Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Glu,Asp-специфичная и тиолзависимая сериновая протеиназы Streptomyсes thermovulgaris Т-54

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Glu,Asp-специфичная и тиолзависимая сериновая протеиназы Streptomyсes thermovulgaris Т-54"

московски! государственный университет им.м.в.ломоносова

г^ г Р о. 1 Биологический факультет

1 I и V' • <

" - - На правах рукописи

\

ХАДДАРОВА Нэлда Васильевна

УДК 577.152

01и,Аар-СгаЩИФИЧНАЯ И ТЙОЛЗАШСИМАЯ СЕРИЮВАЛ ПРОТЕЩШ й1;гер1;отусез гИетктЯеаг I з Т-54. 03.00,04 - бИОХИМИЯ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидате биологических наук

¡¿осква - 1993

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета МГУ.

Научные руководители: Консультант:

Официальные оппоненты:

проф.В.М.Степанов д.х.н. Г.Н.Руденская проф.Н.С.Егоров

проф,В.В.Мосолов д.б.н. М.А.Белозерский

Ведущая организация: Институт биоорганической химия им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова г.Москва

Защита состоится 1993 Г. в _час.

па заседании снециализированйого совета Д.053.05.32 Биологического факультета МГУ по адресу: 119899, г.Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертациой можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан " * 993 г.

Ученый секретарь

специализированного совета ^¿Гл--

кандидат биологических наук Ю.Н.Лейкин

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Протволитические фермента микроорганизмов (в том числе термофильных) привлекают внимание многих исследо вателей.

С одной стороны, сравнение структуры и свойств этих .ферментов из различных источников важно в. теоретическом аспекте, расширяет представления об их происхождении и эволюции, о причинах термоста-бнльности белков и т.д. С другой стороны, протволитические фермента микроорганизмов находят широкое применение в производстве моидих и лекарственных средств, кожевенной и пищевой промышленности и т.д. Поэтому выделение и исследование свойств протэшшз микроорганизмов в особенности термофильных, представляет значительный практический интерес.

Однвко, из известных протеиназ термофильных микроорганизмов подробно изучены лишь немногие - термолизия, архелизин I, терми-таза. Совсем мало работ, посвященных продукции протеиназ в процессе культивирования микроорганизма г в этом смысле хорошо исследован лишь териоактиномице'т Iherraoaotlnomyoea vulgaris. ,

На кафедре микробиологии МГУ широко проводятся работы по поиску перспективных продуцентов протеолитических фер«ентов. В иле горячего источника был обнаружен штамм Streptomycea (ранее Actinomyces) thor-ffiovulgaria ï-54 , проявляющий високух) общую протеолатичвскую и фяб-ринолитическую активность и продуцирующий, по-вйдамому, целый ряд протеиназ. Представлялось интересным изучить протеолятическиа ферменты этого стрептомицета.

Цель и задачи исследования. Целью работы была очистка и пер--* вичная характеристика некоторых протеиназ streptomycea thermovul-gai-ia Г-54. Для этого следовало:

I. Предварительно определить, какие протеяназы продуцирует Str.thor-movulgaria Т-54.

Z. Проследить динамику секреции отдельных протеиназ при культивировании Str.thermovulgaria £-54. 3. Разработать схемы очистки некоторых протеиназ а исследовать их свойства. ;

Научная новизна исследований. Получены впервые следующие реЭу-льтаты, представлящие научну» новизну:

I. Покззако, что при выращивании на синтетической среде Btr-therim-

vulgaris l'-54 продуцирует по крайней мера четыре протеиназы, в том числе оаи.Авр-специфичную протеинезу, и субтилизиноподобную тиолзависшую сериновую протеиназу. 8, Найдены оптимальные условия продукции aiu.Asp-специфичной и ти-олзавлсишй сериновой протеиназ Str.thermavulgaris Т-54-

3. Разработаны схемы выделения индивидуальных а1и,Азр-специфичной и ттаязэвисимой сериновой протеиназ Str.thermovulgaris Ф-54, основанные на аффинной хроматографии.

4. Определены биохимические и физико-химические характеристики гии,Азр-стциничной и тиолзвЕисимой сериновой протеиназ Str.ther— movulgaria Т-54.

Полученные результаты в сочетании с данными других авторов указывают на достаточно широкое распространение у микроорганизмов особой группы а1и,Азр-специфичных протеиназ.

Практическая ценность работы. I. Разработаны схемы очистки Qiu.Asp-специфичной и тиолзависимой сериновой протеиназ Str.thermovulgaris Т-54. ?,. Выделенная 01и,А.зр~опецифжчвая протеиназа, обладающая весьма узкой специфичностью, может бить использована для гидролиза белков при изучении их первичной структуры (вместо протеиназы золотистого стафилококка S.aureus V8). 3. Выделенная нами' тиолзависимая свриновая протеиназа str.therraovul-garis аналогична по свойствам протеиназе Th.vulgaris и перспективна для изготовления стиральных порошков, дрожжевых гидролизатов и т.п.

Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ. Материалы диссертационной работы обсуждались на V Всесоюзной конференции го теории ферментативного катализа (Москва, 1987) и IV Всесошной конференция "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Ташкент, 1988).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзоре, обсуждения результатов работы, экспериментальной части, выводов и списка литературы, включающего 203 ссылки. Работа изложена на 152 страницах машинописного текста и содержит 17 рисунков и 2^*таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Использованный в работе штамм Streptomyoes thormovulgaris (Henesen, 1957) 1-54 получен от С.Н.Выборных ( кафедра микробиолога« МГУ).

Стрептошщет выращивали на синтетической среде Космачева в колбах на качалке (200 об/мин). Посевным материалом служил 18-чвсовой вегетативный мицелий, выращенный из спор на пептоино-кукурузноЯ среде.

Выделение а1и,Аяр-специфичной и тиолзависимой сершювой протеи-наз из культуральной жидкости осуществляли с помощью аффинной хроматографии на биоспецифических сорбентах по стремам, предложенным нога в данной работе.

Активность протеолитических ферментов определяли, используя слито тичёсжжГх^юшТёнш , а также азоказеин.

Электрофорез в полиакриламидном геле в неденатурирумцих условиях проводили по методу Davis (1964); электрофорез в присутствии DS-Na - по методу Laemtll (1970). Обнаружение белковых зон, обладаниях протеолитической активностью осуществляли после электрофореза в неденатурирувдюс условиях по методу Word (1976).

Изоэлектрическую точку aiu.Asp-специфячной протеиназы определяли изоэлектрофокусированием в пластинах ПААГ с вмфолинами в градиенте ph 3,5-9,5 по стандартной методике ("1kb", Швеция); изоэлектрическув точку тиолзависимой сершовой протеиназы ,- хроматофокусировени-ем на колонке со смолой рве-94.

Субстратную специфичность Glu,Авр-специфнчной протеиназы изучали по действии на пептидные субстраты,'фрагмент АКТГ, B-цепь инсулина и парвальбумин III щуки. Продукты переваривания длинных субстратов разделяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), определяли аминокислотный состав образовавшихся пептидов стандартным методом и N-концевые аминокислоты реакцией дансилирования с последующим гидролизом и хроматографией на полиамидных пленках. Для изучения субстратной специфичности тиолзависимой сериновой протеиназы использовали синтетические хромогенные пептидные субстраты.

Аминокислотный состав протеиназ определяли на автоматическом анализаторе стандартным методом после гидролиза 5,7 н HCl при Ю5°С в течение 48 часов в вакуумиро-ванных ампулах. Полуцистин опредэляли после предварительного окисле-тя надчурявыгаой кислотой. Для опроде ления триптофана гидролиз проводили в 4 М'метансульфоновой кислоте в присутствии 0,2% тршттвминя. .

и-кощевие последовательности протеиназ определяли на твердо-фазиом~секвенатор9 автоматическим методом ступенчатой деградации . по Эдмзну. Автор благодарит Л-.П.Ревину и Н.И.Гребенщикова за выполнение атой части работы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ

1.Синтез протеиназ в процессе культивирования вгг.йюг-тоуш^аг!з Ф-54 на синтетической среде.

Микроскопическими исследованиями нами установлено, что при развитии str.thermovulgaris т-54 на синтетической среде Космачева при 40-4й°С наблюдается переход от плотных кустистых микроколоний (8-24 часа развития) к рыхлым сплетениям гиф (32-40 часов), а затем к плохо дифференцируемой массе, по-видиюму, состоящей из обрывков мицелия, продуктов лизиса и т.д. (4а часов развития). С 56 часов культивирования наблюдается вторичный рост стрептомицета - вновь появляется плотные колонии и т.д. В 56-72 часовой культуральной жидкости поело электрофореза в неденатурирущих условиях обнаружено по крайней море 4 зоны, обладающих протеолитической активности). Использование хромогенных синтетических пептидных субстратов показало наличие в культуральной жидкости активности по z-oiu-pNA (субстрат Olu.Aöp-специфичных ггротэиназ); до Z-Ala-Ala-beu-pNA (субстрат ферментов субтилизянового типа) и по DHP-Gly-Gly-Ile-Arg. (субстрат ме-таллопротеиназ и карбоксипептидаз типа В). Максимумы накопления различны? активностей в процессе развития не совпадают во времени (рис.1). Наблюдается два пика активности по DNP-Gly-Gly-Ile Arg: чороз 24 часа после посева (стадия плотных колоний) и через 40 часов (преобладание рыхлых сплетений гиф).Поскольку указанное соединение является субстратом как карбоксипептидаз, так и металлопротеиназ, пока неясно, какой именно фермент (или оба) продуцируется микроорганизмом. Этот вопрос требует дальнейшего изучения.

Наиболее быстрое накопление активностей по z-Giu-pNA. и по Z-Ala-Ala-Xeu-pNA происходит через 48 часов после посева, когда в культуре преобладают процессы лизиса, то есть в период спорообразования (Выборшх, 1976).

