Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика геномной организации МНС в Oreochromis niloticus

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидат биологических наук, Донгак, Роман Шивит-оолович, Тюбинген

62 12/36

Университет Тюбингена имени Эберхарда Карла

На правах рукописи

• о и

Донгак Роман Шивит-оолович

ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОМНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ МНС В

океосняомю мьоттст

Специальность 03.00.26 - «Молекулярная генетика»

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель профессор Я. Кляйн, РЬБ

Тюбинген - 2003

Содержание

I. Введение................................................................................................................1

1. Главный комплекс гистосовместимости (МНС): от трансплантации опухолей до презентации антигена........................................................................1

2. Структура молекул МНС....................................................................................4

3. Распознавание антигена и функция молекул МНС..........................................9

4. Организация генов МНС...................................................................................11

5. Геномная организация МНС: от млекопитающих до рыб............................13

6. Полиморфизм и механизмы диверсификации генов МНС...........................14

7. Классификация и географическое распространение циклидов....................23

8. Цели проекта......................................................................................................26

II. Оборудование, материалы и реагенты............................................................28

1. Объект.................................................................................................................28

2. Оборудование....................................................................................................28

3. Материалы..........................................................................................................29

3.1. Наборы...........................................................................................................30

4. Химикаты и реагенты........................................................................................30

4.1 Растворы и буферы........................................................................................31

4.2. Реагенты для полимеразной цепной реакции............................................34

4.3. Антибиотики и ферменты............................................................................34

4.4. Среды.............................................................................................................35

5. Векторы клонирования и бактериальные штаммы........................................36

III. Методы.............................................................................................................39

1. Стандартные методы.........................................................................................39

1.1. Фенол-хлороформная экстракция ДНК......................................................39

1.2. Осаждение ДНК этанолом...........................................................................39

1.3. Осаждение плазмидной ДНК изопропанолом...........................................40

1.4. Горизонтальный гель электрофорез...........................................................40

1.4.1. Разделение низкомолекулярных фрагментов ДНК..............................40

1.4.2. Разделение высокомолекулярных фрагментов ДНК...........................41

1.4.2.1. Гель электрофорез в пульсирующем поле......................................41

1.4.2.2. Длинный гель электрофорез..............................................................41

1.5. Определение содержания ДНК.....................................................................42

1.5.1. Спектрофотометрическое определение содержания ДНК....................42

1.5.2. Определение содержания ДНК с помощью бромида этидия................43

1.6. Центрифугирование.......................................................................................43

2. Ферментные методы..........................................................................................43

2.1. Рестрикция ДНК энзимами..........................................................................43

2.1.1. Рестрикция ВАС клонов Ыой для определения размера ДНК-включения..............................................................................................................43

2.1.2. Рестрикция ВАС клонов эндонуклеазой Тад! для определения числа локусов МНС.........................................................................................................44

2.1.3. Частичная рестрикция ВАС клонов.......................................................44

2.2. Реакции лигации...........................................................................................45

2.2.1. Лигация фрагментов ДНК в вектор рвЕМ-Т Базу.................................45

3. Извлечение ДНК................................................................................................46

3.1. Извлечение фрагментов ДНК из агарозной геля.......................................46

3.2. Извлечение ДНК методом щелочного лизиса...........................................46

3.3. Извлечение ДНК ВАС клонов для секвенирования..................................47

4. Полимеразная цепная реакция.........................................................................47

4.1. Амплификация полимеразной цепной реакцией и праймеры.................47

5. Трансформация бактериальных клеток...........................................................53

5.1. Приготовление химически компетентных клеток бактерий Е.соН.........53

5.2. Трансформация Е.соН штамма Ш 109.......................................................54

6. Перенос фрагментов ДНК................................................................................55

6.1. Капиллярное блоттирование фрагментов ДНК.........................................55

6.2. Точечное блоттирование колонии единственной бактерии.....................56

7. Гибридизация.....................................................................................................56

