Гликозаминогликаны в биохимических механизмах старения организма

Зимницкий, Александр Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Гликозаминогликаны в биохимических механизмах старения организма
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Гликозаминогликаны в биохимических механизмах старения организма"

На оравах рукописи

Зимницкий Александр Николаевич

ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНЫ В БИОХИМИЧЕСКИХ МЕХАНИЗМАХ СТАРЕНИЯ ОРГАНИЗМА

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Тюмень - 2005

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии Отдела биохимии и цитохимии Уфимского научного центра РАН, лаборатории биологически активных веществ Института нефтехимии и катализа РАН, Башкирском государственном медицинском университете и научно-исследовательской лаборатории НПП «Плазан»

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Башка гов Сергей Александрович Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Бышевский Анатолий Шулимович доктор медицинских наук, профессор Шараев Петр Низачиевич доктор биологических наук, профессор Хуснутдинова Эльза Камилевна

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Омская государственная медицинская академия МЗ РФ

Защита диссертации состоится «о?/ » марта 2005 г. в Ф часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.274.07 при Тюменском государственном университете по адресу: 625043, г. Тюмень, ул. Пирогова, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Тюменского государственного университета (625043, г.Тюмень, ул. Пирогова.З).

Автореферат разослан __ УУсХ' 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

Е.А. Чирятьев

45Ш

I. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Биохимические механизмы адаптации организма к патологическим состояниям, неблагоприятным воздействиям со стороны окружающей среды, возрастным и физиологическим изменениям, например, таким как состояние беременности, в течение последних десятилетий постоянно привлекают внимание исследователей с целью создания средств, повышающих адаптационные возможности организма. В этом отношении недостаточно изучена роль гете-рополисахаридов - гликозаминогликанов (ГАГ) (прежнее наименование "кислые мукополисахариды"), содержащих в своем составе гексозамины, гексозы и гексу-роновые кислоты (Кочетков Н.К., 1967), подразделяющихся в основном на гиалу-роновую кислоту (ГК), хондроитинсульфаты (ХС) и гепарансульфаты (ГС).

ГАГ содержатся в межклеточном матриксе, клеточных мембранах (Hunter G.K., Heersche J.N.M., Aubin J.E.,1983; Vogel K.G., Dolde J.,1979; Vogel K.G., Peterson D.W.,1981), а также в ядрах клеток в виде ассоциированных с хроматином протеогликанов (Onarheim H., Missavage А.Е., Gunther R.A. et al.,1991 ; Stein G.S., Roberts R.M., Davis J.L. et al.,1975). В настоящее время известно (Серов В.В., Шехтер А.Б., 1981; Фукс Б.Б., Фукс Б.И.,1968), что ГАГ в составе протеогликанов соединительной ткани обеспечивают ее механические свойства, участвуют в воспалительных реакциях (Лабори Г., 1970) и репаративных процессах (Слуцкий Л.И., 1969), необходимы для нормального кроветворения (Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Агафонов В.И. и др.,1995; Северин М.В., Юшков Б.Г., Ястребов А.П.,1993; Ястребов А.П., Юшков Б.Г., Большаков В.Н.,1988) и полноценного иммунного ответа (Соловьев Г.М., Петрова И.В., Ковалев C.B., 1987), выполняют за счет влияния на проницаемость веществ в клетки трофическую и антитоксическую функции (Лабори Г., 1970). Следует подчеркнуть, что традиционные представления о механизмах антитоксических эффектов ГАГ основываются на их полианионных возможностях связывать гидрофильные токсические вещества основного характера в межклеточном матриксе, блокируя тем самым их поступление в клетки (Лабори Г., 1970; Переверзев А.Е.,1986).

Этот механизм не представляется исчерпывающим в связи с общностью метаболических путей обмена ГАГ, пснтозофосфатного цикла, дстоксицирующих реакций глюкуронидной конъюгации (Парк Д.В.,1973) и монооксигеназной системы (Голиков С.Н., Саноцкий И.В., Тиунов Л.А.,1986).

Не вызывает сомнений, что именно механизмы устойчивости к ксенобиоти-

кам определяют возможное ь^^^'О^^в^иил организмов в окружающей сре-

БИБЛЯОТСКА Петербург

• {.mî'

дс, которая становится все более насыщенной невероятным количеством разнообразных химических соединений. То есть, проблема адаптации организма к неблагоприятным ситуациям во многом может быть сведена к общебиологической способности клетки защищать себя от токсического воздействия экзогенных и эндогенных токсикантов, используя в качестве щита гетерополисахаридные компоненты межклеточного матрикса (Зимницкий А.Н., Башкатов С.А., 2004).

Однако участие в процессах детоксикации, как уже отмечалось, только часть функций ГАГ в рамках глобального явления адаптации. Источники литературы свидетельствуют, что в организме человека с возрастом отмечаются морфологические и физиологические изменения, являющиеся следствием биохимических сдвигов. Данные литературы констатируют наличие возрастных изменений концентраций низко- и высокомолекулярных эндогенных соединений в органах и тканях организма человека и животных. Однако наблюдения авторов фрагментарны и часто противоречат друг другу. Так, например, не существует однозначного мнения о биохимических механизмах старения и их регуляции, о направленности обусловленных возрастом концентрационных сдвигов содержания альбуминов и глобулинов в крови, фракций ГАГ и ДНК в коже.

Не вызывает сомнений, что качество обмена биополимеров в организме во многом зависит от токсической нагрузки на него экзо- и эндогенных соединений, метаболизирующихся в реакциях микросомального окисления и различных типов конъюгации и, тем самым, отвлекающих на себя метаболические потоки субстратов и макроэргических соединений, а также загружающих белоксинтетический и каталитический аппараты клетки. Очевидно, что такие физиологические состояния как старение и беременность в силу различных причин сопровождаются интоксикацией. В указанной связи возникает закономерное предположение о наличии определенного сходства в направленности биохимических сдвигов при этих состояниях. В пользу этой гипотезы свидетельствуют, например, сведения различных авторов об уменьшении концентрации альбумина в сыворотке крови, как при старении (Маршалл В.Дж., 2002; Пименов Ю.С., 1993; Кипшидзе H.H., Тке-шелашвили JI.K., Салуквадзс Н.С., 1963; Коркушко О.В., 1963; Нагорный Л.В., Никитин В.И., Буланкин И.И., 1963), так и при беременности (Кухта В.К., 1986).

компонентом которой являлись гетерополисахариды из класса ГАГ. В экспериментах на животных была продемонстрирована способность плазана стимулировать синтез РНК, подавлять рост патогенных микроорганизмов, значительно ускорять процессы репаративной регенерации. После успешного проведенных доклинических исследований безопасности препарата и получения разрешения на клиническую апробацию в начале девяностых годов была показана высокая терапевтическая эффективность плазана при лечении хирургических и гинекологических заболеваний.

В последующие годы плазан успешно использовался в качестве биологически активной добавки в изделиях лечебно-профилактической косметики, существенно улучшая у пациентов состояние кожных покровов и корригируя внешние проявления старения кожи. Именно в этот период середины девяностых годов , стала очевидной взаимосвязь между качеством обмена ГАГ и функциональным состоянием кожи у человека, послужившая толчком к выполнению настоящих экспериментальных исследований, направленных на выяснение биохимических механизмов старения организма, сопряженных с обменом ГАГ. На наш взгляд, выполненная работа является примером того, как выяснение биохимических механизмов, лежащих в основе фармакологической активности препаратов, позволяет получить новую информацию о сути общебиологических процессов. В нашем случае исследование фармакологической активности ГАГ проливает свет на ранее не известные стороны метаболизма биополимеров и патохимических механизмов старения организма в целом. В указанной связи сведения о терапевтической эффективности плазана в экспериментальных исследованиях на лабораторных животных и в клинике вынесены в заключительную часть работы, так как используются в качестве дополнительного подтверждения основной гипотезы исследования.

В связи со сказанным, основной гипотезой нашей работы являлось предположении о том, что патохимическис механизмы старения сопряжены с изменением обмена таких биополимеров как гликозаминогликаны, белки и нуклеиновые кислоты. В качестве объекта исследования мы, помимо лабораторных животных, намеренно выбрали женскую популяцию по двум причинам: во-первых, на наш взгляд, характеристика «практически здоровые лица» в старческом возрасте больше соответствует женщинам и, во-вторых, если говорить о прикладном аспекте наших исследований, то есть о прикладной геронтологии и дерматокосме-тологии, то женская популяция в силу исторически сложившейся структуры со-

циальных отношений, системы культурных ценностей и норм поведения больше заинтересована в создании средств, корригирующих патологические изменения при старении.

Целью настоящей работы является теоретическое и экспериментальное обоснование значимой роли гликозаминогликанов и других биополимеров в биохимических процессах возрастных изменений, уточнение патохимических механизмов старения и разработка подходов к их направленной коррекции.

Для достижения поставленной цели представлялось необходимым решить следующие задачи:

1. Изучить фракционный состав гликозаминогликанов в органах и тканях неин-бредных белых крыс.

2. Оценить интенсивность метаболизма в органах и тканях различных фракций ГАГ по интенсивности включения радиоактивного сульфата (358 042~) и 14С-глюкозы, меченой по Сь у лабораторных животных различных возрастных групп.

3. Квантово-химическими и молекулярно-генстическими (дот-гибридизация) методами оценить возможность взаимодействия карбоксильной и гидрокси-метильной групп моно- и полисахаридов с генетическим аппаратом клетки.

4. Изучить фракционный состав ГАГ и белков в сыворотке крови у женщин различных возрастных групп.

5. Изучить фракционный состав ГАГ, уровни общего белка и ДНК в коже у женщин различных возрастных групп.

6. Исследовать возрастную динамику состояния печени по показателям «печеночных проб» у женщин.

7. Сопоставить возрастные изменения фракционного состава белков сыворотки крови у женщин с аналогичными показателями в динамике беременности.

8. Оценить возможность стимуляции ГАГ транскрипционных процессов (синтеза РНК) и репаративной регенерации в целом.

9. Методами корреляционного, регрессионного, дисперсионного, факторного и кластерного анализов изучить взаимосвязи и взаимовлияния изучаемых показателей, описать их математически с помощью уравнений линейной регрессии, а также выявить латентные переменные и их конструкты.

10. Оценить принципиальную возможность патогенетически обоснованной коррекции негативных возрастных биохимических сдвигов.

11. Разработать концепцию дестабилизации системы гликозаминогликанов как одного из общих механизмов старения.

12. Обосновать возможность прогнозирования интенсивности процессов старения по показателям гликозаминогликанового и белкового обменов.

13. Показать возможность практического использования результатов экспериментальных исследований биохимических механизмов фармакологической активности ГАГ в хирургии, гинекологии и дерматокосметологии.

Научная новизна. Проведенные исследования позволили существенно расширить представления о биохимических механизмах, лежащих в основе старения, сопоставить их с побочными эффектами беременности и выявить взаимосвязь с генетическим аппаратом клетки. При этом установлены зависимости между возрастом и показателями содержания в органах и тканях гликозаминогликанов, белков, а также их фракций и нуклеиновых кислот. Показано сходство сдвигов исследованных биохимических параметров при старении и беременности. Разработаны методические подходы к формированию оптимальных концентраций гиалуроновой кислоты в органах и тканях для профилактического применения с целью повышения резистентности организма к возрастным изменениям биохимических процессов. Предложена концепция дестабилизации системы гликозаминогликанов как одного из общих механизмов старения, заключающегося в том, что с возрастом нарушается генетически детерминированный обмен биополимеров межклеточного матрикса, приводящий к обеднению гликозаминогликанами органов, покровной ткани и повышением вследствие этого их концентрации в сыворотке крови. В экспериментах по изучению биохимических механизмов фармакологических эффектов гликозаминогликанов (и в частности, препарата «Пла-зан») установлено, что в их реализации существенную роль играет стимуляция транскрипционной активности клеточных ядер, обеспечивающая интенсификацию репаративной регенерации тканей и антимикробной активности иммуноком-петентных клеток.

таний препарата «Плазан», содержащего плацентарные ГАГ, при хирургических и гинекологических заболеваниях позволяет рекомендовать проведение дальнейших исследований с целью расширения показаний к применению плацентарных ГАГ и, в перспективе, широкого внедрения препаратов на их основе в практическое здравоохранение и дерматокосметологию.

На защиту выносятся следующие научные положения:

1. В патогенезе старения существенное значение имеет снижение генетически детерминированного синтеза организмом несульфатированных и сульфатиро-ванных гликозаминогликанов.

2. Существуют возрастные различия во фракционном составе гликозаминогликанов и белков в органах и тканях у подопытных животных, а также в сыворотке крови и коже у женщин.

3. Существуют возрастные различия показателей состояния печени у женщин.

4. Существуют возрастные изменения фракционного состава белков сыворотки крови у женщин, сопоставимые с аналогичными показателями в динамике беременности.

5. В норме в организме существуют взаимосвязи и взаимовлияния показателей возраста, беременности и обмена биополимеров.

6. Существует принципиальная возможность коррекции негативных возрастных биохимических сдвигов путем стабилизации обмена биополимеров межклеточного матрикса.

7. В биохимическом механизме фармакологической активности гликозаминогликанов существенную роль играет стимуляция транскрипционной активности ядер клеток, обеспечивающей интенсификацию репаративной регенерации тканей и антимикробной активности иммунокомпстснтных клеток.

8. Дестабилизацию системы гликозаминогликанов правомерно рассматривать в качестве одного из общих механизмов старения организма.

9. Существует возможность прогнозирования интенсивности процессов старения по показателям гликозаминогликанового и белкового обменов. Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены

на IV Международном конгрессе по косметологии и эстетической медицине «Kosmetik international»(MocKBa, 2005), на II Всероссийском симпозиуме с международным участием «Клинические и фундаментальные аспекты тканевой терапии» (Самара, 2004), на IV Международном конгрессе по эстетической медицине (Москва, 2004), на III Международном форуме по пластической хирургии и дер-

матокосмстологии (Москва, 2004), на III Международном конгрессе по косметологии и эстетической медицине «Kosmetik international» (Москва, 2004), на Международной конференции «Профессиональная косметика и современные технологии в эстетической косметологии» (Санкт-Петербург, 2004), на Международном форуме по пластической хирургии и дерматокосметологии (Москва, 2003), на II Международном конгрессе по косметологии и эстетической медицине «Kosmetik international» (Москва, 2003), на IV конгрессе по пластической, реконструктивной и эстетической хирургии (Ярославль, 2003), на IV Коференции «Косметология будущего - косметология antu-age» (Санкт-Петербург, 2003), на X Юбилейной научно-практической конференции «Клиническая эффективность нелекарственных оздоровительных продуктов: парафармацевтики, нутрицевтики, космецевти-ки» (Москва, 2003), на VII Всероссийской конференции по проблеме термических травм (Челябинск, 1999), на IV Съезде травматологов и ортопедов России (Нижний Новгород, 1997), на Научной конференции «Люминесцентный анализ в медицине и его аппаратурное обеспечение» (Рига, 1988), на Международной конференции «Медицина и катастрофы» (Уфа, 1990), на Научно-практической конференции «Изучение, охрана и рациональное использование природных ресурсов (Уфа, 1989).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 54 научные работы.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 334 страницах, содержит 125 таблиц, 79 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов, предметов и методов исследования, 14 глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 235 источников, из которых 132 отечественных и 103 иностранных авторов.

II. ОБЪЕКТЫ, ПРЕДМЕТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В печени, головном мозге и коже белых неинбредных крыс обоего пола различного возраста исследовали содержание гликозаминогликанов, их сульфатиро-ванных и несульфатированных фракций, интенсивность включения меченых сульфата (35S042 ) и 14С-глюкозы в сульфатированные и несульфатированныс ГАГ. В образцах кожи и сыворотке крови женщин различного возраста и физиологического состояния определяли фракционный состав гликозаминогликанов и белков, общее содержание нуклеиновых кислот, печеночные пробы (активность аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, тимоловую пробу и билирубин). В работе применены общепринятые биохимические методы, за исключе-

нием определения ГАГ, их фракций, а также технологии выделения ГАГ из плаценты человека, поэтому мы приводим подробное описание этих методик.

Для определения фракционного состава ГАГ 1 грамм исследуемой ткани после измельчения или 3 мл сыворотки крови подвергали гидролизу в 5 мл 10% NaOH на водяной бане при 160°С в течение 1 часа. Затем гидролизат нейтрализовали 30% НС1 до рН 7,0. Полученный раствор фильтровали через бумажный фильтр. Далее методом гельфильтрации производилось обессоливание образца и получение высокомолекулярной фракции, содержащей гликозаминогликаны. Для этого хроматографическую колонку высотой 40 см и диметром 1,6 см заполняли предварительно подготовленной суспензией сефадекса G25 (coarse), уравновешенной дистиллированной водой. Калибровка колонки производилась с использованием растворов голубого декстрана (молекулярная масса 2*106 Да) в водных растворах хлорида натрия. Выход солей контролировали реакцией с азотнокислым серебром на хлориды. V0 (наружный объем колонки) составлял 20 мл. Объем образца, при котором достигалось полное освобождение от солей при постоянной скорости 5 мл/мин, составлял 16 мл. В калиброванную колонку вносили образец и элюировали со скоростью 5 мл в минуту. Регистрацию оптической плотности проводили на спектрофотометре при Х=220 нм и А.=280 нм, контролируя выход полисахаридов и белков. После прохождения наружного объема колонки (20 мл) оптическая плотность элюента на выходе при Х=220 и Х=280 нм возрастала, что свидетельствовало о наличии в нем полисахаридов и белков. С этого момента начинали сбор образца, содержащего биополимеры. Собранный образец для разделения на основные классы гликозаминогликанов: нссульфатированныс (гиалуро-новая кислота) и сульфатированные (хондроитинсульфаты и гепарансульфаты) фракционировали методом анионообменной хроматографии на DEAE-целлюлозе. Для этого образец наносили на колонку объемом 20 см3, заполненную уравновешенной дистиллированной водой волокнистой DEAE-целлюлозой в хлоридной форме. Фракции элюировали дистиллированной водой и 0,15; 0,3; 0,7; 1,5 М водными растворами хлорида натрия под контролем оптической плотности при Х=220 при постоянной скорости 1 мл в минуту. 0,3 М фракция содержала несуль-фатированные гликозаминогликаны (гиалуроновую кислоту); 0,7 и 1,5 М фракции содержали сульфатированные гликозаминогликаны: 0,7 М - хондроитин- и дерма-тансульфаты, а 1,5 М - гепарансульфаты. Каждую фракцию собирали отдельно, элюент упаривали. Сухой остаток растворяли в известном объеме дистиллированной воды, отбирали аликвоту на определение гликозаминогликанов по содер-

жанию уроновых кислот (реакция Дишс). Для этого к 0,5 мл образца добавляли 3 мл концентрированной серной кислоты, содержащей 0,025 М тетраборнокислый натрий, тщательно перемешивали и нагревали на кипящей водяной бане в течение 10 минут. После охлаждения до комнатной температуры к образцам добавляли по 100 мкл 0,1% спиртового раствора карбазола и нагревали 15 минут в кипящей водяной бане, после чего охлаждали и измеряли оптическую плотность против контроля при \=530 нм. Контролем служил насыщенный раствор хлорида натрия, обработанный по Дише, как описано выше. Концентрацию ГАГ (мкг/г ткани) находили по калибровочному графику, построенному по растворам глюкуроновой кислоты в насыщенном растворе хлорида натрия.