Так как к моменту начала данной работы был известен лишь один Фермент микроорганизмов, специфически гидролизущий пептидные связи, образованные остатками гдутаминовой и вспарагиновой кислот (протен-

Рис.1.Продукция протеиназ в процессе развития Str.thermovulgaris Т-54

1 - активность по DNP-Gly-Gly-Ile-Arg;

2 - активность по Z-Glu-pNA;

3 - активность ПО Z-Ala-Ala-Leu-pNA;

4 ~ А280-

Рис.2. Разделение протеиназ Str.thermovulgaris 1-54 на Оацитра-цин-с.ефарозе. 1л культуралъной жидкости наносили на колонку (2x2,8 см) с сорбентом, уравновешенным 0,05 М трис-KCl-буфером, pH 7,2. I - балласт; II - элюция Glu.Asp-■ специфичной протеиназы I М NaCl; III - элюция тиолзависи-мой сериновой протеиназы 25% изопропанолом с I М NaCl.

Рис.3. Хроматография Glu.Asp-специфичной протеиназы на CABS-Ce-фарозе (колонка 0,8x10 см). Стрелкой указано начало алоции фермента 0,2 М NaCl.

наза VO Staphylococcus aureus), представляло значительный интерес выделение и. характеристика а1и,Азр-специфичной протеиназы ¡о Str.thermovulgaris 1-54. Эта протеиназа накапливается в культуральноА жидкости в максимальных количествах одновременно с активностью по Z-Ala-Ale-Leu-pNA, после ■ 56-72 часов развития на синтетической среде. Оптимальные условия для накопления . ферментов на среда Космачева - 40-42°С, начальный рН - 7,4 (табл I).

Таблица I. Влияние температуры и рН среда на продукцию протеиназ культурой Str. Thermovulgaria 3?-54.

Температура, °С рН Время развития, час Максимальная активность(ед/мл) по Z-Glu-pNA.; Z-Ala-Ala-beu-pNA

35-37° 7,4 120 0,008 3,3

40-42° 7,4 56 0,009 3,1

48-50° 7,4 48 0 I.I

35-37° 7,0 • 120 . 0.006 3,0

35-37° 7,4' 120 0,008 3,9

35-37° 7,7 120 0,004 " 2,7

II. Выделение С1и,Авр-специфичной и тиолзависимой сериновой ~ протеиназ Б1;г.Шегпюш11£аг1з Т-54.

Так как максимумы продукции 01и,¿ар-специфичной и тиолзависимой сериновой протеиназы приходятся на одно и то же время развития культуры, был разработан метод одновременного выделения двух ферментов из «сходного материала.

На первой стадии очистки аффинной хроматографией на бацитрацин-зефарозе ^ерапоу, Кийепакауа, 1983) удаляли основную массу балла-зтных веществ и достигали разделения, указанных протеиназ (рис. 2). Размеры колонки были подобраны таким образом, чтобы фермент, активный то 2-а1и-рЫл, элшровался в основном буфером, содержащим I М шл, а активность по г-¿1а-*_1а-Ьеи-рМА. - буфером, содержащим I М ИаС1 и

¿Ш изопроданола, ( Увеличение размеров колонки приводило к тому, что обе активности могли быть десорбированы только раствором, содер ¡кодам и хлористый натрий и изопропанол). В результате хроматографии На бацитрацин-сефарозе каждый из интересующих нас ферментов был очищен не менее чем в 20 раз с выходом 37-40$ (см. табл.2 и 3).

Далее тиолзависимая протеиназа была очищена до гомогенного состояния рохроматографией на бащгграцин-сефарозе (табл. 2).*

ДЛЯ получения чистой 01и,Азр-специфичвой протеиназы йнгибирова-ли примесь тиолз8висимой протеиназы ПХМБ и 1роматографировали фрак-

п на п-амилобензилсукцинол-е-вминокапронил-сефарозе (савэ -софцрозе) (рис.3), а затем еще раз пропускали фермент через баци-т^цин-сефарозу (табл.3).

В результате тиолзависимая сериновая субтилизиноподобная протеиназа была очищена в 41,6 раза с выходом 235&, выход 01и,Авр~спе-дафадой протеиназы составил 30% при очистке в 112 рвз.

Оба фермента были гомогенными, по данным электрофореза в ПААГ в присутствии хе-Иа и определения И-концевых последовательностей.

Ранее САВв-сефароза использовалась в основном для очистки кар-бокоюшптидаз и металлопротеиназ, и лишь в одной работе (Мосолова и др., 1987) была использована для выделения четырех протеиназ ®яг1а, в том числе и С1и,Аар-специфичной протеиназы. Наши данные подтверждай1 возможность использования этого сорбента для выделения протеиназ этого типа. Возможно, лиганд в етом сорбенте представляет собой в определенном смыслэ аналог субстратов подобных ферментов -остатков дикарбоновнх аминокислот:

-1ш-(снг)5-сош-снг-с0 -CHg-CH-COOH

¿н -соон ■ 2

ill Свойства тиолзавясимой сериновой протеиназы . Str.thermovulgaria Т-54

Тиолзависимая сериновая протеиназа,выделенная из культуральной жидкости хроматографией и рехроматографией на бацитрацин-сефарозе, расщепляет синтетический субстрат субтилизина Z-Ala-Ala-leu-pNA и на гидролизует специфические субстраты трипсина - . Bz-Arg-pNA, химотрипсина - Clp-Phe-pNA и Glu,Asp-специфичных протеиназ -

Z-Glu-pNA. Фермент не ингибируется ЭДТА. и о-фенантролином.