7.1. Хемилюминесцентная гибридизация.........................................................56

7.1.1. Прегибридизация.....................................................................................56

7.1.2. Гибридизация...........................................................................................57

7.1.3. Промывка после гибридизации..............................................................57

7.1.4. Авторадиография.....................................................................................57

7.2. Радиоактивная гибридизация.....................................................................58

7.2.1. Прегибридизация....................................................................................58

7.2.2. Гибридизация..........................................................................................58

7.2.3. Промывка после гибридизации.............................................................58

8. Зонды для гибридизации..................................................................................59

9. Секвенирование.................................................................................................60

9.1. Приготовление акриламидной гели для электрофореза...........................60

9.2. Реакция секвенирования..............................................................................61

9.2.1. Секвенирование продуктов ПЦР...........................................................61

9.2.2. Секвенирование концевых последовательностей ВАС клонов..........62

10. Праймеры для секвенирования......................................................................62

11. Секвенирование клона All............................................................................63

12. Анализ последовательностей ДНК................................................................63

13. Филогенетический анализ..............................................................................64

IV. Результаты........................................................................................................65

1. Извлечение ВАС клонов, содержащих гены класса I МНС..........................65

2. Извлечение ДНК класс I ВАС клонов и оценка размера ДНК включения..65

3. Число локусов класса I МНС............................................................................66

4. Извлечение ВАС клонов, содержащих класс II гены МНС с помощью

метода точечного блоттирования колонии единственной бактерии.............68

5. Число локусов класса НА и В МНС................................................................69

5.1. Гибридизация с зондами, специфичными к генам класса ПА.................70

5.2. Гибридизация с зондами, специфичными к генам класса ПВ.................71

6. Извлечение последовательностей класса ПВ МНС.......................................72

7. Извлечение последовательностей класса ПА МНС.......................................78

8. Извлечение экзонов 2, 3 и 4 генов класса I МНС...........................................82

9. Филогенетический анализ последовательностей класса I МНС...................88

10. Экспрессия генов МНС...................................................................................94

10.1. Экспрессия генов класса I МНС.................................................................94

10.2. Экспрессия генов класса ПА МНС.............................................................95

10.3. Экспрессия генов класса ПВ МНС.............................................................96

11. Конструкция кластеров клонов класса I МНС.............................................97

12. Геномная организация локусов класса I МНС.............................................98

12.1. Конструкция кластера А............................................................................98

12.2. Идентификация локусов класса I МНС....................................................99

13. Структурные характеристики геномного региона класса I МНС.............102

13.1. Распределение ОС содержания и повторяющихся элементов.............102

14. Рестрикционное картирование локусов класса II МНС............................104

14.1. Конструкция кластера А..........................................................................104

14.1.1. Неполная рестрикция ВАС клона В5..............................................105

14.1.2. Гибридизация с зондами, специфичными к концам ВАС клона

В5..........................................................................................................................106

14.1.3. Гибридизация с зондами, специфичными к локусам МНС.............107

14.1.4. Гибридизация с зондом В1Бр6............................................................109

14.2. Конструкция кластера В..........................................................................109

14.2.1. Неполная рестрикция клонов ВЗ и В13.............................................110

14.2.2. Гибридизация с зондами, специфичными к концам ВАС клона

ВЗ..........................................................................................................................110

14.2.3. Гибридизация с зондами, специфичными к локусам DKB, DAB и

DGB......................................................................................................................110

14.2.4. Гибридизация с зондами B14sp6 и B13sp6.......................................111

14.2.5. Гибридизация с зондами, специфичными к концам клона

В13........................................................................................................................113

14.2.6. Гибридизация с зондами, специфичными к локусам МНС.............114

14.3. Конструкция кластера С..........................................................................114

14.3.1. Рестрикция клонов В14 и В22............................................................115

14.3.2. Гибридизация с зондами, специфичными к концам клона

В14........................................................................................................................115

