Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Гуминовые кислоты различного генезиса
ВАК РФ 03.00.27, Почвоведение

Автореферат диссертации по теме "Гуминовые кислоты различного генезиса"

На правах рукописи

Трубецкой Олег Анатольевич

ГУМИНОВЫЕ КИСЛОТЫ РАЗЛИЧНОГО ГЕНЕЗИСА: ВЫДЕЛЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ СТАБИЛЬНЫХ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИХ ФРАКЦИЙ

Специальность 03.00.27 - почвоведение

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Пущино - 2003

Работа выполнена в Институте фундаментальных проблем биологии РАН

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Ганжара Николай Федорович

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Клёнов Борис Максимович

\

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Шарков Иван Николаевич

Ведущая организация: Тюменская государственная сельскохозяйственная академия

Защита состоится 20 июня 2003 года в 10 часов 00 минут на заседании диссертационного совета Д 003.013.01 при Институте почвоведения и агрохимии СО РАН, по адресу 630099, Новосибирск, ул. Советская 18, Институт почвоведения и агрохимии

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института почвоведения и агрохимии СО РАН

Автореферат разослан "20" мая 2003 г.

Ученый секретарь

СО РАН

диссертационного совета, доктор биологических наук

Артамонова В.С.

Актуальность проблемы.

По данным ЮНЕСКО более половины органического вещества природных экосистем нашей планеты содержится в виде гумусовых веществ (ТВ) - сложного комплекса природных органических гетерополимеров, различающихся молекулярными размерами и мономерным составом. Являясь обязательным и стабильным компонентом почв и природных вод, ГВ в значительной мере влияют на их основные физико-химические свойства и обеспечивают многие токсикопротекторные функции экосистем, связывая и инактивируя пестициды, гербициды, тяжелые металлы, полициклические углеводороды и другие поллютанты. В последнее время доказано, что ГВ, будучи самым большим природным резервуаром углерода, являются одним из

* определяющих факторов парникового эффекта и связанного с ним глобального ' потепления климата планеты.

ГВ, содержащиеся в плотных средах (почвах, донных отложениях, торфах, углях, - компостах и т.д.), разделяют на три фракции - гуминовые кислоты (ГК), растворимые в ^ щелочных и нейтральных растворах и выпадающие в осадок при рН<2, фульвокислоты 1> (ФК), растворимые как в щелочных, так и в кислых растворах, а также гумин,

нерастворимый ни в кислых, ни в щелочных растворах. ГВ, выделяемые из водных источников (морей, океанов, рек, озер, болот и т.д.), разделяют на ГК и ФК.

История изучения ГВ насчитывает два столетия, и многие вопросы, касающиеся закономерностей изменения их состава и свойств под воздействием природных и антропогенных факторов, достаточно хорошо^изучены как в России Тюриным И.В., Драгуновым С.С., Трусовым А.Г., Кононовой М.М., Александровой JI.H., Христевой Л.А., Орловым Д.С., Кауричевым И.С., Гаджиевым И.М., Комиссаровым И.Д., Ганжарой Н.Ф., Фокиным А.Д. и др., так и за рубежом Фляйгом В. (Flaig), Шнитсером М. (Schnitzer), Стевенсоном Ф. (Stevenson), Малколмом Р. (Malcolm), Фриммелем Ф. (Frimmel), Сайз-Хименесом Ц. (Saiz-Jimenez), Вершау P. (Wershaw), Джессингом Е. (Gjessing), Клавиншем M. (KlavinS) и др. Однако до сих пор не существует единого мнения о механизмах образования и принципах строения ГВ. Теоретическая разработка и экспериментальное подтверждение смысловых закономерностей в молекулярной структуре ГВ является одной из центральных задач современного физико-химического почвоведения и молекулярной экологии. t Для анализа структурных особенностей ГВ требуется применение современных

\. методов фракционирования. Получение стабильных фракций, существенно

различающихся по физико-химическим свойствам и содержащихся в различных по генезису ГВ, даёт возможность анализировать процессы гумификации на

• молекулярном уровне.

Одним из наиболее эффективных методов фракционирования природных биополимеров является электрофорез. Метод основан на разделении макромолекул по таким важнейшим параметрам как электрический заряд, размер (или молекулярная масса) и пространственная конфигурация. Рядом исследователей (Кононовой М.М., Кауричевым И.С., Степановым В.В., Пахомовым А.Н., Каспаровым C.B., Тихомировым Ф.А., Стевенсоном Ф. (Stevenson), Курветто H. (Curvetto), Ориоли Г. (Orioli), Клокинг Р. (Klöcking), Гонзалесом Н. (Gonzales) и др.) была показана принципиальная возможность электрофоретнческого разделения ГВ. Различные варианты метода были использованы в качестве теста (фингерпринга) для оценки гумусового состояния экосистем. Однако выделение и комплексное исследование электрофоретических фракций практически не проводилось.

Другим методом, широко применяемым для изучения ГВ, является эксклюзивная хроматография (гель-фильтрация или гель-проникающая хроматография), основанная на пространственном разделении молекул различных размеров с помощью пористых гелей. С появлением эксклюзивной хроматографии (ЭХ) химия ГВ несомненно получила новый, исключительно информативный и достаточно простой метод для изучения структуры и функции ГВ, пшрок^jap^^j^ ^рдссийскими учеными

! БИБЛИОТЕКА I i С. Петербург <W |

! 09 100ftmxOSf I

Александровой Л.Н., Тихомировым Ф.А., Фокиным А.Д., Карпухиным А.И., Ганжарой Н.Ф., Кауричевым И.С., Орловым Д.С., Милановским Е.Ю., Перминовой И.В. и др., так и зарубежными исследователями Джессингом Е. (Gjessing), Познером А. (Posner), Свифтом P. (Swift), Де Нобили М. (De Nobili), Бехером Г. (Becher), Пикколо A. (Piccolo) и др. Однако следует отметить, что результаты ЭХ одного и того же образца ГВ при различных хроматографических условиях часто противоречивы, а иногда взаимоисключающи. Сравнение результатов ЭХ неоднократно предпринималось с помощью электрофореза в качестве тест-системы, однако попытки обнаружить взаимосвязь между хроматографическим профилем и электрофоретяческими зонами ГВ были безуспешны.

Получение стабильных фракций ГВ, в т. ч. электрофоретических, и их глубокое и всестороннее исследование весьма актуально для изучения молекулярного строения и функции ГВ в природных экосистемах. Это позволяет установить взаимосвязь между генетическими особенностями и физико-химическими параметрами стабильных фракций ГВ, выявить механизмы образования и принципы строения ГВ. Можно с уверенностью утверждать, что от развития таких подходов во многом будет зависеть будущее физико-химического почвоведения и отдельных направлений молекулярной 'экологии.

Цели я задачи исследований.

Основными целями настоящей работы являлись:

1. Разработка хорошо воспроизводимого метода электрофореза, применимого для анализа широкого круга ГК.

2. Использование-электрофореза в сочетании с эксклюзивной хроматографией для препаративной наработки и очистки стабильных электрофоретических фракций ГК.

3. Проведение комплексного анализа электрофоретических фракций современными физико-химическими методами с последующей оценкой структурных особенностей ГК.

4. Исследование взаимосвязи физико-химических свойств и структурных особенностей электрофоретических фракций ПС с генетическими особенностями почв.

5. Использование электрофореза для оценки эффективности фракционирования ГК почв методом ультрафильтрации и мониторинга степени созревания гуминоподобных веществ в процессе компостирования органических отходов.

Эти цели потребовали решения следующих задач:

1. На основе существующих современных вариантов метода электрофореза природных биополимеров подобрать наиболее эффективные условия (тип носителя, буферная система, способ подготовки образца и т.д.) для разделения ГК на фракции с четкими и хорошо воспроизводимыми электрофоретическимн характеристиками.

2. Провести сравнительный электрофоретический анализ ГК, выделенных из -почв различного генезиса.

3. Выявить взаимосвязь между разработанным методом электрофореза и другими методами фракционирования ГК (эксклюзивной хроматографией и ультрафильтрацией).

4. Разработать условия для проведения препаративной наработки и очистки электрофоретических фракций ГК в количествах, достаточных для их исследования современными физико-химическими методами.

5. Определить весовое содержание отдельных фракций в препаратах ГК различного генезиса. Измерить спектральные характеристики фракций.

Определить качественное и количественное содержание отдельных ароматических соединений, жирных кислот и аминокислот по фракциям.

6. Выявить взаимосвязь между физико-химическими параметрами фракций в условиями почвообразования (водным режимом, биологической активностью,рН и другими).

7. Провести сравнительный электрофоретический анализ гуминоподобных веществ компостов различных сроков созревания.

Степень научной новизны. ■

В настоящем исследовании был разработан не имеющий аналогов ни в России, ни за рубежом метод электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии набора дезагрегирующих агентов (ЭПАГ), позволяющий разделять ГК из различных источников (почв и компостов) на несколько фракций с четкими и хорошо воспроизводимыми электрофоретическими характеристиками. Использование ЭПАГ в качестве тест-метода впервые позволило подобрать оптимальные условия для ЭХ на сефадексе. С помощью сочетания ЭХ-ЭПАГ впервые были наработаны препаративные количества стабильных электрофоретических фракций и обнаружено, что различные по генезису почвенные ГК отличаются по весовому содержанию фракций, что частично обусловливает различия некоторых физико-химических свойств почв.

Методы ЭПАГ и сочетание ЭХ-ЭПАГ в комплексе с новейшими физико-химическими методами впервые дали возможность выявить сходные вариации оптических свойств, аминокислотного состава и распределения жирных кислот, близкое электрофоретическое и хроматографическое поведение при переходе от высокомолекулярных фракций ГК к низкомолекулярным. Полученные закономерности служат прямым экспериментальным подтверждением общего принципа молекулярного строения почвенных ГК независимо от их генезиса.

Пиролитическая газовая хроматаграфия/масс-спектрометрия препаратов ГК и фракций, основанная на термальном гидролизе с одновременным метилированием, впервые выявила неравномерное распределение гомологов жирных кислот микробного и растительного происхождения по фракциям, что указывает на их различное биогенное происхождение.

Генетические особенности почв, в основу которых положены представления о географических факторах, условиях и закономерностях гумусообразования, позволили объяснить и связать- содержание и некоторые индивидуальные особенности электрофоретических фракций с типом гумификации и функциональной ролью ГК в почвах различного генезиса.

Защищаемые положения

Разработан оригинальный метод электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии комплекса дезагрегирующих агентов для фракционирования ГК, и показана эффективность использования метода для разделения ГК из различных источников на отдельные фракции с четкими и хорошо воспроизводимыми электрофоретическими характеристиками.

Реализована возможность препаративной наработки и очистки электрофоретических фракций ГК сочетанием разработанного метода электрофореза с эксклюзивной хроматографией (гель-фильтрацией) на сефадексе.

Современными физико-химическими методами проведен комплексный анализ стабильных электрофоретических фракций для выяснения распределения основных структурных компонентов почвенных ГК между фракциями.

Исследована взаимосвязь физико-химических свойств электрофоретических фракций ГК с генетическими особенностями почв.

Выявлены смысловые вариации и закономерности молекулярно-структурной организации, указывающие на общие на принципы строения и образования почвенных ГК.

Разработанный метод электрофореза и его сочетание с эксклюзивной хроматографией использованы для решения ряда практических задач.

Реализация результатов работы и практическая значимость.

Полученные результаты доведены до широкого круга исследователей путём публикаций и докладов на отечественных и международных конференциях и конгрессах. Метод ЭПАГ и сочетание ЭХ-ЭПАГ были использованы для решения ряда практических задач, таких как оценка эффективности фракционирования ГК почв методом ультрафильтрации и анализ процесса формирования ГК в компостах, образованных из антропогенных отходов. Метод ЭПАГ оказался эффективным для мониторинга степени созревания гуминоподобных веществ в процессе компостирования органических отходов, что позволяет рекомендовать его к внедрению как в практике научных исследований, так и в производственных условиях. Данные, полученные сочетанием ЭХ-ЭПАГ, позволяют, по крайней мере частично, решить вопрос о степени трансформации и тождественности компостных гуминоподобных веществ почвенным ГК. Учитывая обнаруженное неравномерное распределение главных структурных компонентов ГК между электрофоретическими фракциями, можно прогнозировать пути и механизмы взаимодействия ГК с различными поллютантами. Область практического применения ЭПАГ и сочетания ЭХ-ЭПАГ на этом далеко неисчерпана. Напротив, их использование создаёт основу для фундаментального усовершенствования диагностики гумусового режима в природных экосистемах и разработки методов мониторинга природных биосферных ресурсов.

АпрЫмцм работы.

Работа по теме диссертации была выполнена в Инстиуте фундаментальных проблем биологии РАН (до 1999 г. называвшемся Институтом почвоведения и фотосинтеза РАН), Филиале Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (Пущино, Россия); Институте природных ресурсов и агробиологии Испанской АН (Севилья, Испания).

Основное содержание работы и отдельные её части докладывались и обсуждались на: Vin всесоюзном съезде почвоведов (Новосибирск, Россия, 1989); конференции "Органо-минеральные взаимодействия в почвах" (Пущино, Россия, 1990); международном симпозиуме "Humus et Planta" (Прага, Чехословакия, 1991); северных симпозиумах международного общества гуминовых веществ (Турку, Финляндия, 1991; Лоен, Норвегия, 1993; Лунд, Швеция, 1995; Хаммелинна, Финляндия, 1997; Кристиансанд, Норвегия, 1999); конференциях международного общества гуминовых веществ (Бари, Италия, 1992; Вест-Индия, Тринидад и Тобаго, 1994; Вроцлав, Польша, 1996; Тулуза, Франция, 2000; Бостон, США, 2002); конференции "Эволюция почв и почвенного покрова в связи с изменениями природной среды" (Пущино, Россия, 1992); международных симпозиумах по биогеохимии окружающей среды (Саламанка, Испания, 1993; Вроцлав, Польша, 2001); международном симпозиуме по гуминовым веществам в окружающей среде (Атланта, США, 1995); международном симпозиуме по пиролизу органических соединений (Севилья, Испания, 2000); международной конференции по фотохимии (Москва, Россия, 2001); международных конгрессах почвоведов (Акапулько, Мексика, 1994; Монпелье, Франция, 1998); семинарах в лаборатории массо- и энергообмена в почвах Института почвоведения и фотосинтеза РАН и лаборатории молекулярной спектроскопии Института фундаментальных проблем биологии РАН; общеинститутских конференциях Института фундаментальных проблем биологии РАН, Института биоорганической химии РАН,

Института природных ресурсов и агробиологии Испанской АН, факультета агробиологии Университета г.Болоньи.

Ли™» «слид автора.

В цикле исследований, составляющих диссертационную работу, автору принадлежит решающая роль в выборе направления, разработке экспериментальных подходов и обобщении полученных результатов.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 73 работы (в т.ч. 12 статей в рецензируемых отечественных журналах и 23 статьи в рецензируемых международных журналах и сборниках).

Гранты по теме диссертации.

Работа по теме диссертации поддержана грантами Российского Фонда Фундаментальных Исследований (проект а-01-64666), Международного Научного Фонда (проект MU-0300), Международной ассоциации содействия сотрудничеству с учеными независимых государств бывшего Советского Союза (проект INTAS-01-0186), в которых автор являлся руководителем.

Объём и структура диссецтации.

Диссертационная работа изложена на 237 страницах и включает введение, 7 глав, заключение, 12 выводов, список литературы из 400 наименований и приложения. Работа содержит 25 рисунков, 15 таблиц и 6 диаграмм.

Глава I. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА И ЭКСКЛЮЗИВНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ ДЛЯ СТРУКТУРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ГУМУСОВЫХ ВЕЩЕСТВ.

1. Основные варианты электрофоретических методов, применяемых для фракционирования гумусовых веществ.

Электрофоретическое фракционирование основано на способности макромолекул ГВ приобретать в растворе заряд, величина и знак которого зависят от рН среды, и перемещаться (мигрировать) под действием электрического поля. Попытки электрофоретического фракционирования ГВ различного генезиса с возможной последующей идентификацией структурных компонентов электрофоретических фракций начали интенсивно предприниматься с середины 50-х годов XX столетия. Электрофорез на бумаге был одним из первых вариантов метода, применявшихся для анализа ГВ. Было обнаружено, что ГК и ФК не являются электрофоретически однородным материалом, причем одним из препятствий для их эффективного электрофоретического разделения являются межмолекулярные взаимодействия (Stevenson, 1953; Johnston, 1959; Кауричев и др., 1960; Waldron and Mortensen, 1961; Кононова и Титова, 1961; Титова, 1962; Поспишил, 1962 - полная библиография цитируемых здесь и далее в автореферате работ приведена в разделе диссертации "Литература"). По мере появления новых материалов в конце 60-х - начале 70-х гг. появляются работы по разделению ГВ методом электрофорез» в инертны* гелдт. среди которых наиболее широкое применение получил полиакриламидный гель (ПАГ). Фракционирование ГК электрофорезом в ПАГ (ЭПАГ) приводило к образованию в геле от двух до шести зон (Степанов и Пахомов, 1969; Curvetto et al., 1974,1982; Каспаров и др., 1981; De Gonzalez et al., 1981; Baxter and Malysz, 1992; De Nobili and Fomasier, 1996; Ruttinger and Dunkel, 1997), причем количество зон увеличивалось при добавлении в буфер геля мочевины (Castagnola et al., 1978,1979; De Gonzalez et al.,

1981) или додецилсульфата натрия (Klöking, 1973). Однако исследования ГВ с использованием ЭПАГ ограничивались либо приблизительной оценкой молекулярных размеров полученных электрофоретических фракций, либо сводились к фингерпринтовой (отпечатковой) характеристике исследуемых препаратов, что впрочем не снижает ценности полученных результатов. Возможно на фоне других, более простых и менее дорогостоящих методов фракционирования, таких как гель-фильтрация или ультрафильтрация, выделение и исследование электрофоретических фракций представлялось значительно более трудоемким и менее перспективным. К тому же фракции иногда занимали другое положение в ПАГ при повторных экспериментах. В 70-90 гг. для фракционирования ГВ также использовали изоэлектрофокусирование (ИЭФ). при котором разделение амфотерного исследуемого вещества в градиенте pH, создаваемом в ПАГ амфолитами-носителями, происходит в соответствии с изоэлектрическими точками фракционируемой смеси. В процессе ИЭФ поисходило разделение ГВ на многочисленные (до 20-30 полос) узкие зоны, распределяющиеся по всей области фракционирования между катодом и анодом (Сассо et al., 1974; Curvetto et al., 1974; Duxbuiy, 1975; Цыпленков, 1983; De Nobili, 1988; De Nobili et al., 1990; Govi et al., 1992; Kutsch and Schumacher, 1994; Ciavatta et al., 1996). Однако другими авторами было высказано предположение, что результаты ИЭФ скорее всего являются артефактом, т.к. ГВ в исследуемом диапазоне pH практически не амфотерны. Образующиеся многочисленные электрофоретические фракции, вероятно, обусловлены взаимодействием ГВ с амфолитами или pH-зависимой агрегацией-дезагрегацией (Thornton, 1975; Swift, 1996). Фракционирование ГВ в ПАГ с помощью изотахофореза. основанного на свойстве смеси электролитов (с общим противоионом) формировать под действием электрического поля узкие зоны ионов одного сорта, мигрирующие с равной скоростью в одинаковом направлении, не получило широкого развития из-за применения в качестве разделяющих ионов амфолитов-носителей, взаимодействующих с ГВ (Curvetto et al., 1974; Curvetto and Orioli, 1982). В последнее десятилетие для фракционирования ГВ был применен капиллярный электрофорез - новейший аналитический вариант электрофореза, использующий инструментарий высокоэффективной жидкостной хроматографии и обладающий исключительно высокой разрешающей способностью для белковых смесей. Однако картина аналитического фракционирования ГВ при использовании зонального капиллярного электрофореза (Rigol et al., 1994; Garrison et al., 1995; Pompe et al., 1996; Ciavatta et al., 1997; Schmitt-Kopplin et al., 1998; Rigol et al., 1998; Nyiraneza et al., 2000), а также капиллярного изотахофореза (KopaCek et al., 1991) мало отличалась от результатов, полученных с использованием менее дорогостоящей электрофоретической техники.

Анализ вышеописанных вариантов показал актуальность разработки простого хорошо воспроизводимого метода, позволяющего не только наблюдать сравнительную электрофоретическую картину фракционирования ГВ различного генезиса, но и в сочетании с другими методами фракционирования получать стабильные электрофоретические фракции в препаративных количествах для их дальнейшего структурного анализа.

2. Принципы н проблемы эксклюзивной хроматографии гумусовых веществ.

Метод эксклюзивной хроматографии (ЭХ), часто называемый гель-фильтрацией или молекулярно-ситовой хроматографией, основан на пространственном разделении молекул по их размерам с помощью пористых гелей. Применение ЭХ для фракционирования ГВ началось в 60-х гг. с появлением мягких пористых гелей, среда которых наиболее популярными были сефадексы (декстрановые гели). ЭХ при низком давлении на сефадексах широко использовалась как в России (Ганжара, 1969; Фокин, 1974; Каспаров и Тихомиров, 1978; Колесников, 1978; Александрова, 1980; Морозков, 1981; Орлов и Милановский, 1987 и др.), так и за рубежом (Posner, 1963; Gjessing, 1965;

Sequi et al., 1971; Cameron et al., 1972; Swift and Posner, 1971; Anderson and Hepburn, 1977; Ghosh and Schnitzer, 1980; Kuiters and Mulder, 1993 и др.). В конце 80-х гг. с появлением новых синтетических жестких пористых гелей для фракционирования ГВ стали применять высокоэ**ек™иу" «ипкостную эксклюзивную хроматографию (ВЭЖЭЮ (Becher et al., 1985; Susie and Boto, 1989; Berden and Berggren, 1990; Morrison et al., 1990; Sunda and Keiber, 1994; Hongve et al., 1996; De Nobili and Fornasier, 1996; Perminova et al., 1998; De Nobili and Chen, 1999; Varga et al., 2000; Piccolo, 2001).

Независимо от типа применяемых гелей и используемой техники, все исследователи в той или иной степени сталкивались с проблемой взаимодействия ГВ с неподвижной фазой, что существенно влияло на результаты ЭХ, которые весьма различались при изменении pH и/или ионной силы эгаоирующего буфера, а также при замене одного типа геля на другой. Наличие ионных, гидрофобных и водородных связей между фракционируемыми ГВ и матрицей геля необходимо учитывать при интерпретации результатов ЭХ.