В

Таблица 2. Очистка тиолзависимой сериновой протеиназы в гг. ^елло-ш1еаг1а

Общий Активность по 2-А1а-А1а-1<ви-рМА , Стадия очистки белок, оощая , удельная, Очистка Выход

280

ед

вя/А2В0

%

Культуральная 3780 2300 жидкость

Хроматография 74 938

на бацитрацин-

сефарозе

Рехроматография 21 533

на Оацитрицин-

сефарозе

0,61 12,60'

25,40

I

20-в

100 40,8

41,6 23,2

Таблица 3. Очистка а1и,Аар-специфичной протеиназы 51;гДЬегп!Оуи1£а1'1з

Общий Активность по г-а1и-рИА Очистка Выход Стадия очистки белок, общая, удельная, ■ 96

¿280 ед'

удельная, ед./А280

Культуральная 3780 6,0 жидкость

Хроматографам 60 2,2

на бацитращш-

сефарозе

Икгибированив 60 1.8 ПХМБ, диализ

Хроматография 13 ' 1,8 на САВБ-сефарозе

Рехроматография .10 1,8 на бацитрацин-сефаророзе

0,0016 I 100

0,037 23 . 36,7

0,030 18,8 30,0

0,138 86,3 30,0

0,18 112,5 , 30,0

Активность фермента полностью подавляется ингибиторами сериноша протеиназ - ФМСФ и ДФЕ. Кроме того,, протеиназа ингибируется роарентами на тиоловые группы - ионами ртутй Hg2+ и ПХМБ, активность фсфмонта может быть частично восстановлена дат или меркаптоэтанолом. Все это указывает на принадлежность к группе тиолзависимых сериноьых протеиназ, представленных субтилизиноподобными ферментами-самых раз-нсюбразных организмов (бациллы, термоактиномицет,стрептомицет, гриб, подсолнечник, человек). Однако не было ясно, насколько тиолза-•висимые ферменты стрептомицетов эволпционно близки к другим ферментам этой группы, тек как фермент str.rectus var.proteolyticus охарактеризован не полно. Поэтому исследование выделенной нами протеиназн представляло определенный теоретический интерес. Изученные субтили-злноподобныэ протеиназы других видов стрептомицетов - . Str.griseus

Таблица 4. Гидролиз синтетические субстратов тиолзависимой сершовой протешазой StiT.thermovuLgaria 5-54

Субстрат Удельная активность, ед/о.е.

Bz-Arg-pNA 0

Z-Glu-pNi 0 .

Qlp-Phe-pNA. 0 .

Glp-Ala-Ala-Phe-beu-pNA 3,86

Glp-Ala-Ala-Leu-pNA 14,20

Z-Ala-Ala-Xeu-pHA 12,50

Z-Gly-Gly-leu-pNA 0,19

Z-Ala-Gly-Xeu-pNA 0,79

Z-Gly-Ala-beu-pNA 2.79

Z-Gly-Ala-Phe-pNA 8,88

Boo-Ala-Ala-Ala-pNA 0,30

(Awad et al., 1975), Str.epheroides (Крейер и др., 1983), Str.rutge-rsenais (Лавренова и др., 1984), как и классические субтилизины, не ингибируются реагентами не SH-грушш.

Из белковых ингибиторов на фермент Str.thermovulgaria наиболее сильно действует ингибитор субтшшзина из Str.jantinua, слабее -ингибитор протеина^ из картофеля, еще слабее - овомукоид; ингибитор

трипсина из соевых бобов мало влияет на активность протеиназн. :

Исследование субстратной специфичности с помощью сжзтетических пептидных субстратов (табл.4) свидетельствует о принадлежности'выделенного фермента к семейству субтилизшоподобных протеиназ.

Сопоставление физико-химических свойств протеиназн Б1;г. гьегао-vulgaгts Т-54 со свойствами других тиолзависимых сериновых протеиназ (табл. 5) указывает на значительное сходство етих белков по молекулярной массе, оптимумам рЯ, рн-стабильности. Близки и определенные

Таблица 5. свойства некоторых тиолзависимых протеиназ

Источник фермента Свойство ' Str.thermo- Sh.vulga- B.thurin- В.oereus Heliantua vulgaris rle giensia annuus

. (lieloun (Честухи- (Честухи- (Руденская et al., на и др., на и др., и др., 1985) 1982 1985 1987)

Мол.масса,Ба 32000 28365 29000 29000 25000

Р1 5,0 8-9 . 9,0 8,5 7,1

Оптимум рн 7,8-8,2 ПО Й-А1а-А1а-Ьеи-рНА 8,2 8,5 ' 8,5 7,1

Температур- . 55° ный оптимум 65°* 45° 45° -

кМкахпо 2-А1а-А1а-Ъеи-рМ,|Л1 0,3 КМках 110 азоказеину, мг/мл 1,0 1,9** 0,6**

- ПО Ao-Ala-Ala-Ala-pNA **- штамм ИНМИ-4а

нами в идентичных условиях константы Ыихаалиса Ку^^ по г-А1а-А1а-Ьои-рНА у ферментов стрептомицета и термоактиномицйта. Выделенный нами фермент имеет довольно низкую изоэлектрическую точку, субтилизинн бацилл отличаются высокими значениями р1, в то хе время низкие значения и.а.т. имеит.суб'лгишзиноаодобные ферменты Аагепюп1ш! оЬт1во£;ешт ^ерапог вt а1.» 1986) и Бичги%егвепв1в (Лавренова и др., 1984).