Квантово-химические расчеты проводились полуэмпирическим методом РМЗ (Stewart J.J.Р., 1989). Дот-гибридизацию проводили по Maxam A., Gilbert W. (1977). В экспериментах на лабораторных животных и в клинике изучали влияние ГАГ, выделенных из плаценты человека, на интенсивность синтеза РНК и процессов репаративной регенерации. Исходным материалом для получения гликозами-ногликанов служили оболочки, пуповины и гомогенат мягких тканей плаценты, тестированной на ВИЧ, гепатит, сифилис. Экстракцию ГАГ из исходного материала вели равным объемом 2% КОН, содержащей 25% KCl, в течение 24 часов. После экстракции смесь центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 минут. Супернатант отбирали и титровали 50% соляной кислотой до pH 6-7 по индикаторной бумаге. Удаление белков из смеси вели кислотным осаждением ТХУ, доводя ее концентрацию до 10% на холоде. Смесь выдерживали 30 минут и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 минут. Дальнейшую депротеинизацию вели смесью фенол-хлороформ (1:1), добавляя к супернатанту равный объем де-протеинизирующей смеси. Затем 30 минут вели встряхивание полученной смеси при комнатной температуре. Разделение водно-фенольно-хлороформной смеси осуществляли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 минут. Супернатант декантировали и осуществляли диализ против дистиллированной воды в проточном варианте до момента окончательного удаления кислоты из смеси. Контроль качества диализа вели по значению pH. Полученный таким образом раствор гликозаминогликанов лиофилизировали до порошкообразного состояния. Субстанцию гликозоаминогликанов чистотой 95% использовали в экспериментах.

При обработке полученных данных рассчитывали средние значения, стандартные отклонения, вычисляли t-критерий Стыодента, применяли корреляцион-

ный, регрессионный, дисперсионный, факторный и кластерный анализ. Для этого использовали пакет компьютерных программ STAT1STICA 6.0 for WINDOWS. При упоминании в тексте увеличения или уменьшения значений показателей, их связей и влияний подразумеваются статистически значимые процессы.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

3.1. Содержание и метаболизм гликозаминогликанов в некоторых органах и тканях белых крыс различного возраста

Суммарное содержание ГАГ в печени крыс уменьшалось с возрастом (табл. I) и составило в сравнении с трехмесячными животными в остальных группах соответственно 85,1%, 75,3%, 64,2% . Различия в показателях между 6- и 24-месячными животными составили 1,33 раза. В головном мозге снижение уровня ГАГ отмечалось только у 24-месячных животных на 15,5% относительно 3-месячных. Наибольшее количество возрастных различий в показателях концентрации ГАГ отмечалось в коже подопытных животных. Так, по сравнению с 3-месячными крысами, уровень ГАГ снижался у 12-месячных животных в 1,31 раза, а у 24-месячных - в 1,70 раза. Различия между 6-месячными и 12-месячными составили 15,3%, а между 6- и 24-месячными - 34,6%. Содержание ГАГ в коже 12-месячных крыс превышало в 1,30 раза этот показатель у 24-месячных животных. Таблица 1. Содержание ГАГ (мкг/г тк) в печени, мозге и коже крыс различ-

Возраст животных (месяцы)

3 6 12 24

Печень 61,18+6,70 52,1±6,73 46,08±6,50 39,33±6,91

Моз1 45,90±3,60 42,4±4,04 41,53+5,00 38,78±4,65

Кожа 87,47 ±6,55 78,6±8,33 66,55±5,86 51,37±9,64

Возрастная динамика содержания несульфатированных ГАГ (НСГАГ) в органах представлена в таблице 2. В печени подопытных животных с возрастом снижалось содержание НСГАГ: по сравнению с 3-месячными животными у 12- и 24-месячных этот показатель был снижен соответственно на 35,5% и 61,5%. У 24-месячных крыс уровень НСГАГ был меньше, чем у 6- и 12-месячных на 50,9% и 40,4%. Показатели НСГАГ в мозге также снижались в зависимости от возраста, однако были менее выраженными. Различия наблюдались только между группой «3 месяца» и группами «12- и 24 месяца». Уменьшение показателей составило соответственно 22,6% и 32,1%.

Наиболее выраженное возраст-зависимое уменьшение концентрации НСГАГ наблюдалось в коже подопытных животных. Следует подчеркнуть, что

статистически значимые различия по этому показателю наблюдались во всех сравниваемых группах. Так, у 3-месячных животных уровень НСГАГ был выше, чем у 6-, 12- и 24-месячных соответственно в 1,37; 1,78 и 3,16 раза. У 6-месячных показатели были выше, чем у 12- и 24-месячных в 1,30 и 2,3! раза. Уровень НСГАГ у 12-месячных крыс был выше, чем у 24-месячных в 1,77 раза.

Представляется важным (табл. 2), что в мозге животных снижение содержания доли НСГАГ было достаточно небольшим и составило 9,1% . В печени доля НСГАГ уменьшилась более значительно: на 22,1%. Наиболее выраженным было уменьшение доли этого показателя в коже, которое составило 28,4%. Таблица 2. Содержание НСГАГ (мкг/г тк) в печени, мозге и коже крыс раз-

Возраст животных (месяцы)

3 6 12 24

33,78±6,15 26,4715,79 21,7714,34 13,0312,09

Печень (55,2%) (50,9%) (47,3%) (33,1%)

21,2013,54 18,4515,71 16,3513,42 14,4012,68

Мозг (46,2%) (43,6%) (39,5%) (37,1%)

54,03±6,62 39,4816,83 30,3315,56 17,1312,79

Кожа (61,7%) (50,3%) (45,5%) (33,3%)

Временная динамика содержания сульфатированных ГАГ (СГАГ) в печени, мозге и коже крыс представлена в таблице 3. В печени и мозге статистически значимых различий между сравниваемыми группами не наблюдалось. Статистически значимые различия в уровнях СГАГ присутствовали в коже. Так, у 6-месячных животных показатели были выше в 1,17 раза, чем у 3-месячных, и в 1,14 раза, чем у 24-месячных. Следует подчеркнуть, что в печени, мозге и коже подопытных животных наблюдалась отчетливая закономерность роста доли сульфатированных гликозаминогликанов (табл. 3).

Таблица 3. Содержание СГАГ (мкг/г гк) в печени, мозге и коже крыс различ-

Возраст животных (месяцы)

3 6 12 24

27,4214,15 25,5713,48 24,3214,22 26,2814,04

Печень (44,8%) (49,1%) (52,7%) (66,9%)

24,7214,99 23,8813,36 25,1314,22 24,4212,75

Мозг (53,8%) (56,4%) (60,5%) (62,9%)

33,5213,60 39,0813,74 36,3014,05 34,3213,48

Кожа (38,3%) (49,7%) (54,5%) (66,7%)

Таким образом, с возрастом у белых неинбредных крыс в печени, мозге и коже снижается абсолютное содержание ГАГ за счет падения концентрации НСГАГ (ГК). Также снижается интенсивность синтеза СГАГ (ХС и ГС). Эти па-

тохимичсские сдвиги в большей мерс выражены в коже и печени, и в меньшей степени в головном мозге.

Интенсивность включения радиоактивного сульфата в СГАГ у животных различных возрастных групп представлена в таблице 4. Величина счета импульсов во фракции СГАГ печени у 3-месячных крыс была выше, чем у 6- и 24-месячных в 1,14 и 1,44 раза. Радиоактивность СГАГ 6-месячных животных была выше, чем у 24-месячных, в 1, 27 раза. Также отмечалась тенденция различий в средних значениях 3- и 12-месячных животных. Количество импульсов во фракции СГАГ, полученной из мозга 3-месячных крыс, было выше, чем в СГАГ 12- и 24-месячных животных в 1,14 и 1,23 раза соответственно. Величина радиоактивности СГАГ кожи 3-месячных крыс превышала значения последней у 12- и 24-месячных животных соответственно в 1,37 и 1,66 раза. В свою очередь, показатели 24-мссячных крыс были ниже значений 6- и 12-месячной группы в 1,43 и 1,21 раза. Различия показателей интенсивности включения меченого сульфата в СГАГ между 3- и 24-месячными животными составили: для печени 30,7%, для мозга 18,5% и для кожи 39,6%. Полученные результаты свидетельствуют о замедлении с возрастом синтеза СГАГ в печени, мозге и коже подопытных животных.

Таблица 4. Интенсивность включения радиоактивного сульфата (ив) во фракцию сульфатированных ГАГ в печени, мозге и коже крыс (ерш/мг уро-новых кислот), а также процент от значения в 3 месяца_

Возраст животных (месяцы)

3 6 12 24

Печень 1559±91 (100%) 13721164 (88,0%) 11971459 (76,8%) 10801146 (69,3%)

Мозг 14841104 (100%) 13831273 (93,2%) 13061149 (88,0%) 1209189 (81,5%)

Кожа 1611±179 (100%) 13921241 (86,4%) 11741147 (72,9%) 9731114 (60,4%)

Для выяснения силы связей между исследованными показателями нами были рассчитаны коэффициенты ранговой корреляции Спирмена, показавшие, что в печени, мозге и коже существуют отрицательные корреляции между возрастом и показателями ГАГ, НСГАГ, интенсивностью включения меченого сульфата:

1) между возрастом и уровнем ГАГ печени г= -0,79 (сильная связь);

2) между возрастом и уровнем ГАГ мозга г= -0,51 (средняя связь);

3) между возрастом и уровнем ГАГ кожи г= -0,91 (сильная связь);

4) между возрастом и уровнем НС ГАГ печени г= -0,86 (сильная связь);

5) между возрастом и уровнем НС ГАГ мозга г= -0,56 (средняя связь);

6) между возрастом и уровнем НС ГАГ кожи 1= -0,94 (сильная связь);

7) между возрастом и уровнем включения меченого сульфата в СГАГ печени г= -0,71 (сильная связь);

8) между возрастом и уровнем включения меченого сульфата в СГАГ мозга г= -0,55 (средняя связь);

9) между возрастом и уровнем включения меченого сульфата в СГАГ кожи г= -0,81 (сильная связь).

Для математического описания статистически значимых линейных корреляционных зависимостей между изученными показателями нами был проведен регрессионный анализ, "результаты которого с надежностью Р<0,05 приведены в уравнениях:

[Печ. ГАГ] = 60,2065 - 0,9361 »Возраст

[Мозг ГАГ] = 45,4348 - 0,2920* Возраст [Кожа ГАГ] = 89,6580 - 1,6592*Возраст [Печ. НС ГАГ] = 33,9870 - 0,9088*Возраст [Мозг НС ГАГ] = 20,9000 - 0,2933*Возраст [Кожа НС ГАГ] = 53,1529 - 1,5917*Возраст [Печ. 358] = 1536,1449 - 20,8203»Возраст [Мозг "в] = 1481,0435 - 12,0372»Возраст [Кожа "Б] = 1605,6377 - 28,2715»Возраст

Влияние возраста на уровень ГАГ, НСГАГ в печени, мозге и коже крыс, а также на интенсивность включения меченого сульфата в НСГАГ печени, мозга и кожи подопытных животных было доказано однофакторным дисперсионным анализом (Р - критерий Фишера, р - вероятность нулевой гипотезы):

1) Возраст влияет на ГАГ печени:Р(3,20)= 11,470; р=0,00014.

2) Тенденция влияния возраста на ГАГ мозга: Р(3,20)=2,7218; р=0,07158.

3) Возраст влияет на ГАГ кожи: Р(3,20)=24,508; р<0,000001.

4) Возраст влияет на НСГАГ печени: И(3,20)= 12,209; р<0,000001.

5) Возраст влияет на НСГАГ мозга: Р(3,20)=3,1865; р=0,04604.

6) Возраст влияет на НСГАГ кожи: Р(3,20)=44,819; р<0,000001.

7) Возраст влияет на включение 358042" в СГАГ печени: Р(3,20)=3,9172; р=0,02374.

8) Тенденция влияния возраста на включение "во/" в СГАГ мозга: Р(3,20)=2,8287; р=0,06458.

9) Возраст влияет на включение 358042" в СГАГ кожи: Р(3,20)=14,605; р=0,00003.

Для анализа тесноты связи между исследованными показателями нами был проведен кластерный анализ, результаты которого представлены на рисунках 1 и 2. На рисунке 1 представлены результаты кластерного анализа всех изученных

показателей, которые группируются в два блока. Первый блок содержит показатели ГАГ и возраста, а во второй блок входят показатели интенсивности включения меченого сульфата НСГАГ, характеризующие скорость их синтеза.

Возр(мес) Пен ГАГ Мозг ГАГ Кожа СГАГ |1сч HCIAI Мозг НСГАГ Печ СГАГ Мозг СГАГ Кожа НСГАГ ' Кожа ГАГ -I

Печ «S04 -1

Мозг +S04 -[I

Кожа *S04 -'

О 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000

Linkage Distance

Рис. 1. Результаты кластерного анализа всех изученных показателей.

Tree Diagram for Переменные Single Linkage ЕисМеап distances

Возр (мес) -

Печ ГАГ - -

Мозг ГАГ -

Кожа СГАГ -

Печ НСГАГ -

Мозг НСГАГ - -

Печ СГАГ -

Мозг СГАГ -

Кожа НСГАГ --

Кожа ГАГ -

0 20 40 60 80 100 120

Linkage Distance

Рис. 2. Результаты кластерного анализа показателей ГАГ, СГАГ, НСГАГ и возраста.

Tree Diagram for Переменные Single Linkage Euclidean distances

В связи с тем, что нас, прежде всего, интересуют особенности влияния возраста на биохимические процессы в организме, в последующий кластерный анализ мы взяли блок возраста и сопряженных с ним показателей. Анализируя полученные результаты (рис. 2), становится очевидным, что возраст в большей мерс связан с биохимическими показателями печени и мозга и в меньшей степени с биохимическими показателями кожи. Таким образом, можно сделать вывод, что процессы старения больше затрагивают биохимические процессы в печени и мозге, нежели в коже. Иными словами, по-видимому, негативные возрастные изменения биохимических процессов раньше появляются в печени и мозге и лишь позже - в коже.

3.2. Влияние глюкозы на содержание гликозаминогликанов в ядерной

фракции печени крыс

В настоящее время считается, что гликозаминогликаны (ГАГ) синтезируются на белковых корах протеогликанов (ПГ) в эндоплазматичсском ретикулюмс клеток, после чего ПГ импортируются, в частности, фибробластами в межклеточное пространство, где они выполняют многочисленные функции, присущие межклеточному матриксу. Однако до сегодняшнего дня остается открытым вопрос о роли, содержании и обмене ГАГ в клеточных органоидах и других субклеточных структурах. В указанной связи целью настоящего фрагмента исследования явилось изучение фракционного состава ГАГ в ядерной фракции клеток печени и его динамика под воздействием такого универсального источника энергии и субстратов как глюкоза. Результаты количественного определения ДНК и состава ГАГ в ядерной фракции и гомогенате клеток печени после внутрибрюшинного введения крысам глюкозы в дозе 1 г/кг представлены в таблице 5. Таблица 5. Содержание ДНК и гликозаминогликанов в ядерной фракции

Показатель п Среди, знач. Стаид. откл.

ДНКя 8 9,26 2,96

преГКя 8 1,42 1,18

ГКя 8 1,46 1,41

ХСя 8 2,56 1,64

ГСя 8 0,68 0,81

ДНКг 8 167,61 69,03

преГКг 8 42,02 21,37

ГКг 8 23,74 24,52

ХСг 8 23,60 17,04

ГСг 8 13,45 11.83

Примечание: индекс «я» указывает на принадлежность к ядерной фракции, «г» - к гомогенату клеток печени.

В 0,15М хроматографической фракции помимо ДНК определялись и ГАГ. В связи с тем, что эта фракция предшествовала 0,ЗМ фракции, содержащей ГК, она получила название преГК. Общее содержание ГАГ в ядерной фракции составило 6,12 мкг/г ткани, а в гомогенате - 102,81 мкг/г. Процентное содержание ГАГ в ядерной фракции было следующим: преГК - 23,20%, ГК - 23,86%, ХС - 41,83%, ГС - 11,11%. В гомогенате аналогичные показатели составили: преГК - 40,87%, ГК - 23,09%, ХС - 22,95%, ГС - 13,08%.

В связи с тем, что уровень ДНК в тканях является достаточно стабильным, нами было проведено нормирование биохимических показателей по отношению к ДНК. Полученные результаты представлены в таблице 6. Таблица 6. Содержание гликозаминогликанов в ядерной фракции

Показа! ель п Средн. знач. Станд. откл.