В отсутствии абсолютных стандартов ГК и ФК представляется целесообразным оценить эффективность ЭХ, приняв во внимание распределение в хроматографическом профиле отдельных стабильных фракций, различающихся по какому-либо четко детектируемому физико-химическому свойству (например, электрофоретической подвижности). Сочетание двух независимых методов (например, тандем ЭХ-ЭПАГ) позволило бы как сопоставить результаты фракционирования ГВ различными вариантами ЭХ, так и получить препаративные количества стабильных электрофоретических фракций. Однако попытки обнаружить взаимосвязь между хроматографическим профилем и электрофоретическими зонами ГК или ФК, предпринимавшиеся ранее, были безуспешны.

Одной из целей настоящей работы было решение этой проблемы, используя ЭХ при низком давлении на сефадексах в сочетании с разработанным нами в применении к ГК методом ЭПАГ.

Глава П. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Почвенные образцы были взяты из горизонтов А четырех резко различающихся по генезису, свойствам, географическому положению и биоклиматическим условиям почв: дерново-подзолистой глееватой на покровных суглинках (Чашниково, север Московской области, Россия), светло-серой лесной среднесуглинистой (юг Московской области, Россия), чернозема типичного (Курская область, Россия) и краснозема типичного на зебровидной глине (субтропики, Анасеули, Западная Грузия).

ГК были выделены раствором 0,1 М пирофосфата натрия и 0,1 МNaOH, pH 13,0, с последующим осаждением соляной кислотой (pH 2,0). Некоторые характеристики ГК представлены в таблице 1.

Таблица 1. Элементный состав (в расчете на сухое беззольное вещество),

содержаниие воды и золы в препаратах почвенных ГК различного генезиса.

Почва С Н N Вода Зольность

% % % % %

Дерново-подзолистая 57,6 5 Л 4,8 8,2 3,1

Серая лесная 61,2 3,6 3,9 9,6 1,7

Чернозем 62,6 4,7 4,3 8,9 2,5

Краснозем 59,8 4Д 4,5 10,2 9,5

Гуминоподобные вещества, аналогично выделенные из компостов различных сроков созревания, были любезно предоставлены профессором К.Чиавагга (факультет агробиологии Университета г.Болоньи, Италия).

Электрофорез проводили на приборе 2001 (LKB), эксклюзивную хроматографию -в стеклянных колонках (Whatman) с использованием комплекса хроматографического оборудования (ISCO). Элементный состав препаратов ГК проводили на CHNS/0 -анализаторе серии П 2400 (Perkin Elmer), а зольность и влажность препаратов - на термальном анализаторе (Perkin Elmer). Спектральные характеристики препаратов (коэффициенты экстинкции и цветности) определяли на спектрофотометре DU-8 (Beckman). Пиролиз метилированных препаратов ГК осуществляли на пиролизатаре 0316 (Fisher), соединенном с газовым хроматографом GC-8000/масс-спектрометром MD 800 (Fisons) для количественного и качественного анализа пиролитических продуктов ГК. Содержание аминокислот проводили после гидролиза образцов 5,7 N HCl на аминокислотном анализаторе LC5001 (Biotronic). Ультрафильтрацию проводили в ячейке (Amicon) с использованием набора ультрафильтров с различными диаметрами пор. В работе использовали импортные реактивы фирм "Sigma", "Aldrich", "Pharmacia", "Serva", а также отечественные реактивы марки ХЧ или ОСЧ. Методики, использованные в работе, подробно описаны в главе П диссертации.

Глава ¡П. РАЗРАБОТКА МЕТОДА ЭЛЕКТРОФОРЕЗА ГУМИНОВЫХ КИСЛОТ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ В ПРИСУТСТВИИ ДЕЗАГРЕГИРУЮЩИХ АГЕНТОВ.

Электрофорез в полиакриламидном геле (ЭПАГ) в 89 мМ трис-боратном буфере, pH 8,3, применяемый для разделения нуклеиновых кислот и обладающий высокой разрешающей способностью для соединений полианионной структуры, был взят за основу при разработке метода фракционирования почвенных ГК.

Использование буфера с pH 8,3 предполагает практически полную ионизацию карбоксильных групп и, следовательно, обеспечивает взаимное отталкивание отрицательно заряженных молекул ГК. С целью нейтрализации влияния двухвалентных катионов и предотвращения комплексообразования в систему вводили этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА). Для разрушения водородных связей в буфер для геля и образца добавляли мочевину. Для предотвращения гидрофобного взаимодействия между молекулами в буфер для образца вносили додецилсульфат натрия (ДЦС-Na). Система с таким набором реагентов для электрофоретического разделения ГК ранее не применялась.

В серии аналитических экспериментов были подобраны оптимальная концентрация акриламида (10%) и соотношение акриламида и бисакриламида (35,7:1), сила постоянного тока (25-50 мА), оптимальная концентрация и объем наносимого на гель вещества (0,05-0,25мг в 0,02-0,1 мл буфера для образца), продолжительность электрофореза (1 час). На рисунке 1 представлены результаты ЭПАГ четырех образцов ГК, выделенных из различных по генезису почв, каждый из которых разделился на четыре дискретные зоны (фракции): А - стартовая зона, не вошедшая в 10% ПАГ и три узкие интенсивно окрашенные зоны В, С, D, причем зона В значительно отличается от зон С и D по электрофоретической подвижности. Зоны С и D из-за их близкой электрофоретической подвижности были объединены во фракцию C+D. Следует отметить, что одинаково обозначенные на электрофореграмме зоны различных ГК имели сходную электрофоретическую подвижность, но значительно различались по интенсивности естественной окраски. Наличие мочевины и ДЦС-Na в значительной мере определило формирование дискретных зон на электроферограмме. При проведении ЭПАГ тех же почвенных ГК в отсутствии ДДС-Na и мочевины ГК мигрировали от катода к аноду сплошной диффузной полосой (рис.2).

Для дальнейшего изучения электрофоретических фракций ГК был разработан метод их выделения с матрицы ПАГ с последующей очисткой от примесей. Выделенные электрофоретические фракции ГК после их ре-электрофореза имели ту же электрофоретическую подвижность, что и в первоначальном эксперименте (рис.3).

1 2 3

ж '' » ........ ' '

л; '«»w «www

C+D

Рисунок 1. Электрофорез в 10% ПАГ в трис-боратной системе в присутствии ДЦС-Ыа и мочевины 0,25 мг ГК дерново-подзолистой почвы (1), серой лесной почвы (2), чернозема (3) и краснозема (4). А, В и С+О - естественно окрашенные электрофоретические зоны ГК. Здесь и на рис. 2, 3 и 6 знаками (+) и (-) обозначены анод и катод. ' 1 2

Рисунок 2. Электрофорез 0,25 мг ГК чернозема (1) и краснозема (2) в 10% ПАГ в трис-боратной системе в отсутствии ДДС-№ и мочевины.

C+D

Рисунок 3. Ре-элекгрофорез в 10% ПАГ в трис-боратной системе в присутствии ДДС-Na и мочевины фракций ГК серой лесной почвы D(l), А(2), C+D(3), С(4) и В(5) после их экстракции из геля. Исходный образец ГК серой лесной почвы (6) использовали в качестве стандарта.

Однако метод препаративной наработки фракций путем их элюции с матрицы ПАГ оказался малоэффективным из-за низкого выхода экстрагируемого вещества ГК (7-10% от наносимого), к тому же исследование фракций методом пиролитической газовой хромагографии/масс-спектрометрии показало сильную их загрязненность акриламидом, что затрудняло, а подчас делало невоможным дальнейшее изучение фракций современными физико-химическими методами. Возникшие проблемы обусловили необходимость использования ЭПАГ в качестве тест-системы в сочетании с другим методом фракционирования, что позволило бы получать достаточные количества электрофоретических фракций, лишенных посторонних примесей. Одним из таких методов является метод ЭХ, который, благодаря высокой информативности, относительной методической простоте и сравнительно недорогому оборудованию, широко применяется для изучения ГК.

Глам IV. СОЧЕТАНИЕ ЭКСКЛЮЗИВНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С ЭЛЕКТРОФОРЕЗОМ ДЛЯ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ В РАЗЛИЧНЫХ УСЛОВИЯХ И ПРЕПАРАТИВНОГО ПОЛУЧЕНИЯ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИХ ФРАКЦИЙ ГУМИНОВЫХ КИСЛОТ.

1. Выбор оптимальных условий эксклюзивной хроматографии на сефадексе дли получения стабильных электрофоретических фракций гумнновых кнслот.

Основываясь на анализе литературных данных, показавшем, что в результате ЭХ при низком давлении на сефадексах ГК распределялись практически по всей области фракционирования колонки, в то время как в процессе ВЭЖЭХ на синтетических ригидных гидрофильных гелях ГК в большинстве экспериментов выходили с колонки преимущественно одним узким пиком, подбор оптимальных условий для фракционирования ГК проводили на сефадексе G-7S с диапазоном фракционирования для глобулярных белков от 80000 до 3000 дальтон.

В качестве подвижной фазы для сравнения использовали три раствора: 0,1 М Трис-HCl, рН 9,0, который по данным ряда исследователей (Swift and Posner, 1971; Swift, 1996) частично предотвращает адсорбцию ГК на сефадексе; 7М мочевину, разрушающую водородные связи; дистиллированную НгО.

При фракционировании в дистиллированной воде значительная часть ГК вышла после общего объема колонки и некоторое количество фракционируемого материала адсорбировалось в верхней части колонки. При использовании Трис-НС1-буфера в качестве подвижной фазы наблюдали существенную адсорбцию ГК в верхней части колонки с сефадексом, кроме того небольшая часть фракционируемого вещества вышла после общего объема колонки. При ЭХ в 7М мочевине ГК не адсорбировались на колонке с сефадексом, и все нанесенное вещество распределялось в области фракционирования от свободного до общего объема колонки, образуя несколько максимумов. Все три хроматографических профиля были разделены на несколько аликвот, каждая из которых была проанализирована с помощью ЭПАГ.

При использовании Трис-НС1-буфера и Н^О все хромагографические аликвоты содержали смесь нескольких электрофоретических фракций. В случае 1М мочевины в качестве элюента было достигнуто лучшее разделение ГК и получены в достаточных количествах стабильные электрофоретические фракции А, В и C+D.

Хроматографические аликвоты, полученные при фракционировании ГК в 7А/ мочевине и содержащие соответственно индивидуальные электрофоретические фракции А, В и C+D, были рехроматографированы в идентичных условиях. Увеличение времени элюции (Ve) фракций в ряду У^сщ > V^j > V«*, соответствовало увеличению их электрофоретической подвижности, что впервые позволило установить взаимосвязь между электрофоретическими зонами и соответствующими хроматографическими фракциями ГК.

Полученные данные дают возможность предположить, что МР фракции А>В>С+15, и распределение фракций в матрице геля при электрофорезе происходит в основном по МР.

Таким образом, использование 7М мочевины при фракционировании ГК на сефадексе 0-75 является оптимальным для препаративного получения стабильных фракций, различающихся как по электрофоретической подвижности, так и по МР.

2. Применение сочетания эксклюзивной хроматографии с электрофорезом для препаративной наработки электрофоретических фракций почвенных гумииовых кислот различного генезиса.

Сочетайте ЭХ-ЭПАГ было использовано для фракционирования четырех почвенных ПС различного генезиса и препаративной наработки фракций с различными МР и электрофоретической подвижностью. На рисунке 4 представлены хроматографические профили ПС, выделенных из дерново-подзолистой и серой лесной

Черными прямоугольниками на осях абсцисс обозначены объемы удерживания (Уе) хроматографических фракций А, В и ОФ.

ГК различного происхождения при хроматографии в 1М мочевине не адсорбировались на сефадексе и выходили в пределах общего объёма колонки, однако формы хромагографических профилей существенно различались между собой. После электрофоретического анализа хромагографических профилей было найдено, что Уе, а следовательно и МР одноименных электрофоретических фракций, были сходны независимо от генезиса исследуемых ПС (рис. 4).

Для препаративной наработки отдельных фракций хроматографическая процедура с последующим электрофоретическим анализом была повторена десятки раз. Результаты хроматографии имели хорошую воспроизводимость. Было наработано достаточное количество (50-100 мг) отдельных фракций для проведения комплексного анализа их физико-химических свойств.

Глава V. КОМПЛЕКСНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПОЧВЕННЫХ ГУМИНОВЫХ КИСЛОТ И ИХ ФРАКЦИЙ, ПОЛУЧЕННЫХ СОЧЕТАНИЕМ ЭКСКЛЮЗИВНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С ЭЛЕКТРОФОРЕЗОМ.

1. Спектрофотометрическое исследование.

Спектры поглощения в ультрафиолетовой и видимой областях ГК серой лесной почвы, дерново-подзолистой почвы, чернозема и краснозема, а также их фракций, полученных .сочетанием ЭХ-ЭПАГ, не имели чётких максимумов, оптическая плотность монотонно убывала с увеличением длины волны. Однако следует отметить, что. незначительные плечи в области 240-280 нм наблюдались у всех исследованных препаратов.

Для характеристики полученных фракций использовали коэффициенты экстинкции (ЕС«}) и цветности (Е4/Е6 - соотношение поглощения раствора при длинах волн 465 и 665 нм) (таблица 2).

Таблица 2. Коэффициенты экстинкции ЕСде; и цветности Е4/Е6 почвенных ГК

различного генезиса и их фракций А, В и С+Э, полученных сочетанием ЭХ-

ЭПАГ.

Почва Образец ЕС465 Е4/Е6

С=1мг/мл

Дерново- ГК 4,4±0,3 6,9±0,8

подзолистая А 1,4±0,1 5,9±03

В 2,3±0,1 5,8±0Д

с+о 4,6±0Д 6,8±0Д

Серая лесная ГК 9,3±0,6 4,8±0,2

А 3,4±0,1 3,8±0,1

В 5,6±0,6 3,6±0,1

С+О 9,9±0,6 6,4±0,3

Чернозем ГК 9,1±0,5 4,4±0,1

А 4,2±0,2 3,3±0,2

В 8,0±0,3 3,3±0,2

С+О 9,8±0,3 5,4±0,7

Краснозем ГК 3,3±0Д 6,1 ±0,2

А 1,8±0,1 4,5±0,2

В зд±о,з 4,5±0,5

С+Б 3,7±0,3 7,0±0,7

В каждом из исследуемых образцов ГК было обнаружено достоверное увеличение значений ЕС465 от фракции А к фракции C+D. Коэффициенты цветности Е4/Е6 были близкими для фракций А и В во всех исследуемых образцах и существенно увеличивались во фракциях C+D.

Полученные данные показали наличие взаимосвязи между MP фракций и их оптическими параметрами (особенно для значений ЕС465) внутри каждого исследуемого образца ГК, что находится в соответствии с данными ряда авторов, указывающих на существование обратной зависимости между величинами вьппеиспользованных оптических коэффициентов и MP гуминовых веществ (Chen et al., 1977; Ghosh and Schnitzer, 1979). С другой стороны, генезис почв оказывал существенное влияние на абсолютные значения этих оптических параметров. Так значения ЕС465 и Е4/Е6 для ГК и их фракций в серой лесной почве и черноземе в 2-3 раза выше соответствующих значений в дерново-подзолистой почве и красноземе. Одноименные фракции со сходными хроматографическими характеристиками и электрофоретической подвижностью, полученные из почвенных ГК различного генезиса, существенно различались по значениям ЕС465 и Е4/Е6.

2. Пиролитическая газовая хроматография/масс-спектрометрия.

а). Идентификация структурных компонентов.

Пиролитическая газовая хроматография/масс-спектрометрия, в которой сочетается термическое разложение высокомолекулярных веществ на более простые фрагменты с масс-спектрометрической идентификацией продуктов деструкции, в последние годы широко и успешно используется для изучения химической структуры гуминовых веществ (Хмельницкий и др., 1977; Бродский и др., 1985; Shulten, 1990; Saiz-Jimenez, 1994; Almendos et al„ 1997; Rio et al., 2000; Hatcher et al., 2001).

Для изучения почвенных ГК различного генезиса и их фракций, полученных сочетанием ЭХ-ЭПАГ, нами был использован модифицированный метод пиролитической газовой хроматографии/масс-спектрометрии, основанный на термальном гидролизе вещества в атмосфере инертного газа при t=500C° (точке Кюри) с одновременным метилированием тетраметиламмонием фенольных и карбоксильных групп, входящих в состав молекул ГК. Метод позволяет определять содержание алифатических и ароматических кислотных и гидроксильных групп в составе ГК. В таблице 3 и на рис. 5 представлены основные пиролитические структурные компоненты ГК различного генезиса и их фракций. Карбоксильные и фенольные группы были идентифицированы соответственно в виде метиловых эфиров и метоксилов.

Все исследованные ГК и фракции содержали набор насыщенных неразветвленных жирных кислот С12-С26 , среди которых преобладали гомологи Ci6 и С«. В значительных количествах присутствовали ненасыщенная Cis-жирная кислота, а также некоторые разветвлённые жирные кислоты. Кроме того были обнаружены фенолы и бензолполикарбоновые кислоты. Эти компоненты составляли подавляющее большинство идентифицированных продуктов пиролиза ГК. В небольших количествах были обнаружены некоторые гомологи нормальных алканов и азот-содержащие гетероциклические соединения. Пиролитические продукты полисахаридов (фураны) были детектированы лишь в следовых количествах и не внесены в таблицу.

Среди исследователей, занимающихся изучением структуры ГК, до настоящего времени нет единого мнения о типе связи между бензолполикарбоновыми кислотами и гуминовой матрицей. По теории Шнитсера и Хана (Shnitzer and Khan, 1972,1978) бензолполикарбоновые кислоты существуют в свободном виде, соединенные с гуминовой матрицей водородными связями.

С другой стороны вполне возможно, что бензолполикарбоновые кислоты соединены с другими компонентами ГК сложноэфирными связями и образуются при

Таблица 3. Основные структурные компоненты ГК и ¿фракций, идентифицированные с помощью пиролитической газовой хроматографии/масс-спектрометрии.

№ Название соединения

1. Метиловый эфир бензолмонокарбоновой кислоты

2. Метоксифенол

3. Метокси-метил-фенол

4. Диметап-урацил

5. Диметокси-толусш

б. Метокси-винил-фенол

7. Диметокси-стирен

8. 1,3,5-Триметап-урацил

9. Метиловый эфир метокси-бензойной кислоты

10. 13,5-Триметил-1,3,5-триазин-2,4,6Ч1Н,ЗН,5Н)-трион

П. 2-Метил-1 Н-изоиндол-1,3(2Н>дион

12. 1,2,3-Триметокси-бензол

13. Метиловый эфир додекановой кислоты Диметиловый эфир 1,3-бензолдикарбоновой кислоты

14. Метиловый эфир 4-гидрокси-З-метокси-бензойной кислоты

15. Метиловый эфир диметокси-бензойной кислоты

16.' Метиловый эфир 3-(4-метоксифенил}-2-пропеоновой кислоты

17. Метиловый эфир тетрадекановой кислоты

18. Метиловый эфир триметокси-бензойной кислоты

19. Метиловый эфир 13-метил-тетрадекановой кислоты

20. Метиловый эфир 12-метил-тетрадекановой кислоты

21. Метиловый эфир пенгадекаиовой кислоты

22. Метиловый эфир ЗЧЗ,4-диметоксифенил)-2-пропеоновой кислоты

23. Метиловый эфир гексадекановой кислоты

24. Метиловый эфир гептадекановой кислоты

25. Метиловый эфир октадеценовой кислоты

26. Метиловый эфир октадекановой кислоты

27. Докозаи

28. Метиловый эфир ноцдекановой кислоты

29. Трикозаи

30. Метиловый эфир эйкозановой кислоты

31. Тетракозан

32. Метиловый эфир генкозановой кислоты

33. Пентакозан

34. Метиловый эфир докозановой кислоты

35. Гексакозан

36. Метиловый эфир трикозановой кислоты

37. Гептакозаи

38. Метиловый эфир тетракозановой кислоты

39. Октакозан

40. Метиловый эфир пентакозановой кислоты

41. Нонкозаи

42. Метиловый эфир гексакозановой кислоты

Дерново-подзолистая почва ГК

Серая лесная почва

ГК

А " -Г

В

..у,;.? к

в

и

и 1

С+Б

\ ; -V

С+Б

I-1-Г-

17 ^

jJJiJLШ

■т—I—I I—I—I—1—I—I—I

1000 1500 2000 2500 »00 3500 4000 1000 1500 2000 2500 3000 )500

Чернозем

Краснозем

ГК

ГК

19

в

и

г п I

гУН,.-!'"^ ЬмЛц.

»-Дли«

К

1

м1и

г а >и.11 м.|

« и

И I 1и

и 1

В <■

с+о

■ • . \ г

С+О в

1)00 »00 2500

1—1-1

1000 1500 2000 2500 3000 3500 «ПО

Рисунок 5. Пирограммы препаратов ГК и фракций А, В и С+О, полученных сочетанием ЭХ-ЭПАГ. Номера над пиками на пирограммах соответствуют порядковому номеру соединения в таблице 3.

пиролитическом метилировании по реакции, предложенной Де Лью и Баасом (De Leeuw and Baas, 1993).

Данные пиролитической спектрометрии о высоком содержании бензолполикарбоновых кислот (рис.5, пики 1 и 13) как в исходных препаратах ПС, так и во фракциях не потверждают структурную гипотезу Шнитсера и Хана. Процесс разделения ПС на фракции, различные по MP и злектрофоретической подвижности, проводили в растворе 1М мочевины, разрушающей водородные связи, при этом образовавшиеся свободные низкомолекулярные бензолполикарбоновые кислоты должны были бы выйти с колонки в конце хроматографического разделения и идентифицированы только в низкомолекулярных фракциях C+D, а не во всех фракциях. Полученный результат доказывает наличие других видов связей (возможно сложноэфирных) между бензолполгасарбоновыми кислотами и гуминовой'матрицей независимо от генезиса исследованных ПС.

б). Установление происхождения исследуемых препаратов гуминовых кислот.

Для установления происхождения исследуемых препаратов ПС использовали преимущественный углеродный индекс (CPI - carbon preference index), предложенный для аэрозолей Симонетом ( Simoneit, 1986), для гуминовых веществ Сайз-Хименесом (Saiz-Jimenez, 1996) и рассчитываемый как соотношение суммарного содержания чётных и нечётных гомологов жирных кислот (т.е. CPI=EC2n/EC2n+i). При CPI ¿2 исследуемое вещество имеет антропогенное, а при СР1>2 - биогенное происхождение. В исходных препаратах ПС дерново-подзолистой и серой лесной почв, чернозёма и краснозёма, а также их фракциях CPI изменялся в пределах 5-20, что без сомнения указывает на биогенное происхождение всех исследованных препаратов.