Таблица 6. Аминокислотный состав таолзависимых сериновых протеиназ

Источник фермента

Str.thermo- №. vul- Str.reotua B.thurin- В. oereue

Остаток vulgarie garis (liizuaawa. gienais (Честухи

1 (Ueloun Yoshida, (Честухи- на и др.

et al., 1973) на и др., 1985)

1985) 1982

Азх 37 35 35 33 31

Thr • 26 21 22 20 20

Ser 31' 29 30 27 32

Olx 19 14 14 24 26

Pro 14 12 12 . 12 11

Gly 38 33 34 34 32

Ala 48 44 44 37 35

1/2Cya 2 1 1 1 8 !

Val >3 23 ?3 24 21

Mol ' 1 •1 1 1 • 1

lie 15 14 14 14 14

Leu 10 9 9 12 12

Туг 16 • 15 , 15 -15 14

Phe 4 Э 3 1-2

His 4 4 5 5 б

Lya io 10 10 11 12

' Arg 6 5 5 6 5 •

(Ггр Э 6 8 5 5

Итого 308 267-270 279 285 282-283

r¿

Тиолзависимая сериновая протеиназа Btr.thormovulgaris обладает заметной термостабильностью: фермент- выдерживает прогревание й течение 30 мин при 50° без потери активности , при 60° за то же время теряется 3056 активности. Наличие" в среде ионов кальция (I Ш СаС12) стабилизирует белок: при 70° за 30 мин фермент сохраняет 75% активности.

Аминокислотный состав тиолзависимой серияовой протеинази (табл. 6) схЪден с соотавом других ферментов этой группы, в особенности термитазы из термоактиномицета Th.vulgaris. В отличие от большинства тиолзависимых протеиназ в белке стрептоияцета обнаруживается два остатка подуцистина.

N-концевая последовательность тиолзависимой сериновой протеина-зы str.thermovulgarin на протяжении 14 определенных остатков оказалась идентичной N-концевоЙ последовательности термитазы из Th.vulgaris. следует заметить, что большинство К-коицев.тх последовател!>ностей тиолзависимых серинових протеиназ (за исключением протеинази К из Tritirichium album и термомиколина) весьма близки, и даже про-теиназа подсолнечника мало отличается в атом смысле от других представителей этой группы:

Str.thermovulgari в 1 T р N D Р Y Р Б В R Q Y G..

№.vulgaris Y T р N D Р Y У S в В Q Y 0..

В.thuringiensis ff Т р N Q Р Y N N - Q Y G..

B.cereus IT т р N Q Р Y * К N - Q Y О..

I.annuus Б г ,р N D Р Y К с X Q Y G..

Рис. 4. м-ковдевые последовательности тиолзавйсимых серинових протеиназ из • некоторых микроорганизмов и подсолнечника

Зесьма консервативный Ы-концевой учвсток, по-видимому, играет важну» юль в этих ферментах.. Для термитазы из №.уи1(заг1в показано, что ой гчаствует в связывании ионов кальция и, тем самым, в повышении гермостабильности белка.

Тиолзависимая протеиназэ Б^. «1епюти1£аг1в Т-54, таким образом, »есьма близка по структуре и свойствам к термитазе, ферменту термоак-■иномицета. Как и тэрмитвзв, этот фермент может быть использован в фоизводстве мовдих средств, дрожжевых гидролиз а тов и т.п.

IV. Свойства Glu,Asp-специфичной протеиназы.

Выделенный наш фермент гидролизувт z-Glu-pNA, но не субстраты трипсина - Bz-Arg-pNA, химотрипсина - Glp-Phe-pNA, субтилизина -Z-Ala-Ala-Leu-pNA, металлопротеиназ - DWP-Gly-Gly-Ile-Arg. Фермент расщепляет азоказеин и денатурированный гемоглобин: Активность фермента полностью подавляется специфическим ингибитором сериновых протеиназ диизопропилфторфосфатом (ДЗФ), но не фенилметилсульфонил-фторидом (ФМСФ). Протеиназа нечувствительна к ЭДТА, реагентам на тиоловую группу (ПХМБ и Hg2+), к ингибитору трипсина из соевых бобов, ингибитору протеиназ из картофеля и ингибитору субтилизина из Str.jantinu3. Аналогичная картина наблюдается и для Glu,¿яр-специфичных протеиназ из s.aureus и Ih.vulgaris. Характер интибиро-

'Габлица 7. Влияние состава буферных смесей на активность Glu,Asp-> специфичной протеиназы Str. thermovulgari3

Буфер

Концентрация, мМ

Активность, %

pH 8,0

ТрИС-НС1 • 0,05

трис-фосфат 0,05

трис-ацетат 0,05

Na-фосфатный 0,05

аммоний-ацетат 0,05

аммоний бикарбон нт 0,05

100 80 67 91 60 56

ТрИС-НС 1+ Nli^C 1

трис-HCl+NaOl трис-HCimoi

0,05+0,05 0,05+0,05 0,05+0,05

100 100 100

pH 6,5 фармиатный ацетатный

0,05 0,05

25 44

ашя протеиназы Str.therroovulgäris указывает на принадлежность ее к классу сериновых прогеиназ.