14.3.3. Гибридизация с зондами, специфичными к локусам МНС.............115

14.3.4. Гибридизация с зондами В 13sp6 и В1 lsp6.......................................116

14.3.5. Гибридизация с зондами, специфичными к концам клона В22......118

14.3.6. Гибридизация с зондами, специфичными к локусам МНС.............118

14.3.7. Гибридизация с зондами В11 sp6 и В14Т7........................................118

V. Обсуждение.....................................................................................................120

1. Область класса I МНС в О. niloticus..............................................................120

2. Новые линии генов класса IIB МНС в циклидах.........................................121

3. Эволюция генов класса II МНС в О. niloticus...............................................125

VI. Выводы.........................................................................................................127

VII. Приложение..................................................................................................128

VIII. Сокращения.................................................................................................130

IX. Литература.....................................................................................................134

I. Введение

1. Главный комплекс гистосовместимости (МНС): от трансплантации опухолей до презентации антигена

История главного комплекса гистосовместимости (МНС) начинается с начала XX в. с изучения пересадки опухолей. Первое наблюдение того, что трансплантированная опухоль не растет в генетически чужом хозяине одного и того же вида, было опубликовано Дженсеном (1903) и Лоеб (1908). Первые генетические анализы устойчивости к трансплантции опухолей были проведены Тайзером (1909) и Литтлом (1914) с использованием чистых линий мышей и их гибридов. Это привело к открытию, что число генов отвечающих за отторжение опухоли варьирует от 2 до 15 в зависимости от комбинации разных линий мыши. А природа генов, отвечающих за устойчивость к трансплантированной опухоли впервые была изучена 19361937 годах Горером (Gorer 1936; 1937). Он обнаружил, что отторжение трансплантантов опухоли сопровождается выделением антител против антигенов красных кровяных клеток, которые контролируются двумя или тремя независимо сегрегирующими генами.

В последующем, Снелл (1948) создал большое количество конгенных линий мышей, каждый из которых различался от выбранной чистой линии одним из 15 локусов, ответственных за отторжение трансплантантов опухоли. Он назвал их локусами гистосовместимости или Н-локусы, и предложил их нумеровать последовательно Н-1, Н-2, Н-3 и т.д. Тестирование конгенных линий антисывороткой Горера, содержащей антитела против одного из трех идентифицированных антигенов, вызывающих отторжение трансплантантов, выяснилось, что ген контролирующий данный антиген оказался идентичным одному из Н генов, открытых Снеллом (Gorer et al. 1948). Поэтому Горер назвал его антигеном «II», а локус гистосовместимости был обозначен Н2.

Тестирование конгенных линий показало, что локус Н2 был особенным среди локусов гистосовместимости по крайней мере по двум причинам. Во первых, кусочки ткани обмененные между линиями, различающимися по локусу Н2 были отторжены немного быстрее чем, у тех линий, которые отличались по любому другому Н локусу (Counce et al. 1956). Во вторых, результаты генетических экспериментов, опубликованных Снеллом в 1952 году, привели его к заключению, что Н2 не был одиночным локусом, а представлял собой группу близлежащих локусов. Первое из двух его наблюдений показало, что Н2 является главной причиной отторжения кусочков ткани, тогда как все другие Н локусы поодиночке имели меньший эффект. Второе наблюдение выяснило, что Н2 не был локусом, а был комплексом локусов. Скоро после этого были открыты похожие комплексы локусов гистосовместимости в других видах и все они имели разные названия. Поэтому было определено общее для всех название - главный комплекс гистосовместимости или МНС (Klein 1996).

Биологическая функция МНС долгое время оставалась неизвестной. Так как трансплантация кусочка ткани является неестественным процессом, было очевидно, что отторжение трансплантантов опухоли или нормальной ткани, не могло быть функцией МНС. Открытие того, что отторжение чужеродной ткани является формой иммунного ответа (Gorer 1937; Gibson & Medawar 1943) намекало на то, что природная функция МНС имеет отношение к иммунитету. Однако делать даже догадки о том, какое именно отношение имеет, было в то время невозможно. Однако, неопровержимые подтверждения физиологической роли были представлены тремя независимыми наблюдениями.