Удалось также впервые обнаружить, что фракции А, В и C+D, полученные с помощью сочетания ЭХ-ЭПАГ, имеют различные биогенные источники формирования. Как известно, в состав микроорганизмов входят жирные кислоты, содержащие менее 20 углеродных атомов, а высшие растения содержат высокомолекулярные гомологи с более чем 22 атомами углерода в своем составе. Для оценки источника происхождения ГВ Сайз-Хименес (Saiz-Jimenez, 1996) с успехом использовал соотношение суммы доминантных гомологов жирных кислот растительного происхождения (Р) к сумме доминантных гомологов жирных кислот микробного происхождения (М), т.е. Р/М или C22+C24+C26/Ci4+Ci6+Ci8. Этот подход был использован нами для оценки происхождения полученных фракций (таблица 4). Было впервые обнаружено неравномерное распределение гомологов жирных кислот по фракциям. Фракции А имели наибольшие величины Р/М (0,2-0,6), на порядок и более превышая эти значения

Таблица 4. Соотношение суммы доминантных гомологов жирных кислот растительного происхождения Р=Сы+С24+С2б к сумме доминантных гомологов жирных кислот микробного происхождения М= С14+С16+С18 (т.е. Р/М или С22+ С24+С26/ С,4+С16+С18).

Почва ПС Фракция А Фракция В Фракция C+D

Дерново-подзолистая 0,09 од 0,02 0,03

Серая лесная 0,14 0,3 0,03 0,02

Чернозем 0,13 0,3 0,04 0,01

Краснозем 0,06 0,6 0,02 0,03

во фракциях В и С+И во всех исследованных препаратах. На пирограммах (рис.5) высокомолекулярные доминантные гомологи жирных кислот (пики 34, 38 и 42 ) существенно преобладают во фракциях А.

Учитывая закономерный характер изменения этого параметра, проявляющийся в образцах ГК различного происхождения, можно с определенной долей уверенности предположить, что независимо от генезиса высокомолекулярные фракции А, полученные из почвенных ПС, имеют растительное происхождение, в отличие от фракциий В и C+D, происхождение которых ближе к микробному.

3. Аминокислотный состав.

Аминокислоты являются важной интегральной составляющей, аккумулирующей значительную часть азота ПС. Их изучению уделяется большое внимание на протяжении длительного времени исследования структуры и функции гуминовых веществ (Кононова, 1963; Swift and Posner, 1972; Александрова, 1980; Орлов, 1990; Warman and Bishop, 1987; Anderson and Hepburn, 1989; Hejzlar et al., 1994; Appelqvist et al., 1996; Clapp and Hayes, 1996; Kuzyakov, 1997).

Нами было проведено сравнение аминокислотного состава ПС различного генезиса и их фракций.

Экстракты из ПС и фракций 5,7 N HCl при комнатной температуре не содержали заметного количества аминокислот, однако после 24-часового кислотного гидролиза при 110°С в каждом из исследуемых препаратов были обнаружены все 17 аминокислот, идентифицируемые использованной методикой: аспарагиновая кислота (Asp), треонин (Thr), серии (Ser), глутаминовая кислота (Glu), пролин (Pro), nimnm(Gly), аланин (Ala), цистеин (Cys), валин (Val), метионин (Met),' изолейцин (Ile), лейцин (Leu), тирозин (Туг), фенил аланин (Phe), гистидин (His), лизин (Lys), аргинин (Arg). Полученный результат указывает на возможность взаимодействия аминокислот с другими структурными компонентами ПС при помощи ковалентных связей, разрушающихся в процессе кислотного гидролиза.

Все исследованные образцы ПС и их фракции А, В и С +D содержали 23-32 % кислых (Asp+Glu); 11-17% основных (Arg+Lys+His); 53-69% нейтральных аминокислот (Thr+Ser+Pro+Gly+Ala+Val+Leu+Ile+Phe). Во всех препаратах наиболее широко представленными аминокислотами были Asp, Glu, Gly и Ala. В ПС чернозема обнаружено несколько больше кислых аминокислот, ПС серой лесной почвы незначительно обогащены основными, а в ПС дерново-подзолистой почвы и краснозема незначительно преобладают нейтральные аминокислоты. В целом ПС различных почв и их фракции имели достаточно одинаковый аминокислотный состав.

С другой стороны, образцы ПС и фракций существенно различались по весовому содержанию аминокислот (таблица 5). В ПС близких по генезису серой лесно^ почвы и чернозема содержалось соответственно 5,9 и 6,1% аминокислот, в то время как ПС краснозема и дерново-подзолистой почвы содержали 8,0 и 11,3% аминокислот, соответственно. Во всех исследуемых образцах наибольшее количество аминокислот (11,5-13,9%) было обнаружено в высокомолекулярных фракциях А. Фракции В содержали 7,9-11,5% аминокислот. Наименьшее сдержание аминокислот (2,1-5,5%) отмечалось в фракциях C+D. Во всех случаях исходные ПС имели среднее весовое содержание аминокислот по сравнению с фракциями.

Таблица 5. Весовое содержание аминокислот (%) в ПС различного генезиса и фракциях А, В и С+й, полученных сочетанием ЭХ-ЭПАГ.

Почва ПС Фракция А Фракция В Фракция C+D

Дерново-подзолистая 11,3 13,9 11,5 4,4

Серая лесная 5,9 11,5 8,1 2,1

Чернозем 6,1 13,2 7.9 23

Краснозем 8,0 12,7 11,1 5,5

Таким образом, ГК четырёх различных по генезису почв и их фракции, полученные сочетанием ЭХ-ЭПАГ, имели сходный аминокислотный состав, но существенно различались по весовому содержанию аминокислот. Весовое содержание аминокислот снижалось с уменьшением молекулярного размера и увеличением электрофоретической подвижности фракций во всех исследуемых образцах ПС различного генезиса.

Глава VI. ВЗАИМОСВЯЗЬ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИХ ФРАКЦИЙ ГУМИНОВЫХ КИСЛОТ С ГЕНЕЗИСОМ ПОЧВ.

В Л. Докучаев в монографии "Русский чернозём" (1883) впервые сформулировал положение о равновесном состоянии почв, при котором мощность гумусового горизонта и содержание гумуса остаются неизменными. Он писал: "Прежде всего необходимо иметь в виду, что как количество гумуса в почвах, так и особенно их мощность, должны иметь предел, выше которого они подниматься не могут" (с.488). В дальнейшем факторы и условия гумусообразования были детально рассмотрены как в работах российских ученых Трусова А.Г., Тюрина И.В., Кононовой М.М., Христевой Л.А., Александровой Л.Н., Волобуева В.Р., Гаджиева И.М., Орлова Д.С., Пономарёвой В.В., Кауричева И.С., Ганжары Н.Ф., Комиссарова И.Д., Фокина АД., Карпухина A.B., Титляновой A.A., Дергачбвой М.М., Клёнова Б.М., Шаркова И.Н., Черникова В.А. и др., так и за рубежом Ваксманом С. (Waksman), Фляйгом В. (Flaig), Шнитсером М. (Schnitzer), Стивенсоном Ф. (Stevenson), Фриммелем Ф. (Frimmel), Малколмом (Malkolm), Дюшофуром П. (Duchaufour), Джессингом Е. (Gjessing) и другими.

Приоритет ГК в почвенном гумусообразовательном процессе обусловлен тем, что условия, благоприятные для их накопления, как правило благоприятны для накопления гумуса в целом, что впервые было установлено И.В. Тюриным (1937). Можно с большой долей уверенности предположить, что эти условия оказывают определяющее влияние на качественный и количественный составы высоко- и низкомолекулярных электрофоретических фракций, определяя некоторые физико-химические свойства ГК, что в свою очередь в значительной мере обусловливает многие физико-химические свойства почв. Соотношение между высоко- и низкомолекулярными компонентами ГК во многом определяет пути и механизмы взаимодействия почвенных ГК с органическими поллютантами, тяжелыми металлами, радионуклидами и т.д. (Александрова, 1980; Орлов, 1990; Карпухин, 1993; Ladd and Battler, 1971; Vaughan et al., 1974; Malcolm and Vaughan, 1979; Frimmel, 1988; Berdén and Berggrer, 1990; Nardi et al., 1991; KJavinä, 1997; Tan, 1998; Nardi et al., 2000; Hayes and Clapp, 2001).

В настоящей работе было выявлено существенное различие в весовом содержании одноименных электрофоретических фракций ГК в почвах различного генезиса (таблица 6). Содержание высокомолекулярной фракции А в черноземе типичном и серой лесной почве примерно вдвое ниже (17-24%), чем в красноземе и дерново-подзолистой почве (40-43%), а содержание низкомолекулярной фракции C+D в ГК чернозема типичного и серой лесной почвы вдвое выше (36-37%), чем в дерново-подзолистой почве и красноземе (23-24%). Весовое содержание фракций было определено методом прямого взвешивания после хроматографии.

Полученные соотношения низко- и высокомолекулярных электрофоретических фракций ГК различного генезиса имеют логическую взаимосвязь с водным режимом исследованных почв. При промывном водном режиме, характерном для краснозема и дерново-подзолистой почвы (Роде, 1965), одновременно с образованием и последующей адсорбцией ГК на поверхности почвенных минералов происходит непрерывное вымывание подвижной части ГК в нижележащие горизонты и далее в грунтовые воды (Кононова, 1963; Пономарева и Плотникова, 1980). Основываясь на

Таблица б. Весовое содержание (%) фракций А, В и С+Б, полученных сочетанием ЭХ-ЭПАГ из четырех почвенных ГК различного генезиса.

Почва Фракции

А В ВиС+D (смесь) C+D

Дерново-подзолистая 39,7±3,1 20,1±1,8 16,0±1,8 24Д±2,7

Серая лесная 17,1±1,6 18,1±2,0 27,9±2,8 36,9±ЭД

Чернозем 24,0±2,7 19,3±2,0 21,0±2,2 35,7±3,7

Краснозем 43,3±5,0 18,9±2,0 14,8±2,0 23,0±2,2

литературных данных о большей подвижности в водной почвенной фазе низкомолекулярных фракций ГК (Riise et al., 1994; Stevenson, 1994) можно допустить, что низкомолекулярные фракции ГК гораздо легче вымываются осадками, что является одним из факторов, определяющих соотношение фракций в ГК дерново-подзолистой почвы и краснозема в сторону увеличения доли высокомолекулярных фракций.

В чернозёме типичном и серой лесной почве, сформированных в условиях умеренного (периодически промывного) водного режима (Роде, 1965), процесс выноса части ГК происходит только во влажные периоды, а в периоды дефицита влаги большинство вновь образовавшихся ГК вступают во взаимодействие с минеральной частью почвы (Волобуев, 1948; Кононова, 1963), образуя практически нерастворимые в почвенных растворах органо-минеральные комплексы (Александрова, 1980; Stevenson, 1994). Ранее Орлов и Пивоварова (1974) показали, что из полидисперсной системы ГК на минералах адсорбируются преимущественно низкомолекулярные компоненты. Преобладающую сорбцию низкомолекулярных фракций ГВ на модельных опытах с различными минералами позже потвердили Тан (Tan, 1976) и Дударчик (1993). В наших исследованиях этот факт также нашёл подтверждение в почвах с периодически промывным режимом.

Процессы вымывания и закрепления фракций различного молекулярного размера одновременно присутствуют в обоих рассмотренных типах водного режима, однако тип водного режима несомненно может оказывать определённое влияние на весовое распределение стабильных электрофоретических фракций.

Наряду с водным режимом была также отмечена зависимость между величинами рН исследованных почв и весовым распределением электрофоретических фракций. Так краснозём и дерново-подзолистая почва, имеющие кислые значения рН (4,5 и 5,8, соответственно), характеризуются бблыпим содержанием высокомолекулярных фракций, в то время как в чернозёме типичном и серой лесной почве, значения рН которых соответственно 7,5 и 6,9, ГК были обогащены низкомолекулярными фракциями. Однако ионные механизмы взаимодействия отдельных фракций ГК с минеральной частью почвы требуют отдельного, более глубокого исследования.

Интересно отметить, что весовое соотношение низко- и высокомолекулярных фракций ГК тесно взаимосвязано и с величинами предельного накопления гумуса (т.е. отношения запасов гумуса в профиле почв к годовому количеству его источников в этом же слое), используемыми в концептуальной модели гумусообразования (Ганжара, 1997) и являющимися количественными характеристиками эффективности

гумусонакопления. Величины предельного накопления гумуса в дерново-подеолистой почве, чернозёме типичном, серой лесной почве и краснозёме составляли 10,31,43 и 14 относительных единиц, соответственно, а содержание низкомолекулярных фракций ГК в тех же почвах было 24, 36, 37 и 23%, соответственно (таблица 6). Возможно, величины весового соотношения низко- и высокомолекулярных фракций ГК того или иного почвенного типа могут служить индикатором предельного накопления почвенных ГК. Однако требуются дальнейшие исследования с использованием более широкого почвенного генетического спектра, чтобы подтвердить или опровергнуть данное предположение.

Было бы ошибочно разделить вышеизложенные почвообразующие факторы на основные и второстепенные при рассмотрении их влияния на формированию весового распределения фракций ГК. Весьма вероятно, что только совокупность факторов приводит к конечному соотношению высоко- и низкомолекулярных фракций в исследованных ГК.

Важнейшей характеристикой почвы является емкость катионного обмена (ЕКО). По имеющимся литературным данным ЕКО почвенного гумуса колеблется от 300 до 1400 сМ кг"1 (Кононова, 1963; Shnitzer, 1977; Орлов, 1990; Stevenson, 1994; Клёнов, 2000) и определяется в основном содержанием кислотных групп (карбоксильных и фенолгидроксильных).

Весовое содержание высоко- и низкомолекулярных фракций, весьма вероятно, является одним из определяющих факторов ЕКО гуминовых кислот, а следовательно и ЕКО почв. Величины ЕКО гуминовых кислот чернозема типичного и серой лесной почвы изменяются в пределах 450-500 сМ кг'1, а дерново-подзолистой и краснозёма -300-350 сМ кг"1 (Кононова, 1963; Клёнов, 2000). Согласно данным 13С-ЯМР (Swift et al., 1992; Hatcher, 2001) низкомолекулярные фракции ГК обогащены карбоксильными и фенолгидроксильными группами по сравнению с высокомолекулярными. Кроме того величина коэффициента цветности Е4/Е6 находится в прямой зависимости от содержания свободных радикалов, карбоксильных групп и общей кислотности, но в обратной зависимости от молекулярного размера фракций ГК (Кононова, 1963; Chen et al., 1977; Ghosh and Schnitzer, 1979). Величины E4/E6 для фракций А и В внутри всех исследуемых образцов были близкими и существенно увеличивались во фракциях C+D (глава V, раздел 1), потверждая предположение о более высоком содержании карбоксильных и фенолгидроксильных групп в низкомолекулярных фракциях. Повышенное содержание низкомолекулярной фракции C+D в ГК чернозема и серой лесной почвы является одной из возможных причин более высоких ЕКО гуминовых кислот этих почв по сравнению с краснозёмом и дерново-подзолистой почвой.

Почвенный генезис и связанная с ним биологическая активность несомненно оказывают значительное влияние на качественный состав фракций. В главе V, разделе 3 настоящей работы было показано, что весовое содержание аминокислот снижалось с уменьшением молекулярного размера и увеличением электрофоретической подвижности фракций во всех исследуемых образцах ГК независимо от их генезиса (таблица 5). Это, по-видимому, объясняется более интенсивной биодеградацией низкомолекулярных фракций по сравнению с высокомолекулярными под воздействием почвенных микроорганизмов (Александрова, 1980; Stevenson, 1994). Однако, между высокомолекулярными фракциями А не было отмечено существенного различия в содержании аминокислот, и, наоборот, в низкомолекулярных фракциях C+D чернозема типичного и серой лесной почвы содержание аминокислот было более чем в 2 раза ниже, чем в красноземе и дерново-подзолистой почве. Этот факт можно объяснить более глубокой биодеградацией полипептидных цепочек в низкомолекулярных фракциях при повышенной биологической активности, характерной для чернозема типичного и серой лесной почвы. В почвах с ослабленной или частично подавленной кислой реакцией среды биологической активностью (дерново-подзолистая почва и краснозём, соответственно) процесс биодеградации протекает замедленно. Всё это в

конечном итоге отражается на весовом содержании аминокислот в исходных препаратах ГК (весовое содержание аминокислот в ПС дерново-подзолистой почвы и краснозёма в 1,5-2,0 раза превышает таковое в чернозёме типичном и серой лесной почве).

Для объяснения механизма синтеза ПС было предложено большое количество теорий, часто различающихся незначительными модификациями. Согласно одной группе гипотез сначала происходит распад органических остатков до мономеров, а затем конденсация и полимеризация, ведущая к образованию ПС (Трусов, 1916; Кононова, 1963; Feibeck, 1971; Flaig, 1988; Hedges, 1988), хотя допускается участие высокомолекулярных фрагментов (например лигнина) в процессе гумификации (Кононова, 1963; Hedges, 1988). С другой стороны, предлагается рассматривать образование молекул ПС в процессе окисления и трансформации высокомолекулярных компонентов в низкомолекулярные (Тюрин, 1937; Александрова, 1980; Schnitzer, 1991), при этом не исключаются реакции конденсации для образования высокомолекулярных соединений (Александрова, 1980; Stevenson, 1994).

Полученные впервые в настоящей работе с помощью пиролитической газовой хроматографии/масс-спектрометрии данные (глава V, раздел 2) показали, что высокомолекулярные фракции А из почвенных ПС различного генезиса содержат жирные кислоты как растительного, так и микробного происхождения, в отличие от фракций В и C+D, содержащих практически только жирные кислоты микробного происхождения. Можно с определённой долей уверенности предположить, что формирование высокомолекулярных фракций А из низкомолекулярных C+D во всех исследованных ПС маловероятно, в противном случае в низкомолекулярных фракциях C+D также должны быть идентифицированы жирные кислоты растительного происхождения. Однако из низкомолекулярных компонентов C+D вполне допустимо образование фракции В, имеющей по данным эксклюзивной хроматографии больший молекулярный размер, чем C+D. Результаты распределения жирных кислот по фракциям находятся в противоречии с теорией субмолекулярной структуры ГВ, выдвинутой и усиленно рекламируемой в последние годы Пикколо (Piccolo, 1996, 2001), в соответствии с которой высокомолекулярные фракции ГВ являются агрегатами, образующимися за счет гидрофобного взаимодействия простых низкомолекулярных природных соединений, включая и жирные кислоты.

Малколм (Malkolm, 1990) на основании исследования большого числа ГК методом 13С-ЯМР предложил рассматривать каждую гуминовую кислоту, как строго индивидуальную и обладающую присущими только ей структурными особенностями. Эта идея недавно была поддержана Пикколо (Piccolo, 2001), Хайесом и Клаппом (Hayes and Clapp, 2001). С другой стороны ряд исследователей (Кононова, 1963; Коммисаров, 1971; Frimmel, 1988; Дергачёва, 1989; Орлов, 1990; Stevenson, 1994; Клёнов, 2000) выдвинули предложение о существовании отдельных сходных блоков, составляющих структурные компоненты ГК. Представленные в настоящей работе данные о закономерной вариации оптических свойств, аминокислотного состава, распределении пиролитических компонентов; сходном электрофоретическом и хроматограф ическом поведении фракций ГК при их переходе от высокомолекулярных к низкомолекулярным служат прямым экпериментальным потверждением общего принципа молекулярного строения почвенных ГК, предложенного второй группой авторов.

Генетические особенности почв, в основу которых положены представления о географических факторах, условиях и закономерностях гумусообразования, позволяют объяснить и связать содержание и некоторые индивидуальные особенности электрофоретических фракций с типом гумификации и функциональной ролью ПС в почвах различного генезиса.

Гляич VTI. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СОЧЕТАНИЯ ЭКСКЛЮЗИВНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С ЭЛЕКТРОФОРЕЗОМ ДЛЯ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОЦЕССОВ УЛЬТРАФИЛЬТРАЦИИ И КОМПОСТИРОВАНИЯ.

1. Анализ эффективности фракционирования гуминовых кислот методом ультрафнльтрации.

Для фракционирования ГК по MP широко применяют метод ультрафильтрации (УФ), теоретически представляющий собой простой процесс, основанный на , разделении полидисперных веществ мембранами с порами различного диаметра. Однако на практике применение этого метода ограничено как эффектами взаимодействия отдельных компонентов фракционируемого вещества между собой, <

усиливающегося в процессе концентрирования, так и из-за неспецифического ' взаимодействия ГК с поверхностью УФ мембраны. Большинство опубликованных экспериментальных данных по УФ почвенных и водных ГК противоречивы, что связано с отсутствием критерия, на основании которого можно было бы оценить эффективность проведенного фракционирования (Buffle et al., 1978; Aiken, 1984; De <

Nobili and Fornasier, 1996; Swift, 1996; Christi et al., 2000; Schafer et al., 2002).

При разработке сочетания ЭХ-ЭПАГ и изучении оптических свойств электрофоретических фракций было показано, что MPa>MPb>MPc+d. Полученный результат дает возможность применять ЭПАГ в качестве экспресс-метода оценки эффективности фракционирования ГК с помощью УФ.

ГК чернозема, растворенные в 7M мочевине или НгО, были последовательно фракционированы с использованием набора ультрафильтров YM100, YM30, YM10 и YM5, задерживающих глобулярные белки с ММ больше 100, 30, 10 и S кДа, соответственно. Электрофоретический анализ результатов ультрафильтрации ГК в растворе IM мочевины показал, что фракция 100К содержит зоны А, В и C+D, фракция ЗОК и 10К - зоны В и C+D в различных соотношениях, фракция 5К представляет собой практически чистую зону C+D. При проведении УФ в НгО фракции 100К - 5К содержали смесь двух или трех электрофоретических зон. Сравнительный электрофоретический анализ показал, что метод УФ малоэффективен для получения отдельных высокомолекулярных фракций А и В, что вероятно обусловлено усиленной агрегацией между ними из-за увеличения концентрации вещества в растворе в процессе ультрафильтрации. Однако использование при ультрафильтрации мочевины, разрушающей водородные связи и тем самым частично препятствующей формированию гуминовых агрегатов и взаимодействию с мембраной, позволило получить некоторое количество индивидуальной фракции C+D.

На основании электрофоретического анализа результатов фракционирования ГК методами ЭХ и УФ можно сделать вывод, что ЭХ является более предпочтительным методом, чем УФ, для фракционирования почвенных ГК.