На активность фермента значительное влияние оказывает природа используемого буферного раствора. Из таблицы 7 видно, что вещества, содержащие -СООН-группы, снижают активность ферменте.

Как указывалось, до последнего времени был извэстен лишь один фермент микроорганизмов, расщеплящий пептидные связи, образованны« карбоксильными грушами дикарбоновых аминокислот, и веяно было установить первичную специфичность выделенной протеиназы str.thermovul-gaj'ia ü?-54. Специфичность исследовали, анализируя продукты гидролиза В-цопи инсулина, фрагмента адренокортикотропного гормона АЙТГ^^ и белка - парвальбумина III щуки. Анализ показал, что в этих субстратах в использованных нами условиях гидролизуются исключительно связи, образованные «-карбоксильной группой глутаминовой кислоты:

АКТГ1-24 S-Y-S-M-E-H-P-R-W-G-K-P-V-G-K-K-R-R-P-V-K-V-Y-P

B-цепь ' ?-T-N-Q-H-Ir-C-a-5-H-I>-T-E-A-Ir-Y-lr-r-0-G-E-R-a-P-инсулина

P-Y-T-P-K-A

Парваль- C^CO-A-K-D-b-L-K-A-D-D-r-K-Ir-K-A-L-B-A-T-K-A-B^a-бумин III

щуки S-P-N-H-K-A-P-P-A-K-7-G-L-K-A-M-S-A-ii-D-Y-K-K-V-P-K-A-I-D-A-D-A-S-G-P-I-E-B-B-^b-K-7-V-IrK^-i-A-A-D-O-R-D-ir-T-II-A-B^E-K-A-P-Ir-K-A-A-D-K-D-O-D-O-K-I-

■ м

K-1-G-I-D-B-P-B-T-If-Y-H-B-A

Рис.5. Расщепление пептидных и белковых субстратов под действием С1и,АБр-специфичной протеиназы Str. thermovulgarie. Стрелками указаны места расщепления

В парвальбумине III щуки, содержащем 14 остатков аспарагиновой кислоты, ни одна из связей, образованных этими остатками не расщеплялась даже при высоком соотношении фермент:субстрат (1:100) и длительной инкубации (4 часа и более). Однако мы наблвдали гидролиз

связей Aap-Gly в пептиде z-Ala-Asp^Gly-OEt, Aap-Phe в пентагастрине Boo-Ala-Trp-Uet-Aap-Phe-NHg И Aap-Phe В'октапептидо Asp-Tyr-liet-«ly-ïrp-Met-Asp-Phe-MHg, правда,-не в морфолингтрифторацетатном, - а в трис-HCi- буфере. Таким образом, фермент явно предпочитает связи, образованные остатками глутаминовой кислоты, но способен расщеплять и связи аспарагиновой кислоты. Протешаза 78 также гидролизует преиму щественно связи глутаминовой кислоты, а состав буферной смеси оказывает влияние на то, какие связи будут разорваны. Сходная картина наблюдается и для Glu,Азр-специфичных протеиназ str.grieeua и B.lichenlformie. С1и,Авр-специфичная протеиназа Str.thermovulgaris т-54, как и протеиназа те, расщепляет только внутренние связи (не затрагиваются акзопептидаые связи Glu-Ala в парвальбумине III и Asp-Туг в октапептиде). По-видимому, сс-аминные и ot-карбоксильнне группы вблизи связей', образованных остатками дикарбоновой кислоты, мешают гидролизу, но наличие 7-карбоксильной группы необходимо, так как не подвергаются гидролизу связи,"образованные глутамином и аспа-рагином. Для стафилококковой протеиназы показано отсутствие гидролиза внутренних связей типа Glu-Glu, Glu-Asp; аналогичное явление наблюдается и в нашем случае. Таким образом, первичная субстратная специфичность протеиназы str.thermovulgarie практически идентична специфичности протеиназы "V8. Следует заметить, некоторые Glu,Asp-специфичные протеиназы при высоких соотношениях фермент:субстрат( 1:100) расщепляют не только связи, образованные остатками дикарбоновых аминокислот Так, фермент str.grieeua гидролизовал связь Суз(Б03)-Бег в К8ссинияе, ь протеиназа B.lioheniîormia - связь Phe^-Val^ в рибонуклеазе А Мы не наблвдали гидролиза иных связей, нежели образованных дикарбоно-шми аминокислотами, 'даже при высоких соотношениях фермент:субстрат и длительной инкубации.