преГКя 8 0,21 0,23

ГКя 8 0,20 0,22

ХСя 8 0,27 0,13

ГСя 8 0,07 0,07

преГКг 8 0,27 0,11

ГЮ 8 0,14 0,14

ХСг 8 0,15 0,12

ГСг 8 0,10 0,12

Примечание: индекс «я» указывает на принадлежность к ядерной фракции, «г» - к гомогенату клеток печени

После нормирования отношение ГАГ/ДНК в ядерной фракции составило 0,75, а в гомогенате - 0,66. Процентное содержание ГАГ/ДНК в ядерной фракции было следующим: преГК/ДНК - 28,00%, ГК/ДНК - 26,67%, ХС/ДНК - 36,00%, ГС - 9,33%. В гомогенате аналогичные показатели составили: преГК - 40,91%, ГК/ДНК -21,21%, ХС/ДНК - 22,73%, ГС/ДНК -15,15%.

Таблица 7. Коэффициенты эмпирической корреляции Пирсона (г) между показателями времени после введения глюкозы, содержания ДНК и ГАГ в печени крыс _______

((мин) ДНКя преГКя ГКя ХСя ГСя ДНКг преГКг ГКг ХСг ГСг

1(мин) 1,00 -0,01 -0,28 -0.31 -0,35 -0,54 -0,53 -0,34 -0,24 -0,58 0,81

ДНКя -0,01 1,00 -0,71 -0,41 0,62 0,54 -0,09 0,53 -0,19 0,09 0,35

преГКя -0,28 -0,71 1,00 0,45 -0,08 -0,12 0,29 -0,05 -0,13 0,37 -0,47

ГКя -0.31 -0,41 0,45 1,00 0,24 0,07 -0.18 -0,09 0,30 0,37 -0.55

ХСя -0,35 0,62 -0,08 0,24 1,00 0.66 0,06 0,54 0,03 0,50 -0,30

ГСя -0,54 0,54 -0,12 0,07 0,66 1,00 0,61 0,95 0,24 0,69 -0,24

ЛНКг -0,53 -0,09 0,29 -0,18 0,06 0,61 1,00 0,64 0,37 0,43 -0,42

ггрсГКг -0,34 0.53 -0,05 -0,09 0.54 0,95 0,64 1,00 0,12 0,62 -0,03

ГКг -0,24 -0,19 -0,13 0,30 0,03 0Д4 0,37 0,12 1,00 -0,18 -0,50

ХСг -0,58 0,09 0,37 0,37 0,50 0,69 0,43 0,62 -0.18 1,00 -0,34

ГСг 0,81 0,35 -0,47 -0,55 -030 -0,24 -0,42 -0,03 -0,50 -0,34 1,00

Для выявления связей между временем после введения глюкозы и изу ными биохимическими показателями нами был проведен корреляционный а В связи с тем, что эмпирическая выборка по своему объему относится к мал выборкам (п<30), были рассчитаны параметрические коэффициенты эмпири ской корреляции Пирсона и непараметрические коэффициенты ранговой ко) ляции Спирмена Полученные результаты приведены в таблицах 7-10.

В таблице 7 выявлены сильные положительные корреляции между по! телем времени и содержанием ГС в гомогенате (г=0,81), между уровнями ГС ре и преГК в гомогенате (г=0,95) и сильная отрицательная между содержани преГК и ДНК в ядерной фракции (г= -0,71).

Таблица 8. Коэффициенты ранговой корреляции Спирмена (И) между п зателями времени после введения глюкозы, содержания ДНК и ГАГ в п

( (мин) ДНКя преГКя ГКя ХСя ГСя ДНКг прсГКг ГКг ХС I

1 (мин) 1,00 -0.15 -0.15 -0,15 -0.34 -0,47 -0,68 -0,15 -0,32 -0,49

ДНК« -0,15 1,00 -0,74 -0,36 0,54 0,48 -0,20 0,35 0,01 -0.01

прсГКя -0,15 -0,74 1,00 0,53 0,07 -0,10 0,31 0,10 -0,04 0,41

ГКя -0,15 -0,36 0,53 1,00 0,45 0.23 0,19 0,12 0.40 0,40

ХСя -0,34 0,54 0,07 0.45 1,00 0,67 0,14 0,62 0.26 0.50

ГСя -0,47 0,48 -0,10 0,23 0,67 1,00 0,30 0,84 -0,04 0,84

ДНКг -0,68 -0,20 0,31 0,19 0,14 0,30 1,00 0,19 0,61 0,38

прсГКг -0,15 0,35 0,10 0,12 0,62 034 0,19 1,00 -0,24 0,74

ГКг -0,32 0,01 -0,04 0,40 0,26 -0,04 0,61 -0,24 1.00 -0,17

ХСг -0,49 -0,01 0,41 0,40 0,50 0,84 0,38 0,74 -0,17 1,00

ГСг 0,63 0,34 -0,40 -0,50 -0,07 0,16 -0,45 0,36 -0,49 0,00

Примечание: жирным шрифтом выделены статистически значимые корреляции.

В таблице 8 представлены 3 сильные корреляции: отрицательная меж/) держанием преГК и ДНК в ядре, положительная между уровнем ГС в ядре и гомогенате, положительная между концентрацией преГК и ХС в гомогенате (К=0,74).

Таблица 9. Коэффициенты эмпирической корреляции Пирсона (г) межд; казателями времени после введения глюкозы и содержания ГАГ, норми

1(мин) преГКя ГКя ХСя ГСя пре! 'Кг ГЮ ХСг I

Нмин) 1,00 -0,15 -0,17 -0,39 -0,54 0,19 -0,07 -0,42 0,

мре! Кя -0,15 1,00 0,60 0,25 0,15 -0,41 -0,07 0.09 -0

ГКя -0,17 0,60 1,00 0,41 0,08 -0,21 0,58 0,24 -0

ХСя -0,39 0,25 0,41 1,00 0,57 0,29 0,07 0,58 -0

ГСя -0,54 0,15 0.08 0.57 1,00 0,34 -0,16 0,53 -0

прсГКг 0.19 -0,41 -0,21 0,29 0,34 1,00 -0,41 0.58 0,

ГКг -0,07 -0,07 0,58 0,07 -0,16 -0,41 1.00 -0.36 -0

ХС'1 -0,42 0,09 0,24 0,58 0.53 0.58 -0,36 1,00 -0

ГСг 0,85 -0,45 -0,51 -0.53 -0,41 0,47 -0,38 -0,19 1.

аблице 9 приведена сильная положительная корреляция между показателем мени и содержанием ГС в гомогенате (г=0,85). В таблице 10 приведена сильная ожительная корреляция между содержанием ГС в ядре и ХС в гомогенате ),79).

>лица 10. Коэффициенты ранговой корреляции Спирмена (К) между пока-елями времени после введения глюкозы и содержания ГАГ, нормирован-

I (мин) преГКя ГКя ХСя ГСя преГКг ГКг ХСг ГСг

ин) 1.00 -0,15 -0,24 -0.29 -0,49 0,24 -0,10 -0,34 0,59

ГКя -0,15 1,00 0,38 0,24 -0,02 -0,33 -0.55 -0,05 -0,43

1 -0,24 0,38 1,00 0,45 0.32 -0.36 0,31 0,24 -0,62

и -0,29 0,24 0,45 1,00 0,66 0,36 0,12 0,57 -0,19

1 -0,49 -0,02 0.32 0,66 1,00 0,32 0.00 0.79 -0.19

ГКц 0,24 -0,33 -0.36 0,36 0,32 1,00 -0,12 0,48 0,69

1 -0.10 -0,55 0,31 0,12 0.00 -0,12 1,00 -0,26 -0,36

1 -0,34 -0,05 0.24 0,57 0,79 0,48 -0,26 1,00 0,24

1 0,59 -0,43 -0,62 -0.19 -0,19 0,69 -0,36 0.24 1,00

пиечание: жирным шрифтом выделены статистически значимые корреляции.

Для выявления латентных переменных, объединяющих изученные показа-и, нами был проведен факторный анализ (по программе «Варимакс»), резуль-

которого представлены в таблицах 11 и 12. тица 11. Результаты факторного анализа (Варимакс) показателя времени

Пока кнель Фактор! Фактор2 ФакторЗ

1 (мин) -0,490 0,494 -0,473

ДНКя 0,656 0,656 -0,189

преГКя -0,064 -0,851 -0,009

[Кя 0,054 -0,768 0,019

ХСя 0304 -0,064 -0,063

I Ся 0,913 0,061 0,361

ДНКг 0,386 -0,106 0,728

преГКг 0,863 0,159 0,279

ГКг -0,112 0,001 0,866

ХСг 0,776 -0,500 -0,041

ГСг -0,146 0,692 -0,573

Собственное значен-гис фактора 3.687 2,762 2,083

Доля дисперсии, объясняемая фан ороч 0,335 0,251 0,189

[мечание: жирным шрифтом вылелены статистически значимые корреляции между показам и фактором.

Из таблицы 11 следует, что в Фактор! входят показатели ХСя, ГСя, преГКг Сг. В Фактор2 включены показатели преГКя и ГКя. В ФакторЗ вошли ДНКг и •. В таблице 12 в Фактор 1 вошли преГКг и ХСг, в Фактор2 - только ГКя и в сторЗ - время и ГСг.

Для доказательства влияния введения глюкозы на показатели фракционного гава ГАГ в ядре и гомогенате нами был проведен однофакторный дисперсион-

ный анализ, выявивший значимое изменение динамики содержания ГК в ядерной фракции после введения глюкозы (Р=7,2239; Р<0,05) (рис. 3).

Таблица 12. Результаты факторного анализа (Варимакс) показателя времени после введения глюкозы и содержания ГАГ, нормированных по ДНК, в пе-

Показатель Фактор! Фактор2 ФакторЗ

1(мин) -0,152 -0,050 -•,950

преГКя 0,038 0,659 0,185

ГК* 0,117 0,964 0,056

ХСя 0,667 0,424 0,348

ГСя 0,626 -0,016 0,561

преГКг Ml* -0,331 -0,352

ГКг -0,426 0,601 0,067

ХСг •,879 0,066 0,217

ГСг 0,028 -0,494 -«,859

Собственное эначен-гие фактора 2,497 2,263 2,290

Доля дисперсии, объясняемая фактором 0,277 0,251 0,254

Примечание: жирным шрифтом выделены статистически значимые корреляции между показателем и фактором.

t (мин), LS Means Current effect F=7,2239, p-,04308 Effective hypothesis decomposition Vertical bars denote 0,95 confidence intervals

0,8 I-■-----

-0,3-■-----•—

15 30 60 120

t (мин)

Рис. 3. Влияние показателя времени после введения глюкозы на уровень ГК в ядерной фракции печени крыс.

Таким образом, проведенное исследование позволило охарактеризовать фракционный состав ГАГ в ядерной фракции и гомогенате печени крыс. Представляется важным выявление фракции преГК, имеющей более низкий заряд по сравнению с ГК. В связи с тем, что ГК имеет самый низкий заряд из всех классов

кислых ГАГ, обязательно содержащих гексуроновую кислоту, то уменьшение отрицательного заряда ГК можно объяснить только отсутствием у нее ацетамидной группы.

Наиболее важными результатами корреляционного анализа представляются выявленные сильные линейные связи между временем после введения глюкозы и содержанием ГС в гомогенате печени, а также между содержанием преГК и ДНК в ядерной фракции. В первом случае мы констатируем увеличение синтеза самого модифицированного ГАГ (несет не менее двух сульфогрупп на дисахаридный фрагмент), подтверждаемое результатами факторного анализа (табл. 12), по данным которого время и содержание ГС в гомогенате входит в один фактор. Во втором случае мы, по-видимому, - устанавливаем функциональную связь синтеза ГАГ с генетическим аппаратом клетки. Сделанное предположение подтверждается результатами факторного анализа, объединяющего преГК и ГК в рамках одного фактора (табл. 11). Еще больше укрепляют высказанное предположение результаты дисперсионного анализа (рис.3), характеризующего влияние однократного введения большой дозы глюкозы на уровень ГК в ядерной фракции. В течение часа наблюдается рост содержания ГК с последующей нормализацией ко второму часу.

3.3. Исследование локализации биосинтеза гликозаминогликанов и его

динамики с применением 14С-глюкозы, меченной по С]

Исторически сложилось так, что биосинтез ГАГ исследовали по включению клетками меченого сульфата (358042') (Слуцкий Л.И, 1969). Было убедительно показано, что процесс сульфатирования ГАГ происходит в эндоплазматическом ре-тикулюме клетки. Однако исследований по локализации синтеза самой полисаха-ридной цепи ГАГ, состоящей из гексоз и гексуроновых кислот, соединенных о-гликозидными связями не проводилось. Вышеописанные результаты, полученные нами, по исследованию динамики содержания ГАГ (преГК, ГК, ХС и ГС) в ядерной фракции печени крыс, привели нас к заключению о необходимости пометить предшественник синтеза самой полисахаридной цепи ГАГ. Этим предшественником является глюкоза, из которой образуются сначала УДФ-глюкоза, а затем УДФ-глюкуроновая кислота, идущие на синтез ГАГ. Следует подчеркнуть, что глюкоза используется клетками печени и по другим метаболическим путям: 1) гликолиз с последующим окислением в цикле трикарбоновых кислот; 2) пентозо-фосфатный цикл; 3) синтез гликогена; 4) возврат глюкозы в кровоток в случае падения ее концентрации в последнем. В указанной связи для исследования метабо-

лизма ГАГ глюкоза является слабой, но единственно возможной меткой. Следует также учитывать, что образующийся из глюкозо-6-фосфата рибозо-5-фосфат включается в состав нуклеиновых кислот (НК) Известно, что в пентозофосфат-ном цикле остаток глюкозы, превращаясь в рибозу, теряет углерод в первом положении, который уходит в составе углекислого газа, поэтому для исключения образования радиоактивных НК в экспериментах мы применили 14С-глюкозу, меченную по С\.

6000

5000

Е а.

4000

3000

2000

1000

/ Í \

/ / \ \ ядра — — Микросомы

/ f \ N.

/ / ! /

/ / / /

л/

15мин 30 мин 60 мин 120 мин 360 мин

Рис. 4. Динамика радиоактивности ядерной и микросомной фракций, выделенных из го-могената печени крыс (ерт - счет в минуту).

ь» 2

Е а

180 160 140 120 100 80 60 40 20

/ ч \ V \

/ N \ ч

0 • 15мин

—преГК — ГАГ

30 мин

60 мин

120 мин

360 мин

Рис. 5. Динамика радиоактивности преГК и суммарных ГАГ, выделенных из гомогената печени крыс (ерш - счет в минуту на мг уроновых кислот).

В первой серии экспериментов крысам весом 200 г внутрибрюшинно ввели

глюкозу в дозе 1 г/кг, в составе которой активность 14С-глюкозы составила 107 Бк

Однако фракции ГАГ (преГК, ГК, ХС и ГС), выделенные из гомогената, ядерной

и микросомной фракции печени, не показали радиоактивности, обусловленной ß-распадом |4С.

Во второй серии опытов активность метки была увеличена и составила 4* 108 Бк на животное. Из гомогената ткани печени, ядерной и микросомной фракций выделили преГК и суммарные ГАГ (ГК, ХС, ГС). Суммарная радиоактивность ядерной и микросомной фракций приведена на рисунке 4. В ядерной фракции наблюдаются два пика этого показателя - на 60 и 360 минут. В микросомной фракции - только один между 60 и 120 минутами после введения метки. К сожалению, преГК и ГАГ ядерной фракции и микросомной фракций не пометались, очевидно из-за достаточно малого их выхода, однако в гомогенате ткани удалось получить надежные результаты, которые представлены на рисунке 5. Обращает на себя внимание закономерное опережение синтеза преГК всех остальных фракций ГАГ, то есть ГК, ХС и ГС. Пик синтеза преГК наблюдается уже к 60 минутам после введения меченой глюкозы, а в случае ГАГ этот показатель сдвинут к 120 минутам.

3.4. Квантово-химический анализ образования водородных связей между основаниями ДНК и различными химическими группами полисахаридов

Выявленная взаимосвязь биосинтеза ГАГ с генетическим аппаратом клетки обусловила необходимость исследования возможных химических взаимодействий между полисахаридами и нуклеиновыми кислотами. Для изучения самой возможности этих процессов был проведен квантово-химический анализ.

Квантово-химические расчеты, выполненные полуэмпирическим методом РМЗ (Stewart J.J.Р., 1989), основанном на приближении, в котором пренсбрегается двухатомным дифференциальным перекрыванием (Neglect of Diatomic Differential Overlap - NDDO), показали, что возможно образование комплексов между азотистыми основаниями ДНК и карбоксильными, а также гидроксиметильными группами сахаридов. Принципиальные схемы и энергии этих взаимодействий представлены на рисунке 6.

Квантово-химические расчеты показали, что между азотистыми основаниями ДНК и карбоксильной или гидроксиметильной группами сахаридов могут образовываться водородные связи. Причем, величины этих связей неравноценны: карбоксильная группа образует более прочные водородные связи с пуринами (А и Г), менее прочные - с пиримидинами (Т и Ц). Гидроксиметильная группа - наоборот: более устойчивые водородные связи образует с пиримидинами, менее прочные - с пуринами.

Гуанин (Г) - УДФ-глюкуроновая кислота

ДЕ= -8,54 ккал/ моль

Аденин (А) - УДФ-глюкуроновая кислота

АЕ= -7,91 ккал/моль Рис.6. Образование водородных связен между карбоксильной группой глюкуроновой кислоты и азотистыми основаниями ДНК. Квантово-химнческий расчет методом МРЗ (атомы углерода показаны зеленым цветом, кислорода - красным, азота - синим, водорода -серым).

В целом, опираясь на полученные результаты, описанные в разделах 3.1-3.4, можно предположить следующий биохимический механизм синтеза ГАГ. Сначала в ядре на ДНК синтезируется преГК, представляющая собой гиалуроновую кислоту без ацетамидных групп, то есть полисахаридную цепочку, в которой глюкоза и глюкуроновая кислота соединены о-гликозидными связями. В принципе, по аналогии с синтезом РНК это соединение можно назвать гликотранскриптом. Затем полученный гликотранскрипт подвергается Ы-ацетилированию с образованием гиалуроновой кислоты. Далее в эндоплазматическом ретикулюме гиалуроно-вая кислота подвергается дальнейшим модификациям (изомеризации и сульфати-рованию) с образованием хондроитинсульфатов, гепарансульфатов, нейтральных гликозаминогликанов и пр. Завершающим этапом анаболизма ГАГ, очевидно, является синтез белкового кора с образованием протеогликанов, которые, в основном, экспортируются в межклеточное пространство для формирования межклеточного матрикса. В заключение отметим, что высказанная схема биохимических путей анаболизма ГАГ, безусловно, нуждается в дальнейшем экспериментальном обосновании.