2. Мониторинг созревания гуминоподобных веществ в процессе компостирования органических отходов.

Принципиальной задачей процесса компостирования является трансформация органических отходов различного происхождения в стабильные, зрелые гуминоподобные вещества, представляющие собой исключительно полезное агрономическое сырье, способное улучшать физико-химические параметры почвы и поднимать урожайность сельскохозяйственных культур. Гуминоподобные продукты по своим параметрам должны быть максимально приближены к природным гуминовым веществам.

Для оценки созревания компостов достаточно широко применялись электрофоретические методы (Roletto et al., 1985; De Nobili et al., 1989; Ciavatta et al., 1993; Govi et al., 1993; Filip et al., 1997), позволяющие проводить только качественную оценку состояния гуминоподобных веществ в процессе созревания. Для мониторинга и

количественной оценки созревания нами было впервые применено сочетание ЭХ-ЭПАГ.

На рис. 6 представлена электрофореграмма гуминоподобных веществ, выделенных из компоста в начале (образец Ко) и после 130 дней компостирования (образец К130).

Рисунок 6. Электрофорез 0,25 мг гуминоподобных веществ, выделенных из компостов в начале коиргостирования (Ко) и после 130 дней компостирования (К13о).

Гуминоподобные вещества разделялись в ЭПАГ на электрофоретические фракции А, В и С+Э, причём электрофоретическая подвижность одинаково обозначенных фракций была тождественна. Однако интенсивность электрофоретических полос резко усиливалась у гуминоподобных веществ компостов после 130 дней созревания. Этот эффект наиболее ярко выражен у низкомолекулярной фракции С4С). Результаты весового содержания электрофоретических фракций гуминоподобных веществ до и после компостирования, полученные с помощью сочетания ЭХ-ЭПАГ, представлены в таблице 7.

При компостировании происходило значительное снижение (в два раза) весового содержания высокомолекулярной фракции А и увеличение (в четыре раза) весового содержания низкомолекулярной фракции С+Э. Следует отметить, что почвенные ГК различного происхождения характеризуются достаточно высоким содержанием (1737%) низкомолекулярной фракции С+О (см. таблицу 6).

Таблица 7. Весовое содержание (%) фракций А, В и С+Б, полученных сочетанием ЭХ-ЭПАГ для гуминоподобных веществ, выделенных из компостов.

Образец Фракция А Фракция В Смесь фракций ВиС+Б Фракция С+Б

Ко 51±4 19±2 25±1 3±1

К,зо 27±2 17±1 43±3 14±2

Полученные результаты показывают, что в процессе компостирования происходит значительное увеличение содержания низкомолекулярных и снижение высокомолекулярных фракций, т.е. гуминоподобные вещества по весовому содержанию электрофоретических фракций постепенно приближаются к почвенным.

Данные ЭПАГ и сочетания ЭХ-ЭПАГ впервые дают возможность провести качественную и количественную оценку формирования фракций гуминоподобных веществ, различающихся по молекулярной массе, и позволяют, по крайней мере частично, решить вопрос о степени трансформации и тождественности компостных гуминоподобных веществ почвенным ГК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты проведённых исследований убедительно показали эффективность разработанного метода ЭПАГ и сочетания ЭХ-ЭПАГ для аналитического и препаративного разделения ГК различного генезиса на несколько стабильных электрофоретических фракций. Полученные в настоящей работе данные о сходном электрофоретическом и хроматографическом поведении стабильных электрофоретических фракций почвенных ГК, закономерной вариации их оптических свойств и аминокислотного состава, а также распределения между фракциями структурных ароматических и алифатических компонентов, являются прямым экспериментальным подтверждением общего принципа молекулярного строения почвенных ГК независимо от их генезиса. Неравномерное распределение гомологов жирных кислот микробного и растительного происхождения по электрофоретическим фракциям указывает на их различное биогенное происхождение, что может служить одним из ключевых ориентиров при изучении взаимодействия ПС с различными поллкггантами. Следует особо подчеркнуть, что некоторые индивидуальные особенности электрофоретических фракций непосредственно связаны с типом гумификации и функциональной ролью ГК в почвах различного генезиса.

Разработанный метод электрофореза показал свою эффективность при мониторинге степени созревания гуминоподобных веществ в процессе компостирования органических отходов, что позволяет использовать его в производственных условиях и частично решить вопрос о степени тождественности компостных и почвенных ГВ.

Таким образом, разработка метода электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии комплекса дезагрегирующих агентов, выделение и последующее изучение стабильных электрофоретических фракций новейшими физико-химическими методами дает возможность исследовать на молекулярном уровне структурные особенности ГК различного происхождения, усовершенствовать диагностику гумусового режима в природных экосистемах и разработать методы мониторинга биосферных ресурсов. Это в свою очередь открывает новые перспективы для решения целого ряда фундаментальных и прикладных задач физико-химического почвоведения и молекулярной экологии.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии дезагрегирующих агентов (ЭПАГ), позволяющий разделять различные по генезису гуминовые кислоты (ГК) на несколько стабильных дискретных электрофоретических фракций. Хорошая воспроизводимость метода доказана как его многократным повторением, так и ре-электрофорезом фракций.

2. Впервые показана взаимосвязь между эксклюзивно-хроматографическим (ЭХ) и электрофоретическим фракционированием почвенных ГК. ЭПАГ позволил

оценить эффективность различных буферных систем для фракционирования почвенных ПС методом ЭХ.

3. С помощью сочетания ЭХ-ЭПАГ впервые реализована возможность выделения и препаративной наработки электрофоретических фракций почвенных ПС различного генезиса. Полученные весовые соотношения низко- и высокомолекулярных электрофоретических фракций ПС различного генезиса имеют логическую взаимосвязь с водным режимом исследованных почв. При промывном водном режиме, характерном для краснозема и дерново-подзолистой почвы, в составе ПС преобладают высокомолекулярные фракции, что частично объясняется вымыванием доли более подвижных низкомолекулярных фракций в нижележащие горизонты. При периодически промывном водном режиме, присущем чернозему типичному и серой лесной почве, наблюдается преобладание низкомолекулярных фракций, обусловленное их преимущественной адсорбцией на минеральной части почвы в периоды дефицита влаги.

4. Величина рН, обусловленная генезисом исследованных почв, оказывала определённое воздействие на весовое соотношение электрофоретических фракций. Краснозем и дерново-подзолистая почва, имеющие кислые значения рН, характеризуются высоким содержанием высокомолекулярных фракций, в то время как в черноземе типичном и серой лесной почве, значения рН которых близки к нейтральным, ПС были обогащены низкомолекулярными фракциями.

5. Более высокие значения емкости катионного обмена ПС чернозема типичного и серой лесной почвы в значительной мере обусловлены более высоким 'содержанием низкомолекулярных фракций в этих препаратах по сравнению с таковыми в ПС краснозема и дерново-подзолистой почвы.

6. Генетические особенности почв, в основу которых положены представления о географических факторах, условиях и закономерностях гумусообразования, позволяют объяснить и связать содержание и некоторые индивидуальные особенности электрофоретических фракций с типом гумификации и функциональной ролью ГК в почвах различного генезиса. Каждый из изученных генетических факторов не является основополагающим в распределении фракций, и только совокупность факторов может привести к конечному итогу фракционного формирования исследованных ГК.

7. Распределение электрофоретических фракций исследованных ГК в матрице полиакриламидного геля происходило в основном по молекулярным размерам (МР). Уменьшение МР фракций соответствовало увеличению их электрофоретической подвижности. Значения коэффициентов экстинкции ЕС4«5 и цветности Е4/Е6 увеличивались при уменьшении МР и увеличении электрофоретической подвижности фракций для каждой исследованной ГК.

8. Пиролитическая газовая хроматография/масс-спектрометрия препаратов ГК и фракций, основанная на термальном гидролизе с одновременным метилированием, впервые выявила неравномерное распределение гомологов жирных кислот микробного и растительного происхождения по фракциям, что указывает на их различное биогенное происхождение. Гомологи жирных кислот растительного происхождения идентифицированы только в высокомолекулярных фракциях. Основываясь на анализе данных о структурных компонентах ГК, полученных с помощью пиролитической газовой хроматографии/масс-спектрометрии можно предположить, что механизм формирования высокомолекулярных фракций из низкомолекулярных в исследованных ГК маловероятен.

9. Весовое содержание аминокислот снижалось с уменьшением МР и увеличением электрофоретической подвижности фракций независимо от генезиса почвенных ГК. Однако в высокомолекулярных фракциях не было существенного различия в содержании аминокислот, и, наоборот, различия более чем в 2 раза в весовом

содержании аминокислот наблюдались в низкомолекулярных фракциях, что частично объясняется генезисом и связанной с ним биологической активностью почв.

10. Методы ЭПАГ и сочетание ЭХ-ЭПАГ в комплексе с новейшими физико-химическими методами впервые дали возможность выявить сходные вариации оптических свойств, аминокислотного состава и распределения жирных кислот, близкое электрофоретическое и хроматографическое поведение при переходе от высокомолекулярных фракций ГК к низкомолекулярным. Полученные закономерности служат прямым экспериментальным подтверждением общего принципа строения почвенных ПС независимо от их генезиса. s

11. Электрофоретический анализ продуктов фракционирования почвенных ПС . методами ультрафильтрации (УФ) и ЭХ показал, что ЭХ является более предпочтительным методом, чем УФ для получения индивидуальных элекгрофоретитических фракций. Тем не менее, метод УФ может быть успешно 1 использован при определении MP фракций почвенных ПС, полученных ^ сочетанием ЭХ - ЭПАГ.

12. Метод ЭПАГ и сочетание ЭХ-ЭПАГ оказались эффективными для мониторинга степени созревания гуминоподобных веществ в процессе компостирования органических отходов. Данные, полученные сочетанием ЭХ-ЭПАГ, позволяют, по крайней мере частично, решить вопрос о степени трансформации и тождественности компостных гуминоподобных веществ почвенным ПС.

НАИБОЛЕЕ ВАЖНЫЕ РАБОТЫ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Trubetskoj О.А., Kudryavceva L.Yu„ Shirshova L.T. Characterization of soil humic matter by polyaciylamide gel electrophoresis in the presence of denaturating agents // Soil Biology & Biochemistry. 1991. v.23, p.1179-1181.

2. Trubetskoj O.A., Trubetskaya O.E., Khomutova Т.Е. Isolation, purification and some physico-chemical properties of soil humic substances fractions obtained by polyacrylamide gel electrophoresis // Soil Biology & Biochemistry. 1992. v.24, p.893-896.

3. Trubetskoj O.A., Trubetskaya O.E., Afanas'eva G.V., Reznlkova O.I., Saiz-Jimenez C. 1 Polyacrylamide gel electrophoresis of soil humic acid fractionated by size-exclusion chromatography and ultrafiltration // Journal of Chromatography A. 1997. v.767, p.285-

292.

4. Trubetskoj O.A., Trubetskaya O.E., Afanas'eva G.V., Reznikova O.I. Weight and optical differences between soil humic acid fractions obtained by coupling SEC-PAGE // Geoderma. 1999. v.93, p.277-287.

5. Трубецкой O.A., Трубецкая O.E., Афанасьева Г.В., Резникова О.И. Сайз-Хименез Ц. Электрофоретический анализ гумусовых веществ и продуктов их кислотного гидролиза // Почвоведение. 2001. № 10, с.1230-1233.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ (статьи в рецензируемых журналах и сборниках)

6. Трубецкой О.А., Кудрявцева JI. Ю. Электрофорез гумусовых веществ // ОНТИ НЦБИ. 1991. с. 1-20.

7. Trubetskoj О.А., Trubetskaya О.Е. Electrophoresis in PAAG in the presence of denaturating agents: a new method for fractionation, isolation and characterization of soil humic matter // Finnish Humus News. 1991. v.3, p.347-350.

8. Трубецкой OA., Золотарева Б.Н., Стрнад В., Хайнос М., Холиш Л. Влияние тяжелых металлов на величину электрокинетического потенциала илистой фракции серой лесной почвы // Агрохимия. 1992. №1, с.80-83.

9. Трубецкой OA., Трубецкая О.Е., Хомутова Т.Э. Спектрофотометрические исследования фракций, полученных электрофоретячесхим разделением гумусовых веществ серой лесной почвы // Известия Академии Наук, серия биологическая. 1992. №1,с.134-137.

10. Чудинова СМ, Трубецкой OA., Золотарева Б.Н., Ширшова JI.T. Влияние последовательного удаления фракций органического вещества на электрокинетический потенциал почвы // Почвоведение. 1992. №7, с.123-129.

11. Трубецкой О.А., Кудрявцева Л.Ю., Ширшова Л. Т. Фракционирование гумусовых веществ почв электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии денатурирующих агентов // Почвоведение. 1993. № 8, с.122-126.

12. Trubetskoj OA., Trubetskaya O.K. Markova LF. and Muranova ТА. Comparison of amino-acid compositions and E4/E6 ratios of soil and water humic substances fractions obtained by polyacryiamide gel electrophoresis // Environment International. 1994. v.20, p.387-390.

13. Trubetskoj OA., Trubetskaya O.E, Markova LF., Muranova ТА. Amino acid compositions of soil humic acids fractions obtained by polyacryiamide gel electrophoresis // In: Humic Substances in the Global Environment and Implications on Human Health, edited by N. Senesi and T.M. Miano, Elsevier Science. 1994. p.381-386.

14. Fiiip Z, Trubetskoj OA., Alberts J. Electrophoretic evidence of the structural similarity of different salt march related humic substances // Scientia Agriculturae Bohemica. 1995. v.26,p.219-225.

15. Трубецкой OA., Трубецкая O.K, Афанасьева Г.В., Резникова О.И. Сочетание гель-хроматографии с электрофорезом для препаративной наработки фракций гуминовых кислот // Известия РАН, серия биологическая. 1995. № 4, с.481-486.

16.Trubetskoj OA., Trubetskaya O.K. Afanas'eva G.V., Reznikova O.L, Saiz-Jimenez C. Characterization of humic acids by polyacryiamide gel electrophoresis following preparative gel filtration // In: Humic Substances and Organic Matter in Soil and Water Environments: Characterization, Transformations and Interactions. Eds: Clapp C., Hayes M.H.B., Senesi N. and Griffith S. Published by IHSS & University of Minnesota, USA. 1996. p.47-51.

17. Saiz-Jimenez C„ Hermosin В., Trubetskoj OA., Sukhoparova V.P., Trubetskaya O.E. Use of analytical pyrolysis for investigation a humic acid fractionated by PAGE // In: Humic Substances and Organic Matter in Soil and Water Environments: Characterization, Transformations and Interactions. Eds: Clapp C., Hayes M.H.B., Senesi N. and Griffith S. Published by IHSS & University of Minnesota, USA. 1996. p.57-63.

18. Filip Z, Trubetskoj OA., Alberts J. Electrophoretic comparison of humic substances derived from natural and anthropogenic environments // In: The Role of Humic Substances in the Ecosystems and in Environment Protection. Eds. Drozd J., Gonet N., Senesi N., Weber J. Published by IHSS & Polish Society of Humic Substances, Wroclaw, Poland. 1997. p.115-119.

19. Трубецкая O.E., Трубецкой OA., Афанасьева Г.В., Резникова О.И., Маркова Л.Ф., Муранова ТА. Аминокислотный состав гуминовых кислот из различных по генезису почв, фракционированных сочетанием гель-хроматографии и электрофореза // Известия РАН, серия биологическая. 1998. № 1, с.84-88.

20. Trubetskoj OA., Trubetskaya О.Е., Afanas'eva G.V., Reznikova O.L, Hermosin B. Saiz-Jimenez C. Tandem size exclusion chromatography - polyacryiamide gel electrophoresis of humic acids // Zeitschrift fur Pflanzenernahrung und Bodenkunde (Plant Nutrition and Soil Science). 1998. v. 161, p.619-625.

21. Trubetskaya 0£., Trubetskoj OA., Afanas'eva G.V., Reznikova O.L, Markova LF., Muranova ТА. Amino acids distribution in soil humic acids fractionated by tandem size

exclusion chromatography-polyacrylamide gel electrophoresis // Environment International. 1998. v.24,p.573-581.

22. Трубецкой O.A., Трубецкая O.E., Резникова О.И., Афанасьева Г.В. Использование электрофореза для оценки эффективности фракционирования гуминовых кислот почв методами гель-хроматографии и ультрафильтрации // Известия РАН, серия биологическая. 1999. № 2, с.216-220.

23. Сердюк О.П., Смолыгина Л.Д., Иванова Е.П., Трубецкая O.E., Трубецкой O.A., Обертюр Р.Ф. Фитогормональная активность гуминовых кислот, выделенных из почвы и компоста // Доклады Академии Наук. 1999. т.365, с.430-432.

24. Saiz-Jimenez С., Trubetskaya O.E., Trubetsko] O.A., Hermosin В. Polyacrylamide gel electrophoresis of soil humic acids, lignins, model phenolic polymers, and fimgal melanins // Communications in Soil Science and Plant Analysis. 1999. v.30, p.345-352.

25. Тимченко АЛ, Трубецкая O.E., Трубецкой O.A., Аксенов B.JI., Авдеев М.В., Обертюр Р., Kuxapa X., Сердюк И.Н. Анализ конформации гуминовых веществ методами диффузного рассеяния нейтронов и рентгеновских лучей // Поверхность. 1999. №4, с.23-30.

26. Трубецкой O.A., Трубецкая O.E., Резникова О.И., Афанасьева Г.В. Весовое распределение и оптические свойства почвенных гуминовых кислот, фракционированных сочетанием гель-хроматографии и электрофореза // Известия РАН, серия биологическая. 2000. № 1, с.84-88.

27. Aguer J.-P., Trubetskaya O.E., Trubetsko] O.A., Richard С. Photoinductive properties of soil humic acids and their fractions obtained by tandem SEC-PAGE // Chemosphere. 2001. v.44, p.205-209.

28. Peuravuori J., Pihlaja K, Trubetskaya O.E., Trubetsko] O.A. The effects of a strong disaggregating agent on SEC-PAGE of aquatic and soil humic matter // International Journal of Environmental Analytical Chemistry. 2001. v.79, p.217-228.

29. Trubetskaya O.E., Trubetsko] O.A., Ciavatta C. Evaluation of the transformation of organic matter to humic substances in compost by coupling SEC-PAGE // Bioresourse Technology. 2001. v.77,p.51-56.

Ж Hermosin В., Trubetskoj O.A., Trubetskaya O.E., Saiz-Jimenez С. Thermally assisted hydrolysis and methylation of humic fractions obtained by Polyacrylamide gel electrophoresis I I Journal of Analytical and Applied Pyrolysis. 2001. v.58, p.341-347.

31. Trubetskaya O.E., Trubetsko] O.A., Saiz-Jimenez C. Polyacrylamide gel electrophoresis of humic and fill vie acids after acid hydrolysis // Fresenius Environmental Bulletin. 2001. v.10, p.635-637.

32. Peuravuori J., Pihlaja K., Trubetskaya O.E., Afanas'eva G. F., Rezntkova O.I., Trubetskoj O.A. SEC-PAGE characterization of lake aquatic humic matter isolated with XAD-resin and tangential membrane ultrafiltration // International Journal of Environmental Analytical Chemistry. 2001. v.80, p.141-152.

33. Trubetskaya O.E., Trubetskoj O.A., Guyot G., Andreux F., Richard C. Fluorescence of soil humic acids and their fractions obtained by tandem SEC-PAGE // Organic Geochemistry. 2002. v.33/3, p.213-220.

34. Aguer J.-P., Richard C„ Trubetskaya O., Trubetskoj O., Ltvique J. and Andreux F. Photoinductive efficiency of soil humic and fill vie acids, the influence of colored components // Chemosphere. 2002. v.49, p.257-261.

35. Cavern L, Ciavatta C., Trubetskaya O.E., Afanas'eva G.V., Reznikova О.1., Trubetskoj O.A. Capillary zone electrophoresis of soil humic acid fractions obtained by coupling SEC-PAGE // Journal of Chromatography A. 2003. v.938, p.263-270.

Научное и 5дание Автореферат О.А.Трубецкого

Налоювая льппа - общероссийский кчассификаюр продукции ОК-ОО.5-93, том 2; 953000 - киши и брошюры

02.04 03 1. Заказ 9842Р. Тираж 100 зкз Уел печ. л 2,0.