Некоторые свойства а1и,Аар-специфичноЙ протеиназы Str.thermovulgaria сравниваются в таблице 8 с данными для других подобных протеиназ. .

Молекулярная масса выделенного нами фермента, равная 26000 Ра близка молекулярным массам других С1и,дер-специфичных протеиназ (22000-26500 Da). Сходство между протеиназами Str.thermovulgaris СГ-5Ч. И», vulgaris ИН'.М-4а и S.aureus состоит и в том,что они имеют по два оптимума рЯ прл гидролизе белковых субстратов (гемоглобина и азоказеиаа) и по ода>му - ¿и гидролизе синтетических пептидных субстратов, Определение КИкш для ферментов Sti ihermovulgaris Т-54. Th.vulgai'la ИНМИ-4а (предоставлен Мосоловой 0.1.) и s.aureus 9?гн

(предоставлен Беляевой Е.В.) в идентичных условиях показало, что кажущеся константы Михаэлиса ферментов актиномицетоз весьма близки, а НМкаж протешазы стафилококка примерно на порядок выше.

Таблица 8. Свойства С1и,¿ар-специфичных протеиназ микроорганизмов

Источник фермента

Б1г. 1ЬвгшоуиХ- Иг. VIII- Str.gr!- Б.аигв- В.11оЬвп11ог-

СвоЙство garia 5-54 ^ат1а вена из У8 т1а

ИНШ-4а

(Мосоло- (УоайМа, (Огареиа, (Вуепс1веп,

ва И др. 0t а1., 1976) Вге<1(1ал),

1987) 1988) 1992)

Мол.масса 3)а 26000 25000 22000 26500 23589

Р1 6.7 5,7 8,4 4.5 -

рН-оптимум по:

г-сии-рЯА 6,5 8.5 8,8 - 8,0

гемоглобину 6,5 и 8,0 6,0 и 9,0 - 4,0 И 8,0 -

азоказеину 6,5 И 8.0 6,0 и 8,5 - - -

рН—стабиль— ' 6,0-10,0 6,0-10,0 5,0-8.0 3,5-9,5 4,0-10,0

ность

Температурный оптимум 55° 55° - 45° -

кМках* по г-а1и-рНА,мМ .1,25 1.1 . 10

кМкаж* по азоказеину

«г/мл 3,2 5,5 50

01.цДзр-слецифичная протеиназа str.thermovulgaris Jf-54 сохраняет 100% активности при прогревании в течение 30 мин при 40°. при 60° •за это же время активность снижается на 20%, при 60° активность теряется полностью. Ионы кальция значительно повышают устойчивость фермента к высоким температурам - -за 30 мин при 70° в присутствии I мМ СаС12 теряется лишь 20-25% активности. В отличив от Glu.isp-сдацифичных протеиназ Str.thermovulgaris и Ih.vulgaris, фермент В.lioheniiormls не только стабилизируется ионами кальция, но и нуждается в них для проявления максимальной активности и ингибируется ЭДТА.

Таблица 9. Аминокислотный состав Glu,¿вр-специфичных протеиназ.

Источник фермента •

Остаток Str.thermo- (Th. vulga- Str.gri- S.aure- B. liehen if or-

vulgaris iP-54 ria ИНМИ-4а seus us V8 mis (Svend-

(Мосолова (Ifoahida (Dra- aen. Bred-

и др.,1987) et al., 1988) peua, 1976) dam, 1992)'

1/2 Cys 4-5 4 4 0 4

АЗХ ,37 36 17 58 18

Ihr 27 25 22 20 28

Ser 22 18 28 10 32

Glx 17 16 6 22 12

Pro а 12 5 24 10 ^

aiy 38 35 37 22 29 :

Ala 19 19 25 15 12

Val 15 15 25 . 15 12

Met 1 г 1 3 2

lie 14 14 8 14 13

Leu 6 6 4 8" 5

Tyr 19 20 8 9 17

Phe 4 5 4 9 4

Hia • 5 5- 4 7 4

bys 9 10 4 13 6

Arg 12 10 5 5 9

Trp 3 8 - 2 4

Итого 260-261

264 207

253 223

Аминокислотный состав diu,Asp-специфичгой протеиназы str.thet1-Moviügaria т^54 приведен в таблице 9-в сравнении с составом ферменте® из других источников. Выделенный нами фермент наиболее близок по составу протеиназе другого термофильного акгиномицета Th.vulgaris. Существенны отличия лишь по содержанию триптофана, пролина и серила.

Можно отметить также, что 01и,Азр-слецифичные протеиназы акта-номицетов и B.lioheniformis отличаются от протеиназы VB наличием остатков цистеина, более высоким содержанием серияа и треонина и более низким - дакярбоновых аминокислот и пролина.

Рассмотрение N-концевых последовательностей 01и,Авр-специфичных иротеиноз, известных к настоящему времени, указываот на явное структурное их сходство (кроме Str.griseus, для нее данные отсутствуют):

S.aureus

10

20

Str.therm.