3.5. Дот-гибридизация полисахаридов с пурин-пиримидиновыми зондами

Для экспериментального подтверждения гомологичности полисахаридного участка гликанов отдельным фрагментам ДНК была проведена дот- гибридизация. В качестве полисахаридов использовали глюкуроноксиланы чеснока, поли-урониды овса, амилозу картофеля, гиалуроновую кислоту и хондроитинсульфаты плаценты человека. Также использовали ДНК чеснока, рыб, теленка, человека. Применяли следующие олигодезоксинуклеотидные зонды: Poly dA, Poly dC, Poly dG-C. Результаты гибридизации представлены на рис. 7.

12 3 4 567 89

Рис. 7. Авторадиографии Дот-гИбридизации полисахаридов и ДНК с зондами олигодезоксинуклеолгидов (1 - глюкуроноксиланы, 2 - полнурониды, 3 - ГК, 4 -ХС, 5 - амилоза, 6 - ДНК чеснока, 7 - ДНК человека, 8 - ДНК рыбы, 9 - ДНК теленка).

Данные дот-гибридизации свидетельствуют, что ДНК из всех организмов специфически связывается с зондами олигодезоксинуклеотидов, причем можно констатировать, что тандемная последовательность G-C находит большее количество комплементарных последовательностей в ДНК, нежели гомополимеры, состоящие из монопуринов и монопиримидинов (А и С ). К примеру, ДНК человека содержит довольно много фрагментов poly dT и poly dG-C, в то время как последовательность poly dG в геноме человека представлена меньшим количеством. Вместе с тем, ДНК чеснока характеризовалась значительно большим количеством именно poly dG последовательностей, нежели ДНК человека. Эти данные вполне согласуются с современными представлениями генома растений (Зеленин A.B., 2003; Гилязетдинов Ш.Я.,Зимницкий А.Н. и др., 1986; Зимницкий А.Н., Гилязетдинов Ш.Я., 1986; Гилязетдинов Ш.Я., Зимницкий А.Н., Бикбаева Э.Ш., 1986). Необходимо отметить, что все использованные полисахариды являются конечным продуктом модификации, то есть «зрелыми» гликанами, отдален-

но напоминающими первичный гликотранскрипт. Практически не модифицированным гликотранскриптом можно считать полиурониды, состоящие, в основном, из глюкуроновой кислоты и амилозу, в состав которой входит только глюкоза. Результаты авторадиографии свидетельствуют о специфической гибридизации зонда poly dA с полиуронидами овса, причем уровень гибридизации соизмерим с таковым для молекул ДНК (ДНК чеснока), а зонд poly dC давал высокую гибридизацию с амилозой. Также получили высокую гибридизацию полиуронидов, соответствующую высказанному выше принципу: пиримидины (С) - комплементарны гидроксиметильной группе сахаридов, а пурины (А) - карбоксиметильной группе глюкуроновой кислоты. Этот принцип не нарушается и при интерпретации данных по глюкуроноксиланам, в которых 1 остаток гексуроновой кислоты приходится на 4 остатка ксилозы. И действительно, результаты эксперимента показали, что уровень образования связей с poly dA у глюкуроноксиланов примерно в четыре раза ниже, чем у полиуронидов. Использованные ГАГ не покачали высоко специфической гибридизации, что можно объяснить модификацией их первичной структуры ацетамидными и сульфатными группами.

3.6. Возрастные изменения содержания гликозаминогликанов, белка и

нуклеиновых кислот в коже у женщин

Связь метаболизма ГАГ с генетическим аппаратом клетки обосновывает целесообразность изучения возрастных изменений содержания этих полисахаридов в органах и тканях. В качестве объекта исследования нами была выбрана кожа человека. Мы достаточно условно распределили данные по возрастным градациям: 40-50 (зрелость), 50-60 лет (кризис зрелости), 60-70 лет (пожилой возраст), 70-80 лет (ранняя старость) и 80-90 лет (поздняя старость) Помимо содержания белка, ГАГ, ДНК приведены коэффициенты ДНК/белок, ГАГ/белок и ГАГ/ДНК.

Таблица!3. Биохимические показатели кожи женщин старше сорока лет

Показатель 40-50 лет 50-60 лет 60-70 лет 70-80 лет 80-90 лет

Белок, мг/г тк 107,40136,96 п=7 93,05133,15 п=9 94,90141,22 п=6 83,33114,05 п=7 97,89148,91 п=7

ДНК, мкг/г тк 464,42+162,77 п=5 500,021404,27 п=7 603,101224,34 п=5 508,531182,62 п=4 615,671195,27 п=5

ДНК/белок 4,3211,50 п=5 5,37+3.13 п=7 6,3612,56 п=5 6,1011,10 п=4 6,2912.57 п=5

ГАГ, мкг/г тк 178,91139,54 л=7 145,96161,18 л=9 100,13140,62 п=6 91,91128,87 л=7 44.72127,19 л=5

ГАГ/белок 1,6710.47 п=7 1,5710,61 п=9 1,06Ю,45 п=6 1,1010,27 п=7 0,4710,26 п=5

ГАГ/ДНК 0,39Ю,11 п=5 0,2910,18 п=7 0,1710,07 п=5 0,1810,06 п=4 0,0710,03 п=5

Из данных, представленных в таблице 13, следует, что с возрастом содержание ГАГ в коже достоверно уменьшается со 178,91±39,54 до 44,72±27,19, то есть в 4,0 раза. Уровень белка и ДНК в коже с возрастом статистически достоверно не изменялся. Сравнение средних значений содержания ГАГ (на г ткани) по N тесту Стьюдента выявило шесть значимых различий между всеми возрастными группами. При использовании в качестве показателя коэффициента ГАГ/белок количество статистически достоверных различий средних значений существенно уменьшалось (до двух) и они были менее сильными, что, очевидно, обусловлено варьированием уровня белка в образцах. Аналогичные результаты получены при статистической обработке коэффициентов ГАГ/ДНК: только два статистически значимых различия средних на уровне Р<0,05. По-видимому, как и в случае коэффициента ГАГ/белок, причиной снижения различий между группами явилось варьирование уровня ДНК в тканях.

Корреляционный анализ между исследованными переменными показал наличие сильной отрицательной корреляционной связи между возрастом и уровнем ГАГ. Корреляции отсутствовали между возрастом, белком и ДНК. Введение в корреляционный анализ коэффициентов ГАГ/ДНК и ГАГ/белок уменьшало силу корреляционных связей до средней и умеренной соответственно (табл. 14). Также в таблице 6 приведены «технические» корреляции между ГАГ и содержащими ГАГ коэффициентами, обусловленные корреляцией ГАГ-ГАГ, равной 1,0. Той же причиной обусловлены достоверные «технические» корреляции между белком и содержащим его коэффициентом, а также между ДНК и ее коэффициентом. Таблица14. Матрица интеркорреляций между показателями возраста, содержания глнкозаминогликанов, белка, ДНК, коэффициентами ГАГ/белок и ГАГ/ДНК в коже у женщин

ДНК ГАГ/белок ГАГ/ДНК

Примечание: жирным шрифтом и заливкой выделены статистически достоверные корреляционные связи (п=24); Для п=24 г критическое равно 0,4 (для Р=0,05) и 0,52 (для Р=0,01).

Для доказательства влияния возраста на уровень гликозаминогликанов в коже женщин нами был проведен дисперсионный анализ (однофакторный), подтвердивший на высоком уровне значимости (Р<0,001) эту зависимость (рис.8).

сс!/р = - 0,0014*Возраст + 0,3846 [Альбумин]= -0,2046*неделя беременности + 39,9137 [ос1 -глобулины] = 0,0235*неделя беременности + 2,0753 [сх2-глобулины] = 0,0761*неделя беременности + 5,9358 [у-глобулины] = 0,0829*неделя беременности + 13,1995

Таким образом, проведенные исследования показали, что существуют возрастные различия в уровнях общего белка, а2-, р-, у-глобулинов и коэффициентов а1/р. Фракционный состав сыворотки крови небеременных женщин коррелирует с возрастом: отмечаются умеренные положительные линейные корреляции между возрастом и общим белком сыворотки крови, возрастом и содержанием аль-фа2-глобулинов, возрастом и уровнем бета-глобулинов , возрастом и гамма-глобулинами. Между возрастом и значениями коэффициента а1/р наблюдается умеренная отрицательная корреляция. Зависимость коэффициента а1/р от возраста, описываемая вышеприведенным уравнением линейной регрессии.

При беременности фракционный состав белков сыворотки крови подвергается значительным изменениям, затрагивающим все исследованные показатели Значения коэффициента ос1/р у беременных соответствуют показателям старших возрастных групп, что позволяет предположить, по крайней мерс, временную интенсификацию процессов старения в период беременности. Отмечаются средние и умеренные корреляции между практически всеми биохимическими параметрами и сроком беременности. То есть показатель «срок беременности» в структуре корреляционных связей фактически ведет себя аналогично показателю «возраст» у небеременных женщин. Это наблюдение также свидетельствует в пользу наличия неблагоприятных для организма биохимических сдвигов, ускоряющих процессы старения, которые, безусловно, нуждаются в соответствующей профилактике и коррекции.

3.8. Возрастная динамика биохимических показателей печени в сыворотке крови и биополимеров в коже у женщин

Результаты обследования всей выборки испытуемых выявили большие стандартные отклонения изученных показателей, что позволяет предполагать существенный разброс значений изученных параметров в различных возрастных группах. Так, выраженное в процентах отношение стандартное отклонение/ среднее значение составило для тимоловой пробы 97,5%, билирубина - 70,9%, АлАТ -126,7%, АсАТ - 108,3%, ГАГ (сыворотка) - 20,2%, ГАГ (кожа) - 31,3%, белка

(кожа) - 31,4%, ДНК (кожа) - 30,0%. Поэтому мы распределили численные значения по трем возрастным группам: 1) до 40 лет (молодость и взрослость); 2) от 40 до 60 лет (зрелость), 3) от 60 до 90 лет (пожилой и старческий возраст) (табл. 17). Для удобства описания возрастные группы до 40 лет, от 40 до 60 лет и от 60 до 90 лет ниже по тексту будут называться соответственно 1, 2 и 3.

Таблица 17. Биохимические показатели печени в сыворотке крови и гликозаминогликанов в коже у женщин __

Показатель Кол-во обследован. Средн. знач. Станд. отклон.

возраст (годы) 33 56,19 16,22

тимол, пр. сыв. (ед. ¡5-Н) 33 4,33 4,22

билируб сыв. (мкМ/л) 33 12,17 8,63

АлАТ сыв. (мккат/л) 33 0,15 0,19

АсАТ сыв. (мккат/л) 33 0.12 0,13

ГАГ сыв. (мкг/мл) 33 10,00 2,02

Белок кожи (мг/г ткани) 33 73,23 23,02

ГАГ кожи (мг/г ткани) 33 116,51 36,48

НК кожи (мг/г ткани) 33 403,29 121,04

Среднее значение возраста в 1 группе составило 29,25±5,09 г., во 2 группе -49,33±4,30 г. и в 3 группе - 72,31±7,29 г. Сравнение средних значений выборок по Месту Стьюдента показало, что с возрастом показатель «тимоловая проба» достоверно увеличивается в 1,73 раза (различие между 1 и 2 группами) и в 3,03 раза (различие между 1 и 3 группой). При этом показатели 2 и 3 группы различались в 1,74 раза. Уровень билирубина также увеличивался с возрастом в 1,96 раза (между 1 и 2 группой) и в 2,28 раза (между 1 и 3 группой). Активность АлАТ в сыворотке крови в группе 40-60 лет увеличивалось в 6,5 раз, а в группе 60-90 лет - в 12 раз по сравнению с 1 группой обследованных в возрасте до 40 лет. Аналогичная возрастная динамика отмечалась и в случае определения активности АсАТ: различие между 1 и 2 группами составило 11 раз, а между 1 и 3 группами - 19 раз Уровень ГАГ достоверно возрастал только после 60 лет. Содержание белка и НК в коже с возрастом не изменялось, поэтому мы не стали определять эти показатели в сыворотке крови.

Для изучения связей между регистрируемыми переменными нами были рассчитаны непараметрические коэффициенты ранговой корреляции Спирмена (табл. 18). Была выявлена значимая средней силы положительные корреляции между возрастом и активностью АлАТ (г= 0,60; р<0,05). Умеренные положительные корреляции наблюдались между возрастом и активностью АсАТ (г=0,47; р<0,05) и между возрастом и концентрацией ГАГ в сыворотке крови (г=0,40; р<0,05). Представляется важным, что была выявлена сильная отрицательная кор-

реляция между возрастом и содержанием ГАГ в коже (г= - 0,71; р<0,05). Полученные результаты убедительно свидетельствуют, что возрастные изменения статистически достоверно связаны, не только с показателями ГАГ в коже и сыворотке крови, но и с состоянием печени.

Таблица 18. Коэффициенты ранговой корреляции Спирмена между биохимическими показателями печени в сыворотке крови и биополимеров в

возраст тимол пр билирубин АлАТ АсАТ ГАГ сыв Белок кожа ГАГ кожа НК кожа

возраст 1,00 0,27 0,24 0,60 <М7 -0,12 -в,71 0,25

тимол пр 0,27 1,00 0,72 0.49 0,53 -0,23 026 -0,20 0,26

билирубин 0,24 0,72 1,00 0,60 0,67 0,02 0,11 -0,10 0,34

АлАТ 0,60 0,49 0,60 1,00 0,85 0,22 -0,10 -0,35 0,26

АсАТ 0,47 0,53 0,67 0,85 1,00 0,08 -0,01 -0,19 0,37

ГАГ сыв 0,40 -0,23 0,02 0,22 0,08 1,00 0,05 -0,06 0,35

Белок кожа -0,12 0,26 0,11 -0,10 -0,01 0,05 1,00 0,34 0,24

ГАГ кожа -0,71 -0,20 -0,10 -0,35 -0,19 -0,06 0,34 1,00 0,03

НК кожа 0,25 0,26 0,34 0,26 0,37 0,35 0,24 0,03 1,00

Примечание: жирным шрифтом выделены статистически достоверные корреляции.

Линейный характер связей между переменными позволил рассчитать уравнения линейной регрессии:

[АлАТ] = 0,0047*Возраст - 0,0966 [АсАТ] = 0,0033*Возраст - 0,0444 [ГАГ кожи] = - 1,5114*Возраст + 201,4289 [ГАГ сывор.] = 0,0378'" Возраст + 4,9425

Для доказательства гипотезы о влиянии возраста на изученные биохимические показатели нами был проведен однофакторный дисперсионный анализ, результаты которого показали, что возраст влияет на уровень билирубина (Р(21,6)= 4,3516; р=0,03778), активность АлАТ (Р(21,6)=3,9875; р=0,04648) в сыворотке крови и концентрацию ГАГ в коже женщин (Тг(21,6)=3,9901; р=0,04514). Дисперсионный анализ не выявил влияния возраста на содержание белка и НК в сыворотке крови женщин, что согласуется с результатами 1-теста Стьюдента. Отсутст вие статистически значимых результатов, констатирующих влияния возраста на показатели тимоловой пробы, АсАТ и ГАГ в сыворотке крови, можно объяснить малым объемом выборки испытуемых.

Для выявления латентных переменных, описывающих общие закономерности, или так называемые конструкты, нами был проведен факторный анализ. Простой факторный анализ показал (таблица 19), что Фактор 1 высоко коррелирует с показателями билирубина, АлАТ и АсАТ, что позволяет интерпретировать его как переменную, характеризующую общее состояние печени.

Таблица 19. Результаты факторного анализа биохимических показателей печени и состава биополимеров в сыворотке крови и коже у женщин различ-

Показатель Фактор 1 Фактор2 ФакторЗ Фактор4

возраст 0,671909 0,456222 -0,227815 -0,441897

тимолов проба 0,452654 -0,061888 0,682438 -0,394168

билирубин 0,738787 -0,387289 0,246152 -0,056956

АлАТ 0,868834 -0,080105 0,046701 0,391478

АсАТ 0,879462 -0,101169 0,093843 0,343978

ГАГсыворотки 0,241481 -0,245434 -0,824991 -0,270469

Белок кожи -0,220051 -0,544271 0,301827 -0,580565

ГАГ кожи -0,408421 -0,811698 0,046490 0,308258

НК кожи 0,395576 -0,570926 -0,445358 -0,156159

Собств. знач. фактора 3,160512 1,719892 1,561415 1,155079

Доля дисперсии, объясняемая фактором 0,351168 0,191099 0,173491 0,128342

Таблица 20. Результаты вращения факторов по программе «эквимакс» при анализе биохимических показателей печени и состава биополимеров в сыво-

Показатель Фактор 1 Фактор2 ФакторЗ Фактор4

возраст 0,275577 0,874460 0,253461 0,043692

тимолов проба 0,420040 0,258877 -0,308279 0,700949

билирубин 0,769908 0,024954 0,150950 0,378771

АлАТ 0,931725 0,112694 0,063495 -0,178559

АсАТ 0,939141 0,119229 0,051646 -0,109297

ГАГ сыворотки -0,012883 0,154604 0,912974 -0,121350

Белок кожи -0,211839 -0,250492 0,133733 0,804551

ГАГ кожи -0,052118 -0,938942 0,151670 0,124546

НК кожи 0,321621 -0,125443 0,751775 0,144308

Собств. знач. фактора 2,746429 1,843232 1,628337 1,378900

Доля дисперсии, объясняемая фактором 0,305159 0Д04804 0,180926 0,153211

Примечание: жирным шрифтом выделены коэффициенты корреляции > 10,701.