Первое доказательство было получено в результате изучения генетического контроля иммунного ответа. В 60-х годах группа исследователей во главе с В. Бенасерраф с одной стороны и Н. О. Макдевит с другой, открыли, что существуют различия в количестве антител

вырабатываемых различными чистыми линиями гвинейских свинок или мышей, иммунизированных простым антигеном, синтезированным искусственно из нескольких аминокислот (Levine et al. 1963; McDevitt & Sela 1965). Во многих случаях, иммунный ответ контролировался главным образом одним локусом, который в мыши был назван иммунный ответ 1 или Ir-1. В мышах иммунный ответ коррелировал с типом Н2, которые эти линии имели (McDevitt & Chinitz 1969) и действительно, ген Ir-1 был картирован в комплексе Н2 (McDevitt et al. 1972).

Второе подтверждение по функции МНС было получено при изучении иммунного ответа на введение вируса лимфоцитарного хориоменингита (LCM) в головной мозг мышей. Частью ответа была выработка цитотоксических Т-лимфоцитов, которые атаковали инфицированные клетки хозяина. Уничтожение инфицированных клеток можно показать in vitro, смешивая лимфоциты, взятые из инфицированного хозяина с соответствующими инфицированными клетками-мишенями. Полагая, что ответ на заражение вирусом LCM должно контролироваться МНС, подобно ответу на простой синтетический антиген, Петер С. Дохерти и Рольф М. Зинкернагель в 1974 году продемонстрировали, что для того чтобы клетки мишени были уничтожены, нужна не только экспрессия на их поверхности антигена из вируса, но также нужно присутствие той же Н2 молекулы, подобно цитотоксическим клеткам. Таким образом, оказалось, что цитотоксические Т-лимфоциты имеют двойственную специфичность, одновременно опознавая компонент из вируса (чужеродный) и молекулы МНС, содержащиеся как на стимулирующих клетках, так и на клетках-мишенях (собственные; Doherty & Zinkernagel 1974; Zinkernagel & Doherty 1974).

Наконец, третье подтверждение физиологической роли МНС получено в результате изучения природы антигена, распознанного Т-лимфоцитами. В отличие от антител, которые были долгое время известны способностью

связываться с большими молекулами антигенов, будучи либо в растворе в свободном виде, либо в интегрированном в плазматическую мембрану клетки виде, данные о том что антигенспецифичные рецепторы Т-лимфоцитов -рецепторы Т-клеток - распознают антигены по другому, накапливались постепенно. В 1980-х годах в сериях экспериментов, проведенных в лабораториях Эмилья Р. Унани, Ховарда Грея и Алена К. Тоунсенда, было продемонстрировано, что Т-лимфоциты могут распознавать белковые антигены только после того, как они фрагментированы («процессированы») и доставлены к ним специализированными антиген-презентирующими клетками (Unanue 1981; Shimonkevitz et al. 1983; Allen et al. 1984; Townsend et all983). Природа процесса презентации антигена проясняется только после того, как стала известна третичная структура молекул МНС (Bjorkman et al. 1987). Позднее H.G. Раммензи и сотрудники показали, что короткие пептиды, образованные в результате протеолиза больших протеинов антигенов связываются со специализированными связывающими полостьями МНС. Именно данный комплекс чужеродных пептидов с молекулами МНС распознается рецепторами Т-лимфоцитов (Rötzschke et al. 1990; Falk et al. 1991). Стало ясно, что физиологической функцией молекул МНС является презентация пептидов Т-лимфоцитам, которые научились различать свои от чужих в ходе своего онтогенеза в тимусе. Связывание пептидов с МНС приводит к активации последних с последующей инициацией адаптивной формы иммунного ответа.

2. Структура молекул МНС

Молекулы МНС являются членами большой группы структурно и функционально сходных протеинов суперсе