VILPNNDRHQITDT

В. liehen. |S V I 0 S)D - Dit BTÎN

T А

Y p Y G I A

H Y - A P V ® Y T

Y P Y H A I V H I S

30

40

50

Str.therm. |_SJD|I O|T N Ш G W и В A D T У A 3? A G В I

5.aureus Q V E А P - T G œ f I A S G У V T G К в T|II]T N К H V

В.liehen. |s|sfi~ojs С T G w и I ---^--- G P Kl® v AT A G H 0

Рис. 6. N-кощевые последовательности Glu.Aap-спецйфичных проте-

ИН83

Ии.Азр-специфичная протеиназа З^.йюгтстх^агзз имеет большув 'омологию с протеиназой В.11о!\еп1Гогт1з, чем с протеиназой Т8 (на цютяжении 22 остатков совпадает 13 и 5 остатков соответственно). Сроме того, у ферментов Stг.theгmovulgaris и В.11сЬеп11огт1а имеется ;ходная делеция в сравнении с последовательностью протеиназы У8.

Таким образом, наши данные в совокупности с данными других ав-•оров указывают на наличие отдельной группы сериновых а1и,Аар-специ-мчных протеиназ, обладающих структурным сходством и сходством мно-•их • физико-химических свойств, и ферменты эти, по-видимому, широко тспрострэнены у микроорганизмов. Некоторые авторы даже полагаит.

что эта груша прбтеиназ стоит особняком, и не имеет гомологии с другими семействами сериновых протеиназ (Svendsen, Breddam, 1992) Однако, подобный вывод нуждается в подтверждении рентгеноструктурны анализом.

В заключение следует отметить .близость выделенных нами протеиназ стрвптомицета к соответствующий протеиназам бацилл заметное структурное сходство а1и,Азр-специфичных протеина» Btr, thermovulgaria и B.liotieniformia и тяолзависимых сериновЫх Протеиназ Str.thermovulgaria и'В.thurlngienaia, B.oereua. Получениие дашше могут бить полезны для уяснения систематического положения особой группы бактерий - актиномицетов.

вывода

1. Исследовано образование некоторых протеиназ в процессе культивирования стрептомицвта Btreptomyoee thermovulgaria ï-54. Покаэан-что микроорганизм синтезирует по крайней мере четыре протеиназы; среда них тнолзависимую сершовую субтилизиноподобную протеиназу и Glu,Алр-специфичную протеиназу.

2. Впервые выделена и охарактеризована тиолзависимая сериновая протеиназа Str.thermovulgaria ï-54- Фермент имеет молекулярную массу 32000 дальтон и изоэлектрическую точку 5,0. По N-коицевой последовательности и ферментативным свойствам тиолзависимая сериновая протеиназа стрептомицета ßtr. thermovulgaria Т-54 весьма близка тиолзависимой сериновой протеиназб термоактиномицета ïhermoaoti-nomyoes vulgaris (термитазе).

3. Впервые наделена 'и охарактеризована а1и,Аар~спвцифичная протеиназа str.thermovulgaria Т-54. Показано, что фермент является сериновой протеиназой с молекулярной массой 26000 дальтон и изо-электрической точкой 6,7. Определение аминокислотного состава и N-концевой последовательности фермента указывает на распространенность у микроорганизмов особой группы Glu,Аар-спвцифичных про теиназ, обладающих сходством ферментативных свойств и структуры.

4. Glu,Asp-сйецифичная протеиназа Str.thermovulgaria обладает специфичностью, аналогичной специфичности протеиназы va из золотистого стафилококка s.aureus, и может быть использована для изучения первичной структура белков.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

. Руденская Г.Н., Хабарова Н.В., Ревина Л.П. Тиолзависимая серино-вая протеиназа streptomycea thermovulgaris. Тезисы IV Всесоюзной конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами". Татгэнт» 1988, стр. I30-I3I.

Ревина Л.П., Хайдарова Н.В., .Руденская Г.Н., Гребенщиков Н.И. ßlu,Asp-специфичнпя протеиназа из Streptomyoes thermovulgaris. Тезисы докладов IT Всесоюзной конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами". Ташкент, 1988, стр. 248-249.

. Хайдарова Н.В.,- Руденская Г.Н., Ревина Л.П., Степанов В.М., Егоров Н.С. Glu,Жар-специфичная протеиназа из Streptomycea thermovulgaris. Биохимия, 1989, т.54, N 1, стр.46-53.

. Ревина л.П.Хайдарова Н.В., Гребенщиков Н.И., Баратова Л.А., Степанов В.М. Исследование действия diu,Азр-сповдфгаюй протеина зы Streptomyoes thermovulgaris на пептидные и белковые субстраты. Биохимия, 1989, т.54, N 5, стр.846-850.

. Хайдарова Н.В., Руденская Г.Н., Ревина Л.П., Степанов В.М., Егоров Н.С. Тиолзависимая сериновая протеиназа streptomycea thermovulgaris . Биохимия, Г990, т.55, N 6, стр. ШО-ШЭ.

. Хайдарова Н.В., Руденская Г.Н., Степанов В.М., Егоров Н.С. Продукция, протеиназ в процессе развитая культуры Streptomycea thermovulgaris 1-54. Прикладная биохимия и микробиология, 1991, Т.27, N3, стр.375-380 .

MrjoPTn bhXüZlTupSO