Применение методического приема «вращения факторов» по программе «эквимакс» позволило выявить еще 3 фактора (табл. 20): Фактор2, положительно

коррелирующий с возрастом и отрицательно коррелирующий с содержанием ГАГ в коже, ФакторЗ, положительно коррелирующий с уровнем ГАГ сыворотки крови и НК в коже, и Фактор4, положительно коррелирующий с показателями тимоловой пробы в сыворотке крови и белка в коже.

Наиболее важным, на наш взгляд, представляется Фактор2, который связан с показателями возраста и ГАГ в коже. Этот фактор можно интерпретировать как функциональную отрицательную обратную связь между ГАГ и возрастом. Результаты факторного анализа также убеждают нас в том, что интегральная оценка состояния организма может быть получена расчетом следующих индексов: 1) [ГАГ кожи]/возраст; 2) [ГАГ сыв]*[НК кожи]; 3) [Белок кожи]""Тимоловая проба. 3.9. Влияние плацентарных гликозаминогликанов на процессы репара-тивной регенерации

3.9.1. Качественная оценка влияния плацентарных ГАГ на репаратив-ную регенерацию кожи

Эксперименты выполнены на крысах-самках, которым на освобожденном от шерсти участке кожи спины межлопаточной области вырезали лоскут кожи размером 1x1 см. Животные были разделены на 3 группы: 1-ая группа (п=15) - не-леченные животные, 2-ая группа (п=15) ежедневно получала плацебо, 3-я группа (п=15) ежедневно получала субстанцию гликозаминогликанов в виде 0,1% мази. Забор материала для гистологического исследования проводили на 3, 7, 14, 21 и 30 сутки эксперимента в каждой группе у 3 крыс, которые в указанные сроки забивались декапитацией. В ходе опыта проводилось цитологическое исследование ран методом раневых отпечатков. В целом, проведенные исследования свидетельствуют, что нанесение на кожную рану крысам субстанции гликозаминогликанов стимулирует процессы репаративной регенерации, ускоряя образование многослойного плоского эпителия, коллегановых волокон, пролиферацию волосяных фолликулов, полностью восстанавливая нормальную структуру поврежденной кожи.

3.9.2. Количественная оценка влияния плацентарных ГАГ на репара-тивную регенерацию кожи

Терапевтическую эффективность 0,1% мази ГАГ на вазелин- ланолиновой основе и препарата сравнения «солкосерил» при ежедневном в течение 21 суток эпикутанном нанесении оценивали на модели резаных кожных ран, регистрируя в

динамике уменьшение их площади. Полученные результаты приведены в таблице

21.

Таблица 21. Репара гивная регенерация кожных ран у крыс при лечении ГАГ и солкосерилом

Препарат Исходная площадь ран, мм2 Процент заживления ран на 3-21 сутки эксперимента

3 сутки 7 сутки 10 сутки 14 сутки 21 сутки

Контроль (л=8) 18,7±1,3 26,2±2,7 32,4±2,0 # 53,5±4,5 # 79,0±4,9 # 100

Солкосерил (п=8) 20,4±0,9 34,3±3,1 50,1 ±3,8* 79,2±5.1* 92,4±5,9* 100

ГАГ (п=8) 21,0±1,1 46,5±2,9* # 87,0±2,8* # 93,7±4,5* и 100*

Примечание: * - различия с группой «контроль» статистически достоверны; # - рахзичия с группой «солкосерил» статистически достоверны.

На 3 сутки эксперимента процент заживления площади ран крыс, леченных ГАГ, был выше, чем у нелеченных и получавших солкосерил соответственно в 1,77 раза ив 1,36 раза. На 7 сутки эти различия составили 2,69 раза и 1,74 раза. На 10 сутки опыта преимущество препарата ГАГ сохранялось: процент заживления ран был выше по сравнению с контролем в 1,75 раза, а по сравнению с группой, леченой солкосерилом, в 1,18 раза. Аналогичная зависимость между показателями ГАГ, солкосерила и контроля наблюдалась на 14 сутки. В этот период отмечалась полная эпителизация ран, леченных ГАГ. При этом эпителизация в группе «солкосерил» была 92,4%, а в контроле - 79,0%. Показатели группы, леченной солкосерилом, были лучше, чем у не леченных животных на 7, 10 и 14 сутки. Полная эпителизация ран в этих группах завершалась к 21 суткам опыта. В ходе эксперимента шел забор материала для цитологических исследований с целью определения интенсивности транскрипционных процессов по спектру флуоресценции нуклеиновых кислот в ядрах клеток, окрашенных красителем «акридиновый оранжевый». Рассчитанные коэффициенты а, представляющие собой отношение концентрации РНК к ДНК (а = [РНК]/[ДНК]), приведены в таблице 22. ГАГ и солкосерил стимулировали синтетические процессы в ядрах клеток базальных эпидермо-цитов, начиная с первых этапов процессов регенерации на: на 7-10 сутки значения коэффициентов а в образцах кожи животных, леченных ГАГ и солкосерилом, были выше показателей интактных и не леченных животных в среднем в 1,7 раза. К 14 суткам значения коэффициента а в группе «ГАГ» возвращались к нормальным значениям, а в группах «контроль» и «солкосерил» оставались повышенными.

Таблица 22. Транскрипционная активность ДНК (коэффициенты а) ядер базальных эпидермоцитов

Препарат Значение коэффициента а на 3-21 сутки эксперимента

3 сутки 7 сутки 10 сутки 14 сутки 21 сутки

Норма (интактные) 0,5010,06 0,5010,04 ♦ 0,4910,04 ♦ 0,5210,04 # 0,5110,04 #

Контроль (нелеченные) 0,4710,04 0,5110,05 ♦ 0,5110,04 ♦ 0,6910,05 »♦ 0,7110,05 *

Солкосерил 0,54±0,05 0,8710,06 *# 0,9110,08 Ч 0,9010,08 «# 0,6710,05 *

ГАГ 0,5910,06 0,8610,07 0,8010,07 ч 0,5410,07 0,5310,04

Примечание: * - различия с группой «норма» статистически достоверны; # - различия с группой «контроль» статистически достоверны; 4 - различия с группой «солкосерил» статистически достоверны.

Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что повышенная транскрипционная активность у животных групп «контроль» и «солкоссрил» в клетках базальных эпидермоцитов в период завершения эпитслизации раневой поверхности может, благодаря усиленной продукции коллагена, привести к образованию грубой рубцовой ткани. Этого недостатка лишено фармакологическое действие препарата ГАГ, стимулирующего транскрипционные процессы только на ранних этапах репаративной регенерации и обеспечивающего нормальные значения коэффициента а к моменту завершения процесса эпителизации.

ЗЛО. Сведения об эффективности применения препарата «Плазан» в

медицине

Клинические исследования препарата «Плазан» проводились в Республике Башкортостан согласно Указанию Министерства здравоохранения БАССР за № 556-Д от 01 октября 1990 года, а также инструкции по применению «Плазана», утвержденной Министерством здравоохранения БАССР 12 декабря 1991 г., и заключениям ВНИИМТ (г. Москва) от 17 октября 1995. Клинические испытания препарата «Плазан», содержащего 0,1% гликозаминогликанов, были проведены на базе Городской клинической больницы №6 (г.Уфа).

3.10.1. Применение препарата «Плазан» в хирургии

Препарат плазан, был использован для лечения 52 больных. Контрольную группу составили 28 больных. Для лечения раневых поверхностей плазан использовался путем непосредственной заливки его в рану или путем наложения асепти-

ческой повязки, предварительно пропитанной этим препаратом. Раневые поверхности в стадии нагноения перевязывались ежедневно, при чистых ранах перевязки проводились через день. Применение плазана при гнойных ранах начинали с 3 дня от начала поступления больного в стационар, перед наложением плазана проводилась обработка раны перекисью водорода и раствором БАЛИЗ. В контрольной группе применялся антисептик БАЛИЗ-2, на чистые раны накладывались солкосериповая или диоксидиновая мази.

У больных, леченых плазаном в отличие от контрольной группы за один и тот же промежуток времени наблюдалось ускоренное уменьшение площади ран (в среднем в 1,3 раза). Значительный эффект от применения плазана наблюдался у больных с обширными и глубокими ранами после ампутации бедра. Скорость заживления в этой группе у больных, леченных плазаном, была почти в 1,5 раза выше, чем в контрольной группе. При традиционном лечении наблюдается медленное, постепенное уменьшение площади ран, при применении плазана в первую неделю идет резкое уменьшение площади ран, темп которого затем несколько замедляется, но, тем не менее, остается высоким. Клинические исследования эффективности препарата плазан при лечении трофических язв, нагноений посттравматических ран, нагноений культи бедра, гнойных заболеваний кожи и подкожной клетчатки подтвердили его способность стимулировать процессы ре-паративной регенерации, а также выявили антимикробную активность.

3.10.2. Применение препарата "Плазан" в гинекологии

В качестве клинической модели, были использованы инфекционные осложнения после ручного вхождения в полость матки женщин. Под наблюдением находилось 256 женщин, перенесших в родах ручное вхождение в полость матки, по поводу гипотонического кровотечения, дефекта последа, плотного прикрепления плаценты, а также в качестве контрольной ревизии после акушерских влагалищных операций. Из этого числа основная группа составила 110 женщин, которым профилактика послеродовых инфекционных осложнений после внутриматочных вмешательств проводилась с использованием препарата плазан. Контрольную группу составили 146 женщин, перенесших ручное вхождение в полость матки, которым профилактика послеоперационных осложнений проводилась традиционными средствами.

Разработанная система лечебно-профилактических мероприятий при ручном вхождении в полость матки с использованием препарата «Плазан» показала

свою высокую эффективность, описана и защищена авторским свидетельством «Способ профилактики осложнений при внутриматочных вмешательствах» (АС № 1718939).

3.11. Сведения об эффективности применение плацентарных гликоза-миногликанов в составе лечебно-профилактических средств в дермато-косметологии

В настоящее время изделия лечебно-профилактической косметики, содержащие плацентарные гликозаминогликаны, выпускаются ОАО НПП «Жеспар-Биос» (руководитель А.Н. Зимницкий). Высокое качество продукции, ее эффективность и востребованность подтверждается:

— Патентом РФ на изобретение № 2317486 от 20.09.1999 г. Аллогенный препарат плаценты человека, обладающий противовоспалительным, репаративным, антимикробным, ранозаживляющим действием, и способ его получения.

— Авторским свидетельством на изобретение №1768155 от 15.06.1992 г. Способ приготовления аллотрансплантата для лечения поврежденных периферических нервов.

— Авторским свидетельством на изобретение №1718939 от 15.11.1991 г. Способ профилактики осложнений при внутриматочных вмешательствах.

— Авторским свидетельством на изобретение №1788616 от 15.09.1990 г. Способ приготовления аллотрансплантата для лечения дефектов твердой мозговой оболочки.

— Удостоверением на рационализаторское предложение №1239, выданным Башкирским государственным медицинским университетом 11.11.1989 г. Способ лечения ран.

— Награждением А.Н. Зимницкого медалью Всероссийского выставочного центра (г. Москва, 2003 г.) «за научное обоснование, экспериментальное изучение механизмов действия плацентарных компонентов на кожу человека, за разработку

* рецептур, доклиническое и клиническое изучение».

— Награждением А.Н. Зимницкого медалью «Российская Марка» (удостоверение № 75) за большой личный вклад в разработку и изготовление плацентарной косметической продукции высокого качества, разработку новых технологий.

— Награждением Золотым знаком качества изделия НПП «Жеспар-Биос» Плацентарная коллагеновая маска (свидетельство Лауреата национального конкурса «Российская Марка» от 02.04.2003, г. Москва).

— Награждением Золотым знаком качества изделия НПП «Жеспар-Биос» Крем Плазан «Бальзаковский» (свидетельство Лауреата национального конкурса «Российская Марка» от 02.04.2003, г. Москва).

— Награждением Золотым знаком качества изделия НПП «Жеспар-Биос» Крем коллагеновый «Плазан» (свидетельство Лауреата национального конкурса «Российская Марка» от 02.04.2003, г. Москва).

— Награждением НПП «Жеспар-Биос» медалью «Золотой Сирин» I степени по результатам VII Всероссийской межотраслевой выставкой отечественных товаров -«Покупайте Российское» 21.12.2003 (г. Москва) за Плацентарную коллагеновую маску «Плазан».

— Награждением НПП «Жеспар-Биос» медалью «Золотой Сирин» II степени по результатам VII Всероссийской межотраслевой выставкой отечественных товаров «Покупайте Российское» 21.12.2003 (г. Москва) за Крем дневной «Бальза-ковский-Плазан».

— Награждением НПП «Жеспар-Биос» Дипломом Российского фонда защиты прав потребителей за активное участие в XIII Международной выставке «Здравоохранение, медицинская техника и лекарственные препараты» 22.04.2004 (г. Москва).

— Награждением НПП «Жеспар-Биос» Дипломом Всероссийского выставочного центра за разработку и внедрение в производство косметической серии «Плазан» 01.11.2002 (г. Москва).

— Награждением НПП «Жеспар-Биос» Дипломом IV Международного конгресса эстетической медицины 25.09.2004 (г. Москва).

— Награждением НПП «Жеспар-Биос» Дипломом VII Всероссийской межотраслевой выставкой отечественных товаров «Покупайте Российское» 21.12.2003 (г. Москва) за Крем «Коллагеновый-Плазан».

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные нами эмпирические исследования показали, что с возрастом у белых неинбредных крыс в печени, мозге и коже снижается абсолютное содержание гликозаминогликанов за счет падения концентрации нссульфатированных гликозаминогликанов (гиалуроновой кислоты). Также снижается интенсивность синтеза сульфатированных гликозаминогликанов. Эти патохимические сдвиги в большей мере выражены в коже и печени, и в меньшей степени в головном мозге, что позволяет сделать заключение о большей устойчивости тканей мозга к возрастной патологии. Корреляционный анализ выявил большое количество сильных

и средних отрицательных взаимосвязей между возрастом и большинством показателей содержания и обмена гликозаминогликанов в печени, мозге и коже крыс. Полученные экспериментальные данные также позволили рассчитать уравнения линейной регрессии, описывающие корреляционные зависимости. Применение однофакторного дисперсионного анализа и факторного анализа позволило доказать влияние возраста на содержание и обмен гликозаминогликанов в печени, мозге и коже крыс. Применение кластерного анализа позволило доказать, что возрастные изменения в большей мере связаны с биохимическими процессами в печени и мозге, и в меньшей мерс - в коже подопытных животных, что свидетельствует о том, что возрастные патохимические сдвиги в коже носят вторичный характер. Изучение метаболизма ГАГ с использованием 14С-глюкозы показало, что в печени сначала синтезируется наименее заряженный гликозаминогликан преГК и лишь затем остальные фракции ГАГ. Появление радиоактивности в ядре опережает по времени ее определение в микросомной фракции, что свидетельствует о сопряженности синтеза ГАГ с ядром и, очевидно, с генетическим аппаратом клетки. Второй по времени пик радиоактивности в ядре, по-видимому, обусловлен оттоком из эндоплазматического ретикулума зрелых ГАГ для обеспечения нормального функционирования самого ядра. Квантово-химические расчеты и методы дот-гибридизации позволили предложить гипотезу матричного синтеза ГАГ, однако это во многом аргументированное предположение требует тщательного экспериментального обоснования. Нанесение на кожную рану крысам субстанции гликозаминогликанов стимулировало процессы репаративной регенерации, ускоряя образование многослойного плоского эпителия, коллагеновых волокон, пролиферацию волосяных фолликулов, полностью восстанавливая нормальную структуру поврежденной кожи.

Полученные данные позволили заключить, что показатели содержания в коже женщин белка и ДНК достаточно стабильны и не изменяются с возрастом. В то же время, можно с высоким уровнем достоверности констатировать, что с возрастом в коже женщин уменьшается уровень гликозаминогликанов в соответствии с приведенным уравнением линейной регрессии. Одновременно было отмечено, что существуют возрастные различия в уровнях общего белка, а2-, (3-, у-глобулинов и коэффициентов а1/р. При этом констатировали, что фракционный состав сыворотки крови женщин коррелирует с возрастом: отмечаются слабые положительные корреляции возраста с общим белком, а2- и у- глобулинами, а также умеренная положительная корреляция с Р-глобулинами и умеренная отри-

цатсльная - с коэффициентом а1/р. Проведенный однофакторный дисперсионный анализ показал, что существует влияние возраста на значения коэффициента а1/|3, описываемое вышеприведенным уравнением линейной регрессии. Наиболее важной является выявленная и доказанная с помощью факторного анализа связь показателя «возраст» со всеми параметрами белкового обмена в организме.

Выяснилось, что при беременности фракционный состав белков сыворотки крови подвергается значительным изменениям, затрагивающим все исследованные показатели. Значения коэффициента <х1/р у беременных соответствуют показателям старших возрастных групп, что позволяет предположить, по крайней мере, временную интенсификацию процессов старения в период беременности. Отмечаются средние и умеренные корреляции между практически всеми биохимическими параметрами и сроком беременности. То есть показатель «срок беременности» в структуре корреляционных связей фактически ведет себя аналогично показателю «возраст» у неберсмснных женщин. Это наблюдение свидетельствует в пользу наличия неблагоприятных для организма биохимических сдвигов, ускоряющих процессы старения, которые, безусловно, нуждаются в соответствующей профилактике и коррекции.

Проведенное исследование показало, что с возрастом в сыворотке крови женщин увеличиваются значения показателей тимоловой пробы, общего билирубина, АлАТ, АсАТ и ГК, что свидетельствует о патохимических процессах в печени. При этом уровень гликозаминогликанов достоверно возрастает за счет увеличения содержания хондроитинсульфатов. То есть, представляется очевидным, что сохранность функций печени является необходимым условием профилактики старческих изменений в организме.