Отпечатано с орш пиала-макета в Объединенном паучпо-темшческом издательстве Путинского научною центра РАН

142290 г Пущино Московской обл , нросп Науки, 3 ОНТИ ПНЦ РАН '

«ß - 8 9 О 9

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Трубецкой, Олег Анатольевич

ВВЕДЕНИЕ б j

ГЛАВА I. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА

И ЭКСКЛЮЗИВНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ ДЛЯ I СТРУКТУРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ГУМУСОВЫХ ВЕЩЕСТВ

1. Основные варианты электрофоретических методов, | применяемых для фракционирования гумусовых веществ а). Электрофорез в растворе, на бумаге, целлюлозе и агар-агаре б). Электрофорез в полиакриламидном геле в). Изотахофорез и изоэлектрическое фокусирование г). Капиллярный электрофорез и капиллярный изотахофорез

2. Принципы и проблемы эксклюзивной хроматографии гумусовых веществ а). Эксклюзивная хроматография при низком давлении б). Высокоэффективная жидкостная эксклюзивная хроматография

I, в) . Проблемы эксклюзивной хроматографии гумусовых веществ i!!t

ГЛАВА II. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Характеристика почв а). Дерново-подзолистая почва б). Серая лесная почва в) . Чернозём г) . Краснозём

2. Экстракция и очистка гуминовых кислот

3. Определение элементного состава, содержания золы и влажности препаратов гуминовых кислот

4. Электрофорез гуминовых кислот в полиакриламидном геле в присутствии дезагрегирующих агентов

5. Эксклюзивная хроматография гуминовых кислот на сефадексе G

6. Определение спектров поглощения, коэффициентов экстинкции и цветности препаратов гуминовых кислот

7. Анализ структурных компонентов гуминовых кислот с помощью пиролитической газовой хроматографии/масс-спектрометрии в присутствии тетраметиламмония

8. Определение аминокислотного состава гуминовых КИСЛОТ

9. Ультрафильтрация гуминовых кислот

10. Реактивы, использованные в работе

ГЛАВА III. РАЗРАБОТКА МЕТОДА ЭЛЕКТРОФОРЕЗА ГУМИНОВЫХ КИСЛОТ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ В ПРИСУТСТВИИ

ДЕЗАГРЕГИРУЮЩИХ АГЕНТОВ

ГЛАВА IV. СОЧЕТАНИЕ ЭКСКЛЮЗИВНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С ЭЛЕКТРОФОРЕЗОМ ДЛЯ ПРЕПАРАТИВНОГО ПОЛУЧЕНИЯ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИХ ФРАКЦИЙ ГУМИНОВЫХ

КИСЛОТ

1. Выбор оптимальных условий эксклюзивной хроматографии на сефадексе для получения электрофоретических фракций гуминовых кислот

2. Применение сочетания эксклюзивной хроматографии с электрофорезом для препаративной наработки электрофоретических фракций почвенных гуминовых кислот различного генезиса

ГЛАВА V. КОМПЛЕКСНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПОЧВЕННЫХ ГУМИНОВЫХ КИСЛОТ И ИХ ФРАКЦИЙ, ПОЛУЧЕННЫХ СОЧЕТАНИЕМ ЭКСКЛЮЗИВНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С ЭЛЕКТРОФОРЕЗОМ

1. Спектрофотометрическое исследование

2. Пиролитическая газовая хроматография/масс-спектрометрия а). Идентификация структурных компонентов б). Оценка происхождения исследуемых препаратов

3. Аминокислотный состав

ГЛАВА VI. ВЗАИМОСВЯЗЬ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИХ ФРАКЦИЙ

ГУМИНОВЫХ КИСЛОТ с ГЕНЕЗИСОМ ПОЧВ

ГЛАВА VII. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СОЧЕТАНИЯ ЭКСКЛЮЗИВНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С ЭЛЕКТРОФОРЕЗОМ ДЛЯ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОЦЕССОВ УЛЬТРАФИЛЬТРАЦИИ И

КОМПОСТИРОВАНИЯ

1. Анализ эффективности фракционирования почвенных гуминовых кислот методом ультрафильтрации

2. Мониторинг созревания гуминоподобных веществ в процессе компостирования органических отходов

Введение Диссертация по биологии, на тему "Гуминовые кислоты различного генезиса"

По данным ЮНЕСКО более половины органического вещества природных экосистем нашей планеты содержится в виде гумусовых веществ (ГВ) - сложного комплекса природных органических гетерополимеров, различающихся молекулярными размерами и мономерным составом. Общая масса органического углерода почвы - 3 миллиарда тонн, значительно больше, чем масса других соединений углерода, включённых в глобальные геохимические циклы. Углерод газов атмосферы составляет 0.7, живых организмов - 0.48, поверхностных вод -0.25, морских вод - 0.5-0.8 млрд. тонн (Bohn, 1976). Принимая во внимание тот факт, что до 50% органического вещества почвы и до 80% органики природных вод представлены ГВ, становится ясной огромная роль этих соединений как в глобальном цикле углерода, так и в процессах трансформации живого вещества и образовании углекислого газа. Гумус является одновременно продуктом разложения живого вещества и источником его последующего образования, то есть одним из звеньев системы трофических связей между различными формами живых организмов. В последнее время доказано, что ГВ, будучи самым большим природным резервуаром углерода, являются одним из определяющих факторов парникового эффекта и связанного с ним глобального потепления климата планеты (Marmo, 2000).

Являясь обязательным и стабильным компонентом почв и природных вод, ГВ в значительной мере влияют на основные физико-химические свойства и обеспечивают многие токсикопротекторные функции экосистем, связывая и/или инактивируя пестициды, гербициды, тяжелые металлы, полициклические углеводороды и другие поллютанты.

История изучения ГВ насчитывает два столетия, и многие их функции (сельскохозяйственная, экономическая, экологическая и т.д.), а также условия формирования достаточно хорошо изучены как в России Тюриным И.В., Драгуновым С.С., Трусовым А.Г., Кононовой М.М., Александровой JI.H., Христевой Л.А., Орловым Д.С., Кауричевым И.С., Гаджиевым И.М., Ганжарой Н.Ф., Комиссаровым И.Д., Фокиным А.Д. и др., так и за рубежом Фляйгом В. (Flaig), Шнитсером М. (Schnitzer), Стевенсоном Ф. (Stevenson), Малколмом Р. (Malcolm), Фриммелем Ф. (Frimmel), Сайз-Хименесом Ц. (Saiz-Jimenez), Вершау Р. (Wershaw), Джессингом Е. (Gjessing), Клавинчем М. (Klavins) и др. Однако до сих пор не существует единого представления о механизмах образования и принципах строения ГВ, что частично связано с отсутствием стандартных подходов к изучению этого исключительно сложного класса соединений и многообразием используемых источников ГВ. В последнее время усиленно пропагандируется научная концепция, согласно которой определение структуры ГВ в принципе невозможно, так как по своему составу и условиям образования эти вещества являются исключительно неоднородным, и их структурные особенности тесно связаны с конкретным местом формирования и способом выделения. С другой стороны всё больше сторонников получает теория, в соответствии с которой структуру ГВ целесообразно рассматривать не как однозначные химические структуры (как например белки или нуклеиновые кислоты), но как ансамбль полидисперсных компонентов, обладающих физико-химическими свойствами, присущими данному классу соединений и позволяющими объяснить те или иные природные функции ГВ. В соответствии с вышеизложенным теоретическая разработка и экспериментальное подтверждение смысловых закономерностей в молекулярной структуре ГВ является одной из центральных задач современного физико-химического почвоведения и молекулярной экологии. Такие исследования открывают возможность идентификации и анализа процессов гумификации на молекулярном уровне, позволяют определять биогеохимическую роль ГВ, условия их образования, комплексообразвания с ионами металлов, а также создают основу для фундаментального усовершенствования диагностики гумусового режима в природных экосистемах и разработки методов мониторинга природных биосферных ресурсов.

ГВ, содержащиеся в природных плотных средах (почвах, донных отложениях, торфах, углях, компостах и т.д.), разделяют на три фракции -гуминовые кислоты (ГК), растворимые в щелочных и нейтральных растворах и выпадающие в осадок при рН<2, фульвокислоты (ФК), растворимые как в щелочных, так и в кислых растворах, а также гумин, нерастворимый ни в кислых, ни в щелочных растворах. ГВ, выделяемые из природных вод (морей, океанов, рек, озер, болот и т.д.), разделяют на ГК и ФК. Наиболее хорошо исследованные ГК и ФК из различных источников являются полидисперсными смесями органических гетерополимеров, и для анализа их структурных особенностей требуется применение современных методов фракционирования, т.е. разделения на индивидуальные вещества (что до сих пор не удавалось сделать) или группы соединений со сходными физико-химическими свойствами. Необходимо отметить, что в природной среде нет чёткой границы между гумусовыми и негумусовыми веществами (белками, полисахаридами и т.п.), между ними могут существовать ковалентные, электростатические, водородные и другие типы связей. Задачей любого метода фракционирования является обеспечение отделения ГВ от сопутствующих им веществ. Необходимо отметить, что традиционные методы фракционирования биополимеров и органических соединений ограничено применимы для ГВ в связи с их амфифильностью (наличию гидрофобной и гидрофильной частей в структуре) и способностью к комплексообразованию. Процедуру фракционирования необходимо осуществлять таким образом, чтобы по возможности предотвратить образование агрегатов и межмолекулярных комплексов. В силу вышеуказанных факторов фракционирование ГВ требует разработки новых нестандартных подходов.

Одним из наиболее эффективных методов фракционирования природных биополимеров является электрофорез, основанный на разделении макромолекул по таким важнейшим параметрам как электрический заряд, размер (или молекулярная масса) и пространственная конфигурация. Рядом исследователей (Кононовой М.М., Кауричевым И.С., Степановым В.В., Пахомовым А.Н., Каспаровым С.В., Тихомировым Ф.А., Курветто Н. (Curvetto), Ориоли Г. (Orioli), Клокинг P. (Klocking), Гонзалезом Н. (Gonzales) и др.) была показана принципиальная возможность электрофоретического разделения ГВ по заряду. Различные варианты метода были использованы для оценки гумусового состояния экосистем.

Другим методом, широко применяемым для изучения ГВ, является эксклюзивная хроматография (гель-фильтрация или гель-проникающая хроматография), основанная на пространственном разделении молекул различных размеров с помощью пористых гелей. С появлением эксклюзивной хроматографии (ЭХ) химия ГВ несомненно получила новый, исключительно информативный и достаточно простой метод для изучения структуры и функции ГВ, широко применяемый как российскими учеными Александровой JI.H., Тихомировым Ф.А., Фокиным А.Д., Карпухиным А.И., Ганжарой Н.Ф., Кауричевым И.С., Орловым Д.С., Милановским Е.Ю., Перминовой И.В. и др., так я зарубежными исследователями Джессингом Е. (Gjessing), Познером A. (Posner), Свифтом P. (Swift), Де Нобили М. (De Nobili), Бехером Г. (Becher), Пикколо А. (Piccolo) и др. Однако следует отметить, что результаты ЭХ одного и того же образца ГВ при различных хроматографических условиях (рН и ионная сила подвижной фазы и образца, тип геля, высокое или низкое давление в колонке, ионный состав элюирующего буфера и образца, концентрация образца и т.д.) часто противоречивы, а иногда взаимоисключающи. Проблему оценки эффективности фракционирования ГВ различными вариантами ЭХ можно легко разрешить, имея эталонные препараты ГК и ФК известного размера и молекулярной массы (ММ). Однако при существующей неопределённости структуры ГВ возможность создания универсальных ММ стандартов на сегодняшний день практически исключена. В этой ситуации представляется целесообразным оценить эффективность ЭХ, приняв во внимание распределение в хроматографическом профиле отдельных фракций, различающихся по другим физико-химическими свойствам (например, электрофоретической подвижности). Анализ результатов эксклюзивной хроматографии с помощью электрофореза предпринимался неоднократно, однако попытки обнаружить взаимосвязь между хроматографическим профилем и электрофоретическими зонами ГК или ФК были безуспешны.

Разработка стабильного метода электрофореза и его сочетания с эксклюзивной хроматографией является весьма актуальным направлением исследования молекулярного строения и функции ГВ в природных экосистемах. Это позволило бы глубоко и всесторонне изучить взаимосвязь между генетическими особенностями почв и электрофоретическими и хроматографическими параметрами почвенных ГВ. Можно с уверенностью утверждать, что от развития таких подходов во многом будет зависеть будущее физико-химического почвоведения и отдельных направлений молекулярной экологии.

Автор выражает глубокую благодарность научному сотруднику Гайде Владиславовне АФАНАСЬЕВОЙ, научному сотруднику Ольге Ивановне РЕЗНИКОВОЙ и старшему научному сотруднику, кандидату химических наук Ольге Евгеньевне ТРУБЕЦКОЙ за неоценимую помощь в работе.

Автор считает своим приятным долгом поблагодарить профессора Цезарео САЙЗ-ХИМЕНЕСА (С. Saiz-Jimenes), заведующего отделом биогеохимии Института природных ресурсов и агробиологии (Севилья, Испания) за помощь в выполнении некоторых экспериментов и профессора Клаудио ЧИАВАТТА (С. Ciavatta), заведующего лабораторией по исследованию гуминовых веществ почв и компостов факультета агробиологии Университета г.Болоньи (Италия) за любезно предоставленные образцы гуминоподобных кислот, выделенных из компостов различных сроков созревания.

Автор также благодарит Российский Фонд Фундаментальных Исследований (проект РФФИ-а-01-64666), Международный Научный Фонд (проект ISF-MU-0300) и Международную ассоциацию содействия сотрудничеству с учеными независимых государств бывшего Советского Союза (проект INTAS-01-0186), при финансовой поддержке которых была выполнена значительная часть настоящей работы.

Заключение Диссертация по теме "Почвоведение", Трубецкой, Олег Анатольевич

выводы

Разработан метод электрофореза в полиакрил амидном геле в присутствии дезагрегирующих агентов (ЭПАГ), позволяющий разделять различные по генезису гуминовые кислоты (ГК) на несколько стабильных дискретных электрофоретических фракций. Хорошая воспроизводимость метода доказана как его многократным повторением, так и ре-элекгрофорезом фракций.

Впервые показана взаимосвязь между эксклюзивно-хроматографическим (ЭХ) и электрофоретическим фракционированием почвенных ГК. ЭПАГ позволил оценить эффективность различных буферных систем для фракционирования почвенных ГК методом ЭХ.

С помощью сочетания ЭХ-ЭПАГ впервые реализована возможность выделения и препаративной наработки электрофоретических фракций почвенных ГК различного генезиса. Полученные весовые соотношения низко- и высокомолекулярных электрофоретических фракций ГК различного генезиса имеют логическую взаимосвязь с водным режимом исследованных почв. При промывном водном режиме, характерном для краснозема и дерново-подзолистой почвы, в составе ГК преобладают высокомолекулярные фракции, что частично объясняется вымыванием доли более подвижных низкомолекулярных фракций в нижележащие горизонты. При периодически промывном водном режиме, присущем чернозёму типичному и серой лесной почве, наблюдается преобладание низкомолекулярных фракций, обусловленное их преимущественной адсорбцией на минеральной части почвы в периоды дефицита влаги.

4. Величина рН, обусловленная генезисом исследованных почв, оказывала определённое воздействие на весовое соотношение электрофоретических фракций. Краснозём и дерново-подзолистая почва, имеющие кислые значения рН, характеризуются высоким содержанием высокомолекулярных фракций, в то время как в чернозёме типичном и серой лесной почве, значения рН которых близки к нейтральным, ГК были обогащены низкомолекулярными фракциями.

5. Более высокие значения ёмкости катионного обмена ГК чернозема типичного и серой лесной почвы в значительной мере обусловлены более высоким содержанием низкомолекулярных фракций в этих препаратах по сравнению с таковыми в ГК краснозёма и дерново-подзолистой почвы.

6. Генетические особенности почв, в основу которых положены представления о географических факторах, условиях и закономерностях гумусообразования, позволяют объяснить и связать содержание и некоторые индивидуальные особенности электрофоретических фракций с типом гумификации и функциональной ролью ГК в почвах различного генезиса. Каждый из изученных генетических факторов не является основополагающим в распределении фракций, и только совокупность факторов может привести к конечному итогу фракционного формирования исследованных ГК.

7. Распределение элекгрофоретических фракций исследованных ГК в матрице полиакриламидного геля происходило в основном по молекулярным размерам (MP). Уменьшение MP фракций соответствовало увеличению их электрофоретической подвижности. Значения коэффициентов экстинкции ЕС465 и цветности Е4/Е6 увеличивались при уменьшении MP и увеличении электрофоретической подвижности фракций для каждой исследованной ГК.

8. Пиролитическая газовая хроматография/масс-спекгрометрия препаратов ГК и фракций, основанная на термальном гидролизе с одновременным метилированием, впервые выявила неравномерное распределение гомологов жирных кислот микробного и растительного происхождения по фракциям, что указывает на их различное биогенное происхождение. Гомологи жирных кислот растительного происхождения идентифицированы только в высокомолекулярных фракциях. Основываясь на анализе данных о структурных компонентах ГК, полученных с помощью пиролитической газовой хроматографии/масс-спектрометрии можно предположить, что механизм формирования высокомолекулярных фракций из низкомолекулярных в исследованных ГК маловероятен.

Весовое содержание аминокислот снижалось с уменьшением MP и увеличением электрофоретической подвижности фракций независимо от генезиса почвенных ГК. Однако в высокомолекулярных фракциях не было существенного различия в содержании аминокислот, и, наоборот, различия более чем в 2 раза в весовом содержании аминокислот наблюдались в низкомолекулярных фракциях, что частично объясняется генезисом и связанной с ним биологической активностью почв.

Методы ЭПАГ и сочетание ЭХ-ЭПАГ в комплексе с новейшими физико-химическими методами впервые дали возможность выявить сходные вариации оптических свойств, аминокислотного состава и распределения жирных кислот, близкое электрофоретическое и хроматографическое поведение при переходе от высокомолекулярных фракций ГК к низкомолекулярным. Полученные закономерности служат прямым экспериментальным подтверждением общего принципа строения почвенных ГК независимо от их генезиса.

Электрофоретический анализ продуктов фракционирования почвенных ГК методами ультрафильтрации (УФ) и ЭХ показал, что ЭХ является более предпочтительным методом, чем УФ для получения индивидуальных электрофоретитических фракций. Тем не менее, метод УФ может быть успешно использован при определении MP фракций почвенных ГК, полученных сочетанием ЭХ - ЭПАГ.

Метод ЭПАГ и сочетание ЭХ-ЭПАГ оказались эффективными для мониторинга степени созревания гуминоподобных веществ в процессе компостирования органических отходов. Данные, полученные сочетанием ЭХ-ЭПАГ, позволяют, по крайней мере частично, решить вопрос о степени трансформации и тождественности компостных гуминоподобных веществ почвенным ГК.

4'

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты проведённых исследований убедительно показали эффективность разработанного метода электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии комплекса дезагрегирующих агентов и его сочетания с эксклюзивной хроматографией для аналитического и препаративного разделения ГК различного генезиса на несколько стабильных электрофоретических фракций. Полученные в настоящей работе данные о сходном электрофоретическом и хроматографическом поведении стабильных электрофоретических фракций почвенных ГК, закономерной вариации их оптических свойств и аминокислотного состава, а также распределения между фракциями жирных кислот и их гомологов, являются прямым экспериментальным подтверждением общего принципа молекулярного строения почвенных ГК независимо от их генезиса. Для идентификации происхождения исследуемых препаратов гуминовых веществ использовали так называемый преимущественный углеродный индекс (CPI - carbon preference index). В исходных препаратах ГК, а также их фракциях, величины CPI без сомнения указывают на биогенное происхождение всех исследованных препаратов. К тому же неравномерное распределение гомологов жирных кислот микробного и растительного происхождения по элекгрофоретическим фракциям указывает на их различное биогенное происхождение, что может служить одним из ключевых ориентиров при изучении взаимодействия ГК с различными поллютантами. Отдельное место в работе занимает изучение структурных ароматических и алифатических компонентов стабильных электрофоретических фракций. Хотя среди исследователей, занимающихся изучением структуры ГК, до настоящего времени нет единого мнения о типе связи между бензолполикарбоновыми кислотами и гуминовой матрицей, предположение о существовании бензолполикарбоновых кислот в свободном виде не подтверждается в наших исследованиях. Равномерное распределение бензолполикарбоновых кислот по всем фракциям доказывает наличие других видов связей (возможно сложноэфирных) между бензолполикарбоновыми кислотами и гуминовой матрицей независимо от генезиса исследованных ГК.

Следует особо подчеркнуть, что некоторые индивидуальные особенности электрофоретических фракций непосредственно связаны с типом гумификации и функциональной ролью ГК в почвах различного генезиса. Полученные весовые соотношения низко- и высокомолекулярных стабильных электрофоретических фракций и их некоторые структурные компоненты для ГК различного генезиса имеют логическую взаимосвязь с водным режимом, рН, ёмкостью катионного обмена, биологической активностью исследованных почв. Однако было бы ошибочно разделить исследованные в диссертации почвообразующие факторы на основные и второстепенные при рассмотрении их влияния на формированиие весового распределения стабильных электрофоретических фракций ГК и их структурных компонентов. Весьма вероятно, что только совокупность факторов может привести к конечному соотношению высоко- и низкомолекулярных фракций и их структурных компонентов в исследованных ГК.

Метод электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии комплекса дезагрегирующих агентов и его сочетание с эксклюзивной хроматографией были использованы для решения ряда практических задач. Полученный результат дает возможность применять электрофорез в качестве экспресс-метода оценки эффективности фракционирования почвенных ГК с помощью ультрафильтрации.

Разработанный метод электрофореза также показал свою эффективность при мониторинге степени созревания гуминоподобных веществ в процессе компостирования органических отходов, что позволяет использовать его в производственных условиях и частично решить вопрос о степени тождественности компостных и почвенных ГВ.

Таким образом, разработка метода электрофореза в поли акрил амидном геле в присутствии комплекса дезагрегирующих агентов, выделение и последующее изучение стабильных элекгрофоретических фракций новейшими физико-химическими методами дает возможность исследовать на молекулярном уровне структурные особенности ГК различного происхождения, усовершенствовать диагностику гумусового режима в природных экосистемах и разработать методы мониторинга биосферных ресурсов. Это в свою очередь открывает новые перспективы для решения целого ряда фундаментальных и прикладных задач физико-химического почвоведения и молекулярной экологии.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Трубецкой, Олег Анатольевич, Пущино

1. Александрова J1.H. 1970. Гумусовые вещества почвы (Их образование, состав, свойства и значение в почвообразовании и плодородии). Изд. Ленинградского с.-х. института. Т. 142,232 с.

2. Александрова JI.H. 1980. Органическое вещество почвы и процессы его трансформации. JI.: Изд. Наука, 288 с.

3. Аржанова B.C., Вертель В.Ф., Елпатьевская П.В. 1981. Микроэлементы и растворимое органическое вещество лизиметрических вод. Почвоведение, № 11, с.50-59.

4. Базилевич Н.И. 1993. Биологическая продуктивность экосистем Северной Евразии. М.: Наука, 293 с.

5. Вильк К.К. 1962. Природа горно-таежных ожелезненных почв Западного Забайкалья. Почвоведение, № 12, с.31-37.

6. Вильяме В.Р. 1949. Почвоведение (земледелие с основами почвоведения). М.: Сельхозгиз. 472 с.

7. Воейков В JI., Решетов П.Д., Набиев И.Р., Сычёв С.В., Арсеньев А.С., Быстрое В.Ф., Дёмин В.В., Розынов Б.В. 1992. Физико-химические методы исследования биополимеров и низкомолекулярных регуляторов. М.: Наука, 406с.

8. Волобуев В.Р. 1948. Изменение содержания гумуса в почвах СССР в зависимости от климатических условий. Доклады АН СССР, т. LX, №1.

9. Высоцкий Г. Н. 1962. Избранные труды. Т. 1. Изд-во А.Н. СССР, 499 с.

10. Гаджиев И.М. 1976. Почвы бассейна реки Васюган. Новосибирск: Наука, Сибирское отделение, 152 с.

11. Гаджиев И.М. 1982. Эволюция почв южной тайги Западной Сибири. Новосибирск: Наука, Сибирское отделение, 297с.

12. Гаджиев И.М. и Клёнов Б.М. 1976. О дерново-подзолистых почвах со вторым гумусовым горизонтом Свердловской области. География и генезис почв. Новосибирск: Наука, Сибирское отделение, с. 32-47.

13. Ганжара Н.Ф., Кауричев И.С. и Фокин А.Д. 1968. Исследование водорастворимых органических веществ почв с применением сефадекса. Докл.ТСХЛ, вып.5, с.157-161.

14. Ганжара Н.Ф. 1969. Фракционирование гумусовых веществ почв методом гелевой фильтрации. Докл. ТСХЛ, вып. 149, с.95-99.

