нами была выбрана начальная стадия БП-индуцируемого канцерогенеза у мышей. Известно, что длительное введение внутрибрюшинно БП приводит к образованию опухолей различной локализации у мышей ( Benedict et al., 1978, Ляхович и Цырлов, 1981 ). При этом у мышей, линии DBA/2 ( нечувствительных к введению ПАУ

Рис. 9. Динр' . изменения О-деэтилазной активности в микро-с- .¿"печени мышей оппозитных линий, длительное вре-V получавших БЕ

По оси абцисс дни от начала введения БП. По оси ординат скорость Одезтилирования 7-ЭР ( нмоль продукта в мин на мг белка ) в микросомах печени мышей. •———•' - микросомы печени мышей линии С57В1/6. ,______ - микросомы печени мышей линии 0ВА/2.

индукторов ) появление опухолей происходит чаще, чем у мышей линии С57В1/6 ( чувствительных ). На рис.9 представлена динамика 0-дезтилазной активности форм цитохрома Р-450 с нулевого по 90 день введения БЕ Как видно из рисунка, для мышей линии С57В1/6 наблюдается характерное для однократной индукции повышение О-дезтилазной активности на 3-4 день и последующее падение ее до контрольного уровня. К 90 дню скорость окисления возрастает в два раза

Для мышей линии DBA динамика О-деэтилирования 7-ЭР и гидроксилирования БП монооксигеназной системой, с 0 по 90 день введения практически не меняется. У мышей чувсвтиель-ной линии гидроксилирование БП не претерпевает изменений к • 90 дню, т. е. остается на контрольном уровне.

Содержание цитохромов Р1-450 и РЗ-450 у мышей линии С57В1/6 характеризуется разной динамикой при длительном введении БЕ Так количество иммунохимически определенного цитохрома Р1-450 снижается после V дня до уровня сходного' с контролем. Доля цитохрома РЗ-450 с 8 по 70 день не превышает 2-3 % от суммарного количества цитохрома Р-450 в микросомах печени мышей, но к 80 дню и дальше его содержание возрастает до 7-10 Z. У мышей линии DBA не определяются формы цитохрома P-450I с 0 па 90 день введения Ж

Таким образом, увеличение количества цитохрома РЗ-450 в микросомах печени мышей коррелирует с увеличением О-дезтилазной активности, наблюдаемой к 90 дню введения БЕ

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод выделения форм цитохрома семейства P-450I из микросом печени мышей индуцированных БП, позволяющий получать ферменты в препаративных количествах и бев потери ими каталитических свойств.

2. Для изолированных форм цитохрома P-450I показано, что цитохромы PI-450 и РЗ-450 отличаются по максимуму'абсорбции в окисленном состоянии ( 417 и 392 нм ), имеют разные м. м. ( 55,0 и 54,5 кДа ) и различные скорости метаболизма 7-этоксирезоруфина и 3,4-бензпирена.

3. йммуноингибиторным анализом было впервые показано, что цитохрому РЗ-450 прш'ацгеглт до 80 Z О-деэтилазной ак-

тивности в микросомах печени БП-индуцированных мышей, в то время как в микротомах печени индуцированных крысэта реакция практически не катализируется гомологичной формой ци-тохромом P-450d.

4. Показано,что гидроксилирование БП в микросомах печени БП-индуцированных мышей катализируется цитохромом Р1-450 и РЗ-450, и не может являться специфической реакцией на присутствие цитохрома P-450IA1 в микросомах печени мышей.

5. Выявлено, что длительное введение 3,4-бензпирена мышам линии С57В1/6 приводит к преимущественному увеличению содержания цитохрома РЗ-450 и свойственных ему ферментативных реакций.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Цырлов И. Б., Дужак Т. Г. , Ляхович В. В Кинетические харатеристики гидроксилирования 3,4-бензпирена в микросомах печени мышей У/ Биол. науки.-1987. -N. 3. -С. 30-36.

2. Дужак Т. Г. функциональная активность молекулярных форм'цитохрома Р-450 у мышей линии С57В1/6 при индукции 3,4 -бензпиреном // Тез. Докл. III Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и охрана окружающей среды" . -Новосисибирск. -1987.- С. 98.

3. Дужак Т. Г. Динамика изменений микросомных моноокеи-геназ печени мышей при длительном введении 3,4-бензпирена / / Тез. Докл. III Всесоюной конференции "Цитохром Р-450 и охрана окружающей среды".-1987.-Новосибирск.-С. 99.

4. Цырлов И. Б. , Дужак Т. Г., Часовникова О. Б. Исследование "метилхолантренового семейства" молекулярных форм цитохрома Р-450 у грызунов и человека // Тез. Докл.. III Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и охрана'окружающей среды". -1987. -С. 36.

5. Дужак Т. Г., Цырлов И. Б. Характеристика индуцированных 3,4-бензпиреном форм цитохрома Р-448, изолированных из микросом печени мышей // Биохимия. -1987. -Т. 52. -С. 214-219.

6. Дужак Т. Г. , Гуткина Н.-И., Цырлов It Б., Ляхович В. В. Сравнение форм цитохрома Р-450, индуцируемых фенобарбиталом и 1,4-бис[2-(3,5дихлорпиридилокси)]бензолом в печени мышей' И крыс // Биохимия. -1988. -Т. 53. -N. 2. -С. 188-195.

7. Duzhak Т. 6., Tsyrlov I.B. Purification and

- 21 -

functional activity of cytochrome P3-450 from

benzo(a)pyrene-induced mouse liver // In: II Symposium drug

metabolizing enzymes system, Bugaria. -1989. -P. 41.

8. Tsyrlov I. B. , Duzhak T. G. Interspecies pecularities • of hepatic cytochromes P-4501A1 and P-4501A2 in mammals // In: Metabolic and kinetic perspectives in safety assessment. Some current issues, III European symposium on forign compound metabolism, London.-1989.-P. 75.