Сделанные выводы подтверждаются данными однофакторного дисперсионного анализа, констатировавшего влияние возраста на содержание билирубина, АлАТ и хондроитинсульфатов в сыворотке крови женщин. Также были выявлены средней силы положительные корреляции между возрастом и уровнем АлАТ, возрастом и уровнем хондроитинсульфатов. Отмечались умеренные положительные корреляции между возрастом и содержанием АсАТ и между возрастом и содержанием ГАГ. Выявленные корреляционные зависимости описываются уравнениями линейной регрессии, позволяющими прогнозировать возрастные сдвиги исследованных биохимических показателей.

Применение факторного анализа позволило выявить тесную взаимосвязь между возрастом и содержанием в сыворотке крови хондроитинсульфатов, что позволяет с высокой степенью вероятности предполагать наличие функциональной связи между этими показателями. В указанной связи представляется очевидным, что с возрастом из органов и тканей «вымывается» не только гиалуроновая кислота, что было ранее известно из литературы, но и хондроитинсульфаты, играющие ведущую роль в функционировании протеогликанов межклеточного мат-рикса. Иными словами представляется очевидным, что патохимия старения затрагивает не только обмен гиалуроновой кислоты, объединяющей протеогликаны в макромолекулярные комплексы, но и обмен самих протеогликанов, уменьшая их содержание в тканях, что достаточно убедительно доказывается наблюдаемым нами увеличением содержания их фрагментов в сыворотке крови. Результаты факторного анализа также убеждают нас в том, что интегральная оценка состояния организма может быть получена расчетом следующих индексов: 1) [ГАГ ко-жи]/возраст; 2) [ГАГ сыв]*[НК кожи]; 3) [Белок кожи]* Тимоловая проба.

Проведенное исследование доказывает, что существуют статистические и функциональные связи между показателями возраста, состояния печени и биополимеров в коже и сыворотке крови у женщин. Выявленные закономерности представляют интерес для геронтологии, так как позволяют разработать биохимические методики уточнения биологического возраста испытуемых. Полученные результаты могут быть использованы в медицинской биохимии в части изучения механизмов естественного старения, а также в биохимической фармакологии в рамках понимания, что препараты из группы геронтопротекторов целесообразно сочетать с лекарственными средствами, проявляющими гепатопротекторную активность.

В заключение отметим, что выдвинутую нами в разделе «Введение» гипотезу о том, что патохимические механизмы старения сопряжены с изменением обмена таких биополимеров как гликозаминогликаны, белки и нуклеиновые кислоты, можно считать доказанной в отношении нарушений метаболизма белков и ге-терополисахаридов. Ранее считалось, что определяющую роль в механизмах старения кожи имеет снижение в ней уровня несульфатированных гликозаминогли-канов, то есть гиалуроновой кислоты. Однако, по нашим данным, этот процесс носит более масштабный характер, затрагивая и сульфатированные гликозаминогликаны: с возрастом снижается интенсивность их синтеза и содержание не только в коже, но и в других органах и тканях. Известно, что в состав протеогли-

канов входят только сульфатированные гликозаминогликаны, а несульфатиро-ванные ГАГ (гиалуроновая кислота) организует протеогликаны в гигантские мак-ромолекулярные комплексы. Поэтому в патохимии старения страдает не только пространственная организации комплексов протеогликанов по причине нарушения обмена гиалуроновой кислоты, но и сама структура протеогликанов из-за деструкции сульфатированных ГАГ.

С учетом полученных нами данных и сведений литературы, можно предложить концепцию дестабилизации системы гликозаминогликанов как одного из общих механизмов старения организма (рис. 10), заключающуюся в том, что с возрастом нарушается обмен биополимеров межклеточного матрикса, обусловленный во многом дефицитом УДФ-глюкуроновой кислоты, существенной причиной которого является ее повышенное расходование в реакциях глюкуронидной конъюгации. Следствием этих процессов является снижение синтеза несульфати-рованных и сульфатированных гликозаминогликанов, а также интенсивности фибриллогенеза, что приводит к обеднению протеогликанами и их компонентами - гликозаминогликанами - внутренних органов и покровной ткани. Уменьшение содержания гликозаминогликанов приводит к снижению интенсивности функционирования глюкуронат-ксилулозного цикла, в состав которого входит пенто-зофосфатный цикл. Также одной из причин уменьшения концентрации ГАГ в органах и тканях может бьггь генетически детерминированное снижение их синтеза.

Пентозофосфатный цикл является поставщиком рибозо-5-фосфата для синтеза РНК, поэтому уменьшение его активности неизбежно ведет к снижению транскрипции в клеточных ядрах, наблюдаемое нами в виде уменьшения соотношения [РНК]/[ДНК]. Эти биохимические сдвиги, очевидно, нарушают функционирование межклеточного матрикса тканей, следствием которого является «вымывание» фрагментов протеогликанов и гликозаминогликанов в кровь сначала тканевой жидкостью и затем лимфой.

Рис. 10. Гипотетическая схема нарушения структуры межклеточного матрикса в патогенезе старения.

Выше по тексту мы отмечали, что исходным субстратом синтеза гликоза-миногликанов является УДФ-глюкуроновая кислота, которая также расходуется в реакциях глюкуронидной конъюгации. Нами показано, что с возрастом снижается синтез всех классов гликозаминогликанов, что, очевидно, во многом обусловлено дефицитом УДФ-глюкуроновой кислоты. В указанной связи с позиций метаболической терапии представляется теоретически обоснованным введение в избытке экзогенной УДФ-глюкуроновой кислоты для повышения адаптационных возможностей организма.

Научно-практическая ценность выполненного исследования заключается в том, что существует принципиальная возможность прогнозирования интенсивности процессов старения по показателям гликозаминогликанового и белкового обменов путем определения фракционного состава гликозаминогликанов и белков в сыворотке крови с последующей подстановкой результатов в соответствующие уравнения линейной регрессии. При разработке лекарственных средств с позиций биохимической фармакологии можно ожидать наличие геронтопротекторной активности у всех препаратов, нормализующих обмен гликозаминогликанов в организме.

Экспериментальные исследования плацентарных ГАГ на лабораторных животных выявили стимуляцию транскрипционной активности, репаративной регенерации и антимикробной активности иммунокомпетентных клеток. Клинические исследования фармакологической активности плацентарных ГАГ в составе препарата «Плазан» подтвердили данные экспериментальных исследований и показали их терапевтическую эффективность при лечении хирургических и гинекологических заболеваний. На основании этих данных можно сделать правомерный вывод, что в биохимических механизмах фармакологических эффектов гликозаминогликанов существенную роль играет стимуляция транскрипционной активности клеточных ядер, обеспечивающая интенсификацию антимикробной активности иммунокомпетентных клеток и репаративной регенерации в целом.

Сопоставление данных биохимических исследований метаболизма гликозаминогликанов и результатов клинических испытаний препарата «Плазан» при хирургических и гинекологических заболеваниях позволяет рекомендовать проведение дальнейших исследований с целью расширения показаний к применению препаратов на основе плацентарных ГАГ и, в перспективе, широкого их внедрения в практическое здравоохранение и дерматокосметологию.

ВЫВОДЫ

1. Применение методов аналитической биохимии, меченых атомов, молекулярной биологии и квантово-химических расчетов позволило аргументировать выдвижение гипотезы матричного синтеза гликозаминогликанов.

2. В патогенезе старения, по данным корреляционного и дисперсионного анализов, существенное значение имеют взаимозависимые снижения синтеза и концентрации в тканях не только несульфатированных, но и сульфатированных гликозаминогликанов.

3. Переменная «возраст», показатели содержания гликозаминогликанов и их фракций, а также анаболизма сульфатированных гликозаминогликанов, по данным факторного анализа, описываются одним математическим конструктом, доказывающим регуляцию именно возрастом биохимических процессов в организме.

4. Возраст, по данным кластерного анализа, в большей мере связан с биохимическими показателями печени и мозга и в меньшей степени с биохимическими показателями кожи, что свидетельствует о первичности патохимических сдвигов в печени, головном мозге и вторичности - в коже.

5. С возрастом изменяется фракционный состав гликозаминогликанов органов и тканей организма (головного мозга, печени, кожи и сыворотки крови). При этом наименьшие патохимические сдвиги отмечаются в головном мозге, что свидетельствует о его большей устойчивости к возрастной патологии.

6. Выявлена отчетливая зависимость между возрастной динамикой биохимических показателей обмена гликозаминогликанов, белков и показателями состояния печени. По данным регрессионного анализа, интегральная оценка состояния организма может быть получена расчетом следующих индексов: 1) [ГАГ кожи]/возраст; 2) [ГАГ сыв]*[НК кожи]; 3) [Белок кожи]*Тимоловая проба.

7. Возрастные изменения фракционного состава белков сыворотки крови у женщин сопоставимы с аналогичными показателями в динамике беременности. Значения коэффициента а 1/(3 у беременных соответствуют показателям старших возрастных групп, что позволяет предположить, по крайней мерс, временную интенсификацию процессов старения в период беременности.

8. В норме в организме существуют взаимосвязи и взаимовлияния показателей возраста, беременности и обмена биополимеров. Показатель «срок беременно-

сти» в структуре корреляционных связей фактически ведет ссбя аналогично показателю «возраст» у небсрсмснных женщин.

9. Существует принципиальная возможность коррекции негативных возрастных биохимических сдвигов путем стабилизации обмена биополимеров межклеточного матрикса.

10. Дестабилизацию системы гликозаминогликанов правомерно рассматривать в качестве одного из общих механизмов старения организма.

11. Существует возможность прогнозирования интенсивности процессов старения по показателям гликозаминогликанового и белкового обменов.

12. Можно считать доказанной гипотезу о сопряженности механизмов старения с состоянием гликозаминогликанового и белкового обмена.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для диагностики соответствия паспортного возраста биологическому целесообразно определять показатели фракционного состава гликозаминогликанов и белков в сыворотке крови с последующей оценкой путем применения регрессионного анализа.

2. При разработке лекарственных препаратов из группы геронтопротекторов целесообразно проводить их скрининг по показателям воздействия на спектральный состав гликозаминогликанов и белков сыворотки крови с расчетом соответствующих возрастных коэффициентов.

3. С учетом полученных сведений о биохимических механизмах метаболизма гликозаминогликанов и результатов клинических исследований фармакологической активности препарата «Плазан», в целях повышения адаптационных возможностей организма представляется целесообразным изучить на соответствующих экспериментальных моделях фармакологическую активность УДФ-глюкуроновой кислоты.

4. Целесообразна подготовка соответствующей документации, способствующей широкому внедрению препарата «Плазан» в практическое здравоохранение.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Зимницкий А.Н. Возрастная динамика показателей метаболизма гликозами-ногликанов у белых крыс /А.Н. Зимницкий //Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии,- 2005,- № !.- С.24-28.

2. Зимницкий А.Н. Возрастные изменения содержания гликозаминогликанов в коже у женщин /А.Н. Зимницкий// Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии.- 2005.- № 1,- С.21-24.

3. Зимницкий А.Н. Гликозаминогликаны в биохимических механизмах адаптации организма к некоторым физиологическим и патологическим состояниям /А.Н Зимницкий, С.А. Башкатов.-М: Глобус: Фармацевтический Бюллетень, 2004,-208с.

4. Зимницкий А.Н. Возрастные изменения содержания гликозаминогликанов в коже у женщин (Сообщение 1) /А.Н. Зимницкий, С.А. Башкатов, Е.Г. Петренко, С.Б. Хуснутдинова// Биомедицинская химия.-2004.-Т.50.-Вып. 3.-С.309-313.

5. Зимницкий А.Н. Возрастные изменения содержания гликозаминогликанов в коже у женщин (Сообщение И) /А.Н. Зимницкий, С.А. Башкатов, Е.Г. Петренко, С.Б. Хуснутдинова//Биомедицинская химия.-2004.-Т.50.-Вып. З.-С. 493497.

6. Зимницкий А.Н. Сопоставление возрастной динамики фракционного состава белков сыворотки крови у женщин с аналогичными показателями при беременности /А.Н. Зимницкий, С.А Башкатов, Е.Г. Петренко, С.Б. Хуснутдинова // Биомедицинская химия.-2004.-Т.50.-Вып. 5 -С 440-445.

7 Зимницкий А.Н. Содержание и метаболизм гликозаминогликанов в органах и тканях белых крыс различного возраста /А.Н. Зимницкий, С.А. Башкатов, С Б. Хуснутдинова, Е.Г. Петренко, O.E. Ерофеева // Биомедицинская химия.-2004.-Т.50.-Вып.6. С.592-599.

8. Зимницкий А.Н. Концепция генетически детерминированного синтеза полисахаридов на частых повторах ДНК /А.Н.Зимницкий, С.А.Башкатов, В.Н. Ураз-баев //Парафармацевтика - 2004.-Т.23.-№ 10-11 .-С.21-37.

9. Зимницкий А.Н. Возрастные изменения фракционного состава белков в сыворотке крови женщин /А.Н. Зимницкий, С.А. Башкатов, Е.Г. Петренко, С.Б. Хуснутдинова //Парафармацевтика.-2004.-Т.16.-№1.-С.25-26.

Ю.Зимницкий А.Н. Геномика на старте третьего тысячелетия /А.Н.Зимницкий // Парафармацевтика. - 2004,- Т.20.-№ 8-9.-С.8-9.

11.Зимницкий А.Н. Механизмы старения кожи. Методы борьбы со старением кожи с применением плацентарных препаратов /А.Н. Зимницкий // Материалы III

Международного конгресса по косметологии и эстетической медицине «Kosmetik international».-M., 2004.-С.61-62.

12.Зимницкий А.Н. Роль гликозаминогликанов в механизмах старения. Методы профилактики и коррекции /А.Н. Зимницкий // Материалы IV Международного конгресса по косметологии и эстетической медицине «Kosmetik interna-tional».-M., 2005.-С. 18.

13.Зимницкий А.Н. Роль гликозаминогликанов в механизмах старения. Методы профилактики и коррекции /С. А. Башкатов, А.Н. Зимницкий//Материалы IV Международного конгресса по эстетической медицине -М., 2004.-С.8.

14.3имницкий А.Н. Механизмы старения кожи и роль плацентарной косметики в антивозрастной терапии /А.Н. Зимницкий, С.А. Башкатов //Материалы Международной конференции «Профессиональная косметика и современные технологии в эстетической косметологии. -СПб., 2004.-С.4.

15.Зимницкий А.Н. Роль плацентарной косметики «Плазан» в anti-age терапии /А.Н. Зимницкий, С.А. Башкатов, Е.Г. Петренко, Е.Ф. Колмакова // III Международный форум по эстетической медицине: Сб. науч. тр. Актуальные вопросы дсрматокосмстологии .-М., 2004.-С.94.

16 Зимницкий А.Н. Механизмы старения кожи. Методы борьбы со старением кожи с применением плацентарных препаратов /А.Н. Зимницкий // Материалы III Международного конгресса по косметологии и эстетической медицине «Kosmetik international».-M., 2004.-С.61-62.

17.Зимницкий А.Н Препараты плаценты для лечения ран /А.Н. Зимницкий, Т.Р. Мавлготов, В.В. Никитин, P.A. Нуруллин // Материалы II Всероссийского симпозиума с международным участием «Клинические и фундаментальные аспекты тканевой терапии».-Самара, 2004.-С.31.

18.Зимницкий А.Н. Опыт применения отечественной плацентарной косметической продукции /Е.А. Щербина, О.С. Панова, Л.П. Гурочкина, А.Н. Зимницкий // Парафармацевтика.-2003.-Т. 16.-№6.-С.25-26.

19.3имницкий А.Н Отечественная аллокосметика «Плазан» /Зимницкий А.Н. // Парафармацевтика.-2003 .-№ 11 .-С.27-30.

20.Зимницкий А.Н. Результаты применения модифицированных трансплантатов в лечении ожогов /Мавлютов Т.Р., Зимницкий А.Н., Олейников С.И. //Здравоохранение Башкортостана.-2003.-№6.-С.112-113.

21.Зимницкий А.Н. Отечественная плацентарная косметика /Зимницкий А.Н. // Парафармацевтика.-2003.-Т. 12.-№2.-С.27-30.

22.Зимницкий А.Н. Плацентарная аллокосметика. Активные компоненты и механизмы действия на клетки кожи /А.Н. Зимницкий // Материалы IV конгресса

по пластической, реконструктивной и эстетической хирургии .-Ярославль, 2003.-С.54.

23.3имницкий А.Н. Плацентарная косметика и ее перспективы /А.Н. Зимницкий // Материалы II Международного конгресса по косметологии и эстетической медицине «Kosmetik international», 2003.-С.58-59.

24. Зимницкий А.Н. Плацентарная косметика, се свойства и перспективы применения /А.Н. Зимницкий // Международный форум по пластической хирургии и дерматокосметологии: Сб. науч. тр. Актуальные вопросы пластической хирургии и дерматокосметологии. -М., 2003.-С.94.

25.Зимницкий А.Н. Сравнительный анализ плацентарных коллагеновых масок «Плазан» и «Placenta laboratories inc.» /А.Н. Зимницкий // Парафармацевтика.-2002.-№7.-С.36-37.

26.3имницкий А.Н. Косметика «Плазан»: компоненты, применение/А.Н. Зимницкий // Парафармацевтика.-2002.-№9.-С.24-25.

27.Зимницкий А.Н. Использование плацентарной косметики «Плазан» /А.Н. Зимницкий // Парафармацевтика.-2002.-№8.-С.35-36.

28.3имницкий А.Н. Плацентарная косметика «Плазан» - шаг в третье тысячелетие /А.Н. Зимницкий. -Уфа, 2002.-39с.

29.3имницкий А.Н. «Плазан» - новая косметика на основе компонентов плаценты человека /А.Н. Зимницкий, Р.В. Пироговский. -Уфа, 2000.-64с.

30.Зимницкий А.Н. Аллогенный препарат плаценты человека, обладающий противовоспалительным, репаративным, антимикробным, ранозаживляющим действием, и способ его получения /А.Н. Зимницкий, Л.П. Котова, А.В. Волгарев // Патент РФ на изобретение № 2317486 от 20.09.1999 г.

31.Зимницкий А.Н. Экспериментальное биопротезирование кожных покровов при термической травме /Т.Р. Мавлютов, Р.И. Еникеев, А.Н. Зимницкий, JI.H. Шес-такова //Уроки Улу-Телякской катастрофы.-СПб, 1999.-С.27.