15. Ганжара Н.Ф. 1997.Концептуальная модель гумусообразования. Почвоведение, № 9, с.1075-1080.

16. Ганжара Н.Ф. 2001. Почвоведение. М.: Изд. "Агроконсалт", 392с.

17. Гедройц К.К. 1926. Почвенный поглощающий комплекс и почвенные поглощённые катионы как основа почвенной генетической классификации. Труды Носов, с.-х. Опыт. Ст. Вып. 38.

18. Гедройц К.К. 1927. Почвенный поглощающий комплекс и почвенные поглощённые катионы как основа почвенной генетической классификации. Труды Носов, с.-х. Опыт. Ст. Вып. 47.

19. Глазовская М. А. 1981. Общее почвоведение и география почв. М.:Высшая школа.

20. Горбунов Н.И. 1974. Минералогия и коллоидная химия почв. М.; Наука, 293 с.

21. Горбунов Н.И. 1978. Минералогия и коллоидная химия почв. М.; Наука, 298 с.

22. Гордиенко С.А., Гавриш И.Н. и Ивахно Л.И. 1973. Сравнительное исследование торфяных гуминовых кислот методом гель-хроматографии на сефадексах. Почвоведение, №11, с.138-142.

23. Дергачёва М.И. 1989. Система гумусовых веществ почвы. Новосибирск. Изд-во Наука, Сиб.отделение. 110 с.

24. Докучаев В.В. 1883. Русский чернозём. СПб. То же. Соч., т. 1. Изд-во АН СССР, 1949.

25. Драгунов С.С., Желоховцева Н.Н. и Стрелкова Е.И. 1948. Сравнительное исследование почвенных и торфяных гуминовых кислот. Почвоведение, № 7, с. 54-59.

26. Дроздова Т.В. и Емельянова М.П. 1960. Внутрикомплексные соединения меди с гуминовыми веществами. Докл. АН СССР, т. 131, № 3, с.651-654.

27. Дубин В.Н., Фильков В.Н. 1968. Фракционирование гуминовых кислот некоторых почв Молдавии через сефадексы. Почвоведение, № 5, с.85-93.

28. Дударчик И. М. 1993. Связывание гуминовых кислот глинистыми минералами. В книге "Гуминовые вещества в биосферИздательство Наука, с. 139-143.

29. Жигунов А.В. и Шурухина С.И. 1975. Сезонная динамика некоторых свойств гуминовых кислот дерново-подзолистой почвы. Научные доклады высшей школы, Биологические науки, № 10, с. 128-132.

30. Зонн С.В. 1982. Железо в почвах (генетические и географические аспекты). М:. Изд-во Наука, 207 с.

31. Зырин Н.Г., Овчинникова М. Ф., Орлов Д.С. 1964. Аминокислотный состав гуминовых кислот и фульвокислот некоторых типов почв. Агрохимия, с. 135146.

32. Иенни Г. 1948. Факторы почвообразования. М., ИЛ. 223 с.

33. Карпухин А.И. 1993. Функциональная роль комплексных соединений в генезисе почв и питании растений. В книге "Гуминовые вещества в биосфере" Издательство Наука, с. 117-125.

34. Карпухин А.И. и Фокин А.Д. 1969. Хроматографическое фракционирование фульвокислот. Известия ТСХА, Выпуск 5, с. 139-146.

35. Карпухин А.И. и Фокин А.Д. 1971 .Фракционный состав фульвокислот некоторых типов почв. Известия ТСХА, Выпуск 3, с. 126-130.

36. Карпухин А.И., Платонов И.Г., Шестаков Е.И. 1982. Органо-минеральные соединения подзолистых остаточно-карбонатных легкосуглинистых почв Архангельской области. Почвоведение, № 3, с.37-45.

37. Карпухин А.И., Гасанов A.M., Гончарук Т.С. 1985. Гель-хромаггографические исследования соединений железа в почве. Известия ТСХА, Выпуск 4, с. 8491.

38. Каспаров С.В. и Тихомиров Ф.А. 1978. Выбор элюентиых систем для гель-фильтрации гумусовых кислот чернозёма. Вестник МГУ, сер. Почвоведение, №4, с. 33-39.

39. Каспаров С.В., Тихомиров Ф.А. и Флесс А.Д. 1981. Применение метода электрофореза для фракционирования гуминовых кислот. Вестник МГУ, сер. Почвоведение, № 1, с.23-30.

40. Качинский Н.А. 1970. Физика почвы, ч. II. М. Высшая школа. 211с.

41. Кауричев И.С. 1982. Почвоведение. М.: Изд. Колос, 496с.

42. Кауричев И.С., Федоров Е.А. и Шнабель И.А. 1960. Разделение гуминовых кислот при помощи метода непрерывного электрофореза на бумаге. Почвоведение,№ 10, с.31-36.

43. Кауричев И.С., Базилинская Н.В., Заболотнова JI.A. 1972. Качественный состав водорастворимого органического вещества, извлекаемого из гумифицированных и негумифицированных растительных остатков. Известия ТСХА, выпуск 2, с. 100-109.

44. Кауричев И.С., Фокин А.Д. и Карпухин А.И. 1978. Водорастворимые органо-минеральные соединения почв таежно-лесной зоны. Докл. ТСХА, вып.243, с.35-42.

45. Кейтс М. 1975. Техника липидологии. М. Изд. Мир, с. 324.

46. Клёнов Б.М. 1981. Гумус почв Западной Сибири. М.: Наука. 144 с.

47. Клёнов Б.М. 2000. Устойчивость гумуса автоморфных почв Западной Сибири. Н.: Изд. СО РАН, филиал ГЕО, 176 с.

48. Клёнов Б.М., Корсунова Т.М. 1976. Гумус некоторых типов почв Западной Сибири. Новосибирск: Наука, Сиб. Отделение, 158 с.

49. Колесников М.П. 1978. Молекулярно-весовое распределение гуминовых кислот по данным гель-хроматографии на сефадексах. Почвоведение, №4, с.32-38.

50. Комиссаров И.Д., Логинов Л.Ф. 1971. Электронный парамагнитный резонанс в гуминовых кислотах. В книге: Гуминовые препараты. Тюмень, с. 99-115.

51. Комиссаров И.Д., Логинов Л.Ф., Елин Е.С. 1978. Некоторые вопросы изучения реакционной способности гуминовых кислот. В книге: О почвах Сибири. Новосибирск: Наука, с. 219-225.

52. Комиссаров И.Д., Логинов Л.Ф. 1993. Молекулярная структура и реакционная способность гуминовых кислот. В книге "Гуминовые вещества в биосфере" Издательство Наука, с. 36-45.

53. Кононова М.М. 1963. Органическое вещество почвы. М.: Изд.АН СССР, 314с.

54. Кононова М.М. и Бельчикова Н.П. 1961. Ускоренные методы определения состава гумуса минеральных почв. Почвоведение, № 10, с.75-87.

55. Ленинджер Л. 1985. Основы биохимии, том первый. М.: Изд.Мир, 365 с.

56. Милановский Е.Ю. 1984. Применение ионного детергента в гель-I хроматографии гумусовых веществ. Почвоведение, № 8, с.142-146.

57. Милановский Е.Ю. 2000. Амфифильные компоненты гумусовых веществ почв. Почвоведение, № 6, с.706-715.

58. Морозков B.K. 1974. Гель-фильтрация гуминовых кислот каштановой и дерново-подзолистой почв. Изв. Сиб. отделения АН СССР, серия биологическая, № 5, вып.З, с.169-170.

59. Морозков В.К. 1981 Особенности макромолекулярной структуры гумусовых веществ некоторых почв Западной Сибири. Автореферат кандидатской диссертации. Новосибирск.

60. Орлов Д.С. 1974. Гумусовые кислоты почв. М.:Изд. МГУ, 332 с.

61. Орлов Д.С. 1990. Гумусовые кислоты почв и общая теория гумификации. М.: Изд. МГУ, 324 с.

62. Орлов Д.С. и Овчинникова М.Ф. 1966, Различные формы соединений азота в серозёме, чернозёме и дерново-подзолистой почве. Агрохимия, № 1, с. 35.

63. Орлов Д.С., Аммосова Я.М., Глебова Г.И., Горшкова Е.И., Ильин Н.П. и Колесников М.П. 1971. Молекулярные веса, размеры и конфигурация частиц гумусовых кислот. Почвоведение, № 11, с.43-57.

64. Орлов Д.С. и Пивоварова И. А. 1974. Об избирательном поглощении глинистыми минералами различных фракций гумусовых веществ. Почвоведение, № 5, с.59-67.

65. Орлов Д.С. и Милановский Е.Ю. 1987. Гель-хроматография в почвоведении -возможности и ограничения метода. Современные физико-химические методы исследования почв. М.: Изд. МГУ, с. 94-118.

66. Орлов Д.С., Демин В.В., Завгородняя Ю.А. 1997. Влияние молекулярных параметров гуминовых кислот на их физиологическую активность. Доклады Академии Наук, Т. 354, № 6, с. 843-845.

67. Остерман J1.A. 1985. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Изд. Наука, 536 с.

68. Полынов Б.Б. 1934. Кора выветривания. М.: JL: Изд-во АН СССР Ч. I, 335 с.

69. Пономарева В.В. и Плотникова Т.А. Гумус и почвообразование. 1980. JL: Изд. Наука, 221 с.

70. Поспишил Ф. 1962. Электрофорез гумусовых веществ и их комплексов с медью. Почвоведение, № 12, с.44-52.

71. Ремезов Н.П. 1933. О качественном составе органического вещества почв СССР. Почвоведение, № 5, с.34-42.

72. Роде А.А. 1965. Основы учения о почвенной влаге, т. I и т. II. Л.: Гидрометеоиздат.

73. Ростовщикова И.Н. 2002. Состав и свойства фракций гуминовых кислот, различных по молекулярным массам. Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук. М., 27с.

74. Ростовщикова И.Н. и Корнеева Г.А. 1999. Роль веществ гумусовой природы в ферментативных процессах деструкции органического вещества. Известия РАН, сер. биологическая, № 3, с. 359-366.

75. Симаков В.Н. и Алябина Г.А. 1972. Изучение фракционного состава гуминовых кислот некоторых типов почв методом гель-фильтрации. Почвоведение, № 7, с.63-68.

76. Симаков В.Н. и Жигунов А.В. 1975. Динамика состава и свойств водорастворимого органического вещества при компостировании корней клевера и тимофеевки. Вестник ЛГУ, Сер. 16. Биология, №3, вып. 1, с.116-121.

77. Симаков В.Н. и Шурухина С. И. 1972.Экстракция органического вещества чернозёма диметилформамидом. Вестник ЛГУ, Сер. 16. Биология, №3, вып. 1, с. 128-134.

78. Степаненко JI. С., Ребачук Н.М., Максимов О.Б. 1969. Методы фракционирования гуминовых кислот. Разделение фильтрацией на гелях. Химия твёрдого тела. № 2, с. 37-43.

79. Степаненко JI. С., Ребачук Н.М., Максимов О.Б. 1972. Использование хроматографии на гелях для изучения состава и реакционной способностигуминовых кислот. Новые методы исследования гуминовых кислот. Владивосток, с. 90-105.

80. Степанов В.В. и Пахомов А.Н. 1969. Электрофорез гумусовых веществ в полиакриламидном геле. Почвоведение, № 12, с.48-56.

81. Степанов В.В. и Остроухова Т.М. 1970. Электрофорез гумусовых веществ на агар-агаре. Почвоведение, № 2, с.44-55.

82. Титлянова А.А. и Наумов А.В. 1995. Потери углерода из почв Западной Сибири при их сельскохозяйственном использовании. Почвоведение, № 11, с. 57-62.

83. Титлянова А.А. и Косых Н.П. 1997. Изменение продуктивности ландшафтов Западной Сибири в связи с различным использованием земель (на примере Новосибирской области). Сибирский экологический журнал, № 4, с. 347-359.

84. Титова Н.А. 1962. Железо-гумусовые комплексы некоторых почв. Почвоведение, № 12, с.38-43.

85. Тихомиров Ф.А., Каспаров С.В., Пристер Б.С. и Курбатов В.М. 1978. Изучение взаимодействия иода-131 с гуминовыми кислотами методом гель-хроматографии. Почвоведение, №12, с.52-59.

86. Трусов А.Г. 1916. О некоторых химико-биологических процессах, совершающихся при гумификации растительных остатков. Ж. Опытной агрохимии. Т. 17.

87. Тюрин И.В. 1937. Органическое вещество почв. М.: Сельхозгиз, 288 с.

88. Тюрин И.В. 1965. Органическое вещество почв и его роль в плодородии. М.: Наука, 320с.

89. Умаров М.М. и Асеева И.В. 1971. Свободные аминокислоты некоторых почв. Почвоведение, №10, с. 108-111.

90. Фокин А.Д. 1974. Исследование процессов трансформации, взаимодействия и переноса органических веществ, железа и фосфора в подзолистой почве: Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук. М., 28с.

91. Фокин А.Д., Аргунова В.К., Кауричев И.С . и Яшин И.М. 1973. Состав органического вещества, состояние полуторных окислов и фосфатов в водах, дренирующих подзолистые почвы. Изв. ТСХА, вып.2, с.99-105.

92. Фокин А.Д. и Карпухин А.И. 1972.Исследование состава комплексных соединений фульвокислот с железом. Изв. ТСХА, вып.1, с.132-137.

93. Фокин А.Д. и Карпухин А.И. 1974. Исследование гумификации растительных остатков и превращений гумусовых веществ в почве с использованием изотопа

94. С14. Почвоведение, № 11, с. 72-78.

95. Фокин А.Д., Князев Д. А., Кузяков Ю. В. 1992. Деструкция аминокислот и нуклеиновых оснований в почве и их поступления в растение (на примере аланина, глицина и урацила). Почвоведение, № 10, с. 70-80.

96. Хмельницкий Р.А., Лукашенко И.М., Крымский Я.Я., Черников В.А. 1977. Методика анализа фульвокислот методом пиролитической масс-спектрометрии. Известия ТСХА, вып.З, с.201-206.

97. Христева Л.А. 1977. К природе действия физиологически активных гумусовых веществ на растения в экстремальных условиях. Гуминовые удобрения: теория и практика их применения. Днепропетровск, т.б, с. 315.

98. Цыпленков Б.П. 1983. Использование изоэлектрофокусирования при сравнительной характеристике гумусовых соединений почв. Вестник ЛГУ, № 15, с.106-108.

99. Черников В. А. и Кончиц В А. 1979. Исследование гумусовых кислот почв дериватографическим методом. Биологические науки, № 2, с. 70- 75.

100. Шарков И.Н. 1997. Минерализация и баланс органического вещества в почвах агроценозов Западной Сибири. Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук. Новосибирск, 37с.

101. Шарков И.Н., Спарроу С. Д., Кокран В.Л. 1992. Минерализация углерода и азота в почвах различных природных зон. Сибирский биологический журнал, №6, с. 36-41.

102. Шарков И.Н., Иодко JI. С. 1996. Влияние ежегодного внесения растительных остатков на накопление органического вещества почвы (опыты с 14С). Почвоведение, № 9, с. 1072-1077.

103. Ширшова JI.T. 1991. Полидисперсность гумусовых веществ почв. М.: Изд. Наука, 85с.

104. Аак О., Galykin Y. A., Kashkin А. P., Yakovlev Y.I. 1984. Isoelectric focusing of high-molecular weight shale and humic acids. Prikl. Biokhim. Microbiol., v. 20, p. 290-294.

105. Aiken G.R. 1984. Evaluation of ultrafiltration for determing molecular weight of fulvic acid. Environ. Scu Technol., v. 18, p.978-981.

106. Almendros G., Polo A., Dorado E. 1983. Estudio de los comuestos humicos en diversos tipos de compost preparados a partir de paja de trigo. Agrohimica, v. 27, p. 310-325.

107. Almendros G., Martin F., Gonzalez-Vila F J. and Del Rio J.C. 1993. The effect of various chemical treatments on the pyrolytic pattern of peat humic acid. Journal of Analytical and Applied Pyrolysis, v. 25, p. 137-147.

108. Amy G.L. Collins M.R. Kuo C. J., King P. H. 1987. Comparing gel permeation chromatography and ultrafiltration for the nolecular weigth characterizationof aquatic organic matter. /. Am. Water Works. Assoc., v.79, p. 43-49.

109. Amy G. L., Sierka R.A., Bedessem J., Price D., Tan L. 1992. Molecular size distribution of dissolved organic matter. /. Am. Water Works. Assoc., v.84, p. 67-75.

110. Anderson H. A. and Hepburn. A. 1977. Fractionation of humic acid by gel permeation chromatography. J. Soil Science, v.28. p.634-644.

111. Anderson H. A., Bick W., Hepburn. A., Stewart M. 1989. Nitrogen in humic substances. In: Humic Substances II: In Search of Structure. M.H.B.Hayes, P. MacCarthy, R. L. Malcolm, and S. Swift (eds.)John Wiley & Sons, Chicester, UK, pp. 223-253.

112. Aoyama M., Watanabe A. and Nagao S. 2000. Characterization of the "fluorescent fractions" of soil humic acids. In: Humic Substances. Versatile Components of Plants, Soil and Water. Eds. Ghabbour E.A. and Davis G., RSC, Boston, USA, p. 125133.

113. Aoyama M. and Kumakura N. 2002. High and low molecular weight components of soil humic acids as affected by plant residue applications. Proceedings of the 12 International Meeting of the International Humic Substances Society, Boston, USA, p.25-27.

114. Baba J.L. and Schroeder R.A. 1975. Amino acid racemization reactions and their geochemical implications. Naturwissenschafien, v. 62, p.71-79.

115. Baes A.U. and Bloom P.R. 1990. Fulvic acids ultraviolet-visible spectra: influence of solvent and pH. Soil ScLSocAm.J. v.54. p. 1248-1254.

116. Bailly J.-R. and Margulis H. 1968. Etude de quelquesacides humiques sur gel de dextrane. Plant and Soil, v. 29. p. 343-361.

117. Bailly J.-R. and Tittonel E. 1972. Etude de quelquesacides humiques sur gel de dextrane. Plant and Soil, v. 37. p. 57-80.

118. Batler J.H.A. Ladd J.N. 1969. Effect of extractant and molecular size on the optical and chemical properties of soil himic acids. Austral. J. Soil Res. v. 7, p. 229-235.

119. Barak P., Chen Y. 1990. Equivalent radii of humic macromolecules from acid-base tetration. Soil Science, v. 154. p. 184-195.

120. Barth H.G., Boyes B.E. Jacksonn C. 1996. Size exclusion chromatography. AnaLChemv.68, p.445R-466R.

121. Baxter R.M. and Malysz J. 1992. Analysis of aquatic humic material and high molecular weigt components of bleached kraft mill effluent (BKME) by gradient gel electrophoresis. Chentospkere, v.24, p.1745-1753.

122. Berden M. and Berggren D. 1990. Gel filtration chromatography of HS in soil solutions using HPLC determination of the molecular weight distribution. J. Soil ScL, v.41, p.62-72.

123. Bhandari G. S., Maskina M.S. and Randhava W.S. 1970. A study of humic and fulvic fraction of some soils of different agro-climatic regions of the Erstwhile Pendjab. Geoderma, v.3, p. 239-247.

124. Blondeau R. 1986. The fractionation of humic acids on Sephadex Gel: the role of salts and extractants. Agrohimica, v. 30, p. 128-136.

125. Bohn H.L. 1976. Estimate of organic carbon in world soils. Soil Science Society of America Journal, v. 40, p. 468 -470.

126. Bremner J.M., 1967. Nitrogenous compounds. In: Soil Biochemistry, A.D. Mc Laren and Peterson G.H. eds. Marcel Drekker, New York, p. 19-66.

127. Brisbane P.G., Amato M. and Ladd J.N. 1972. Gas chromatographic analysis of amino acids from the action of proteolytic enzymes on soil humic acids. Soil BioL & Biochem, v.4, p. 51-61.

128. Buffle J., Deladoey P., Haerdi W. 1978. The use of ultrafiltration for the separation and fractionation of organic Iigands in fresh waters. Anal. Chem. Acta, v. 101, p.339-357.

129. Burba P., Shkinev V., Spivakov B.Y. 1995. On-line fractonation and characterization of aquatic humic substances by means of sequential stage ultrfiltation. Fresenius J. Anal. Chem. v.351, p.74-82.

130. Butler J.H.A. and Ladd J.M. 1971. Importance of the molecular weight of humic and fulvic acids in determing their effects of protease activity. Soil BioL & Biochem, v.3, p.249-257.

131. Cabaniss S.E., Zhou Q., Maurice PA., Chin Y.-P. and Aiken G.R. 2000. A long-normal disstribution model for the molecular weight of aquatic fulvic acids. Envir.ScLTechnol., v.34, p.l 103-1109.

132. Cacco G., Maggioni A. and Ferrari G. 1974. Electrofocusing: a new method for characterization of soil humic matter. Soil BiolBiochem., v.6, p.145-148.

133. Cameron R.S., Swift R.S., Thornton B.K., Posner. A.M. 1972a. Calibration of gel permeation chromatography materials for use with humic acid. J. Soil Science, v.23. p.342-349.

134. Cameron R. S., Swift R. S., Thornton В. K., Posner. A. M. 1972b. Molecular weight and shape of humic acids from sedimentation and diffilsion measurements on fractionated extracts. Journal of Soil Science,, v.23. p.394-108.

135. Castagnola M.,. De Las Heras R.G, Marini-Bettolo G.B. and Nigro C. 1978. Effect of urea on electrophoretic pattern of soil humic acids. J. Chromatography, v. 147, p.438-442.

136. Castagnola M., Nigro C., Marini- Bettolo G.B., Milana A. and De Las Heras R.G. 1979. Characterization of soil humic acid by combined polyacrylamide disc electrophoresis and chromatic reactions. J. Chromatography, v. 177, p. 130-134.

137. Ceccanti В., Nannipieri P., Cervelli S., Sequi P. 1978, Fractionation of humus -urease complexes. Soil Biol. & Biocem, v. 10, p. 39 45.

138. Ceccanti В., Alcaniz-Baldellou J.M., Gispert-Negrell N. and Gassiot-Matas N. 1986. Characterization of organic matter from two different soils by pyrolysis-gas chromatography and isoelectric focusing. Soil Science. 142, p. 83 90.

139. Ceccanti В., Calcinai M., Bonmati-Pont M., Ciardi С., Tarsitano R. 1989. Molecular size distribution of HS with ionic strength. ScL Total Environ. 81/82, p. 471-479.

140. Ciavatta C., Govi M. 1993. Use of insoluble polyvinylpyrrolidone and isoelectric focusing in the study of humic substances in soils and organic wastes. Journal of Chromatography, v.643, p. 261-270.

141. Ciavatta C., Govi M., Pasotti L. Sequi P. 1993. Changes in organic matter during stabilization of compost from municipal solid wastes. Bioresource Technol v.43, p. 141-145.

142. Ciavatta C., Govi M., Sitti L. and Gessa C. 1995. Capillary electrophoresis of humic acid fractions. Commun.Soil ScLPlant Anal., v.26, p.3305-3313.

143. Ciavatta C., Govi M., Banoretti G. and Gessa C. 1996. Identification of peat and leonardite using humification parameters and isoelectric focusing. Fert. Res., v.44, p .225-230.

144. Chakraborty G., Baneijee S.L., Gupta S.K. 1979. Molecular weight and total acidities of humic acids extracted from soil aggregates of different sizes. Journal Ind. Soc. Soil Science, v. 27, p. 129-132.

145. Challa O., Raman K.V. Raman S. 1985. Studies on humic substances from forest soils of Tarai (foot-hills). Region of Uttar Pradesh. Journal Ind. Soc. Soil Science, v. 35, p. 5-10.

146. Challinor J.M. 1995. Characterization of wood by pyrolysis derivatization-gas chromatography/mass spectrometry. J^naLAppLPyrolysis, v.35, p.93-107.

147. Chefetz В., Van Heemst J.D.H., Chen Y., Romaine C.P., Chorover J., Rosario R., Mingxin G., Hatcher P.G. 2000. Organic matter transformations during the weathering process of spent mushroom substrate. J.Environ.Qual., v.29. p.592-602.

148. Chen J., Senesi N. and Schnitzer M. 1977. Information provided on humic substances by E4/E6 ratios. Soil Science Society of America Journal, v.41, p.352-358.

149. Christl I., Knicker H., K6gel-Knabner I., Kretzschmar R. 2000. Chemical heterogeneity of humic substances: characterization of size fractions obtained by hollow-fibre ultrafiltration. Eur. J. Soil Science, v.51, p.617-625.

150. Chin Y.-P., Aiken G. and O'Loughlin E. 1994. Molecular weight, polydispersity, and spectroscopic properties of aquatic humic substances. Environ.Sci. TechnoL, v.28,p.l 853-1858.

151. Chin Y.-P., Aiken G.R. and Danielsen К. M. 1997. Binding of pyrene to aquatic and commercial humic substances: the role of molecular weight and aromaticity. EnvirotuScL TechnoL, v.31, p.1630-1635.

152. Clapp C.E. 1957. High moleculer weight water soluable muck: isolation and determination of constituent sugars of a borate complex-forming polysaccharideemploying electrophoretic techniques. PhD Thesis. Cornell Universssity, Ithaca, NY.

153. Coble P. G., Green S. A., Blough N. V., Gagosian, R. B. 1990. Characterization of dissolved organic matter in the Black Sea by fluorescence spectroscopy. Nature, 348, 432-435.

154. Condron L.M. and Goh K.M. 1989. Molecular weght distribution of soil organic phosphorus under irrigated pasture in New Zeland. J.Soil Science, v.40, p.873-878.

155. Coulson C.B., Davies R.I. and Khan E.J. 1959. Studies in the fractionation of humic acids. /. Soil Scu, v.10, p.271-283.

156. Cowie G. L., Hedges J. I. and Calvert S.E. 1992. Sources and relative reactivities of amino acids, neutral sugars and lignin in an intermittently anoxic marine environment. Geochim. Cosmochim. Acta, v. 56, p. 1963 1978.

157. Curvetto N.R, Balmaceda N.A. and Orioli G.A. 1974. Isotachophoresis and isoelectric focusing of soil humic substances in polyacrylamide gel. Л Chromatography, v.93, p.248-250.

158. Curvetto N.R. and Orioli G.A. 1982. Electrophoretic subfractionation of low and high molecular weight humic acid fractions. Plant and Soil, v.66, p.205-215.

159. Czerney P. and Fielder H.J. 1968. Rahmenwerte fur die chemishen Eigenshaften von Fichtenhumus. Wissenschaftliche Ztschr. Techn. Univ. Drezden. Bd. 17, H.l. s. 223.

160. Danneberg O.H. 1981. Possibilities for separation of humic and non-humic substances. Bodenkultur, v.32, p. 93-104.

161. Dawson HJ., Ugolini F.C. Hrutfiord B.F. and Zachara J. 1978. Role of soluble organics inn the soil processes of a podzol, Central Cascades, Washington. Soil Science, v.126, p.290-296.

162. Dawson H.J., Hrutfiord B.F. Lososki R.J. and Ugolini F.C. 1981. The molecular weight and origin of yellow organic acids. Soil Science, v.132, p.191-199.

163. De Gonzalez N.M., Castagnola N. and Rossetti D. 1981. Humic acid characterization of Colombian soil by disc electrophoresis and infrared spectroscopy following gel filtration. J. Chromatography, v.209, p.421-431.

164. Del Rio J.C., McKinney D.E., Knicker H., Nanny M.A., Minard R.D., Hatcher P.G. 1998. Structural characterization of bio- and geo-macromolecules by off-line thermochemolysis with tetramethylammonium hydroxide. J. Chromatography A, v.823, p.433-448.

165. De Leeuw J.W. and Baas M. 1993. The behaviour of esters in the presence of tetramethylammonium salts at elevated temperatures; flash pyrolysis or flash chemolysis? JAnaLAppLPyrol, v.26, p. 175-184.

166. De Nobili M., Cercignani G., Leita L., Sequi P. 1986. Evaluation of organic matter stabilization in sewage sludge. Commurt .Soil Sci. Plant Anal., v. 17, p. 1109-1119.

167. De Nobili M. 1988. Electrophoretic evidence of the integrity of humic substances separated by means of electrofocusing. J. Soil Science, v.39, p.437-445.

168. De Nobili M., Bragato G., Alcaniz J.M., Puigbo A. and Cornelias L. 1990. Characterization of electrophoretic fractions of humic substances with different electrofocusing behaviour. Soil Science, v.150, p.763-770.

169. De Nobili M. and Fornasier F. 1996. Assesment of the effect of molecular size on the electrophoretic mobility of humic substances. Eur. J. Soil Science, v.47, p.223-229.

170. De Nobili M., Bragato G. and Mon A. 1998. Combined effects of molecular size and electroendosmotic flow on the capillary electrophoretic behaviour of humic substances. Acta Hydrochim. HydrobioL v. 3,186-190.

171. De Nobili M. and Chen Y. 1999. Size exclusion chromatography of humic substances: limits, perspectives and prospectives. Soil Science, v.164, p. 825-833.

172. De Nobili M., Bragato G. and Mori A. 2001. Capillary electrophoresis of humic substances in physical gels. In: Humic Substances. Structures, Models and Functions. Ed. E.A Ghabbour and G. Davies, RSC, Boston, USA, 109-119.

173. Diaz-Burgos M.A. and Polo A. 1991. Variaciones de la fraccio organica durante el compostaje de lodos de depuraciones. Sueloy Planta.y. 1, p. 453-466.

174. Dormaar J.F. 1974a. Comparison of several methods for extracting organic matter from chernozemic and transformed chernozemic Ah horizons. Canadian J Soil Sc, v 54, p. 241-244.

175. Dormaar J.F. 1974b. Molecular sieve chromatography of humic substances extracted with chelating resin from chernozemic Ah horizons. Plant and Soil, v. 41, p. 51-64.

176. Drozdova T.Y. 1963. Role of humic acids in soil geochemistry. Sov. Soil ScL, v.8, p.753-758.

177. Dubach P. and Metha N.C. 1963. The chemistry of soil humic substances. Soils and Fertilizers, v. 26, p.293.

178. Dunkelog R., Rflttinger H.-H. and Peisker K. 1997. Comparative study for the separation of aquatic humic substances by electrophoresis. J. Chromatography A, уП11, p.355-362.

179. Duxbury J.M. 1975. Fractionation of soil organic matter by electrofocussing. Agronomy Abstracts, Annual Meeting of the American Society of Agronomy. University of Tennessee, Knoxxville, TN, p. 127.

180. Duxbury J.M. 1989. Studies of the molecular size and charge of humic substances by electrophoresis. In M.H.B. Hayes, P. MacCarthy, R.L. Malcolm & R.S. Swift, eds. Humic Substances II. John Wiley & Sons, Chichester, p.593-620.

181. Eloff J.N. and Pauli F.W. 1975. The extraction and electrophoretic fractionation of soil humic substances. Plant and Soil, v.42, p.413-422.

182. Fabbri D. and Helleur R. 1999. Characterization of the tetramethylammonium hydroxide thermochemolysis products of carbohydrates. JjlnaLAppLPyrolysis, v.49, p.277-293.

183. Felbeck G.T. 1971. Structural hypotheses of soil humic acids. Soil Science, v. Ill, p. 42-48.

184. Fetsch D. and Havel J. 1998. Capillary zone electrophoresis for the separation and characterization of humic acids. J. Chromatography A, v.802, p. 189-202.

185. Flaig W. 1971. Organic compounds in soil. Soil Science, v. 111, p. 19-33.

186. Flaig, W. 1988. Generation of model chemical precusors. In: Humic Substances and tj; their Role in the Environment (eds F.H. Frimmel & R.F. Christman) pp.75-92. John

187. Wiley & Sons, Chichester-New York- Brisbane-Toronto-Singapure.I

188. Fortun C. and Duato M. 1986. Modificaciones que sufren las substancias humicas como consecuencia de la paja aplicada al suelo. Agrochimica, v. 30, p. 358-367.

189. Francioso O., Sanchez-Cortes S., Tugnoli V., Ciavatta C., Gessa C. 1998.

190. Characterization of peat fulvic acid fractions by means of FT-IR, SERS and *H, ^C NMR spectroscopy. AppL Spectr, v.52 (2), p. 270-277.

191. Frimmel F.H. and Christman R.F. 1988. Humic substances and their role in the Environment. John Willey & Sons. Chichester-NewYork-Brisbane—Toronto-Singapure.

192. Frimmel, F. H. & Kumke, M. U. 1998. Fluorescence decay of humic substances. A comparatively study. In: Humic Substances : Structures, Properties and Uses; (eds. G. Davies & E. A. Ghabbour), pp. 113-122. Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK.

193. Garrison A.W., Schmitt P. and Kettrup A. 1995. Capillary electrophoresis for the characterization of humic substances. Water Research, v.29, p.2149-2159.

194. Garcia C., Hemandes Т., Costa F., Ceccanti В., Dell'Amico C. 1992. Characterization of the organic fraction of an uncomposted sewage sludge by isoelectric focusing and gel filtration. BioL FertiL Soils, v. 13, p. 112-118.

195. Ghosh К. and Schnitzer M. 1979. UV and visible absorption spectroscopic investigations in relation to macromolecular characteristics of humic substances. Journal of Soil Science, v.30, p.735-745.

196. Ghosh K. and Schnitzer M. 1980. Macromolecular structures of humic substances. Soil Science, v. 129, p.266-276.

197. Giusquiani P.L., Patumi M., Businelli M. 1989. Chemical composition of frash and composed urban waste. Plant & Soil, v. 116, p.278-282.

198. Gjessing E.T. 1965. Use of sephadex gel for the estimation of molecular weight of humic substances in natural water. Nature, v.206, p. 1091 -1092.

199. Gjessing E.T. and Gjerdal T. 1972. Electromobility of aquatic humus: fractionation by the use of the isoelectric focussing technique. Pros. Int. Meet. Humic Substances, Niewerslius, Wageningen, p. 33-51.

200. Gjessing E.T. and Bergling L. 1981. Adsorption of PAH to aquatic humus. Arch. HydrobioL;92, p. 24-30.

201. Gjessing E.T. 1991. HUMEX Humic lake acidification experiment. Finnish Humus News, 3 (1), 195-197.

202. Gjessing E.T. 1992. HUMEX project: experimental acidification of a catchment and its humic lake. Eniron. Enternationa, 18, p. 535-545.

203. Gobbels F.-J. and Puttmann W. 1997. Structural investigation of isolated aquatic fulvic and humic acids in seepage water of waste deposits by pyrolysis-gas chromatography/mass spectrometry. Water Research, v. 31, p. 1609-1618.

204. Goh К. M. and Reid M. R. 1975. Molecular weight distribution of soil organic matter as affected by acid pre-treatment and fractionation into humic and fulvic acid. Journal of Soil Science. V.26. P.207.

205. Goh K.M. and Williams M.R. 1979. Changes in molecular weight distribution of soil organic matter during soil development. J.Soil Science, v.30, p.747-755.

206. Goh K.M. and Williams M.R. 1982. Distribution of carbon, nitrogen, phosphorus, sulphur and acidity in two molecular weight fractions of organic matter in soil chronosequences. J.Soil Science, v.33, p.73-87.

207. Govi M., Ciavatta C., Antisari L. and Sequi P. 1991. Characterization of humified substances in organic fertilizers by means of analytical electrofocusing (EF): a first approach. Fertilizer Research, v.28, p.333-339.

208. Govi M., Francioso О., Ciavatta С. and Sequi P. 1992. Influence of long-term residue and fertilizer applications on soil humic substances: a study by electrofocusing. Soil Science, v.154, p.8-13.

209. Govi M., Ciavatta C., Gessa C. 1993. Evolution of organic matter in sewage sludge: a study based on the use of humification parameters and analytical electrofocusing. Bioresource Technol. v. 44, p. 175-180.

210. Griffith S.M. and Schnitzer M. 1989. Oxidative degradation of soil humic substances. In Humic Substances II. In Search of Structure. M.H.B. Hayes, P.MacCarthy, R.L. Malcolm and R.S. Swift (eds.). Jon Wiley & Sons LTD., Chichester, UK, pp.69-98.

211. Grimalt J.O. and Saiz-Jimenez C. 1989. Lipids of soil humic acids. I. The hematomelanic acid fraction. The Science of the Total Environment, v. 81/82, p. 409-420.

212. Gron C., Wassenaar L. and Krog M. 1994. Origin and structures of ground water humic substances from three Danish aquifers. Environment International, v. 22, p. 519-534.

213. Grov A. and Alvsaker E. 1963. Amino acids in soil. I. Water soluble acids. Acta Chem. Scand., v.24, p. 2307 - 2315.

214. Haan H.De., Werlemark G. Boer T.De. 1983. Effect of pH on molecular weight and size of fulvic acids in drainage water from peaty grassland in NW Netherland. Plant and Soil, v.75, p.63-73.

215. Hatcher P.G. and Clifford DJ. 1994. Flash pyrolysis and in situ methylation of humic acids from soil. Organic Geochemistry, v.21, p. 1081-1092.

216. Hatcher P.G., Minard R.D. 1996. Comparison of dehydrogenase polymer (DHP) lignin with native lignin from gymnosperm wood by thermochemolysis using tetramethylammonium hydroxide (TMAH). Organic Geochemistry, v.24, p.593-600.

217. Hatcher P.G., Dria K.J., Sunghwan K. and Fraizer S. W. 2001. Modern analytical studies of humic substances. Soil Science, v. 166, p.770-794.

218. Hayes M.H. B. and Clapp С. E. 2001. Humic substances: consideretion of compositions, aspects of structure, and environmental influence. Soil Science, v. 166, p.723-737.

219. Hedges, J.I. 1988. Polymerization of humic substances in natural environments. In: Humic Substances and their Role in the Environment (eds F.H. Frimmel & R.F. Christman) pp.45-58. John Wiley & Sons, Chichester-New York- Brisbane-Toronto-Singapure.

220. Hejzlar J.; Szpakowska В.; Wershaw R.L. 1994. Comparison of humic substances isolated from peatbog water by sorption on DEAE-cellulose and Amberlite XAD-2. Water Research, v. 28, p. 969-1970.

221. Her N., Amy G., Foss D. and Cho J. 2002. Variations of molecular weight estimation by HP-size exclusion chromatography with UVA versus online DOC detection. EnviroruScLTechno!., v.36, p. 3393-3399.

222. Hernandez Т., Moreno J.I. and Costa F. 1989. Molecular size evaluation by gel filtration of humic acids from two sludges and from leonhardite. Geoderma, v.45, p.83-88.

223. Hoffman F. 1966. Untersuchungen im "Meclenburgischen Kustensaum" uber den Einfluss der Vegetation und der Bodenneigenschaffen auf die organische Substanz des Bodens. Albrechi-Thaer-Archiv. Bd. 10, H. 12, s. 1051.

224. Holty J.G. and Heilman P.E. 1972.Molecular sieve fractionation of organic matter in a podzol from Sotheatem Alaska. Soil Science, v. 112, p.351-356.I

225. Hongve D., Baann J., Becher G., Lomo S. 1996. Characterization of humic substances by means of high-performance size exclusion chromatography. Enironment International, v. 22, p.489-494.

226. Isnor R. A. and Warman P.R. 1990. Amino acid composition of soil peptides chromatographed by high performance chromatography on C18 and C8 columns. Biology and Fertility of Soils, v. 10 p. 213-218.

227. Jones R.I., Shaw P.J. and De Haan H. 1993. Effects of dissolved humic substances on the speciation of iron and phosphate at different pH and ionic strengh. EnviroruScu Technol., v.27, p. 1052-1059.

228. Jonston H. H. 1959. Soil organic matter: I. Electrophoretic separation of acid resistant components. SoilScL SocAm.Proc., v.23, p.293-295.

229. Junkers J., Schmitt-Kopplin Ph. and Hertkorn N. 2002. Electrophoretic characterization of DOM: a free flow electrophoresis (FFE) approach. Proceedings of the 12 International Meeting of the International Humic Substances Society, Boston, USA, p.28-30.

230. Kawaguchi K. and Kyuma K. 1959. On the complex fornmation between soil humus and polyvalent cations. Soil, Plant Food, v.5, p.54.

231. Khan S.V. 1970. Organic matter associationwith soluble salts in the water extract of black solonetz soil. Soil Science, v. 109. p. 227-228.

232. Khan S.V. and Schnitzer M. 1971. Sephadex gel filtration of fulvic acids: The identification of major components in two-low molecular weight fractions. Soil Science, v. 112. p. 231-238.

233. Khan S.V. and Friesen D. 1972. Gel filtration of humic acids extracted from the black solonetric and black chernozemic soils of Alberta. Soil Science, v. 114. p.73-74.

234. Kimber R.W.L., Nannipieri P., Ceccanti B. 1990. The degree of racemization of amino acids released by hydrolysis of humic-protein complexex: implication for age assessment. Soil Biol. & Biocem, v.22, p. 181-185.

235. Kipton H., Powell J., Town R.M. 1992. Solubility and fractionation of humic acid; effect of pH and ionic medium. Anal. Chim. Acta, v. 267, p. 47-54.

236. Klavin§ M. 1997. Aquatic humic substances: characterization, structure and genesis. ISBN 9984-516-52-0, Riga, 234 p.

237. Klenov B.M. and Gadzhiev I.M. 2000. The change of humus statys of plowlands of western Siberia. Proceedings of the Iff* International Meeting of the International Humic Substances Society. Toulouse, France, v.2, p.813-815.

238. Kldcking R. 1973. Ein system zur polyacrylamidgelelektrophorese von huminsauren. J. Chromatography, v.78, p.409-416.

239. Knuutinen J., Virkki L., Mannila P., Mikkelson P., Paasivirta J. and Herve S. 1988. High-performance liquid chromatographic study of dissoleved organic matter in natural waters. Wat.Res., у22, p.985-990.

240. Корабек P., Kaniansky D. and Hejzlax J. 1991. Characterization of humic substances by capillary isotachophoresis. J. Chromatography, v.545, p.461-470.

241. K6gel-Knabner I. 2000. Analytical approaches for characterizing soil organic matter. Organic Geochemistry, v.31, p.609-625.

242. Kollist-Sigur К., Nielsen Т.» Gron С., Hansen P.E., Helweg С., Jonassen К. E., Jorgessen O., Kirso U.J. 2001. Sorption of polycyclic aromatic compounds of humic and fulvic acid HPLC column materials. Environ. Qual.v. 30, p. 526 -537.

243. Kuiters A. T. and Mulder W. 1992. Gel permeation chromatography and Cu-binding of water-soluble organic substances from litter and humus layers of forest soils. Geoderma, v.52, p.501-512.

244. Kuiters A. T. and Mulder W. 1993. Complexometric gel permeation chromatography of soluble HS using Sephadex G-25. J. Soil Science, v.44. p. 501512. •

245. Kulikova N. A. and Perminova I. V. 2002. Binding of atrazine to humic substances from soil, peat and coal related to their structure. Environ. Scu Technol., v.36, p. 3720-3724.

246. Kumada K. 1955. Absorption spectra of humic acids. Soil, Plant, Food. v. 1, p. 29-37.

247. Kumada K. and Miyara E. 1973. Sephadex gel fractionation of humic acids. Soil Scu and Plant Nutr. v.10, p.255-263.

248. Kutsch H. and Schumacher B. 1994. Isoelectric focusing of humic substances on ultrathin polyacrylamide gels: evidence of fingerprint performance. BioLFertiLSoils, v.l 8, p. 163-167.

249. Kuzyakov Y. V. 1997. The role of amini acida and nucleic bases in turnover of nitrogen and carbon in soil humic fractions. European Journal of Soil Science, v.48, p.121-130.

250. Kyuma K. and Kawaguchi K. 1964. Cation exchange properties of soil humic substances. Transactions 8th Iternational Congress of Soil Science, Bucharest, v.3, p. 185.

251. Ladd J.N. 1969. The extinction coefficients of soil humic acids fractionated by Sephadex gel filtration. SoilSci., v. 107, p. 303-306.

252. Ladd J.M. and Butler J.H.A. 1969. Inhibition and stimulation of proteilytic enzyme by soil humic acids. Australian J. Soil Res., v.7, p.253-261.

253. Leinweber P. and Schulten H.R. 1995. Composition, stability and turnover of soil organic matter. Investigation by off-line pyrolysis and direct pyrolysis/mass spestrometry. J. Anal. AppL Pyrolysis, v.32, p.91-110.

254. Leinweber P. and Schulten H.R. 1999. Advances in analytical pyrolysis of soil organic matter. J. Anal. AppL Pyrolysis, v.49, p.359-383.

255. Lindkvist I. 1967. Adsortption effects in gel fitration of humic acid. Acta Chemica Scand. v. 21, p. 2564-2566.

256. Lindkvist I. 1982. Charge transfer interection of humic molecules with donor molecules in aqueous solution. Swed. J. Agric. Res. v. 13, p. 201-203.

257. Levesque M. 1972.Fluorescence and fel filtration on humic compounds. Soil Science, v. 113. p. 346-353.

258. Lin C.-F., Huang Y.-J., Hao O.J. 1999. Ultrafitration process for removing humic substances: effect of molecular weight fractions and pag treatment. Water Research, v. 33, p. 1252-1264.

259. MacCarthy P. and O'Cinneide S. 1974. Fulvic acid. I. Partial fractiopnation. J. Soil Science, v. 25, p420-428.

260. Mackenzie A.F. and Dawson J.E. 1962. A study of organic soil horizons using electrophoretic techniques. J. Soil ScL, v.13, p.160-166.

261. Maggioni A., Cacco G. 1977. Acetyl-naphthyl-esterase activity in humus -enzyme complexex of different molecular size. Soil Science, v. 123, p. 122-125.

262. Maggioni A. and Ferrari G. 1980. Characteristiche della sostanza umica ottenuta mediante compostizzazione di corteccia. AgricJtal v. 109, p. 109-120.

263. Malcolm R.E. and Vaugham D. 1979. Humic substances and phosphatase activities in plant tissues. SoilBiol.& Biochem., v.l 1, p.253-259.

264. Malcolm R. L. 1990. The uniqueness of humic substances in each of soil, stream and marine environments. Analytica Chimica Acta, v. 232. p. 19 -27.

265. Mannino A. and Harvey H.R. 2000. Terrigenous dissolved organic matter along an estuarine gradient and its flux to the coastal ocean. Organic Geochemistry, v.31, p.1611-1625.

266. Marmo L. 2000. Towards a European strategy for biodegradable waste management. In: Ricicla 2000 (L. Morselli, а сита di). Maggioli Editore, Rimini, p.21-30.

267. Martin F., del Rio J.C., Gonzalez-Vila F.J., Verdejo T. 1995. Termally assisted hydrolysis and alkylation of lignins in the presence of tetraalkylammonium hydroxides. J. Anal. Appt. Pyrolysis, v.35, p.1-13.

268. Martinez M.T., Romero C. and Gavilan J.M. 1984. Solubilization of phosphorus by humic acid from lignite. Soil Science, v. 138, p. 257-261.

269. Masters P. M. and Baba J. L. 1978. Amino Acid Racemization dating of bone amd shell. Advances in Chemistry Series, No 171, Archaeoligical Chemistry II, (American Chemical Society), p. 117 138.

270. McKinney D.E. and Hatcher P.G. 1996. Characterization of peatified and coalified wood by tatramethylammonium hydroxide (TMAH) thermochemolysis. Int. Coal Geol., v.32, p.217-228.

271. Montreal С. M. and MeGill W.B. 1985. Centrifugal extraction and determination of free amino acids in soil solutions by TLC using tritiated l-fluoro-2.4-dinitrobenzene. Soil Biol. & Biochem. v. 17, p. 533 539.

272. Mori S. Hiraide M. and Mizuike A. 1987. Aqueous size exclusion chromatography of humic acids on a Sephadex gel colunm with diluted phosphate buffers as eluents. Anal. Chim. Acta, v. 193, p. 231-238.

273. Morrison A. R., J. S. Park, and B. L. Sharp. 1990. Application of high-performance size-exclusion liquid chromatography to the study of copper speciation in waters extracted from sewage sludge treated soils. Analyst, v.l 15, p.1429-1433.

274. Mukhopadhyay N. and Benerjee S.K. 1985. Molecular weight distribution in some soil humic acids. J. Ind. Soc. Soil Science, v. 33, p.211-229.

275. Muller M.B., Schmitt D. and Frimmel F. H. 2000. Fractionation of natural organic matter by size exclusion chromatography properties and stability of fractions. Environment Science and Technnology, v.34, p.4867-4872.

276. Nardi S., Concheri G., Dell'Agnola G. and Scrimin P. 1991. Nitrate uptake and ATPase activity in oat seedlings in the presence of two humic fractions. Soil Biol.& Biochem., v.23, p.833-836.

277. Nardi S., Pizzeghello D., Reniero F. and Rascio N. 2000. Chemical and boichemical properties of humic substances isolated from forest and plant growth. Soil ScL Soc. Am. /., v.64, p.639-645.

278. Noda M. and Iba T. 1958. Studies of humic acid by paper electrophoresis. I. On the separation of humic acid by paper electrophoresis. J. ScL Soil Tokyo, v.29, p.32-34.

279. Norden M. and Dabek-Zlotorzynska E. 1997. Characterization of humic substances using capillary electrophoresis with photodiode array and laser-induced fluorescence detection. Electrophoresis, v. 18, p. 292-299.

280. Oden S. 1919. Die Huminsauren. Kolloidchemische Beih., Bd. 11, s.75. Die Huminsauren. Leipzig.

281. O'Loughlin and Chin Y.-P. 2000. Effect of detector wavelength on the determination of the molecular weight of humic substances by high-pressure size exclusion chromatography. Water Research, v.35, p.333-338.

282. Orioli G.A. and Curvetto N.R. 1980. Evaluation of extractants for soil humic substances, I. Isotachophoretic studies. Plant and Soil, v.55, p. 353-361.

283. Orlov D.S., Ammosova Ya. M. and Glebova G.I. 1975. Molecular parameters of humic acids. Geoderma, v. 13, p.211-229.

284. Pavel L., Kolousek J. and Smatlak V. 1953. Determination of humic matter Ann. Acad. Techecsol. Agric., V.26A, p. 155-163.

285. Pelekani C., Newcombe G., Snoeyink V.L., Hepplewhite C., Assemi S. and Beckett R. 1999. Characterization of natural organic matter using high performance size exclusion chromatigraphy. EnviroruScuTechnol., v.33, p.2807-2813.

286. Perminova I.V. 1999. Size exclusion chromatography of humic substances: complexities of data interpretation attributable to non-size exclusion effects. Soil Science, v.164, p.834-840.

287. Perminova I.V., Frimmel H.F., Kovalevskii D.V., Abbt-Braun G., Kudryavtsev A.V. and Hesse S. 1998. Development of a predictive model for calculation of molecular weight of humic substances. Water Research, v.32, p.872-881.

288. Perminova I.V., Grechishcheva N.Y., Peytrosyan V. Relationships between structure and binding ability of humic substances for polycyclic aromatichydrocarbons: relevance of molecular descriptions. 1999. Environ.ScLTechnol., v.33, p.2807-2813.

289. Pertussi F., De Nobili M., Viotto M., Sequi P. 1988. Characterization of organic matter from animal manures after digestion by earthworms. Plant & Soil, v. 105, p. 41-46.

290. Piccolo A., Nardi S. and Concheri G. 1996. Macro-molecular changes of humic substances induced by interaction with organic acids. Eur. J. Soil Sci. v.47, p.319-328.

291. Piccolo A. 2001. The supramolecular stucture of humic substances. Soil Science, v. 166, p.810-832.

292. Pompe S., Heise K.-H. and Nitsche H. 1996. Capillary electrophoresis for a "fingerprint" characterization of of fulvic and humic acids. /.Chromatography A, v.723, p.215-218.

293. Posner A. M. 1963. Importance of electrolight in the determination of molecular weights by sephadex gel filtration, with special reference to humic acid. Nature, v.198, p.l 161-1163.

294. Prasad В. and Sinha M.K. 1983. Pysical and chemical characterization of moleculary homogeneous fulvic acid fractions and their metal complexes. /. Ind. Soc. Soil ScL, v.l 11, p. 298-306.

295. Prasad B. and Kumar M. 1989.Visible adsorption spectroscopic investigation in relation to molecular characteristics of fulvic acids extracted from organic wastes. /. Ind. Soc. SoilSci., v.l 11, p. 298-306.

296. Pullin M. J., Cabaniss S. E. 1995. Rank analysis of the pH-dependent synchronous fluorescence spectra of six standard humic substances. Environ. ScL & Technol., 29, 1460-1467.

297. Rashid M.A. and King L. H. 1971. Chemical characterization of fractionated humic acids associated with marine sediments. Chem. Geol., v. 7, p. 37 43.

298. Reinhard M. 1984. Molecular weight distribution of dissolved organic carbon and dissolved organic halogen in advanced treated waters. Environ.Sci.TechnoL, v. 18, p. 410-415.

299. Reuter J. H. 1981. Calculation of molecular weight of humus substances from colligative data. Application of aquatic humus and its molecular size fractions. Geochim. Cosmochim. Acta., v. 45, p.2017-2022.

300. Riise G., Salbu В., Vogt R., Ranneklev S. and Mykkelbost T. 1994. Mobility of humic substances major and minor elements in lake Skjervatjem and its catchment area. Environment International, v. 20, p. 287-298.

301. RifFaldi R. and Schnitzer M. 1972. Effects of diverse experimental conditions on ESR spectra of humic substances. Geoderma, v. 8, p. 1-10.

302. Riffaldi R. and Schnitzer M. 1973. Effects of 6 N HC1 hydrolysis on the analytical characteristics and chemical srtucture of humic acids. Soil Science, v. 115, p. 349356.

303. Rigol A., Lopez-Sanchez J. F., Rauret G. 1994. Capillary zone electrophoresis of humic acids. J. Chromatography A, v.664, p.301-305.

304. Rigol A., Vidal M., Rauret G. 1998. Ultrafiltration capillary zone electrophoresis for the determination of humic acid fractions. J. Chromatography A, v.807, p.275-284.

305. Roletto E., Barberis R. and Zelano V. 1982. Gel filtration and absorption spectroscopic investigations on humic substances from organic fertilizers. Plant and Soil, v.66, p.383-390.

306. Roletto E., Cerruti M., Barberis R., 1985a. Investigation of humic substances from decomposing spruce bark. Agr. Wastes, v.13, p.137-148.

307. Roletto E., Chiono R., Barberis R., 1985b. Investigation of humic matter from decomposing poplar bark. Agr. Wastes, v. 12, p. 261-272.

308. Ruggiero P., Interesse F.S., Cassidei L., Sciavovelli O. 1981. H-NMR and IR spectroscopic investigation of soil organic fractions obtained by gel chromatography. Soil Biol.& Biochem., v. 13, p.361 -366.

309. Saharinen M. and Schnitzer M. 1989. Nitrogen in Finish agricultural soil and it's humic acid compared to two Canadian soils. The Science of the Total Environment, v. 81/82, p. 459-463.

310. Saiz-Jimenez C. 1994a. Pyrolysis/methylation of soil fulvic acids: benzencaiboxylic acids revisted. Environ. Sci. Technol., v.28, p. 197-200.

311. Saiz-Jimenez C. 1994b. Analytical pyrolysis of humic substances: pitfalls, limitations and possible solutions. Environ. Sci. Technol., v.28, p. 1773-1780.

312. Saiz-Jimenez, C. 1996. The chemical structure of humic substances: recent advances. In: Humic Substances in Terrestrial Ecosystems (ed A. Piccolo), pp. 1-44. Elsevier, Amsterdam Lausane - New York - Oxford - Shanon-Tokyo.

313. Saiz-Jimenez C., Hermosin В., Trubetskoj O.A., Sukhoparova V.P., Trubetskaya O.E. 1996. Use of analytical pyrolysis for investigating a humic acid fractionated by polyacrylamide gel electrophoresis. In: Humic Substances and Organic Matter in

314. Soil and Water Environments: Characterization, Transformations and Interactions, eds. By S.E. Clapp, M.H.B. Hayes, N.Senesi and S.M. Griffith, Published by International Humic Substances Society, University of Minnesota, St. Paul, MN USA, p.57-61.

315. Sakar A. 1987. Molecular weight distribution in humic and fulvic acids of some I soils of Eastern Humalayan regions. J. Ind. Soc. Soil Science, v. 35, p.198-201.

316. Schafer A.I., Mauch R., Waite T.D. and Fane A.G. 2002. Charge effect in the fractionation of natural organics using ultrafitration. Environ. ScL Technol., v. 36, p. 2572-2580.

317. Scheffer F., Ziechmann W. and Schulter H. 1955. Die papirelektrophorese als moglichkeit der auftrennung von humusauren. Z. Pflanzen Ernajr. Dung., v.70, p.260-274.

318. Schmitt-Kopplin P., Hertkorn N., Garrison A.W., Freitag D. Kettrup A. 1998. Influence of borate buffers on the electrophoretic behhavior of humic substances in capillary zone electrophoresis. Analytical Chemistry, v.70, p.3798-3808.

319. Schnitzer M. 1978. Humic substances: Chemistry and reactions. In: Soil Organic Matter (Schnitzer M. and Khan S.U. eds.) Elsevier, New-York, p. 1-64.

320. Schnitzer M. 1991. Soil organic matter the next 75 years. Soil Science, v.151. p.41-56.

321. Schnitzer M. and Skinner S. I. M. 1968. Gel filtration of fulvic acid, a soil humic compounds. Isotop, Radiat. Soil Organic Matter Stud. Vienna, p 41.

322. Schnitzer M. and Khan S.U. 1972. Humic Substances in the Environment. Marcel Dekker, New York. 327 p.

323. Schnitzer M. and Schuppli P. 1989. Methods for the sequence extraction of organic matter from soils and soil fractions . SoilScL Soc. Am. v.53, p.1418-1425.

324. Schroeder R.A. and Baba J.L. 1976. A review of the geochemical applications of the amino acid racemization reactions, Eath ScL Rev., v. 12, p. 347-391.

325. Senesi N., Brunetti G. 1996. Chemical and physico-chemical parameters for quality evaluation of humic substances produced during composting. In: The Science of

326. Composting. London Glasgow - Weinheim - New York - Tokyo - Melbourn -Madras, p. 195-212.

327. Sequi P., Petruzzelli G. and Guidi G. 1971. Ricerche sni complessi organo-minerali del terreno. I. Estratione e gel filtrazione della sostanza organica. Agrochimica, v. 15, p.362-370.

328. Simonet B.R.T. 1986. Characterization of organic constituents in aerosols in relation to their origin and transport: a review. Intern.J.EnvironAnal.Chem., \2Ъ, p.207-237.

329. Shin H.S., Rhea S.W., Lee B.H., Moon C.M. 1996. Metal binding sites and partial structures of soil fulvic and humic acids compared: aided by Eu (III) luminescence spectroscopy and DEPT/QUAT 1JC-NMR pulse techniques. Org. Geochem, v. 24, p. 523-529.

330. Shulten H. R. and Schnitzer M. 1990. Aliphatics in soil organic matter in fine clay fractuions. Soil Scu Soc. Am. J., v.54, p.98-105.

331. Smith R.G. 1976. Evaluation of combined applications of ultrafitration and complexation capacity techniques to natural waters. Anaytical Chemistry, v.48, p74-76.

332. Sowden F. J., Chen Y. and Schnitzer M. 1977. The nitrogen distribution in soils formed under widely differing climatic conditions. Geochemica and Cosmochimica Acta, v. 41, p. 1524-1526.

333. Specht C.H., Kumke M.U. and Frimmel F.H. 2000. Characterization of NOM adsorption to clay minerals by size exclusion chromatography. Water Research, v.34, p. 4063-4069.

334. Stevenson F.J. 1994.Humus Chemistry. Wiley-Inter-science, New York. 438 p.

335. Stevenson F.J., Marks J.D., Varner J.D. and Martin W.P. 1952. Electrophoretic and chromatographic investigation of clay-adsorbed organic colloids: I. Preliminary investigation. Soil ScL Soc. America Proc., v. 16, p.69-72.

336. Stevenson F.J., Van Winkle Q. and Martin W.P. 1953. Physico-chemical investigations of clay absorbed organic colloids. Soil ScL Soc. Am. Proc., v. 17, p.31-34.

337. Stuermer D. H. and Harvey G. R. 1974. Humic substances from seawater. Nature, v. 250, p. 480-481.

338. Stuermer D. H. and Harvey G. R. 1977. The isolation of humic substances and alcohol soluble organic matter from seawater. Deep-See Research, v. 24, p. 303 -309.

339. Sunda G.W. and Kieber J.D. 1994. Oxidation of humic substances by manganese oxides yields low-molecular-weight organic substrates. Nature, v.367, p.62-64.

340. Susie M. and Boto К. G. 1989. High-performance liquid chromatographic determination of humic acids in environmental samples at the nano-gram level using fluorescence detection. J. Chromatography, v.482, p. 175-187.

341. Swift R.S. 1989. Fractionation of Soil Humic Substances. In: Humic Substances II: In Search of Structure. M.H.B.Hayes, P. MacCarthy, R. L. Malcolm, and S. Swift (eds.). John Wiley & Sons, Chicester, UK, pp. 387-408.

342. Swift R.S. 1996. Methods of Soil Analysis. Soil Science Society of America and American Society Society of Agronomy. Madison, WI, p.1030-1033.

343. Swift R.S. and Posner A. M. 1971. Gel chromatography of humic acids. J. Soil Science, v.22. p. 237-249.

344. Swift R.S. and Posner A. M. 1972. Nitrogen, phosphorus and sulphur content of humic acid fractionated with respect to molecular weight. J. Soil Science, v.23. p. 50-57.

345. Swift R.S., Leonard R.L., Newman R.H. and Theng B.K.G. 1992. Changes in humic acid composition with molecular weight as detected by C13 -nuclear magnetic resonance spectroscopy. Science in Total Environment, у .118, p.53-61.

346. Tan K.H. 1976. Complex formation between humic acid and clays as revealed by gel filtration and infrared spectroscopy. SoilBioL& Biochem. v.8, p.235-241.

347. Tan K.H. 1988. Colloidal chemistry of organic soil constituents. In: Kff.Tan. Principles of soil chemistry. Morsel Dekker, New-York, p.97-176.

348. Tan K.H. and Giddens J.E. 1972. Molecular weight and spectral characteristics of humic and fulvic acids. Geoderma, v. 8. p. 221-229.

349. Thornton J.I. 1975. Letter to the editor "Isotachophoresis and isoelectric focusing of soil humic substances in polyacrylamide gel". /.Chromatography, v. 103, p.402.

350. Tiselius A. 1937. A new apparatus for electrophoretic analysis of colloidal mixtures. Trans. Faraday Soc., v.33, p.524-531.

351. Town R.M. and Powell H.K.J. 1992. Elimination of adsorption effects in gel permeation chromatography of humic substances. Analytica Chimica Acta, v.256, p/81-86.

352. Tsutsuki K. and Kuwatsuka S. 1978. Chemical studies on soil humic acids. 2. Composition of oxygen-containing functional groups of humic acids. Soil Science and Plant Nutrition, v.24, p547.

353. Tsutsuki K. and Kuwatsuka S. 1984. Molecular size distribution of humic acids as affected by the ionic strength and the degree of humification. Soil Science and Plant Nutrition, v.30, pl51-152.

354. Tu-Ping С., Aiken G. and O'Loughlin E. 1994. Molecular weight, polydispersity and spectroscopic properties of aquatic humic substances. Environ. Sci. & TechnoL, v.28, p.1853-1858.

355. Van Heemst J.D.H., del Rio J.C., Hatcher P.G., de Leeuw J.W. 2000. Characterization of estuarine and fluvial dissolved organic matter by thermochemolysis using tatramethylammonium hydroxide. Acta Hydrochim. HydrobioL, v.28, p.69-76.

356. Varadachari C. and Ghosh K. 1984. On humus formation. Plant and Soil, v. 77, p. 305-315.

357. Varga В., Kiss G., Galambos A., Gelencser A., Hlavay J. and Krivacsy Z. 2000. Secondary structure of humic acid. Can micelle-like conformation be proved by aqueous size exclusion chromatography. Environ. Set & Technol., v.34, p.3303-3306.

358. Vaughan D., Chesire M.V. and Mundie C.M. 1974. Uptake by beetroot tissue and biological activity of ,4C-labelled fractions of soil organic matter. Trans. Biochem .Soc., v.2, p.126-129.

359. Udupta S.G., Vasuki N., Channal H.T. 1980. Comparative stadies on spectral properties and chemical behaviour of humic acids. J. Ind. Soc. Soil Science, v. 38, p.152-153.

360. Wake J. R. H. and Posner A. M. 1967. Membranes for measiring low molecular weights by osmotic pressure. Nature, v. 213, p.692-693.

361. Waksman S. 1931. Decomposition of the various chemical constitutes of complex plant material by pure cultures of fungi and bacteria. Arch. Microbiol., v.2, p. 136145.

362. Waldron A. and Mortensen J. 1961. Soil nitrogen complex II. Electrophoretic separation of organic components. Soil ScL Soc. America Proc., v.25, p.29-32.

363. Warman P.R. and Bishop C. 1987. Amino-N compounds found in soil organic matter hydrolysates of loamy sand using an immobilized protease reactor column. Biol. Fertility Soils, v. 5, p. 219-224.

364. Warman P.R. and Isnor R.A. 1989. Evidence of peptides in low-molecular-weight fractions of soil organic matter. Biology and Fertility of Soils, v. 8, p. 25-28.

365. Watanabe A., Fujimori H., Nagai Y., Miyajima T. Kuwatsuka S. 1996. Analysis of the green fraction of humic acids. European Journal of Soil Science, v. 47, p. 197204.

366. Clapp, M.H.B. Hayes, N.Senesi and S.M. Griffith, Published by International Humic Substances Society, University of Minnesota, St. Paul, MN USA, p. 81-91.

367. Welte E. 1955. Neure ergebnisse der humiforschung. Angew.Chem., v.67, p.153-155.

368. Wetzel R.G., Hatcher P.G., Bianchi T.S. 1995. Natural photolysis by ultraviolet irradiance of recalcitrant dissolved organic matter to simple substrates for rapid bacterial metabolism. Limnol. Oceanogr., v.40, p.1369-1380.

369. Williams M. R. and Goh K.M. 1982. Changes in molecular weight distribution of soil organic matter during humification. N.Z.J. Sci. v. 25, p. 335-340.

370. Wright J.R., Schnitzer M., Levik R. 1958. Some characteristics of the organic matter extracted by dilute acids from a podzolic В horizon. Can. J. Soil Sci., v. 38, p. 14-22.

371. Zang X., van Heemst J.D.H., Dria K.J., Hatcher P.G. 2000. Encapsulation of protein in humic acid from histosols as an explanation for the occurrence of organic nitrogen in soil and sediment. Organic Geochemistry, v.31, p.679-695.

372. Zepp R. G, Schlotzhauer P. F. 1981. Comparison of photochemical behaviour of various humic substances in water.III. Spectroscopic properties of humic substances. Chemosphere, 10, 479-486.

373. Zhou Q., Cabaniss S.E. and Maurice P. 2000. Considerations in the use of high-pressure size exclusion chromatography (HPSEC) for determining molecular weights of aquatic humic substances. Water Research, v.34, p. 3505-3514.