32.3имницкий А.Н. Прямая и опосредованная защита ожоговой раны /Т.Р. Мавлютов, В.В. Никитин, Г.А. Гинодман, А.Н. Зимницкий, В.В. Смольников // Материалы VII Всероссийской конференции по проблеме термических травм.-Челябинск, 1999.-С. 187-189.

33.Зимницкий А.Н. Ксенотрансгшантаты для лечения ожоговых ран /Т.Р. Мавлютов, А.Н. Зимницкий // Материалы IV Съезда травматологов и ортопедов Рос-сии.-Нижний Новгород, 1997.-С.111.

34.3имницкий А.Н. Трансплантаты для лечения ран /Т.Р. Мавлютов, Р.А. Гатаул-лин, А.Н, Зимницкий // Новые технологии в хирургии.-Уфа, 1996.-С.62.

35.3имницкий А.Н. Анализ лечения гранулирующих ран с применением новых трансплантатов /Т.Р. Мавлютов, P.A. Гатауллин, А.Н. Зимницкий, Р.Н. Зина-туллин, А.З. Гаймалетдинов //Актуальные вопросы клинической медицины.-Уфа, 1994.-С.73-75.

36.Зимницкий А.Н. Использование новых алло- и ксеноматериалов серии «Плазо- {

дерм» для лечения ожогов. Рекомендации к применению ЛГ.Р. Мавлютов, А.Н. Зимницкий, H.H. Глебова, В.В. Никитин, А.Х. Турьянов, Д.А. Азнагулова.-Уфа, 1992.-23с.

37.Зимницкий А.Н. Анализ лечения ран с применением новых алло- и ксеногсн-ных трансплантатов /Т.Р. Мавлютов, В.П. Коршунова, А.Н. Зимницкий, Б.Ш. Минасов, P.A. Гатауллин, Р.И. Еникссв, P.M. Зинатуллин, В.В. Смольников // Актуальные вопросы детской хирургии и педиатрии. -Уфа, 1991.-С. 106-108.

38.3имницкий А.Н. Сравнительный анализ лечения ожоговых ран с применением новых трансплантатов /Т.Р. Мавлютов, А.Н. Зимницкий, В.П. Коршунова, P.A. Гатауллин, P.M. Зинатуллин, В.В. Смольников // Сб. науч. тр. «Медицина катастроф. Лечение внутри-около-суставных повреждений».-Уфа, 1991.-С.77-79.

39.Зимницкий А.Н. Способ профилактики осложнений при внутриматочных вмешательствах /Д.Г. Азнагулова, H.H. Глебова, А.Н. Зимницкий // Авторское свидетельство на изобретение №1718939 от 15.11.1991.

40.3имницкий А.Н. Способ приготовления аллотрансплантата для лечения дефектов твердой мозговой оболочки /В.А. Халиков, А.Н. Зимницкий, P.A. Валишин // Авторское свидетельство на изобретение №1788616 от 15.09.1990.

41.Зимницкий А.Н. Применение плацена для лечения больных с комбинированными ранами, полученными в результате объемного взрыва /Б.Ш. Минасов Б.Ш., А.Н. Зимницкий, Т.Г. Толстикова, A.B. Волгарев, Ф.С. Зарудий // Материалы междунар. конф. «Медицина и катастрофы».-Уфа, 1990.-С.24-25.

42.Зимницкий А.Н. Эффективный кольцевой диализатор /М.Ю. Хавкин, А.Н. Зимницкий // Лабораторное дело.-1990.-№6.-С.79.

43.Зимницкий А.Н. Лечение трофических язв конечностей, обусловленных артериальной и венозной недостаточностью препаратами серии «Плацен» /A.B. " Волгарев, Р.Ш. Бикмурзин, А.Н. Зимницкий // Материалы междунар. конф. «Медицина и катастрофы».-Уфа, 1990.-С.31-32.

44.3имницкий А.Н. Способ приготовления аллотрансплантата при лечении поврежденных периферических нервов /В.А. Халиков, А.Н. Зимницкий, P.A. Валишин, Ш.И. Ибрагимов, И.А. Басченко//A.C. № 1768155 от 15.06.92.

45.3имяицкий А.Н. Трансплантаты для лечения ожогов (медико-технические требования на опытно-конструкторскую работу) /Т.Р. Мавлютов, Р.Т. Нигматул-лин, А.Н. Зимницкий // Пр. №3, 23.02.89.

46.3имницкий А.Н. Новые составы для местного лечения ран /А.Н. Зимницкий, \ Т.Р. Мавлютов, Б.Ш. Минасов, A.B. Волгарев, Т.Г. Толстикова //Материалы

конф. «Изучение, охрана и рациональное использование природных ресурсов.-Уфа, 1989.-С.161.

47.3имницкий А.Н. Люминесцентный анализ физиологического состояния клеток животных и человека при стимуляции процессов регенерации /Л.С. Сердюк, А.Н. Зимницкий, Т.Г. Толстикова, Л.П. Котова //Сб. науч. тр. Всссоюзн. конф. «Люминесцентный анализ в медицине и его аппаратурное обеспечение».-Рига, 1988.-С.145-146.

48.3имницкий А.Н. Выделение ингибитора РНКазы из плаценты человека /А.Н. Зимницкий, Р.И. Сафиуллин, A.B. Волгарев //Материалы научно-практич. конф. «Биотехнология - народному хозяйству.-Уфа, 1987.-С.24.

49. Зимницкий А.Н. Выделение препаратов для генной инженерии и биотехнологии из плаценты человека/А.Н. Зимницкий // Материалы V Всесоюзн. конф. «Методы получения и анализа биохимических реактивов».-Рига, 1987.-С.49-50.

50.Зимницкий А.Н. Фракционирование растворимых белков плаценты человека /А.Н.Зимницкий, Р.И.Ибрагимов, В.А.Шишкина //Сб. науч. тр. Конф. «Изучение, охрана и рациональное использование природных ресурсов.-Уфа, 1987.-С.204.

51.Зимницкий А.Н. Популяции повторяющихся генов у родительских форм гете-розисных гибридов кукурузы / Ш.Я Гилязетдинов.И.А.,Яхин, Э.Ш.Бикбаева // Доклады АН СССР.-1986,- Т.283.-№1.-С.224-227.

52.Зимницкий А.Н. Состав популяции поли (А)+-РНК в корнях гетерозисных гибридов кукурузы и их исходных линий /Ш.Я. Гилязетдинов // Физиология растений,- 1986.-Т.ЗЗ, Вып.4.-С.769-777.

53.Зимницкий А.Н. Изучение повторяемости множественных генов и состав популяции поли (А)+-РНК у разных линий и гибридов кукурузы /Ш.Я. Гилязетдинов, Э.Ш. Бикбаева // Материалы V Всесоюзного биохимического съезда.-Кисв, 1986.-Т.2.-С.350-353.

54.3имницкий А.Н. Состав популяции поли (А)+-РНК у растений кукурузы с разным генотипом / Ш.Я. Гилязетдинов// Материалы Всссоюзн. конф. «Молекулярная биология генов высших организмов».-Рига, 1987.-С.30-31.

Зимницкий Александр Николаевич

ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНЫ В БИОХИМИЧЕСКИХ МЕХАНИЗМАХ СТАРЕНИЯ ОРГАНИЗМА

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Лицензия на издательскую деятельность Б №848 412 от 03.11.2000 г.

Подписано в печать 27.01.2005 г. Формат 60x84/16. Бумага для лазерной печати. Компьютерный набор. Отпечатано на лазерных принтерах. Гарнитура Times. Усл.печ.л.3,78. Уч.-изд.л. 3,26. Тираж 150 экз. Заказ 567.

ООО Салон оперативной полиграфии "Экспресс" 450040. Уфа, ул. Первомайская, 27. Тел. (3472)425-579.

РНБ Русский фонд

2005-4 45422

1648

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Зимницкий, Александр Николаевич

Список принятых сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Структура и функции гликозаминогликанов.

1.2. Взаимосвязь обмена гликозаминогликанов с процессами детоксикации ксенобиотиков.

1.3. Возрастные изменения биохимических процессов в печени.

1.4. Возрастные изменения фракционного состава белков сыворотки крови.

1.5. Изменения белкового спектра при беременности.

1.6. Теории старения и возрастные изменения биохимических показателей кожи.

1.6.1. Генетическая теория старения.

1.6.2. Свободнорадикальная теория старения.

1.6.3. Элевационная теория старения.

1.7. К вопросу о локализации биосинтеза полисахаридов и его связи с генетическим аппаратом клетки.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Гликозаминогликаны в биохимических механизмах старения организма"

Актуальность работы. Биохимические механизмы адаптации организма к патологическим состояниям, неблагоприятным воздействиям со стороны окружающей среды, возрастным и физиологическим изменениям, например, таким как состояние беременности, в течение последних десятилетий постоянно привлекают внимание исследователей с целью создания средств, повышающих адаптационные возможности организма. В этом отношении недостаточно изучена роль гетерополисахаридов - гликозаминогликанов (ГАГ) (прежнее наименование "кислые мукополисахариды"), содержащих в своем составе гексозами-ны, гексозы и гексуроновые кислоты (Кочетков Н.К., 1967), подразделяющихся в основном на гиалуроновую кислоту (ГК), хондроитинсульфаты (ХС) и гепа-рансульфаты (ГС).

ГАГ содержатся в межклеточном матриксе, клеточных мембранах (Hunter G.K., Heersche J.N.M., Aubin J.E., 1983; Vogel K.G., Dolde J.,1979; Vogel K.G., Peterson D.W., 1981), а также в ядрах клеток в виде ассоциированных с хроматином протеогликанов (Onarheim H., Missavage А.Е., Gunther R.A. et al., 1991; Stein G.S., Roberts R.M., Davis J.L. et al.,1975). В настоящее время известно (Серов В.В., Шехтер А.Б., 1981; Фукс Б.Б., Фукс Б.И.,1968), что ГАГ в составе протеогликанов соединительной ткани обеспечивают ее механические свойства, участвуют в воспалительных реакциях (Лабори Г., 1970) и репаративных процессах (Слуцкий Л.И., 1969), необходимы для нормального кроветворения (Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Агафонов В.И. и др., 1995; Северин М.В., Юшков Б.Г., Ястребов А.П.,1993; Ястребов А.П., Юшков Б.Г., Большаков В.Н.,1988) и полноценного иммунного ответа (Соловьев Г.М., Петрова И.В., Ковалев C.B., 1987), выполняют за счет влияния на проницаемость веществ в клетки трофическую и антитоксическую функции (Лабори Г., 1970). Следует подчеркнуть, что традиционные представления о механизмах антитоксических эффектов ГАГ основываются на их полианионных возможностях связывать гидрофильные токсические вещества основного характера в межклеточном матриксе, блокируя тем самым их поступление в клетки (Лабори Г., 1970; Переверзев А.Е.,1986).

Этот механизм не представляется исчерпывающим в связи с общностью метаболических путей обмена ГАГ, пентозофосфатного цикла, детоксицирую-^ щих реакций глюкуронидной конъюгации (Парк Д.В.,1973) и монооксигеназной системы (Голиков С.Н., Саноцкий И.В., Тиунов Л.А.,1986).

Не вызывает сомнений, что именно механизмы устойчивости к ксенобиотикам определяют возможность самого выживания организмов в окружающей среде, которая становится все более насыщенной невероятным количеством разнообразных химических соединений. То есть, проблема адаптации организма к неблагоприятным ситуациям во многом может быть сведена к общебиологической способности клетки защищать себя от токсического воздействия экзогенных и эндогенных токсикантов, используя в качестве щита гетерополисаха

А ( ридные компоненты межклеточного матрикса (Зимницкий А.Н., Башкатов С.А.,

2004).

Не вызывает сомнений, что качество обмена биополимеров в организме во многом зависит от токсической нагрузки на него экзо- и эндогенных соединений, метаболизирующихся в реакциях микросомального окисления и различных типов конъюгации и, тем самым, отвлекающих на себя метаболические потоки субстратов и макроэргических соединений, а также загружающих бело-ксинтетический и каталитический аппараты клетки. Очевидно, что такие физиологические состояния как старение и беременность в силу различных причин сопровождаются интоксикацией. В указанной связи возникает закономерное предположение о наличии определенного сходства в направленности биохимических сдвигов при этих состояниях. В пользу этой гипотезы свидетельствуют, например, сведения различных авторов об уменьшении концентрации альбумина в сыворотке крови, как при старении (Маршалл В.Дж., 2002; Пименов Ю.С., 1993; Кипшидзе H.H., Ткешелашвили J1.K., Салуквадзе Н.С., 1963; Коркушко О.В., 1963; Нагорный JI.B., Никитин В.И., Буланкин И.И., 1963), так и при беременности (Кухта В.К., 1986).

В конце восьмидесятых годов прошлого века в руководимой нами лаборатории биотехнологии Отдела биохимии и цитохимии Уфимского научного центра РАН был разработан лекарственный препарат «Плазан», представляющий собой высокомолекулярную фракцию биополимеров из плаценты человека, основным компонентом которой являлись гетерополисахариды из класса ГАГ. В экспериментах на животных была продемонстрирована способность плазана стимулировать синтез РНК, подавлять рост патогенных микроорганизмов, значительно ускорять процессы репаративной регенерации. После успешного проведенных доклинических исследований безопасности препарата и получения разрешения на клиническую апробацию в начале девяностых годов была показана высокая терапевтическая эффективность плазана при лечении хирургических и гинекологических заболеваний.

В последующие годы плазан успешно использовался в качестве биологически активной добавки в изделиях лечебно-профилактической косметики, существенно улучшая у пациентов состояние кожных покровов и корригируя внешние проявления старения кожи. Именно в этот период середины девяностых годов стала очевидной взаимосвязь между качеством обмена ГАГ и функциональным состоянием кожи у человека, послужившая толчком к выполнению настоящих экспериментальных исследований, направленных на выяснение биохимических механизмов старения организма, сопряженных с обменом ГАГ. На наш взгляд, выполненная работа является примером того, как выяснение биохимических механизмов, лежащих в основе фармакологической активности препаратов, позволяет получить новую информацию о сути общебиологических процессов. В нашем случае исследование фармакологической активности ГАГ проливает свет на ранее неизвестные стороны метаболизма биополимеров и патохимических механизмов старения организма в целом. В указанной связи сведения о терапевтической эффективности плазана в экспериментальных исследованиях на лабораторных животных и в клинике вынесены в заключительную часть работы, так как используются в качестве дополнительного подтверждения основной гипотезы исследования.

В связи со сказанным, основной гипотезой нашей работы являлось предположении о том, что патохимические механизмы старения сопряжены с изменением обмена таких биополимеров как гликозаминогликаны, белки и нуклеиновые кислоты. В качестве объекта исследования мы, помимо лабораторных животных, намеренно выбрали женскую популяцию по двум причинам: во-первых, на наш взгляд, характеристика «практически здоровые лица» в старческом возрасте больше соответствует женщинам и, во-вторых, если говорить о прикладном аспекте наших исследований, то есть о прикладной геронтологии и дерматокосметологии, то женская популяция в силу исторически сложившейся структуры социальных отношений, системы культурных ценностей и норм поведения больше заинтересована в создании средств, корригирующих патологические изменения при старении.

Для достижения поставленной цели представлялось необходимым решить следующие задачи:

1. Изучить фракционный состав гликозаминогликанов в органах и тканях неин-бредных белых крыс.

2. Оценить интенсивность метаболизма в органах и тканях различных фракций ГАГ по интенсивности включения радиоактивного сульфата (35S042') и 14С-глюкозы, меченой по Сь у лабораторных животных различных возрастных групп.

3. Квантово-химическими и молекулярно-генетическими (дот-гибридизация) методами оценить возможность взаимодействия карбоксильной и гидрокси-метильной групп моно- и полисахаридов с генетическим аппаратом клетки.

4. Изучить фракционный состав ГАГ и белков в сыворотке крови у женщин различных возрастных групп.

5. Изучить фракционный состав ГАГ, уровни общего белка и ДНК в коже у женщин различных возрастных групп.

6. Исследовать возрастную динамику состояния печени по показателям «печеночных проб» у женщин.

Научная новизна. Проведенные исследования позволили существенно расширить представления о биохимических механизмах, лежащих в основе старения, сопоставить их с побочными эффектами беременности и выявить взаимосвязь с генетическим аппаратом клетки. При этом установлены зависимости между возрастом и показателями содержания в органах и тканях глико-заминогликанов, белков, а также их фракций и нуклеиновых кислот. Показано сходство сдвигов исследованных биохимических параметров при старении и беременности. Разработаны методические подходы к формированию оптимальных концентраций гиалуроновой кислоты в органах и тканях для профилактического применения с целью повышения резистентности организма к возрастным изменениям биохимических процессов. Предложена концепция дестабилизации системы гликозаминогликанов как одного из общих механизмов старения, заключающегося в том, что с возрастом нарушается генетически детерминированный обмен биополимеров межклеточного матрикса, приводящий к обеднению гликозаминогликанами органов, покровной ткани и повышением вследствие этого их концентрации в сыворотке крови. В экспериментах по изучению биохимических механизмов фармакологических эффектов гликозаминогликанов (и в частности, препарата «Плазан») установлено, что в их реализации существенную роль играет стимуляция транскрипционной активности клеточных ядер, обеспечивающая интенсификацию репаративной регенерации тканей и антимикробной активности иммунокомпетентных клеток.

Практическая значимость выполненного исследования заключается в том, что показана принципиальная возможность прогнозирования интенсивности процессов старения по показателям гликозаминогликанового и белкового обменов путем определения фракционного состава гликозаминогликанов, белков в сыворотке крови с последующей подстановкой результатов в соответствующие уравнения линейной регрессии. Сопоставление данных биохимических исследований механизмов метаболизма гликозаминогликанов и результатов клинических испытаний препарата «Плазан», содержащего плацентарные ГАГ, при хирургических и гинекологических заболеваниях позволяет рекомендовать проведение дальнейших исследований с целью расширения показаний к применению плацентарных ГАГ и, в перспективе, широкого внедрения препаратов на их основе в практическое здравоохранение и дерматокосметологию.

На защиту выносятся следующие научные положения:

1. В патогенезе старения существенное значение имеет снижение генетически детерминированного синтеза организмом несульфатированных и сульфати-рованных гликозаминогликанов.

3. Существуют возрастные различия показателей состояния печени у женщин.

7. В биохмическом механизме фармакологической активности гликозаминогликанов существенную роль играет стимуляция транскрипционной активности ядер клеток, обеспечивающей интенсификацию репаративной регенерации тканей и антимикробной активности иммунокомпетентных клеток.

9. Существует возможность прогнозирования интенсивности процессов старения по показателям гликозаминогликанового и белкового обменов.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на IV Международном конгрессе по косметологии и эстетической медицине «Kosmetik international»(MocKBa,2005), на II Всероссийском симпозиуме с международным участием «Клинические и фундаментальные, аспекты тканевой терапии» (Самара, 2004), на IV Международном конгрессе по эстетической медицине (Москва, 2004), на III Международном форуме по пластической хирургии и дерматокосметологии (Москва, 2004), на III Международном конгрессе по косметологии и эстетической медицине «Kosmetik international» (Москва, 2004), на Международной конференции «Профессиональная косметика и современные технологии в эстетической косметологии» (Санкт-Петербург, 2004), на Международном форуме по пластической хирургии и дерматокосметологии (Москва, 2003), на II Международном конгрессе по косметологии и эстетической медицине «Kosmetik international» (Москва, 2003), на IV конгрессе по пластической, реконструктивной и эстетической хирургии (Ярославль, 2003), на IV Коференции «Косметология будущего — косметология antu-age» (Санкт-Петербург, 2003), на X Юбилейной научно-практической конференции «Клиническая эффективность нелекарственных оздоровительных продуктов: пара-фармацевтики, нутрицевтики, космецевтики» (Москва, 2003), на VII Всероссийской конференции по проблеме термических травм (Челябинск, 1999), на IV Съезде травматологов и ортопедов России (Нижний Новгород, 1997), на Научной конференции «Люминесцентный анализ в медицине и его аппаратурное обеспечение» (Рига, 1988), на Международной конференции «Медицина и катастрофы» (Уфа, 1990), на Научно-практической конференции «Изучение, охрана и рациональное использование природных ресурсов (Уфа, 1989).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 54 научные работы.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Зимницкий, Александр Николаевич

ВЫВОДЫ

7. Возрастные изменения фракционного состава белков сыворотки крови у женщин сопоставимы с аналогичными показателями в динамике беременности. Значения коэффициента а 1/(3 у беременных соответствуют показателям старших возрастных групп, что позволяет предположить, по крайней мере, временную интенсификацию процессов старения в период беременности.

8. В норме в организме существуют взаимосвязи и взаимовлияния показателей возраста, беременности и обмена биополимеров. Показатель «срок беременности» в структуре корреляционных связей фактически ведет себя аналогично показателю «возраст» у небеременных женщин.

10.Дестабилизацию системы гликозаминогликанов правомерно рассматривать в качестве одного из общих механизмов старения организма.

П.Существует возможность прогнозирования интенсивности процессов старения по показателям гликозаминогликанового и белкового обменов.

12.Можно считать доказанной гипотезу о сопряженности механизмов старения с состоянием гликозаминогликанового и белкового обмена.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

4. Целесообразна подготовка соответствующей документации, способствующей широкому внедрению препарата «Плазан» в практическое здравоохранение. т

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Зимницкий, Александр Николаевич, Уфа

1. Абрамов Ю.В., Володина Т.В., Маркина Л.Г., Ребров Л.Б. Гликозаминогликаны кожи при эмоциональном стрессе //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 1999. — Т. 127. - №2. - С. 134136.

2. Агапова E.H., Крутовская О.В., Михалев И.Д., Ткаченко A.M., Фаунова В.И., Денисова Т.П. Белково-липидный состав, свертывающая и антисвертывающая системы крови у долгожителей. Геронтология и гериатрия, 1972. Ежегодник. Долгожители. Киев,1973, с.213-215.

3. Александрова М.Д. Очерки психофизиологии старения. Ленинград: Изд. Ленинградского университета, 1965. — 112с.

4. Алехин Е.К., Богданова А.III., Плечев В.В., Фархутдинов P.P. Влияние лекарственных средств на процессы свободнорадикального окисления: Справочник.-Уфа: БГМУ, 2002.-288с.

5. Ангелова-Гатева П.,Стойнев Г., Иванова Е. Некоторые биохимические показатели кровяной плазмы долгожителей. Геронтология и гериатрия, 1972. Ежегодник. Долгожители. Киев,1973, с.203-205.

6. Асинова М.И., Белая И.И. Липидный обмен и социальная адаптация человека при старении //Клиническая геронтология. 2001. - №7. — С.18-22.

7. Ашмарин И.П., Стукалов П.В., Ещенко Н.Д. и др. Биохимия мозга.-СПб: Изд-во СПб ун-та, 1999.-328с.

8. Баклаш В., Йорханова А., Кветнянски Р. Катехоламины и их синтез в процессе старения //Геронтология и гериатрия. -Киев, 1976. с. 163- 166.

9. Башкатов С.А. Плацентарные гликозаминогликаны перспективные • средства метаболической терапии и лечебно-профилактическойкосметики //Актуальные вопросы пластической хирургии и дерматокосметологии.- М.: Майер Джей, 2003.- С.93.

10. Берштейн JIM. Эстрогены, старение и возрастная патология //Успехи -геронтологии. 1998. - №2. - С.90-97.

11. Богацкая JI.H. Особенности липидного обмена и его регуляция у долгожителей. Геронтология и гериатрия, 1972. Ежегодник. Долгожители. Киев, 1973, с. 196-203.

12. Богацкая Л.Н., Коркушко О.В., Киряков O.A. Особенности содержания липидов в крови лиц пожилого и старческого возраста с хронической ишемической болезнью сердца. Вопросы геронтологии. Киев — 1978 -с.65-74.

13. Богацкая Л.Н. Коркушко О.В., Киряков O.A. Состояние липидного обмена у больных хронической ишемической болезнью сердца различного возраста. Вопросы геронтологии. Киев — 1982 с.51-58.

14. Бурмистров С.О., Опарина Т.И., Прокопенко Г.Р., Арютюнян A.B. Показатели процесса деградации белков и антиокислительной системы при нормальной беременности.//Акушерство и гинекология. 2001 - №6. -С. 17-20.

15. Вержиковская Н.В., Валуева Г.В., Сабольч И. Возрастные особенности дейодирования тироксина и экстратиреоидного образования прямого и обратного трийодтиронина //Вопросы геронтологии.-Киев, 1978. — С.43-48.

16. Войтенко В.П. Значение наследственности и факторов среды в продолжительности жизни человека. Геронтология и гериатрия. — 1970. — Киев. С.390-400.fir.

17. Войтенко В.П., Полюхов A.M. Системные механизмы развития и старения. Л.: Наука, 1986. — 184с.

18. Введение в клиническую биохимию (основы патохимии). Под. Ред. Иванова И.И.- Ленинград: Медицина, 1969.— 493с.

19. Галь Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. — М.: Мир — 1982, 446с.

20. Гацко Г.Г., Гулько В.В. Гликогенная функция печени и мышц в зависимости от возраста. // Обмен и функции стареющего организма. — Минск, 1969, с. 38-44.

21. Гацко Г.Г, Жукова A.C., Чайка Л.Д. Жировая ткань при старении . — Минск: Наука и техника, 1985. — 184с.

22. Голиков С.Н., Саноцкий И.В., Тиунов Л.А. Общие механизмы токсического действия. — Л.: Медицина, 1986. — 280с.

23. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Агафонов В.И. и др. Принципы создания лекарственных препаратов стимуляторов кроветворения природного происхождения//Эксперим. и клин. фармакол.,1995.-Т.58.-№1.-С.З-7.

24. Гулько В.В. Взаимоотношение цинка и кадмия в печени и почках человека в зависимости от возраста //Обмен и функции стареющего организма. Минск, 1969, с. 11-15.

25. Гуськова P.A., Виленчик М.М., Кольтовер В.К., Роль свободных супероксидных радикалов в старении биологических объектов //Биофизика. 1980. - Том 25. - С. 102-105.

26. Дейл 3. Влияние 17-бета-эстрадиола на метаболизм коллагена I и III типов у лабораторных животных разного возраста // Вопросы геронтологии. Эндокринные механизмы старения и возрастной патологии, вып. X Киев 1988 - С. 27-34.

27. Дейл 3, Сохорова Л., Михль Дж., Фролькис В.В. Анализ возрастных изменений содержания и интенсивности синтеза белков плазматических мембран /Вопросы геронтологии, 1982. — С.3-13.1. Ъ».

28. Дубинская В.А., Виноградова Е.В. Кожа человека: влагообмен и старение //Клиническая геронтология. — 2000. №7-8. - С.22-26.

29. Елаев Н.Р., Бахтиярова К.З. Аномальная экскреция гликозаминогликанов больных сирингомиелией //Бюлл.эксперим.биол. и мед.-1992.-№9:-С.271-272.

30. Ещенко Н.Д. Энергетический обмен головного мозга //Нейрохимия /Под ред. И.П.Ашмарина и П.В.Стукалова.-М.:Изд-во Ин-та биомедицинской химии РАМН, 1996.-С.145-192.

31. Ермолаев О.Ю. Математическая статистика для психологов.-М.:Флинта,2002.-336с.

32. Жижина Г.П. Роль апоптоза в нормальном онтогенезе, патогенезе и старении //Клиническая геронтология. — 2002. Т.8. - №4. - С.3-9.

33. Кочетков Н.К. Методы химии углеводов.-М.:Мир,1967.-С.38-42.

34. Зайдиева ЯЗ. Гормональная терапия в перименопаузе. //Акушерство и гинекология 1995 - №3 - с.28-30.

35. Захариева С., Кирянов А., Златарев.О., Наврькова Ю. Базальный уровень пролактина плазмы крови у старых людей и больных гиперпролактинемией различных типов //Вопросы геронтологии.-Киев, 1980.-С.40-42.

36. Зеленин А. В. Геном растений //Вестник Российской Академии Наук.2003.-Т. 73.- № 9.-С.797-806 .

37. Зелезинская Г.А. Возрастная характеристика некоторых реакций аминокислотного обмена /Обмен и функции стареющего организма. — Минск, 1969, с.51-58.

38. Зимина Н.П. Рыкова В.И., Архипов И.А. //Успехи современной биологии.-1992.- Т.112.-Вып.4.-С.571.

39. Измайлов Д.М., Обухова JI.K. Мелатонин как геропротектор: эксперименты. //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 1999. Том 127. - №2. - С.205-206.

40. Инструкция по применению: Аминотрансфераза АлАТ, Био-Ла-Тест, Pliva-Lachema, Брно, 2004.

41. Инструкция по применению: Аминотрансфераза АсАТ, Био-Ла-Тест,0)

42. Pliva-Lachema, Брно, 2004.

43. Инструкция по применению: Билирубин С, Био-Ла-Тест, Pliva-Lachema, Брно, 2004.

44. Инструкция по применению: Тимоловая проба, Био-Ла-Тест, Pliva-Lachema, Брно, 2004.

45. Киселев Л.Л. Геном человека и биология XXI века //Вестник Российской Академии Наук.-2000.- Т.70.- № 5.-С.412-424.

46. Кожура И.М. Содержание фракций белков и липопротеидов в сыворотке крови кроликов разного возраста при экспериментальном атеросклерозе // Механизмы старения. Киев: Государственное медицинское издательство УССР, 1963. -С.121-126.

47. Кольтовер В.К. Свободнорадикальная теория старения: современное состояние и перспективы //Успехи геронтологии. — 1998. -№2. — С.37-42.

48. Конопля Н.Ф., Лукша Г.М. Гормоны и старение. Цитоплазматическая рецепция стероидных гормонов Минск.: Наука и техника, 1991. — 173с.

49. Коркушко О.В. Возрастная характеристика белкового спектра сыворотки крови у практически здоровых людей пожилого и старческого возраста, в сборнике Механизмы старения — Киев: Государственное медицинское издательство УССР, 1963 С.84-95.1. Гф

50. Королевская Л.И., Серова Л.Д., Лукьянчиков B.C., Чеботарева Е.В, Климакс и постменопаузный остеопороз. //Клиническая геронтология — 2003 Т.9 - №9 — С.55-61.

51. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии.-М.: Высш. шк.,1980.-272с.

52. Кустаров В.Н., Черниченко И.И. Перименопауза и ее осложнения.//Клиническая геронтология — 2003. Т.9. - №1. - С.45-49.

53. Курашвили Р.Б., Мегрелишвили Г.Н., Думбадзе Э.Г Зарандия Л.Т.,

54. Шатиришвили Э.Г. Некоторые показатели липидного обмена и системысвертывания крови у долгожителей. Геронтология и гериатрия, 1972. Ежегодник. Долгожители. — Киев,1973, с.205-208.

55. Кухта В.К., Олецкий Э.И., Стожаров А.Н. Белки плазмы крови: Патохимия и клиническое значение. Справочник. — Минск: Беларусь. -1986, 79с.

56. Лабори Г. Регуляция обменных процессов (теоретический, экспериментальный, фармакологический и терапевтический аспекты).-М. :Медицина, 1970.-3 84с.to

57. Лабори Г. Метаболические и фармакологические основы нейрофизиологии.-М.: Медицина, 1974.-168с.

58. Лакин Г.Ф. Биометрия.-М.: Высшая школа, 1990.-352с.

59. Ландау М.А. Молекулярная природа отдельных физиологических процессов. М.: Наука, 1985 — 264с.

60. Ластовская Т.Г. Содержание сульфгидрильных групп в некоторых тканях и митохондриях крыс различного возраста /Обмен и функции стареющего организма. Минск, 1969, с.45-50.

61. Литошенко А.Я. Некоторые стороны системы биосинтеза белка митохондрий печени в старости//Геронтология и гериатрия. 1979. Ежегодник. Продление жизни: прогнозы, механизмы, контроль. Киев, 1979, с. 87-91

62. Мальцева Н.В., Горин B.C., Жабин С.Г., Зорин H.A. Сравнительное изучение иммуносупрессивных свойств ассоциированных с беременностью протеина А, А2-гликопротеина, а также А2-макроглобулина //Ж Акушерство и гинекология.- 1991. № 5. - С.27-30.

63. Маралов В.Г. Основы саморазвития и самопознания.-М.:Академия, 2002.-256с.

64. Маршалл В.Дж. Клиническая биохимия -2-ое изд.пер с англ. — М. — СПб.: БИНОМ Невский диалект. - 2002. - 784с.

65. Мартин Р., Мартин Г., Мурадян Х.К. Возрастные особенности влияниягидрокортизона на активность РНК-полимераз и транскрипцию разных классов РНК в печени крыс. /Сб. ст. Вопросы геронтологии. Под. Ред. Чеботарева Д.Д., 1978. С.49-56.

66. Матковская Т.А., Юрьева Э.А., Сухоруков B.C., Столяров Ю.Ю. О профилактике возрастных изменений кожи //Военно-медицинский журнал. 2000. - №8. - С. 16-20.

67. Меньшиков В.В. Руководство по клинической лабораторной диагностике. М.: Медицина, 1982. - 576с.1. Ч,

68. Мешкова Н.П., Северин С.Е. Практикум по биохимии.-М.:Изд-во МГУ, 1979.-430с.

69. Мхитарян В.Г., Агаджанов М.И., Геворкян Д.М. Ферментные механизмы антирадикальной защиты клетки при экстремальных состояниях //Вестн. АМН СССР,1982.-№9.-С.15-19.

70. Нагорнев В.А., Назаров П.Г.,Полевщиков В.А., Рабинович B.C. с соавт. Атерогенез и реакция «острой фазы» печени //Архив патологии. — 1998. Т. 60. №6. - С.62-68.

71. Нагорный J1.B., Никитин В.И., Буланкин И.И. Проблема старения и долголетия. М.:Медгиз — 1963 - 740с.

72. Никитин Ю П. Бондарева З.Г., Отева Э.А. с соавт. Образ жизни и показатели липидного состава крови у людей старческого возраста. //Терапевтический архив — 1989 №12 - с.109-112.

73. Никитин Ю.П., Бондарева З.Г. Отева Э.А., Филимонова Т.А. Липидный состав сыворотки крови у здоровых и больных старческого возраста и долгожителей. //Клиническая медицина 1991 - №6- с.32-35.

74. Никитин В.Н., Блок Л.Н., Белоконь Н.С., Красницкая A.A. Системы протеосинтеза печени белых крыс в онтогенезе (эксперименты in vitro) //Геронтология и гериатрия. 1979. Ежегодник. Продление жизни: прогнозы, механизмы, контроль.-Киев, 1979.- с.77-82.

75. Никитин Ю.П., Бондарева З.Г. Отева Э.А., Филимонова Т.А. Липидныйсостав сыворотки крови у здоровых и больных старческого возраста и долгожителей. //Клиническая медицина 1991 - №6- с.32-35.

76. Обухова Л.К., Эмануэль Н.М. Роль свободнорадикальных реакций окисления в молекулярных механизмах старения живых организмов //1983. Том 52. - С.353-371.

77. Орехович В.Н. Современные методы в биохимии.- М.:Медицина,1968.-372с.

78. Парк Д.В. Биохимия чужеродных соединений.-М.:Медицина, 1973.-287 с.84.

Информация о работе

Зимницкий, Александр Николаевич
доктора биологических наук
Уфа, 2005
ВАК 03.00.04

Диссертация

Гликозаминогликаны в биохимических механизмах старения организма - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Гликозаминогликаны в биохимических механизмах старения организма ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Гликозаминогликаны в биохимических механизмах старения организма"

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Зимницкий, Александр Николаевич

Введение Диссертация по биологии, на тему "Гликозаминогликаны в биохимических механизмах старения организма"

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Зимницкий, Александр Николаевич

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Зимницкий, Александр Николаевич, Уфа

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Гликозаминогликаны в биохимических механизмах старения организма
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия