Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гистофизиология газотрансмиттерных систем нервно-сосудистых образований мозга

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Гистофизиология газотрансмиттерных систем нервно-сосудистых образований мозга"

На правах рукописи

КОЦЮБА Александр Евгеньевич

ГИСТОФИЗИОЛОГИЯ ГАЗОТРАНСМИТТЕРНЫХ СИСТЕМ НЕРВНО-СОСУДИСТЫХ ОБРАЗОВАНИЙ МОЗГА

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

005553671

23 ОКТ 2014

Владивосток - 2014

Работа выполнена на кафедре анатомии человека государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Черток Виктор Михайлович Официальные оппоненты:

Целуйко Сергей Семенович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Амурская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Сазонова Елена Николаевна, доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой нормальной физиологии государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Дальневосточный государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Анисимов Алим Петрович, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой клеточной биологии и генетики федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Дальневосточный федеральный университет» Министерства образования и науки Российской Федерации

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится « 2014 г. в « I К? » часов

на заседании диссертационно V, «»м« м «07.01 при ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Минздрава России (690002, г. Владивосток, пр. Острякова, 2). Тел.: (423) 242-97-78; Факс: (423) 24517-19, электронный адрес: tnail@vgnni.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» по адресу: 690002, г. Владивосток, пр. Острякова, 2

Автореферат разослан «_»_2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Открытие нового класса биологически активных веществ, так называемых газообразных посредников, к которым в настоящее время относят оксид азота (NO), монооксид углерода (СО), и сероводород (H2S), заметно изменило представление о химических свойствах и механизме действия нейротрансмитгеров. Газообразные посредники осуществляют, как межклеточную, так и внутриклеточную регуляцию разнообразных физиологических процессов (Samhan-Ariasetal., 2009; Olson, Donald, 2009). Для всех газов установлены не только субстраты синтеза, но и специфические ферменты, участвующие в продукции этих веществ, что позволило показать их наличие во многих структурных образованиях организма (Wang, 2004; Gadalla, Snayder, 2010).

Однако о нейрогенной функции этих веществ данных совсем немного. Особенно мало таких сведений в отношении СО и H2S, функциональные свойства и механизмы действия которых в нервной системе, до сих пор вызывают противоречивые оценки (Boehning, Snyder, 2003; Ishikawa et al., 2005; Jones et al., 2010). Современные представления о роли газотрансмиттеров в центральных механизмах регуляции гемодинамики базируются преимущественно на результатах физиологических, биохимических и фармакологических исследований (Wang, 2004; Ishigami et al., 2009; Jones et al., 2010). Между тем для изучения топохимии и количественного распределения нейронов в многочисленных, зачастую небольших по объему и плотно расположенных ядрах головного мозга, приведенные выше методы мало подходят. Новые данные, которые могли бы детализировать существующие представления по этой проблеме, связаны с внедрением в практику научных исследований гистохимических и иммуногистохимических методов изучения газотрансмитгеров. Они лишены недостатков, свойственных указанным выше методам, а при количественной обработке, позволяют достаточно точно определить не только долю энзимпозитивных нейронов в каждом ядре, но и интенсивность реакции, а, следовательно, и относительное содержание вещества в ядре или во всех ядрах исследуемой области мозга (Kuo et а!., 1997; Старцева и др., 2012).

Считается, что в центральной нервной системе газотрансмитгеры играют решающую роль, по крайней мере, в двух важнейших процессах: во-первых, в межнейронных коммуникациях в качестве сигнальных трансдукгоров, что позволяет им принимать непосредственное участие в организации работы любого нервного центра; во-вторых, в регуляции церебрального кровообращения, где этим газам, возможно, принадлежит ведущая роль не только в функционировании сосудов мозга, но и в центральных механизмах управления гемодинамикой (Черток и др., 2008-2013; Linden et al., 2008; Olson, 2008; Mustafa et al., 2009).

В центральных механизмах регуляции кровообращения особенно важное значение придается бульбарному отделу сердечно-сосудистого центра, морфологическим воплощением которого является относительно небольшой участок ромбовидного мозга, лежащий каудальнее нижнего четверохолмия (Хаютин, 1982; Лебедев, 1986; Anderson, 1989). Собрано огромное количество

доказательств решающей роли этого участка мозга в регуляции гемодинамики. Однако на фоне многочисленных функциональных исследований сердечнососудистого центра, материалы об его структурной организации выглядят особенно скудными. Ограниченность и противоречивость данных о топохимии и взаимоотношениях газотрансмиттерных систем между собой и классическими нейромедиаторами в ядрах продолговатого мозга и моста, вовлеченных в регуляцию гемодинамики, ограничивают возможности для формирования объективных представлений о работе этого нервного центра. Поэтому основное внимание в работе мы уделили особенностям количественного распределения N0-, СО- и Н28-позитивных нейронов в различных ядрах бульварного отдела сердечно-сосудистого центра.

Понятно, что эффективная работа мозга невозможна без уравновешенной и строго сбалансированной системы кровоснабжения. В этом отношении церебральная гемодинамика занимает особое положение в сосудистой системе: с одной стороны, она представляет собой мишень для управляющих воздействий со стороны нейронов сердечно-сосудистого центра, с другой, обеспечивая адекватное кровоснабжение нервного центра, является одним из механизмов управления его функциями. После открытия вазомоторного действия газотрансмиттеров появились веские основания полагать, что эти вещества играют ведущую роль в обеспечении взаимодействия сосудов и нейронов в процессе управления гемодинамикой. Однако при построении этой гипотезы не был установлен морфологический субстрат для реализации таких взаимодействий: мы не встретили материалов по комплексному изучению пространственной организации ферментов, участвующих в образовании газообразных посредников в нервно-сосудистых образованиях сердечно-сосудистого центра. Не имеют морфологического обоснования и промежуточные процессы, проходящие при участии газотрансмитгеров в нервном центре, которые, в конечном счете, обеспечивают трансформацию сенсорной информации в соответствующие нервные и сосудистые реакции.

Цель исследования. Установить закономерности организации, распределения и пространственных отношений сигналтрансдукторных систем, продуцирующих газотрансмитгеры (оксид азота, монооксид углерода и сероводород), в нервно-сосудистых образованиях бульбарного отдела сердечно-сосудистого центра.

Задачи исследования:

1. Провести качественную и количественную оценку N0-, Н25- и СО-продуцирующих нейронов в ядрах различной функциональной принадлежности в продолговатом мозге и мосте у крысы и человека.

2. В ядрах продолговатого мозга и моста, вовлеченных в регуляцию гемодинамики, изучить организацию и пространственные отношения газотрансмиттерных нейронов между собой и нейронами, включающими классические нейромедиаторы (ацетилхолин, норадреналин, серотонин).

3. Используя гистохимические и иммуногистохимические методы, изучить особенности организации и распределения ферментных систем, уча-

ствующих в образовании газообразных посредников, в стенке пиальных и внутримозговых артерий разного диаметра.

4. Установить наличие и локализацию медиаторноспецифических систем в афферентных и эфферентных нервных волокнах сосудов продолговатого мозга.

5. Исследовать динамические преобразования газотрансмиттерных систем в вазомоторных ядрах, пиальных и внутримозговых артериях разного калибра в процессе развития реноваскулярной гипертензии у крысы и артериальной гипертензии у человека.

6. На основании собственных материалов и литературных данных определить роль и место газообразных посредников в механизмах регуляции мозговой гемодинамики.

Научная новизна. В работе представлены оригинальные материалы по комплексному изучению локализации газообразных посредников в нервно-сосудистых образованиях бульварного отдела сердечно-сосудистого центра.

Проведена качественная и количественная характеристика N0-, СО- и Н28-продуцирующих нейронов, в вазомоторных ядрах у крысы и человека, изучены пространственные отношения этих нейронов между собой, а также с нейронами, участвующими в трансмиссии ацетилхолина, норадреналина, серотонина. На основании полученных данных, выдвинута гипотеза, согласно которой регулирующее влияние газообразных посредников на целевые объекты, удаленные от места синтеза газов, объясняются способностью сигнальных молекул оказывать модулирующее воздействие на нейроны, продуцирующие классические медиаторы нервного импульса - ацетилхолин, норадреналин, серотонин.

Установлено, что распределение ферментов, участвующих в синтезе газообразных посредников в стенке пиальных и внутримозговых артерий связано с калибром сосудов и их локализацией относительно поверхности мозга. Представлены морфологические доказательства участия нитроксидергической системы в афферентной и эфферентной иннервации сосудов продолговатого мозга.

Приведены материалы, свидетельствующие об активной перестройке ферментных систем, участвующих в продукции N0, СО и Н28, в процессе ремоделирования нервно-сосудистых образований мозга при развитии реноваскулярной гипертензии у крысы и артериальной гипертензии у человека.

Полученные данные послужили основой для формирования принципиально новой концепции, предполагающей участие системы газотрансмиттеров в организации работы бульбарного отдела сердечнососудистого центра, в котором артериальные сосуды, с одной стороны, представляют собой мишень для регулирующих воздействий N0-, СО- и ЬЬБ-продуцирующих нейронов, с другой, обеспечивая адекватное кровоснабжение нервного центра, являются одним из механизмов его управляющих воздействий.

Теоретическое и практическое значение работы. Приведенные сведения о закономерностях распределения N0, СО и Н28 в нервно-

сосудистых образованиях мозга являются частью фундаментальных исследований в области нейробиологии. Полученные результаты могут служить теоретической базой для понимания роли газотрансмиттерной системы в центральных и местных механизмах регуляции мозговой гемодинамики при обычных условиях жизнедеятельности организма и сосудистых заболеваниях, наметить потенциальные пути для разработки новых препаратов и лечения нарушений мозговой гемодинамики. Результаты исследования могут быть использованы при проведении занятий на кафедрах гистологии, нормальной и патологической анатомии, нормальной и патологической физиологии, неврологии.

Степень достоверности и апробация результатов. Степень достоверности результатов проведенного исследования определяется соответствием его дизайна критериям доказательной медицины, анализом репрезентативных выборок, достаточным объемом наблюдений и использованием современных разноплановых методов исследования. Примененные статистические методы адекватны поставленным задачам, а сформулированные положения, выводы и практические рекомендации аргументированы и логически вытекают из анализа полученных данных.

Основные результаты диссертации были представлены: на Международной научной конференции «Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Бангкок, Паттайа (Таиланд, 2007)); на 1Х-м Конгрессе Международной ассоциации морфологов (Бухара, Республика Узбекистан, 2008); на Международной научной конференции «Фундаментальные исследования» (Доминиканская республика, 2008); на научной конференции посвященной 100-летию кафедры медицинской биологии СПб ГМА им. И.И. Мечникова «Вопросы морфологии XXI века» (С.-Петербург, 2008); на Ш-й международной научной конференции «Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Тайланд-Камбоджа, 2008); на Всероссийской научной конференции «Нейробиологические аспекты морфогенеза и регенерации» (Оренбург, 2008); на научно-практической конференции «Актуальные проблемы биомедицинской антропологии и морфологии» (Красноярск, 2009); на Однораловских морфологических чтениях (Воронеж, 2009, 2010); на научно-практической конференции «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической морфологии» (Волгоград, 2010); на Х-м Конгрессе Международной ассоциации морфологов (Ярославль, 2010); на заочной конференции «Должановские чтения» (Воронеж, 2011); на УН-й международной научно-практической конференции «Образование и наука XXI века» (София, Болгария, 2011); на 1У-Й научной конференции «Микроциркуляция в клинической практике» (Москва, 2012); на У-й Коми республиканской конференции неврологов Северо-западного Федерального округа с международным участием «Актуальные проблемы неврологии» (Сыктывкар, 2012); на Международной заочной научно-практической конференции «Наука и образование в XXI веке» (Тамбов, 2013); на Международной научной конференции «Наука и образование в современной России», (Москва, 2013).

По теме диссертационного исследования опубликованы монография и 58 статей, в которых нашли отражение теоретические положения и результаты работы.

Положения, выносимые на защиту:

1. Ядра бульбарного отдела сердечно-сосудистого центра характеризуются морфологической гетерогенностью газотрансмиттерных систем (N0-, Н25-, СО), отражающей их молекулярные и функциональные особенности.

2. На разных уровнях организации вазомоторных ядер имеются структурные предпосылки для обеспечения взаимодействия N0-, СО- и Репродуцирующих нейронов как между собой, так и с клетками, содержащими классические нейромедиаторы.

3. Между ядрами, между ядрами и проводящими путями в продолговатом мозге и мосте выявляются небольшие по величине иммунопозитивные нейроны, обладающие интенсивной реакцией на пМОБ, СВБ и НО-2. Стратегическое положение в бульбарном отделе сердечнососудистого центра, способность аккумулировать газотрансмиттеры и классические медиаторы нервного импульса, формировать локальные цепи интернейронов между ядрами различной функциональной принадлежности, предполагает активное участие этих клеток в центральной регуляции гемодинамики.

4. В стенке большинства пиальных и внутримозговых артерий у человека и крысы выявляются еКОБ, СБЕ, СВБ и НО-2, особенности распределения которых тесно связаны с диаметром сосудов (порядком ветвления) и положением относительно поверхности мозга.

5. Развитие РВГ у крыс и АГ у человека сопровождается активной перестройкой ферментных систем, участвующих в продукции N0, СО и Н28 в стенке артерий головного мозга и ядрах бульбарного отдела сердечнососудистого центра. При этом изменения топохимии и количественного распределения ферментов в артериальной сети мягкой оболочки продолговатого мозга опережают изменения в большинстве ядер бульбарного отдела сердечно-сосудистого центра.

Публикации результатов работы. По теме диссертации опубликовано 79 научных работ, среди которых 1 монография, и 58 статей (в том числе 55 в журналах, включенных в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертации на соискание ученой степени доктора и кандидата наук», входящие в международные базы цитирования).

Степень личного вклада автора в результаты исследования. Работа выполнена на кафедре анатомии человека ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет». Автор планировал и непосредственно участвовал в проведении всех этапов диссертационной работы, самостоятельно проводил взятие трупного материала, все экспериментальные, электронномикроскопические, гистологические, гистохимические и иммуногистохимические исследования, обобщил полученные данные и сформулировал основные положения диссертации.

Объем и структура диссертации. Диссертация объемом 276 страниц состоит из введения, обзора литературы, изложения объектов и методов исследования, 4-х глав результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список цитируемой литературы включает 343 источника, из них 124 отечественных и 219 иностранных авторов. Диссертация содержит 119 рисунков и 2 таблицы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Характеристика исследованного материала. Работа выполнена на крысах линии \\%1аг, и на аутопсийном материале человека.

Исследования на крысах проводили согласно Правилам проведения работ и использования экспериментальных животных (Приложение 3 к приказу МЗ СССР №755 от 12.08.1977 г.) и Стандарта отрасли «Правила проведения качественных клинических испытаний в Российской Федерации» (утверждены МЗ РФ 29.12.1998 г. и введены в действие с 01.01.1999 г.). Всех крыс, использованных в работе, содержали в одинаковых условиях вивария в соответствии с «Санитарными правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник» (№1045—73 от 06.04.1973 г.), на стандартном рационе, в соответствии с нормами, утвержденными МЗ СССР от 10.03.1986 г. №163.

Всего в исследованиях было использовано 390 крыс самцов массой 230— 250 г. Данные по количественному распределению материала в соответствии с методами исследования представлены в таблице 1.

Материал для исследования забирался тотчас после наступления смерти животного. Эвтаназия крысам производилась передозировкой внутрибрюшинно введенного 3% раствора тиопентала Ыа (приложение 4 к приказу МЗ СССР №755 от 12.08.1977 г.). Этот метод (в отличие от эфирного наркоза) не влияет на исследуемые показатели, поэтому использовался при гисто-иммуногистохимических исследованиях, проводимых в рамках настоящей работы.

Трупный материал человека для исследования получен при проведении аутопсий в ГУЗ ПК «Бюро судебно-медицинской экспертизы» и патологоанатомических отделениях г. Владивостока в период с 1993 г. по 2011 г. Взятие материала от трупов людей производили через 3-4 часа после наступления смерти, что разрешается инструкцией по организации и производству экспертных исследований в бюро СМЭ от 2003 г.

Исследования материала человека проводились в соответствии с нормами и правилами комитета по этике. Правовой основой для взятия материала служили: «Закон РФ о трансплантации органов и (или) тканей человека», 1992 г.; «Основы законодательства РФ об охране здоровья граждан», 1993 г.; «Семейный кодекс РФ», 1995 г.; «Закон о погребении и похоронном деле», 1995 г.; «Порядок организации и производства СМЭ в государственных судебно-экспертных учреждениях РФ» (приказ Минздравсоцразвития России №346н от 12.05.2010 г.) и другие документы, определяющие организацию работ с материалом человека.

Таблица 1

Количественное распределение материала среди интактных и экспериментальных крыс в соответствии с методами исследования

Методы исследования Количественное распределение материала

интакгные крысы крысы с РВГ

а б в г Д е ж

/ 2 3 4 5 б 7 8 9

1 Гистологические

1.1 Гематоксилин-эозин 8 8 54

1.2 Окраска метиленовым синим 8 50 8 54 54

1.3 Импрегнация серебром по Кампосу 5 3 9

2 Гистохимические

2.1 На НАДФН-d (Hope a.Vinsent) 10 10 6 54 54

2.2 Флюоресцентно-гистохимический метод (Furness a. Costa) 8 8

2.3 На холинацетилтрансферазу (Burt а. Silver) 4 6

3 Иммуногистохимические

3.1 Нейрональная NO-синтаза 10 54

3.2 Эндотелиальная NO-синтаза 6 54

3.3 Индуцибельная NO-синтаза 5 54

3.4 Серотонин 6 54

3.5 Цистатионин Р-синтаза 5 5 54 54

3.6 Цистатионин у-лиаза 5 5 54

3.7 Гемоксигеназа-2 5 5 54 54

3.8 Холинацетштгрансфераза 5 6

4 Исглеловаиия с применением электронного микроскопа

4.1 Просвечивающая электронная микроскопия 3

4.2 Электронно-гистохимический метод с использованием тетразолиевой реакции на НАДФН-С1 3

5 Биомикроскопия 38* 48

а, д - мягкая оболочка продолговатого мозга; б, е - пиальные сосуды теменной области большого мозга; в, ж - ствол; г - узловатый ганглий.

♦использовано контрольных животных - 8, при введении ацетилхолина - 6, ЬИАМЕ - 6, ЫЧАМЕ + ацетилхолина - 6, нитроглицерина- 6, Ь-ЫАМЕ + нитроглицерина - 6.

После взятия материала, образцы фиксировали в 4% параформальдегиде на фосфатном буфере (0,01М,рН7,6) при 4°С в течение 2 недель, после чего

они погружались в 15% раствор сахарозы, через три дня их извлекали, замораживали в жидком изопентале и хранили при температуре -70°С в соответствии с рекомендациями Пирса (1962)

Всего было изучено 8 трупов «практически здоровых» людей (контрольная группа) и 22 трупа людей с признаками артериальной гипертензии I (6 чел.), II (8 чел.), Ш (8 чел.) степени (АГ I, П, Ш), погибших внезапно в результате механической травмы. Исследовали трупы мужского пола в возрасте от 18 до 58 лет.

В таблице 2 приведены основные методы изучения материала и количественное распределение объектов, полученных от трупов людей в соответствии с методами исследования.

Таблица 2

Количественное распределение материала человека в соответствии с методами исследования

Методы исследования Количественное распределение материала

контроль больные с АГ

I II III I II III

а б в г д

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

1 Гистологические

1.1 Гематоксилин-эозин 3 3 6 8 8

1.2 Окраска метиленовым синим 8 8 8 6 8 8 6 8 8

1.3 Импрегнация серебром по Кампосу 8 7 5 5 5

2 Гистохимические

2.1 На НАДФН-d (Hope a. Vinsent) 8 8 6 6 8 8 6 8 8

2.2 Флюоресцентно-гистохимический метод (Furness a. Costa) 8 6 8 8

2.3 На холинацетилтрансферазу (Burt a.Silver) 5 6 6 6

3 Иммуногистохимические

3.1 Нейрональная NO-синтаза 3 6 8 8

3.2 Цистатионин р-синтаза 3 6 8 8

3.3 Гемоксигеназа -2 3 6 8 8

4 Исследования с применением электронного микроскопа

4.1 Просвечивающая электронная микроскопия 3 3 3 3

4.2 Сканирующая электронная микроскопия 3 3 3

а, г - мягкая оболочка головного мозга; б, д - ствол; в - узловатый ганглий.

Исследовали следующие ядра ствола мозга крысы и человека: ядро солитарного тракта, дорсальное ядро блуждающего нерва, ядро языкоглоточного нерва, двойное ядро, спинномозговое ядро тройничного нерва, нижнее оливарное ядро, ретикулярное центральное ядро, ретикулярное мелкоклеточное ядро, ретикулярное гигантоклеточное ядро, ретикулярное

ядро, ретикулярное парагигантоклеточное ядро, темное ядро шва, крупное ядро шва, бледное ядро шва, мостовое ядро шва, ретикулярное ядро покрышки моста, ретикулярное оральное ядро моста, ретикулярное каудальное ядро моста.

При определении локализации исследуемых ядер у крысы использовали цитоархитектоническую карту, приведенную в «The Rat Brain» (Paxinos, 1998). Анатомическая номенклатура ядер в настоящей работе приведена в соответствии с атласом мозгового ствола человека и животных (Сар-кисов, 1947).

Гистохимические методы. Исследование NADPH-d-содержащих структур осуществляли методом разработанным Scherer-Singler et al. (1983), в модификации Hope, Vinsent (1989). Для выявления NADPH-d, материал инкубировали в среде, содержащей 0,5 мМ P-NADPH, 0,5 мМ нитросинего тетро-золиевого и 0,3% Тритона 4-100 в 0,15 M Трис-НСЬ-буфере (рН 8,0) в течение 1 ч в термостате при 37°С. После инкубации срезы промывали в дистиллированной воде, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и заключали в канадский бальзам. Однако достоверные результаты при гистохимическом исследовании NADPH-d можно получить только при условии предварительной фиксации образцов в параформальдегиде. Считается, что в этом случае инактивируются все NADPH-зависимые ферменты-окислители за исключением конститутивных NOS (Pasqualotto et al., 1991). В связи с чем, образцы предварительно фиксировали в 4 % параформальдегиде на фосфатном буфере (0,1М, рН 7,6) при 4°С в течение 2-х часов согласно рекомендации Matsumoto (1993).

Для изучения локализации катехоламин-содержащих нейронов в стволе мозга и нервных проводников в сосудах мягкой оболочки продолговатого мозга использовали метод гисто-флюоресцентного маркирования в сахаро-фосфатном растворе глиоксиловой кислоты (Furness, Costa, 1975). Криостат-ные срезы мозга или пленчатые препараты мягкой оболочки, изучали под люминесцентным микроскопом МБИ-15У/4.2 со светофильтрами ДС-1 и СЗС-7.

Активность холинацетилтрансферазы в нейронах ствола мозга и нервных сплетениях артерий выявляли методом Burt, Silver (1973). О степени активности энзимов судили по количеству и интенсивности окрашивания образующихся гранул осадка.

Иммуногистохимические методы исследования. nNOS, eNOS, iNOS, CBS, CSE, HO-2, ХАТ и серотонин определяли непрямым иммуноперокси-дазным методом. Иммуногистохимическое выявление всех указанных ферментов в структурах мозга крысы проходит в несколько этапов. Из мозга, тотчас после извлечения его из полости черепа, брали необходимые кусочки, которые фиксировали в течение 4 ч в 4% параформальдегиде, приготовленном на 0,1 M фосфатном буфере (рН 7.4) при 4°С. Далее в течение 24 ч их промывали в 0,1 M фосфатно-солевом буфере (рН 7.4). Фиксированный материал пропитывали в холодном 15% растворе сахарозы на 0,1 M фосфатном буфере и готовили криостатные срезы толщиной 3CM0 мкм. После подавления эндогенной активности пероксидазы в 1% растворе Н202 и подавления

неспецифического связывания антител в 2-3% растворе нормальной сыворотки козы препараты инкубировали в течение 18 ч при комнатной температуре с поликлональными антителами, полученными у кролика, против nNOS, eNOS, ¡NOS (Cayman, США) в разведении 1:200; против ХАТ (Cayman, США) 1:1000; против серотонина (Immuno Star, США) 1:500. После отмывания материала в нескольких сменах забуференного (0,05 M трис-буфер, pH 7,6) физиологического раствора проводили инкубацию в течение 1 ч при комнатной температуре в биотинилированной козьей антисыворотке против IgG кролика (Vectastain, США) для nNOS, eNOS, ¡NOS в разведении 1:200, для ХАТ 1:100, для серотонина 1:250 (Vector Labs, США). В качестве растворителя для первых и вторых антител использовали забуференный физиологический раствор, содержащий 0,03-0,1% тритон Х-100 и 1-3% нормальную сыворотку козы. После отмывания, срезы инкубировали в течение 1 ч с комплексом авидин-биотинилированной пероксидазы хрена (Vectastain Elite ABC Kit, Vector Labs, США) в разведении 1:50 - 1:100 в забуференном физиологическом растворе, содержащем 0,1% тритон. Активность пероксидазы для nNOS, eNOS, iNOS и ХАТ выявляли инкубированием срезов в диаминбензидине, для серотонина - в субстрате пурпурного цвета (VIP Substrate Kit, Vector Labs, США) под контролем микроскопа.

Для иммунногистохимического выявления CBS, CSE и НО-2 криостат-ные срезы последовательно инкубировали с 1% нормальной сывороткой лошади 1 ч при комнатной температуре; мышиными моноклональными антителами против CBS, CSE (Abeam, Великобритания) в разведении 1:500, против НО-2 в разведении 1:1000 при температуре 4°С в течение 18 ч; биотинилированными антителами лошади против IgG мыши (Vector Labs, США) в разведении 1:100 2 ч при комнатной температуре и с авидин-пероксидазным комплексом (Vectastain Elite ABC Kit, Vector Labs, США) 1 ч при комнатной температуре. Для выявления продуктов реакции для CBS, срезы инкубировали в субстрате красного цвета для обнаружения пероксидазы, для CSE - пурпурного цвета (VIP Substrate Kit, Vector Labs, США). Для определения НО-2, иммунопреци-питат визуализировали как с помощью диаминбензидина (DAB Substrate Kit for Peroxidase, Vector Labs, США), так и в субстрате красного цвета (VIP Substrate Kit, Vector Labs, США).

Для оценки специфичности иммуногистохимической реакции использовали метод негативного контроля. Для этого срезы, вместо первичных антител, инкубировали с 1% не имунной сывороткой. Во всех контрольных экспериментах иммунопозитивная реакция отсутствовала.

При выявлении тех же ферментов на человеческом материале в основном использовали собранный нами в разные годы архивный материал хранившийся в замороженном виде при температуре -70°С в жидком изопентале. После извлечения из изопентала образцы помещали на предметные столики и готовили криостатные срезы толщиной 30-40 мкм. Дальнейшее исследование материала соответствовало процедуре, описанной при работе с образцами лабораторных животных.

Электронномикроскопические методы исследования. Для изучения ультраструктуры исследуемого материала нами были использованы трансмиссионная (просвечивающая и электронная цитохимия NADPH-d) и сканирующая электронная микроскопия.

У экспериментальных животных образцы брали тотчас после эвтаназии, материал, взятый от трупов людей, обрабатывали для исследования не позднее 4 ч после наступления смерти, когда изменения структуры мозга минимальны (Мотавкин, Черток, 1980).

Для электронно-микроскопических исследований образцы мозга, а также фрагменты мягкой мозговой оболочки содержащей артериальные сосуды, фиксировали 2,5% раствором глютаральдегида на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,2) в течение 2,5-4 ч. После промывки в Трис-НСЬ-буфере кусочки до-фиксировали 1% раствором 0s04, обезвоживали (спирт-ацетон) и заливали в Эпон. Ультратонкие срезы окрашивали 7% раствором уранил-ацетата в течение 10 мин и исследовали с помощью электронного микроскопа JEM-100B. В качестве контроля просматривали неокрашенные срезы.

Для изучения локализации энзима в образцах мозга использовали тетра-золиевую реакцию на NADPH-d для электронноцитохимических исследований (Wolf et al., 1992). После инкубации кусочки мозга промывали в Трис-НСЬ-буфере, затем дофиксировали в 1% растворе 0s04, обезвоживали и заливали в Эпон. Ультратонкие срезы исследовали с помощью электронного микроскопа JEM-100B.

Для сканирующей электронной микроскопии материал после аналогичной фиксации, обезвоживали, высушивали с помощью лиофилизации при температуре 30°С при давлении 10"4 мм рт. ст. в течение 24 ч (Крымский и др., 1976). Образцы напыляли золотом в аппарате Jeol JEE (при 4°С). Препараты изучали в сканирующем электронном микроскопе JSM-25SII при ускоряющем напряжении 75 кВ.

Воспроизводство модели реноваскулярной гипертензии. Крысам под эфирным наркозом проводили операцию по перевязке почечной артерии слева и прошиванию правой почки на границе верхней/средней трети. В результате операции наступал инфаркт левой почки и верхней трети правой, приводящий к уменьшению почечной массы на 4/6 и развитию артериальной гипертензии.

Для лабораторных исследований образцы у экспериментальных животных брали через 2 (6 крыс), 4 (6 крыс), 6 (7 крыс), 8 (6 крыс), 10 (8 крыс), 12 (8 крыс), 14 (6 крыс) и 16 (7 крыс) недель после оперативного вмешательства.

У контрольной группы животных АД составляло 114,7±5,4 мм.рт. ст., у оперированной группы крыс на 2-й неделе после операции АД составляло 118,1±6,6 мм рт. ст., на 3-й неделе - 128,1±5,6 мм рт. ст., на 4-й - 138,4±6,4 мм рт. ст., на 6-й - 151,7±7,4 мм рт. ст., на 8-й - 164,3±6,5 мм рт. ст., на 10-й -166,2±6,4 мм рт. ст., на 12-й - 167,6±7,1 мм рт. ст., на 14-й - 160,5±4,4 мм рт. ст., на 16-й - 158,8±6,2 мм рт. ст. Крысы, у которых показатели АД выходили за рамки репрезентативности, не были включены в экспериментальную

группу. Систолическое давление измеряли при помощи системы неинвазивно-го мониторирования кровяного давления у крыс MLU/4c501 методом хвостовой манжеты (Med Lab). Регистрацию и обработку полученных результатов проводили на персональном компьютере с использованием программного модуля.

Технические приемы, использованные в работе. Из продолговатого мозга и моста крыс делали срезы в двух плоскостях — сагиттальной и фронтальной, позволяющих наиболее полно микроскопировать и изучать ядра.

При изучении нервных клеток ствола головного мозга гистохимическими и иммуногистохимическими методами в серии из последовательных срезов продолговатого мозга и моста, один окрашивали 0,5% раствором метиленового синего, а следующий за ним, обрабатывали для визуализации нейронов одним из указанных выше методом. Срезы отбирали таким образом, чтобы в его проекции находились изображения ростральной, центральной и каудальной частей каждого из исследованных в работе ядер.

Для более точного определения пространственной локализации нейронов в исследованных ядрах под микроскопом, использовали окуляр с помещенной в него сеткой с равновеликими квадратами. Пространственные взаимоотношения нейронов разной медиаторной принадлежности в одноименных ядрах изучали методом наложения изображений, полученных на последовательных срезах исследуемого участка мозга (Черток и др., 2011). Каждое ядро на срезах ориентировали по характерным признакам в сагиттальной и фронтальной плоскостях, после чего его контуры воспроизводили на экране монитора в соответствии с положением ядер относительно координат сетки.

Сосуды мозга изучали на тотальных препаратах мягкой оболочки продолговатого мозга и на фронтальных срезах каудальной части ствола. Фрагменты мягкой оболочки расправляли на предметном стекле, высушивали в течение 2-3-х минут в струе проходящего воздуха, а затем обрабатывали в соответствии с процедурой, предусмотренной для того или иного метода исследования. Тотальные препараты мягкой оболочки использовались в основном для установления изучения афферентной и эфферентной инервации пиальных артерий. Долю энзимпозитивных сосудов, а также СПОП фермента в структурных элементах стенки артерий устанавливали на поперечных срезах в соответствии с порядком ветвления пиальных сосудов, который определяли по их диаметру.

Микрофотографии с препаратов получали с помощью микроскопа Carl Zeiss (Jena) соединенного посредством адаптера с фотокамерой Sony Cyber-shot DSC-P12 (5.0 megapixels) в положении трансфокатора — Зх. Регулировку яркости и контраста цифровых фотоизображений осуществляли при помощи программы Adobe Photoshop. Стандартизация параметров измерений освещенности при проведении исследований осуществлялась с помощью люксметра ТКА-Люкс/Эталон.

Биомикроскопия. В качестве объекта для изучения гемодинамики у нормо- и гипертензивных крыс мы выбрали сосуды мягкой оболочки мозга (пиальные) теменной доли. Животных наркотизировали в/м введением рас-

раствора нембутала (5 мг на 100 г массы) и помещали в стереотаксический станок для фиксации головы в горизонтальной плоскости. Методом биомикроскопии под специально изготовленной нами для этих целей установкой, на основе микроскопа Carl Zeiss (Jena), в отраженном свете, через трепанационное отверстие размером 0,8><0,5 см в своде черепа, изучали артериальные сосуды. Твердую оболочку мозга в пределах отверстия удаляли, а поверхность мозга либо покрывали прозрачной пленкой, предохраняющей его от высыхания и отека, либо она постоянно орошалась термостатированным (35-37°С) раствором Ма-кИлвейна (pH 7,4).

Морфометрические исследования. В проекции среза каждого ядра определяли среднее количество гисто- или иммунопозитивных нейронов и долю, которые они составляют от общего числа нейронов, выявленных в соответствующих ядрах метиленовым синим. Кроме того, в проекции каждого ядра высчитывали среднюю площадь профильного поля клеток и относительную плотность (концентрацию) энзимпозитивных клеток. Вычисляли также средний показатель оптической плотности осадка в нейронах ядра, который находили по сумме яркости пикселов при сканировании каждого нейрона в исследуемом ядре (Старцева, Черток, 2012; Черток и др., 2012).

Количественную обработку материала проводили на АСАИ Allegro MC только в тех ядрах, в которых постоянно и в достаточном количестве для статистической обработки определялись гисто- или иммунопозитивные нейроны в соответствии с алгоритмом, предложенным Афанасьевым с соавт. (2002). При определении величины тел нервных клеток измеряли наибольшую длину и поперечник клетки. В соответствии с размерами клеток среди них выделяли: мелкие, с площадью профильного поля от 50 до 250 мкм2, средние - от 251 до 680 мкм2 и крупные - от 681 до 1500 мкм2. Нейроны большей площади относили к гигантским клеткам (Поляков, 1965). Относительную концентрацию клеток в ядрах вычисляли в единице объема (из расчета на 0,01 мм3) мозгового вещества с учетом поправки на толщину среза и диаметр ядра по Abercromhi (Автанди-лов, 1990).

В стенке пиальных и внутримозговых сосудов определяли пиксельным методом значения СПОП для каждого фермента и долю энзимопозитивных артерий от общего числа встретившихся сосудов соответствующего диаметра (порядка ветвления), принятой за 100%. Количественные данные получены при обработке не менее 12 срезов каждого образца.

На тотальных препаратах мягкой оболочки, приготовленных импрегнацией по Кампосу и для выявления NADPH-d, определяли количество рецепторов и относительную площадь, занимаемую ими в стенке сосуда (из расчета на 1 мм ), а также долю, приходящуюся на измененные рецепторы, среди которых при артериальной гипертензии определяли процентное соотношение реактивно и деструктивно измененных нервных окончаний. Концентрацию эфферентных нервных волокон, выявленных методами Furness a. Costa, Burt a. Silver, Hope а. Vinsent, подсчитывали из расчета на 1 мм2, варикозностей -0,1 мм .

Статистические методы исследования. Статистический анализ результатов проводили с использованием пакетов программ Instat 3 и SPSS

11.0. Данные статистического анализа представляли в виде среднего значения и стандартной ошибки среднего значения, полученных от каждого объекта при обработке не менее 10 срезов с двух уровней продолговатого мозга и моста. Для оценки значимости цифровых данных применяли /-критерий Стьюдента. Значение доверительного интервала, р<0,05, считалось статистически достоверным.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Нейротрансмиттеры в ядрах продолговатого мозга и моста В центральных механизмах регуляции кровообращения особенно важное значение придается бульбарному отделу сердечно-сосудистого центра (Лебедев, 1986; Ткаченко и др., 1992; Михайлова и др., 2011). Его нейрохимическая организация отличается исключительным разнообразием. На сегодняшний день практически не осталось нейромедиаторов (или модуляторов), которые не были бы обнаружены в этом участке мозга. Не явились исключением в этом отношении и газотрансмитгеры. Как показали наши наблюдения, нитроксидергиче-ские, CBS- и HO-2-иммунопозитивные нейроны постоянно определяются в «вазомоторных» ядрах продолговатого мозга и моста (рис.1). В ядрах различной функциональной принадлежности они отличаются формой, размерами, количеством, интенсивностью гистохимической реакции.

NO-продуцирующие (NADPH-d- и itNOS-позитивные) нейроны

N0 является одной из наиболее важных сигнальных молекул в организме, функция которого изучена лучше других газотрансмиттеров. В ядрах продолговатого мозга и моста NO-продуцирующие нейроны присутствуют постоянно, однако их распределение и количественное содержание сильно разнятся, что связано не только со структурными особенностями каждого ядра, но и с методом выявления нитроксидергических нейронов. О локализации nNOS в структурных образованиях мозга обычно судят по наличию в них активности NADPH-d, однако результаты гистохимического выявления NADPH-d и имму-ногистохимического — nNOS, довольно часто не совпадают (рис. 1, а, б).

.f

Ау

э

в г

Рис. 1. NADPH-d (a), nNOS (б), CBS (в) и НО-2 (г) в нейронах ретикулярного латерального ядра крысы. Гистохимический (а) и иммуногистохимический (б, в, г) методы. Ув. 100х.

В немалой степени это связано с тем, что основное количество иммуно-позитивных нейронов в ядрах БОСЦ представлено мелкими клетками. Локализация ЫАБРН-ё в меньшей степени связана с размерами нейронов: наряду с небольшими клетками, активность фермента достаточно часто определяется в средних и крупных нейронах. Реакцией на ЫАБРН- с! постоянно выявляются клетки с многочисленными длинными отростками, пИОБ маркирует небольшое число коротких нервных отростков (рис. 1, а, б).

Несмотря на некоторые общие признаки клеточной организации ИАБРН-с! и пЫОБ в ядрах продолговатого мозга и моста, существуют явные отличия топографии и количественного распределения нейронов, участвующих в обмене каждого из этих двух ферментов (табл. 3).

Таблица 3

Некоторые показатели клеточной организации ядер продолговатого мозга и моста крысы при использовании гистохимического и иммуногистохимического методов выявления НО-позитивных нейронов (М±т)

й) о д Доля нейронов (%) 5 Я Л ^

Исследуем ядро Метод исследован Доля от клеток (%' выявлении метиленовь синим мелких средних крупных | Р 2 2 з ё о о ч о = С ~ О СПОП (усл.ед)

яст НАБРН-с! 24,4 ±1,2 80 19 1 8 ±0,6 25 ±2,1

пЫОБ 12,6 ± 0,7 92 8 0 4 ±0,2 12 ± 1,5

ДЯБН НАБРН-с1 17± 1,3 64 35 1 7 ±0,4 29 ± 3,2

пМОБ 13 ±0,6 78 22 0 6 ±0,4 15 ± 1,7

РЛЯ НАБРН-с! 25 ± 1,7 70 28 2 11 ± 0,7 27 ± 2,8

пЫОБ 18 ± 1,5 84 16 0 6 ±0,3 13 ± 1,5

РМЯ НАБРН-с! 40,8 ± 3,3 75 23 2 14 ±0,9 27,5 ± 2,3

п!Ч05 28,6 ±2,1 84 16 0 7 ±0,4 13 ±1,7

РГЯ НАБРН-с! 38 ±2,6 56 28 16 18 ±0,8 53 ± 6,2

пТчЮБ 25 ± 1,8 78 14 8 8 ±0,4 24 ± 2,3

РПГЯ НАБРН-с1 40 ± 3,7 45 31 24 19 ±1,0 62 ±7,1

пЫОБ 26 ± 1,9 72 21 7 9 ±0,5 26 ± 2,5

дя НАБРН-с! 75,8 ± 5,3 23 11 66 16 ± 1,1 80 ± 9,2

пЫОБ 8 ±0,6 77 22 1 3 ± 0,2 15 ±2,7

япн НАБРН-с1 87,9 ± 6,2 24 7 69 17 ± 1,3 57 ±6,8

п>Ю5 5,8 ±0,3 74 23 3 7 ±0,7 14 ±2,4

РКЯМ НАБРН-с! 30,6 ± 1,5 58 24 18 15 ± 1,2 50 ± 6,2

пЖ>5 20,5 ±1,0 75 17 8 9 ±0,6 21 ± 2,0

РОЯМ НАБРН-с! 29,7 ± 1,6 64 23 13 12 ±0,9 28 ± 2,3

пЫОБ 20,8 ± 1,2 76 21 3 8 ±0,5 14 ± 2,4

Так, в одноименных ядрах nNOS всегда обнаруживаются в меньшем количестве клеток, чем при использовании для этих целей гистохимического метода на NADPH-d, в отличие от которого в чувствительных ядрах (ЯСТ, РМЯ, РЛЯ, СПМЯ) выявляется в 1,5-3 раза больше nNOS-иммунопозитивных нейронов, чем в двигательных. В других ядрах (ДЯ, ЯПН) определяются многочисленные NADPH-d-позитивные нейроны, но клетки, содержащие nNOS, выявляются очень редко.

Поэтому, к материалам, полученным при изучении нитроксидергических нейронов гистохимическим методом на NADPH-d, следует относиться с должной осмотрительностью. Вероятно, полную и достоверную картину организации нитроксидергических систем мозга можно получить при совместном применении гистохимического и иммуногистохимического методов.

Н¿¡-продуцирующие (CBS-иммунопозитивные) нейроны В отличие от NO, о нейрогенной функции H2S известно совсем немного. Довольно высокая его концентрация (от 50 до 160 мкМ) была обнаружена в мозгу, что послужило основанием для предположения о большом вкладе этого газа в работу нервной системы (Mustafa et al., 2009).

Проведенное нами исследование свидетельствует, что во многих ядрах бульбарного отдела сердечно-сосудистого центра, постоянно находятся CBS-иммунопозитивные нейроны (рис. 1, в). При специфической иммуногистохи-мической реакции они имеют различную структуру, плотность и цвет выпавшего осадка. На основании этих признаков определяются клетки с низкой, умеренной или высокой плотностью отложения продукта реакции. Клетки с низким содержанием фермента составляют не менее 50% от общего количества CBS-позитивных нейронов в чувствительных и ассоциативных ядрах (ЯСТ, РМЯ, РЛЯ). Нейронов с умеренным содержанием CBS много в ядрах моста, но особенно часто они встречаются в дорсальном ядре блуждающего нерва, где на их долю приходится 40,7%. Клетки с высокой интенсивностью реакции преобладают в двигательных ядрах продолговатого мозга и моста, где их доля колеблется от 28% до 52,5%.

Результаты сравнительного исследования показывают, что численность иммунопозитивных нейронов в разных ядрах колеблется довольно значительно от 3% до 29%. Чаще они выявляются в ретикулярных ядрах медиального эф-фекторного поля (РГЯ, РПГЯ) и висцеро-моторных ядрах - ДЯ и ЯПН (табл. 4).

Экспериментально установлено, что H2S усиливает высвобождение медиатора из двигательных нервных окончаний мотонейронов спинного мозга (Герасимова и др., 2008). Среди этих клеток нами обнаружена наиболее многочисленная группа CBS-позитивных нейронов с высокой плотностью отложения продукта реакции, что является еще одним доказательством того, что ней-ротрансмитгерная функция H2S в большей степени связана с двигательными нейронами.

Таблица 4

Некоторые показатели клеточной организации ядер продолговатого мозга и моста крысы при выявлении цистатионин Р-синтазы (М±т)

4> О Доля от клеток (%) выявленных метиленовым синим Доля нейронов (%) 8 я л ^

Исследуен ядро мелких средних крупных 4 S"s 5 2 2 3 § 0 9 ч о В В ~ О СПОП (усл.ед)

ЯСТ 3,0 ± 0,05 80 19 1 2 ± 0,03 12,4 ±3,6

ДЯБН 4 ,0 ± 0,3 64 35 1 3 ± 0,04 11,8 ±3,5

РЛЯ 3,7 ±0,06 70 28 2 5 ± 0,06 15,4 ±4,2

РМЯ 6,3 ± 0,09 75 23 2 3 ± 0,07 21,2 ±8,4

РГЯ 14,1 ±0,8 56 28 16 16 ±0,8 63,7 ± 9,9

РПГЯ 12,4 ± 1,2 45 31 24 17 ±0,9 60,6 ± 12,3

дя 29,1 ±2,8 24 37 49 36 ± 4,8 66,3 ± 11,8

ЯПН 22,5 ± 3,2 26 30 44 37 ±3,9 58,4 ± 12,5

РОЯМ 8,2 ± 0,07 58 24 18 3 ± 0,02 22, 6 ± 4,3

РКЯМ 12,3 ± 0,06 64 23 13 8 ±0,2 24,4 ± 5,2

СО-продуцирующие (HO-2-илшунопозитивные) нейроны

Наименее изученным из нового класса передатчиков нервного импульса по разным причинам оказался СО. Высказывается мнение, что СО как и H2S обеспечивает кальциевый гомеостаз в нейронах, регулируя его поступление в цито-золь через Са2+ каналы (Boehning, Snyder, 2003). В отличие от N0, время полужизни которого в среднем составляет 5 с, а расстояние диффузии около 100 мкм, СО вместе с H2S обеспечивают развитие не столь мощного, зато долговременного возбуждения с более широкой зоной воздействия (Kerchner, Nicoll, 2008).

В качестве нейротрансмиттера СО может играть заметную роль в реализации центральных механизмов регуляции кровообращения. Согласно нашим данным, во многих ядрах бульбарного отдела сердечно-сосудистого центра выявляются HO-2-иммуноиммунопозитивные нейроны, которые отличаются размерами, формой, плотностью отложения продукта реакции (рис. 1, г).

Доля этих клеток в исследованных ядрах варьирует от 1,5 до 16 %. Выявлена определенная зависимость между функциональной принадлежностью ядер и количеством в них иммунопозитивных нейронов. В двигательных ядрах (РГЯ, РПГЯ) доля HO-2-иммунопозитивных нейронов в несколько раз ниже, чем в чувствительных. Наибольшее количество таких клеток нахо-

дится в ЯСТ и РЛЯ, в котором чаще встречаются клетки и с высокой интенсивностью реакции. В ДЯ и ЯПН СО-продуцирующие нейроны или не определяются, или выявляются в единичных экземплярах (табл. 5).

Таблш!а 5

Некоторые показатели клеточной организации ядер продолговатого мозга и моста крысы при выявлении гемоксигеназы-2 (М±т)

Доля нейронов

а> (%) со

1едуем< ядро оля от ток (% вленны шеновь :иним X X я И X 3 X л н ¿Г" с^ о 5 и о В р в 2 я н — ооо с Я-О ч с 5

и о Ч ё 5 В Ч ч и с о 5о д с ^ <-> >>

к а 2 г а. о а. О

ЯСТ 16,4 ± 1,1 82 18 0 6 ± 0,05 64 ± 4,6

ДЯБН 7 ± 0,05 68 32 0 3 ± 0,03 36 ±3,8

РЛЯ 14,3 ± 0,9 69 29 2 6 ± 0,08 57 ±3,2

РМЯ 7,6 ± 0,08 74 25 1 2 ± 0,04 41 ± 6,2

РГЯ 1,5 ±0,03 63 33 4 1 ± 0,03 11 ±2,1

РПГЯ 3,8 ± 0,06 70 25 5 2 ± 0,05 16 ±2,3

ДЯ 0 0 0 0 0 0

ЯПН 0 0 0 0 0 0

РОЯМ 8 ± 0,04 71 26 3 1,5 ±0,02 45 ± 4,6

РКЯМ 8,2 ± 1,1 65 31 4 1,7 ±0,06 31 ±3,2

На периферии ядер, между ядрами, ядрами и проводящими путями продолговатого мозга и моста, находятся одиночные или небольшие группы из двух-трех N0-, СО- и Н25-продуцирующих нейронов полигональной или вере-теновидной формы. Это небольшие клетки площадью около 320-360 мкм2 с высокой или умеренной плотностью отложения продукта реакции. Особенно часто они наблюдаются в дорсомедиальной части продолговатого мозга на стыке РГЯ и РМЯ, по границе РГЯ с медиальной петлей, ядром лицевого нерва и вестибулоспинальным трактом, на периферии ЯСТ и РЛЯ.

Наличие нейронов аналогичной структуры и локализации отмечено нами и при изучении классических нейротрансмиттеров. Занимая стратегическое положение в бульварном отделе сердечно-сосудистого центра, эти клетки, по имеющимся данным (Бродал, 1960, Вальдман, 1976, А1сЬег е1 а1., 1994), образуют связи и с некоторыми другими ядрами, находящимися в вышележащих отделах мозга и известными своими вазомоторными свойствами. Формируя локальные цепи интернейронов, они, по сути, выполняют интегративную функцию в отношении ядер различной функциональной принадлежности. Все это свидетельствует об активном участии этих нейронов в центральных механизмах регуляции гемодинамики.

Холин-, норадреналин- и серотонинергические нейроны в ядрах продолговатого мозга и моста Нейроны, участвующие в обмене ацетилхолина, крайне неравномерно распределены в ядрах продолговатого мозга и моста. Больше всего таких клеток в ДЯ, РГЯ и РПГЯ. Почти вдвое меньше их в ДЯБН, ядрах моста, ЯСТ и РМЯ (табл. 6).

Таблица 6

Некоторые показатели клеточной организации ядер продолговатого мозга и моста крысы при выявления холинацетилтрансферазы, норадреналина и серотонина (Mim)

Исследуемое ядро Метод исследования Доля от клеток (%) выявленных метиленовым синим Доля нейронов (%) Относительная плотность (0,01мм3) СПОП (усл.ед)

мелких средних крупных

ЯСТ ХАТ 17 ± 1,7 42 50 8 6 ±0,4 41±5,1

НА 8,3 ± 0, 9 - - - 5 ±0,2 -

СН 12 ±0,05 45 37 18 4 ± 0,03 30 ± 3,6

ДЯБН ХАТ 18 ±2,1 28 40 32 13 ±0,9 37±2,7

НА 3,5 ± 0,3 - - - 3 ± 0,4 -

СН 5 ±0,3 40 36 24 2 ± 0,04 8 ±3,5

РЛЯ ХАТ 32 ±4,5 38 40 22 5 ±0,2 39±4,6

НА 10,3 ±0,8 - - - 8 ±0,8 -

СН 8 ± 0,06 46 34 20 4 ± 0,06 38 ± 4,2

РМЯ ХАТ 11 ±0,7 41 41 18 5,5 ±0,1 38±2,7

НА 0,8 ± 0,06 - - - 0,8 ± 0,07 -

СН 2 ± 0,09 56 30 14 1 ± 0,07 7 ±8,4

РГЯ ХАТ 36,2 ±4,8 8 55 47 17 ±1,4 70±8,3

НА 14,3 ± 1,8 - - - 6 ±0,7 -

СН 24 ± 0,8 8 47 45 7 ±0,8 44 ± 9,9

РПГЯ ХАТ 34 ± 2,9 18 38 44 12 ±1,5 60±7,4

НА 11,4± 1,5 - - - 3 ± 0,9 -

СН 22 ± 1,2 10 48 42 9 ±0,9 30 ± 12,3

ДЯ ХАТ 45 ± 0,6 42 53 5 12 ± 1,0 77±8,6

НА 0 - - - 0 -

СН 16 ±2,8 10 45 45 6 ±4,8 40 ± 11,8

РКЯМ ХАТ 11 ±1,7 20 41 39 7 ±0,8 60±5,5

НА 3 ±0,05 - - - 1,5 ± 0,08 -

СН 13 ±0,06 20 38 42 4 ±0,2 32 ±5,2

РОЯМ ХАТ 15 ± 1,4 30 40 30 11 ± 0,9 52±4,4

НА 11,7 ± 1,4 - - - 5 ±0,2 -

СН 10 ±0,07 30 46 24 2 ± 0,02 18 ±4,3

ХАТ - холинацетилтрансфераза; НА - норадреналин; СН - серотонин

Высказывается мнение, что численность холинергических клеток напрямую зависит от количества находящихся там крупных нейронов. Во всяком случае, в ядрах медиальной зоны, в которых велика доля таких клеток, определяется и наибольшее количество холинергических нейронов. Однако в ядрах шва, в том числе и в крупных клетках, ХАТ выявляется редко.

В литературе имеются многочисленные упоминания о скоплениях в стволе мозга норадреналинергических нейронов, хотя данные о численности и локализации этих клеток в ядрах, известных своими вазомоторными функциями, единичны и противоречивы (Dachlstrom et al., 1966; Буданцев, 1976; Вальд-ман, 1976). В связи с этим мы провели сравнительное исследование численности норадреналинергических нейронов в некоторых ядрах бульбарного отдела сердечно-сосудистого центра. В ЯСТ, ДЯБН, РГЯ, РПГЯ, РЛЯ и РОЯМ на долю флюоресцирующих клеток приходится в среднем 8-10% (табл. 6). В других ядрах флюоресцирующие нейроны либо отсутствуют, либо выявляются единичные клетки. Но и в тех ядрах, в которых норадреналинергические нейроны обнаруживаются постоянно, на разных уровнях сечения ядер их численность варьирует в широких пределах. Например, в ЯСТ основное количество клеток определяется в каудальной части, где их доля на некоторых срезах достигает 15%, хотя в среднем по ядру величина этого показателя почти вдвое ниже. Введение в эту зону дигидроэрготоксина приводит к угнетению депрессорных реакций и брадикардии, что лишний раз подтверждает участие норадреналинергических систем в гемодинамических эффектах (Райгородская, 1969).

Существующие представления о роли серотонина в регуляции кровообращения крайне противоречивы. Однако исследования последних лет позволяют рассматривать серотонин в качестве важного участника центральной регуляции сердечно-сосудистой системы (Михайлова, 2009; Watts, 2009). Нейроны, участвующие в обмене серотонина, находятся в ядрах моста и продолговатого мозга. В некоторых ядрах выявляются скопления нейронов, в других встречаются единичные клетки. Особенно часто иммунопозитивные клетки выявляются в области КЯШ и ТЯШ, ядер медиальной зоны, РЛЯ. Не так много серото-нинергических нейронов в РОЯМ, ЯСТ и ДЯБН.

По нашим данным, всего на долю нейронов, участвующих в обмене аце-тилхолина, норадреналина и серотонина, в бульбарном отделе сердечнососудистого центра приходится около 45-50% от общего числа клеток, притом, что среди них норадреналинергические клетки составляют 3—4%, серотонинер-гические 12—18%, остальные участвуют в обмене ацетилхолина.

Пространственные отношения между NO-, СО- и продуцирующими нейронами и нейронами, участвующими в обмене классических нейротрансмиттерных систем

Распределение NO-, СО- и HjS-продуцирующих нейронов и нейронов участвующих в обмене ацетилхолина, норадреналина и серотонина, в каждом из исследованных ядер отличается исключительным своеобразием, а их взаимоотношения на разных уровнях организации ядер сложны и непостоянны (рис. 2).

а / . ^ с • ^ «л i # • \ / ч V ' X ' ч / ч,' Iе * А-^ % \Ф* * Л А \ •ч « * * 1 " - - '

б 1 >' \0 о / \ » ♦ "V / •* \ ✓ * ч ' * * * \ 1 * ч 1 * 1 ** ■ 1 • . * 1 * * 1 : • 1 C4S*«**' i * / \ ^ • * \ 1 t 1 t 1 у \ % А N ° * \ # А ♦ Ж?, ; о " / " 4 - St* '

в 1 - О \ \ / ? \ с Ч * *ч Ч ♦ * w ч ч Ä ■ * *ч ч * " \ > у « 1 У ** 0* о;. Ч* *А *А . А/ ~ - ° _ _ - '

I и III

Рис. 2. Схема распределения нейронов различной медиаторной принадлежности в краниальной (а), центральной (б), каудальной частях (в) ядра одиночного пути (I), ретикулярного гигантоклеточного ядра (II), ретикулярного латерального ядра (III) у крысы: * —N0-, #-С0- и О-Н2Я-проду пирующие нейроны. О-холинергические, А — норадреналинергические и ф — серотонинергические клетки. Размеры символов характеризуют величину клеточных скоплений.

В краниальной части ЯСТ таких клеток очень мало (рис. 2, I а). Стабильно, хотя и в небольшом количестве, в ней выявляются только nNOS-иммунопозитивные и холинергические нейроны. В этой же части РГЯ также преобладают nNOS и ХАТ-иммунопозитивные нейроны. Здесь их намного больше, чем в ЯСТ, а локализация более разнообразна. Несколько чаще они встречаются в срезах, сделанных ближе к ростральному полюсу ядра, там, где редко выявляются моноаминергические клетки и не определяются нейроны, экспрессирующие НО-2 (рис. 2, II а). Зато клеток, продуцирующих H2S, в краниальной части ядра относительно много и располагаются они довольно равномерно. В краниальной части РЛЯ отмечена другая структура взаимоотношений нейронов (рис. 2, III а). Клетки разной медиаторной принадлежности достаточно равномерно распределены в проекции срезов краниальной части ядра, хотя численность ХАТ-иммунопозитивных клеток значительно выше, чем других нейронов. Реже здесь встречаются нейроны, экспрессирующие H2S.

Иная картина пространственных взаимоотношений холин- и моноами-нергических нейронов прослеживается в центральной части ядер, где чаще встречаются почти все типы клеток, нередко образующие более или менее крупные скопления (рис. 2, I б). В ЯСТ нейроны, аккумулирующие ацетилхо-лин, СО или N0, располагаются по всей площади срезов, а их среднее число возрастает более чем в 10 раз. Количество моноаминергических и CBS-иммунопозитивных нейронов также увеличивается, причем особенно значительно в зонах, расположенных ближе к каудальной части ядра, где норадреналинер-гические клетки, как правило, располагаются небольшими группами, состоящими из 2-3 нейронов. В центральной части РГЯ сконцентрировано подавляющее количество медиаторно специфических нейронов. Большинство выявленных здесь NO-, НгБ-продуцирующих, а также норадреналин- и серотонинергических нейронов располагается в непосредственной близости друг от друга, образуя компактные скопления клеток, которые чаще встречаются в вентролатеральной зоне этой части ядра (рис. 2, II б). ХАТ-позитивные нейроны, напротив, в центральной части ядра встречаются не так часто, как в краниальной. В отличие от моноаминергических нервных клеток, они концентрируются в основном по границе с РМЯ и ЯЛН. Небольшое количество ХАТ-позитивных клеток находится в зоне локализации моноаминергических нейронов. СО-продуцирующие нейроны в этой части РГЯ встречаются в минимальном количестве. На срезах, сделанных из центральной части РЛЯ, все виды клеток распределены относительно равномерно, за исключением нейронов, экспрессирующих H2S, которые здесь встречаются очень редко (рис. 2, III б).

В каудальной части ЯСТ ХАТ-иммунопозитивные и нитроксидергиче-ские нейроны встречаются почти в три раза реже, чем в центральной, образуя крупное компактное скопление клеток в дорсомедиальной зоне, там, где СО-продуцирующие и серотонинергические нейроны представлены единичными экземплярами, а Н28-позитивные и норадреналинергические - не выявляются (рис. 2, I в). Нейроны с разными типами химической медиации могут формировать небольшие группы в нескольких участках, но наиболее е выраженное

скопление определяются в области, прилежащей к центральной части ядра. В этой области они концентрируются и в РГЯ (рис. 2, II в).

По мере приближения к нижнему полюсу холин- и моноаминергиче-ские клетки встречаются все реже, а расстояние между ними возрастает. В то же время N0- и Н28-продуцирующие нейроны в этой части ядра располагаются более равномерно. В каудальной части РЛЯ аналогичным образом распределяются только моноаминергические нейроны, хотя флуоресцирующих нейронов в этом участке ядра почти втрое больше, чем серотонинергических (рис. 127, III в). nNOS-, НО-2- и ХАТ-иммунопозитивные нейроны одинаково часто выявляются по всей проекции среза этой части ядра, вследствие чего некоторые из них вступают в тесные пространственные отношения с моно-аминергическими клетками, хотя чаще лежат одиночно или небольшими группами, состоящими из 2-Л клеток. CBS-иммунопозитивные нейроны встречаются крайне редко.

Приведенные выше материалы свидетельствуют, что на разных уровнях организации вазомоторных ядер имеются структурные предпосылки для взаимодействия NO-, СО-, Н28-продуцирующих нейронов с клетками, содержащими классические нейромедиаторы. Согласно современным представлениям, множественность и разнообразие эффектов нейромедиаторов во многом обеспечивают нейромодуляторы, в качестве которых часто выступают N0, СО и H2S (Wang, 2004; Bohlen, 2006). Оказывая нейромодуляторное действие на нейроны, включающие классические нейромедиаторы, они выполняют в мозге многообразные функции — от управления сложными каскадными процессами, создающими условия для функционального объединения отдельных нейронов в нервные центры, до локальной регуляции нейрональной активности и ее сопряжения с интенсивностью местного кровотока (Beckman, 1991, Macrae et al., 1991).

Газообразные посредники в стенке артерий головного мозга

Вазоцептивная функция оксида азота изучена лучше других газотрансмиттеров. Оказалось, что в покое эндотелий постоянно секретирует небольшое количество NO, необходимого для поддержания базального тонуса артериальных сосудов. К настоящему времени наличие N0 установлено в большинстве магистральных и органных сосудах. На химическую или механическую стимуляцию эндотелий реагирует усилением синтеза этого газа, который обеспечивает необходимую величину локального кровотока (Мелькумянц, Балашов, 2005; Toda et al., 2009; Реутов и др., 2012; Швалев и др., 2014).

Сосудистое русло мозга в этом плане оказалось изученным в наименьшей степени. До сих пор отсутствуют сведения об особенностях локализации NO в пиальных артериях разного диаметра (порядка ветвления) и внутримоз-говых сосудах. Проведенное нами исследование свидетельствует, что топо-химия и количественное распределение в стенке сосудов мозга NADPH-d и eNOS — ферментов, участвующих в синтезе NO, во многом зависят от указан-

ных выше факторов. Впрочем, в артериях одного диаметра интенсивность реакции может существенно отличаться: в одних сосудах глыбки преципитата располагаются исключительно плотно, четко отграничивая клетки от окружающего матрикса, в других, зачастую проходящих рядом, мелкозернистый осадок, образующийся в результате ферментативной реакции, слабо контурирует структурные элементы сосуда.

Отметим, что на результаты исследования также большое влияние оказывает метод, использованный для визуализации N0. Изучение сосудов с помощью гистохимического метода на NADPH-d показало, что продукт реакции может откладываться как в эндотелии, так и в средней оболочке (рис. 3, а-в). В эндотелии этим методом активность фермента определяется на всем протяжении сосудистого русла. В средней оболочке она постоянно выявляется только в позвоночной артерии и пиальных ветвях I—II и, отчасти, III порядков, где активность NADPH-d более высока в гладкомышечных клетках, прилежащих к эндотелию. В пиальных ветвях IV порядка, и внутримозговых арте-риолах активность фермента в миоцитах слаба и непостоянна (рис. 3, г). Им-муногистохимическое исследование eNOS продемонстрировало наличие фермента только в эндотелии. Причем интенсивность реакции особенно высока в пиальных ветвях II-III порядков (рис. 3, д-ж). В более мелких пиальных ветвях, прекортикальных и внутримозговых артериолах, как правило, преципитат откладывается лишь в небольшой части клеток (рис. 3, з).

Н в

V *

д у е ж -Ш з

Рис. 3. Локализация NADPH-d (а, 6, в, г) и eNOS (д, е, ж, з) в стенке пиальных ветвей II (а, д) III (б—ж) порядков и внутримозговых артерий (г, з) крысы. Стрелками отмечена локализация ферментов в эндотелии (f) и миоцитах (fj)- Гистохимический метод на NADPH-d (а—г), иммуногистохимический метод на eNOS (д-з). Ув. 100х.

Таким образом оба фермента однозначно указывают на эндотелий как место выработки N0 в сосудах разного калибра и локализации. Наиболее активно этот процесс проходит, судя по высокой концентрации eNOS, в пиальных ветвях II-III порядков, что соотносится с особым местом, которое отводится этим артериям в мозговой гемодинамике (Мчедлишвили,

1968; Барамидзе, Мчедлишвили, 1975). Сомнения остаются в отношении присутствия этой сигнальной молекулы в гладких миоцитах тех сосудов, в которых определяется активность NADPH-d, но не выявляется eNOS. На самом деле, отсутствие eNOS в миоцитах лишь показывает, что в них не происходит синтез N0, что, само по себе, не отрицает возможности нахождения в них этого газа. Будучи липофильной молекулой, N0 легко проникает через клеточные мембраны в соседние клетки, в том числе, посредством мио-эндотелиальных контактов из эндотелия в миоциты сосудов, где циклический гуанозинмонофосфат способствует снижению уровня кальция и, активируя киназу легкой цепи миозина, вызывает локальную дилатацию сосуда (Boo, Jo, 2003). Гистохимический метод на NADPH-d, уступая элек-тивностью иммуногистохимическому, тем не менее, является достаточно информативным для определения присутствия оксида азота в структурных элементах стенки сосуда.

Представленные выше материалы находят подтверждение в проведенном нами биомикроскопическом исследовании реакции пиальных ветвей I—V порядков на ацетилхолиновый (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитроглицериновый тесты (эндотелийнезависимая, миогенная вазодилатация) до и после внутривенного введения блокатора NO-синтазы L-NAME. Если до инъекции L-NAME эндотелийзависимая реакция была особенно хорошо выражена на мелких пиальных ветвях, а эндотелийнезависимая, миогенная вазодилатация, — на артериях I—II порядков, то после его введения ответная реакция сосудов в значительной степени уменьшалась, как на крупных, так и мелких ветвях. Введение нитроглицерина, действие которого связано с высвобождением NO в гладких миоцитах сосудов, приводит к частичному восстановлению вазодилататорной реакции, но в основном на ветвях I—II порядков, обладающих относительно развитой мышечной оболочкой. Являясь донатором N0, нитроглицерин активирует гуанилатциклазу и повышает уровень цГМФ, вызывая гиперполяризацию без участия ионов кальция, и расслабление гладкой мускулатуры артерий (Bellian et al., 2008).

В целом, проведенное исследование показывает, что вклад эндотели-ального и миогенного механизмов в регуляторный процесс меняется на различных отрезках сосудистого русла мозга.

В стенке артерий постоянно находится и другой газообразный посредник — H2S. В сосудах мозга его экспрессия наблюдается как в эндотелии, так и в гладкомышечных клетках, что позволяет ему выступать универсальным регулятором функций сосудов. Эндогенный H2S синтезируется из L-цистеина преимущественно пиридоксаль-5'-фосфат-зависимыми ферментами - CBS и CSE. Неоднократно отмечалось, что CSE участвует в синтезе H2S в кардио-васкулярной системе, a CBS - в нервной (Catalano, Rastelli, 2009; Gadalla, Snayder, 2010). Однако результаты проведенного нами исследования показывают, что в эндотелии церебральных артерий возможна экспрессия как CBS, так и CSE. В то же время, наличие и распределение каждого из этих ферментов зависит от диаметра и локализации сосудов: в эндотелии мелких пиальных и внутримозговых артериол выявляется CBS (рис. 4, а—в). По на-

шим расчетам, энзимопозитивные сосуды относительно часто встречаются среди пиальных ветвей Ш-1У порядка, но наибольших значений величина показателя достигает среди внутримозговых сосудов.

ш

0

п

1 %

\ 40

Г

J, 10

m п

о 0

Рис. 4. Распределение CBS в стенке артерий и относительное содержание энзимпози-тивных сосудов у крысы. За 100% принято общее количество встретившихся внутри-мозговых и пиальных артерий соответствующего порядка ветвления. Стрелкой отмечена локализация CBS в эндотелии внутримозговой артерий (а), пиальных ветвях IV (б) и III (в) порядка. Иммуногистохимия.

Гранулярный осадок, маркирующий CSE, в стенке артерий может выявляться или только в миоцитах, или эндотелии, или в обеих структурах вместе (рис. 5, а-в).

ПА I II III IV в/м

Рис. 5. Распределение CSE в стенке артерий, а также относительное содержание энзим-позитивных сосудов в эндотелии (светлые столбики), в мышечных клетках (темные столбики) и СПОП фермента в миоцитах (уТ) и эндотелии (у) позвоночной артерии (а), пиальных ветвей I (б) и IV (е) порядков у крыс. За 100% принято общее количество встретившихся пиальных и внутримозговых артерий соответствующего порядка ветвления. Иммуногистохимия.

В стенке ПА иммунолокализация CSE ограничивается, в основном, мышечными клетками, окрашивая их в зависимости от плотности отложения осадка в различные оттенки бордового цвета. В пиальных ветвях I—II порядков преципитат откладывается в миоцитах и эндотелии. Интенсивность отложения продукта реакции в миоцитах, лежащих в наружных и внутренних слоях средней оболочки, мало отличается, что является косвенным свидетельством того, что синтез фермента происходит непосредственно в средней оболочке (Hosoki et al., 1996). В большинстве мелких пиальных и внутримозговых сосудах экспрессия CSE наблюдается только в эндотелии. По мере увеличения калибра артерий продукт реакции все реже откладывается в эндотелии, хотя в некоторых случаях он маркирует внутреннюю выстилку и более крупных артерий, включая ветви I порядка.

Подсчеты показывают, что CSE-позитивных пиальных ветвей I порядка почти на треть меньше, чем II и III порядков (рис. 5). В мышечных клетках последних существенно выше и интенсивность реакции. В миоцитах пиальных ветвей IV порядка значения плотности отложения осадка ниже, чем в других пиальных сосудах. Наряду с энзимпозитивными сосудами наблюдается достаточно большое количество пиальных и внутримозговых артерий, в стенке которых исследованные ферменты не выявляются.

Данные последних лет указывают на то, что регуляторная функция газов, помимо N0 и H2S, тесно связана с другой сигнальной молекулой — СО, оказывающей на сосуды не столь мощное как NO, зато длительное релаксирую-щее действие (Catalano, Rastelli, 2009; Leffler et al., 2011). Особенно выраженный эффект СО авторы отмечают в отношении артерий мозга. Однако, несмотря на то, что и субстрат, и фермент, обеспечивающий продукцию СО в сосудистой системе (Wang et al., 1997), был установлен достаточно давно, мы не встретили сообщений о топохимии и количественном распределении НО-2 в стенке мозговых артерий различного диаметра.

По нашим данным, гранулярный осадок коричневого цвета, маркирующий НО-2, определяется преимущественно в мышечных клетках крупных пиальных ветвей с развитой средней оболочкой (рис. 6, а, б). При этом плотность отложения продукта реакции в мышечных клетках наружных и внутренних слоев средней оболочки мало отличается друг от друга. В пиальных ветвях I и II порядков иммунопозитивные миоциты встречаются чаще и обнаруживают более интенсивную реакцию, чем в пиальных ветвях III и IV порядков. В мышечных клетках пиальных ветвей IV порядка и внутримозговых сосудах, в которых сократительные клетки постоянного слоя не образуют, иммунопозитивные миоциты не определяются. Мишенями действия СО в мышечных клетках могут быть потенциалзависимые калиевые каналы и Са2~-активируемые калиевые каналы (Naik, Walker, 2003). Монооксид углерода увеличивает калий-зависимый ток и индуцирует гиперполяризацию в изолированных гладкомы-шечных клетках сосудов. С помощью обратной полимеразной реакции было установлено, что экспрессия указанной изоформы фермента определяется в миоцитах некоторых сосудов, но не определяется в эндотелии (Wang et al., 1997).

* А ГА

* с. \

fj 10 мкм р 1(1 мкм fi И) мкм р 10 мкм

Рис. 6. Относительное содержание сосудов с положительной реакцией на НО-2 в мио-цитах (белые столбики), в эндотелии (серые столбики) и СПОП (кривая) у крыс. За 100% принято общее количество встретившихся внутримозговых и пиальных артерий соответствующего порядка ветвления. Стрелками показана локализация НО-2 в миоцитах (f^) и/или эндотелии (Т) позвоночной артерии (а), пиальных ветвей II (б), IV (в) порядков и внутримозговой артерии (г). Иммуногистохимия.

На этом основании долгое время считалось, что СО в функционировании эндотелия участия не принимает. Используя иммуногистохимический метод, мы показали наличие НО-2 в эндотелиоцитах достаточно большого числа мелких пиальных и внутримозговых сосудов (рис. 6, в, г), что согласуется с недавно опубликованными материалами, позволяющими считать, эндотелий обязательным элементом, обеспечивающим тесное взаимодействие всех трех сигнальных молекул (Bellian et al., 2008; Gadalla, Snayder, 2010). Вместе они составляют единую функциональную систему - EDHF (endotheiium-derived hyper-polarizing factor, эндотелий зависимый фактор гиперполяризации). Такое название было предложено в связи с тем, что любое проявление активности эндотелия, включает основной компонент — гиперполяризацию, после чего электрический сигнал, генерируемый в этих клетках, посредством миоэндотелиальных соединений вызывает возбуждение миоцитов (Bellian et al., 2008; Luksha et al., 2009).

NO является лишь инициирующим звеном в EDHF, обеспечивая начальный этап в развитии сосудистой реакции. Затем сигнал трансформируется и пролонгируется, или посредством СО, который способствует повышению внутриклеточного содержания цГМФ, или H2S, стимулирующего образование цАМФ, или при совместном действии этих газов (Feletou, Vanhoutte, 2007, Luksha et al., 2009). Значение CO и H2S в мышечных

клетках артерий, по мнению этих авторов, в нормальных условиях невелико, но повышается при длительных изменениях артериального давления, причем особенно существенно в артериях, обладающих развитой мышечной оболочкой.

Газотрансмиттеры в афферентной и эфферентной иннервации сосудов

Регуляция мозговой гемодинамики тесно связана с иннервацией сосудов мозга. Еще не так давно нервная регуляция представлялась единственно надежной и эффективной системой обеспечения адекватного мозгового кровотока. Важное место в нервной регуляции мозговой гемодинамики принадлежит афферентной иннервации церебральных артерий. Долгое время считалось, что рецепцию и проведение возбуждения обеспечивает ацетилхолин, а холинергический механизм является едва ли не единственным участником этих процессов. В последние годы появились сообщения о возможном участии в этих процессах NO (Toda, Okamura, 2003). Однако, несмотря на повышенный интерес к изучению NO-ергических механизмов в обеспечении функций нервной системы, в отношении афферентного аппарата сосудов эта проблема оказалась вне исследовательских интересов ученых.

Как показали наши наблюдения, NO широко представлен в афферентных структурах головного мозга, а особенности функциональных свойств этой газообразной молекулы доказывает возможность ее активного участия в локальных механизмах чувствительной иннервации церебральных сосудов. В стенке артерий и, прилежащих к ним участках мягкой оболочки мозга, с большим постоянством определяются рецепторы, обладающие различной степенью активности NADPH-d (рис. 7, а-е). На более крупных артериях чаще наблюдаются просто устроенные древовидные арборизации, которые с уменьшением калибра сосудов замещаются вначале кустиковидными рецепторами, а затем клубочковыми нервными окончаниями. Клубочковые рецепторы имеют разную величину, форму, концентрацию терминальных волокон и активность фермента.

Рис. 7. Рецепторы артерий мягкой оболочки продолговатого мозга и внутримозговых артерий: а - древовидные арборизации, б, в - кустиковидные рецепторы, г, д - клубочковые нервные окончания; а, о, г- человек, в, д - крыса. Метод на ЫАОРН-ё. Ув.: а, б, в — 200* г, д - 400х

Экспериментальными исследованиями установлено, что клубочковые рецепторы, являясь типичными барорецепторами, реагируют на изменения кровяного давления, сигнализируют о тонусе и сократительной деятельности сосудов, о количестве протекающей по ним крови, создавая необходимые предпосылки для обеспечения нормальной работы нейронов головного мозга (Motavkin et al., 1990). На сегодняшний день механизмы участия NO в рецепции и проведении возбуждения к вышележащим центрам доподлинно не известны, но предполагается, что они универсальны как в центральной, так и в периферической нервной системе (Kaushik et al., 2001).

В регуляции мозговой гемодинамике немаловажная роль отводится эфферентной иннервации. Большое количество материалов, подтверждает участие в этом процессе адрен- и холинергических нервных проводников (Мотав-кин, Черток, 1980-2013; Owman, Edvinsson, 1984; Nielsen et al., 1995). Проведенные нами исследования показали, что наряду с адренергическими и холи-нергическими нервными сплетениями на пиальных артериях различного калибра, постоянно присутствуют NO-ергические нервы. Сложность выявления такого рода волокон состоит в том, что при гистохимическом исследовании NADPH-d на тотальных препаратах, в стенке крупных пиальных артерий отмечается исключительно высокая плотность отложения продукта реакции, которая экранирует NO-позитивные проводники периадвентициальных сплетений. Поэтому NO-ергические нервы удается постоянно выявлять только на поперечных и косопоперечных срезах крупных артерий (рис. 8, а) или в мелких сосудах (рис. 8, б, в). На артериях диаметром 400-250 мкм наблюдаются широкопетлистые NO-ергические нервные сплетения, на ветвях меньшего калибра, вплоть до сосудов диаметром 20-30 мкм, прослеживаются тонкие продольные нервные волокна, по ходу которых определяются варикозные утолщения, характерные для эфферентных нервов.

Рис. 8. ЫО-ергические нервные волокна периадвентициальных сплетений на пиальных артериях разного калибра у человека. Артерии диаметром 400 мкм (а), 200 мкм (б), 100 мкм (в) и 60 мкм (г). Метод наЫАОРН-а. Ув. 100х.

Электронно-цитохимическое исследование распределения ЫАБРН^ в нервных сплетениях пиальных и внутримозговых сосудов, показало, что положительная реакция наблюдается в дендритах и аксонах. В дендро- и аксоплаз-

ме некоторых отростков отмечаются крупные скопления электронно-плотного материала. В дендритах преципитат определяется в миелиновой оболочке, незначительное его количество содержится в микрофиламентах и митохондриях. В расширениях аксонов мелкодисперсный осадок связан с мембраной большей части агранулярных пузырьков диаметром 40-60 нм. Скопления продукта реакции локализуется также в мембране и цитоплазме терминального расширения аксона. Незначительное количество гранул преципитата обнаруживается на мембранах митохондрий и микротрубочках. Профили аксонов, маркированные NADPH-d, располагаются как на расстоянии 80—120 нм от стенки сосудов, так и нескольких десятков микрометров. Некоторые пиальные и внутримозговые сосуды иннервированы очень хорошо: в непосредственной близости от их стенки находятся 1-2, иногда 3, расширений аксона, включающих синаптические пузырьки, маркированные NADPH-d.

Полученные данные свидетельствуют, что наряду с ортоградным транспортом NO, возможен локальный синтез фермента в терминалях аксона, т.е. при возбуждении синтез и выделение оксида азота могут проходить в любом участке тела и отростков нейрона. В последние годы дилататорную функцию холинергических нервов все чаще связывают с NO. Высказывается мнение, что NO-ергические нервы в отношении секреции ацетилхолина играют модулирующую роль, т.е. являются фактором, запускающим холинергическую систему, и потому в функциональном отношении для сосудов более важны, чем холинергическая медиация (Wenzel et al., 1999).

Согласно существующим представлениям, регуляция мозговой гемодинамики - это сложный процесс, который реализуется в результате взаимодействия, по крайней мере, трех механизмов: эндотелиального (интимапьного), миогенного и нейрогенного (Мотавкин, Черток, 1980, 2007; Черток, Коцюба, 2012). На протяжении от магистральных артерий до мелких пиальных и внутримозговых сосудов существует своего рода градиент регуляции с постепенной сменой одного доминирующего механизма другим. Приведенные выше материалы показывают, что немаловажная роль в каждом из этих механизмов принадлежит газообразным посредникам.

Газообразные посредники нервно-сосудистых образований мозга при артериальной гипертензии

Как упоминалось, все газообразные посредники обладают вазорелаксирующим действием. При подавлении активности ферментов, отвечающих за продукцию указанных выше газов, развивается гипертензия (Wang, 2004; Olson, 2008; Cata-lano, Rastelli, 2009). Большое место в развитии артериальной гипертензии неизменно отводится NO, тогда как морфологических доказательств участия H2S и СО в нарушении центральных механизмов регуляции кровотока до сих пор не представлено.

Отсутствие материалов о количественных и качественных преобразованиях CBS- и НО-2 в нервно-сосудистых образованиях центров регуляции ва-зомоторики при АГ не позволяет составить цельного представления о

вкладе газотрансмиттеров в нарушение работы нервного центра. Проведенное нами исследование показало наличие субстрата, с помощью или посредством которого газообразные посредники могут участвовать в реализации центральных механизмов управления гемодинамики.

При развитии АГ у человека и РВГ у крысы в вазомоторных ядрах происходят разной степени выраженности изменения интенсивности реакции ферментов, участвующих в продукции газотрансмиттеров, и численности нейронов, которые тесно связаны с периодом формирования гипертензии. I период характеризуется изменением концентрации ферментов в нейронах, II - сокращением концентрации ферментов и количества иммунопозитивных клеток, III - стабилизацией значений показателей на новом минимальном уровне (рис. 9).

Рис. 9. Схема преобразований сосудисто-нервного аппарата головного мозга в процессе развития реноваскулярной гипертензии у крыс. Красными стрелками показано повышение интенсивности реакции ферментов, участвующих в образовании газотрансмиттеров, синими - снижение. Цифрами I, II, III, IV обозначен порядок ветвления пиальных артерий.

Во всех случаях наблюдается сходная последовательность отмеченных преобразований. Однако, несмотря то, что все исследованные ядра входят в единую интегративную систему центральной регуляции гемодинамики, при развитии гипертензии каждое из них имеет собственную шкалу временных изменений значений количественных показателей. В результате этого процесса происходит перераспределение нейронов в нервном центре от

«очаговой» локализации клеток, т.е. более выраженному изменению их концентрации в определенных ядрах или отдельных участках одного ядра, к более или менее равномерному («диффузному») расположению сократившегося количества нейронов, что приводит, в конечном счете, к ремоделированию бульбарного отдела сердечно-сосудистого центра в целом.

Ремоделирование CBS- или HO-2-иммунопозитивных клеток в одноименных ядрах сердечно-сосудистого центра, наступают позднее и выражено в меньшей степени, чем NO-позитивных нейронов. Перераспределение различных типов газотрансмиттерных клеток в ядрах, отражается как на характере связей между ядрами, и, как следствие, организации работы нервного центра в целом. Изменение пространственных отношений между сигнальными молекулами на ранних стадиях АГ приводит к компенсаторному замещению недостаточности функции одних газотрансмиттерных систем другими и, как следствие, к временной стабилизации АД. Дальнейшее сокращение концентрации NOS, CBS и НО-2 в нейронах, а затем и количества клеток, поддерживает длительно текущую гиперактивацию симпатической нервной системы не только на центральном, но и периферическом уровне, способствуя ремоделированию сосудистой стенки, повышению АД и стабилизации его на новом уровне.

Многие исследователи связывают появление и закрепление стабильной АГ с усилением адренергических процессов внутри «бульбарного центра» (De Jong, Nijkamp, 1976; Хрусталева, Цырлин, 2004). Выявление в этом отделе мозга компактных скоплений норадреналинергических нейронов и увеличение их числа в процессе развития АГ, явилось морфологическим подтверждением высказанного предположения. Несмотря на то, что количество норадреналинергических нейронов в стволе мозга составляет около 1-3% от общего числа клеток (Viljoen, Panzer, 2007; Черток, Коцюба, 2013), эффективность и многообразие нейромедиаторного воздействия может существенно увеличиваться за счет нейромодуляторного эффекта газотрансмиттеров. Нейромедиаторы и нейромодуляторы активно взаимодействуя между собой, образуют сложную индукционную сеть, управляющую интеграционными процессами в мозге (Böhlen et al., 2006; Olson, Donald, 2009). В таком случае даже небольшого количества норадреналинергических клеток может быть достаточно для существенного влияния на вазомо-торику. Оказывая воздействие на нейроны, участвующие в продукции классических медиаторов, они выполняют в мозге многообразные функции - от управления сложными каскадными процессами, создающими условия для функционального объединения отдельных нейронов в нервные центры, до локальной регуляции нейронной активности и ее сопряжения с интенсивностью местного кровотока.

При экспериментальной гипертензии установлена общая тенденция артерий мягкой оболочки мозга к вазоконстрикции и разрежению сосудистой сети. Однако наличие и выраженность сосудистой реакции зависят от диаметра артерий и времени, прошедшего после операции. По данным биомикроскопии, в течение первых недель развития РВГ констрикторная реакция

затрагивает преимущественно пиальные артерии I и II порядков, и лишь спустя 2-3 месяца отмечается достоверное сокращение диаметра более мелких ветвей. На 16—20-й неделе появляются артерии, по ходу которых образуются одиночные или множественные булавовидные выбухания так называемые «сосисочные деформации» (рис. 10), свидетельствующие о срыве ауторегуляторного механизма мозговых сосудов (Ганнушкина, Лебедева, 1987).

IV

IV

Ш

ш

а

Рис. 10. Сосудистое русло мягкой оболочки мозга крысы (римскими цифрами обозначены артериальные ветви соответствующего порядка): а — 10-я неделя после операции; б — 16-я неделя после операции; в - деструктивные изменения сосуда, протекающие по типу «сосисочного» феномена. Биомикроскопия. Ув.: а, б- 100"; в —об. 200х.

Иммуногистохимическим методом в этих участках сосуда нами выявлена {N08 в эндотелии, а позднее и в мышечных клетках (рис. 11).

V

•у

a t ^ ô в

Ч

Рис. 11. Индуцибильная NOS мягкой оболочки головного мозга крысы: а - отсутствие iNOS в стенке сосуда (стрелками показаны тени лейкоцитов в просвете сосуда); б - iNOS в лейкоцитах (показано стрелками), находящихся в просвете сосудов (6-я неделя); в - iNOS в лейкоцитах (л), фиксированных к внутренней поверхности эндотелия (10-я неделя), стрелками показана iNOS в эндотелии; г — iNOS в эндотелии (одинарные стрелки) и в мышечной оболочке сосуда (двойные стрелки). Иммуноги-стохимический метод. Ув.: а, б - 100х; в - 200х; г - 400х.

Вероятно, деструктивные изменения в системе пиальных артерий при длительно текущей РВГ связаны с активацией ¡N05 и последующим ремо-делированием эндотелия, что провоцирует все более выраженные нарушения гемодинамики.

Развитие РВГ у крыс сопровождается активной перестройкой в стенке сосудов и других газотрансмиттерных систем. Ниже на диаграмме приведены результаты сравнительного изучения значений СПОП и доли эн-зимпозитивных пиальных ветвей I—IV порядков и внутримозговых артерий на 12-й неделе развития РВГ, когда отклонения величины показателей от контрольного уровня устанавливаются на максимальных значениях (рис. 12).

% □ МАЭРН-с! ПеГЮБ □ НО-2 ПСБЕ

Рис. 12. Изменение значений СПОП (кривая) и доли (столбики) пиальных ветвей I-IV порядков и внутримозговых сосудов с положительной реакцией на NADPH-d, eNOS, НО-2 и CSE на 12 неделе развития РВГ у крыс. За 100% принята величина соответствующих показателей у контрольных животных.

Как видно, реакция ферментов, участвующих в синтезе NO, СО и H2S, на повышение артериального давления существенно отличается. Наиболее значительные отклонения величины соответствующих показателей наблюдаются среди NO-продуцирующих ферментов, в первую очередь, eNOS. Среди НО-2- и CSE-позитивных сосудов изменения величины показателей не столь выражены и в большинстве случаев не превышают 8-12%. Но во всех случаях наибольшие отклонения изученных параметров определяются среди пиальных ветвей III—IV порядков, что соотносится с особой ролью, которая отводится этим сосудам в регуляции внутримозговой гемодинамики (Мчедлишвили, Николайшвили, 1966, Барамидзе, Мчедлишвили, 1975). Вполне вероятно, что выраженные преобразования ферментных систем в стенке пиальных мелких артерий, наблюдающиеся при РВГ, позволяют

внутримозговым сосудам долгое время сохранять исходный уровень функциональной активности, свидетельством чего является то, что среди этих артерий установлены наименьшие отклонения изученных показателей (рис. 12).

При рассмотрении динамики преобразований СПОП и содержания сосудов с положительной реакцией на NADPH-d, nNOS, НО-2 и eNOS в различные временные промежутки развитии РВГ, также прослеживаются отчетливые отличия в выраженности изменений количественных показателей между артериями, маркированными каждым из этих двух ферментов, в преобразованиях которых можно выделить, как и в отношении нейронов, три периода (рис. 9). При этом, изменения NO-продуцирующих ферментов наступают раньше и проявляются в большей степени, чем НО-2 и CSE, а в пиальных артериях опережают соответствующие изменения, установленные во внутримозговых сосудах.

Таким образом повышение артериального давления приводит к уменьшению образования NO, H2S и СО, усилению сосудистого тонуса и, в конечном счете, к ремоделированию сосудистой стенки. У крыс с РВГ значительно сокращается доля сосудов, эндотелий которых участвует в экспрессии ферменты синтеза этих газов.

Неблагоприятно отражаются на процессах управления кровотоком в мозге и системные изменения афферентной и эфферентной иннервации сосудов. Даже при начальных проявлениях АГ нами отмечены реактивные и деструктивные нарушения со стороны рецепторного аппарата артерий мягкой оболочки мозга. В нервных сплетениях мозговых сосудов при АГ заметно снижается активность NADPH-d и количество нервных волокон, тогда как концентрация адренергических проводников и особенно варикозностей существенно возрастает. Измененные приборы посылают в мозг искаженные данные о состоянии кровотока, вызывая ремоделирование нервного центра, в результате чего по эфферентным каналам к сосудам поступает извращенная информация, вызывающая структурные перестройки их стенки и еще более глубокие нарушения гемодинамики. В этой связи отметим распространенную ныне концепцию, согласно которой АГ является болезнью нарушения нервной регуляции артериального давления, а барорецепторный механизм - главным, с которого начинается цепь нарушений регуляции сосудистого тонуса (Рогоза и др., 1990; Del Zoppo, Mabuchi, 2003; Мотавкин, Черток, 2008, Швалев и др., 2014). Подтверждением этому может служить хорошо известный факт нарушения баро-рецепторного рефлекса у больных с АГ, снижение которого часто расценивается в качестве пускового звена в патогенезе гипертонической болезни (Рогоза и др., 1990; Patel et al., 2001; Швалев и др., 2014).

Установленные нами закономерности распределения NO-, СО- и H2S-позитивных нейронов в ядрах, обладающих вазоактивными функциями, и артериях, обеспечивающих кровоснабжение этих ядер, позволяют по-новому охарактеризовать организацию бульбарного отдела сердечно-сосудистого центра, в работе которого немаловажная роль принадлежит газообразным посредникам.

ВЫВОДЫ

1. В продолговатом мозге и мосте человека и крысы в ядрах, участвующих в центральной регуляции сосудистого тонуса, постоянно находятся N0-, СО-, НгБ-продуцирующие нейроны. При этом в одноименных ядрах различной функциональной принадлежности отчетливо прослеживается избирательное выявление морфологически гетерогенных групп газотрансмиттерных нейронов, между которыми определяются отличия качественных и количественных характеристик.

2. На разных уровнях организации вазомоторных ядер имеются структурные предпосылки для обеспечения взаимодействия nNOS, CBS и НО-2-позитивных нейронов, как между собой, так и с клетками, содержащими ацетилхолин, норадреналин, серотонин. Нейроны с разными типами химической медиации в разных участках ядер образуют более или менее компактные скопления, в которых газотрансмитгерные нейроны располагаются в непосредственной близости от клеток, вырабатывающих классические нейромедиаторы.

3. В ядрах продолговатого мозга и моста гистохимическим (NADPH-d) и иммуногистохимическим (nNOS) методами постоянно выявляются нитроксидергические нейроны. Сравнительное изучение в одноименных ядрах топохимии и количественного распределения нейронов, выявленных одним из указанных выше методов, показало наличие определенных отличий:

• nNOS-позитивные клетки в ядрах всегда выявляются в меньшем количестве, чем при гистохимической реакции на N ADPH-диафоразу;

• nNOS маркирует преимущественно небольшие по размеру клетки, тогда как NADPH-диафораза выявляется и в многочисленной группе средних и крупных нейронов;

• nNOS определяется в основном в клетках чувствительных и вегетативных ядер, NADPH-диафораза, кроме того, — в нейронах двигательных ядер.

• при гистохимической реакции на NADPH-диафоразу постоянно выявляются клетки с многочисленными длинными отростками, nNOS маркирует небольшое число коротких нервных отростков.

4. CBS выявляется преимущественно в крупных интенсивно окрашенных клетках двигательных ядер, где доля иммунопозитивных нейронов колеблется от 12 до 14%, в чувствительных и вегетативных ядрах содержание таких нейронов в 2—2,5 раза ниже.

5. НО-2 чаще маркирует небольшие нейроны чувствительных ядер с высокой и умеренной плотностью отложения продукта реакции. Крупные нейроны отличаются невысокой интенсивностью реакции.

6. В большинстве исследованных ядер у человека и крысы установлена во многом сходная организация соответствующих типов газотрансмиттерных нейронов. Вместе с тем сравнительное исследование позволило выявить некоторые видовые особенности топохимии и количественного распределения этих нейронов. Так, у крысы по сравнению с человеком:

• в одноименных ядрах выше значения оптической плотности продукта реакции, доли и относительной плотности иммунопозитивных клеток.

Эти различия лучше выражены среди клеток, участвующих в продукции N0 и СО, в ядре одиночного пути и ретикулярных ядрах латеральной группы;

• количественное соотношение иммунопозитивных нейронов в ядрах «сдвинуто» в сторону группы мелких клеток. Указанные различия проявляются в большей степени в крупноклеточных ядрах (двойное ядро, ретикулярное гигантоклеточное и парагигантоклеточное ядра) и при выявлении в них nNOS.

7. Между ядрами, между ядрами и проводящими путями продолговатого мозга и моста выявляются небольшие по величине иммунопозитивные нейроны веретеновидной или полигональной формы, обладающие интенсивной реакцией nNOS, CBS и НО-2. Занимая стратегическое положение в бульбарном отделе сердечно-сосудистого центра, эти клетки, аккумулирующие как газотрансмитгеры, так и классические медиаторы нервного импульса, формируют локальные цепи интернейронов между ядрами различной функциональной принадлежности, что предполагает их активное участие в центральной регуляции гемодинамики.

8. В стенке исследованных артерий выявляются eNOS, CSE и НО-2, особенности распределения которых тесно связаны с топографией и калибром сосудов: eNOS выявляется только в эндотелии пиальных и внутримозговых сосудов. CSE имеет более разнообразную локализацию: в позвоночной артерии она определяется в основном только в миоцитах, в пиальных ветвях I-III порядков - в мышечных клетках и эндотелии, в более мелких пиальных артериях преимущественно в эндотелии, а во внутримозговых сосудах - только в эндотелии. Экспрессия НО-2 установлена в миоцитах позвоночной артерии и пиальных ветвей I—III порядков. В мелких пиальных и внутримозговых артериях НО-2 определяется, как и CBS, только в эндотелии.

9. N0 участвует в эфферентной и афферентной иннервации церебральных артерий. В пиальных артериях и прилежащих к ним участках мягкой оболочки у человека и крысы постоянно выявляются нитроксидергические нервные сплетения, нервные терминали и рецепторы. На более крупных артериях чаще располагаются просто устроенные NO-позитивные древовидные рецепторы, которые с уменьшением калибра сосудов замещаются кустиковидными арборизациями, сменяющимися, в свою очередь, клубочковыми нервными окончаниями. CBS-позитивные нервные волокна определяются в периадвентициальных сплетениях мелких пиальных и внутримозговых артерий.

10. Развитие РВГ у крыс и артериальной гипертензии у человека сопровождается активной перестройкой газотрансмитгерных систем в стенке артерий головного мозга и ядрах бульбарного отдела сердечно-сосудистого центра. В стенке пиальных артерий качественные и количественные преобразования ферментов опережают соответствующие изменения, установленные в большинстве изученных ядер. При этом в обоих структурных образованиях изменения NO-продуцирующих ферментов наступают раньше и проявляются в большей степени, чем CBS- и НО-2.

11. В бульбарном отделе сердечно-сосудистого центра выраженность и направленность изменений количественных показателей

газотрансмитгерных нейронов, связана с продолжительностью артериальной гипертензии, исследованным ферментом, функциональной принадлежностью ядер. В чувствительных ядрах установлены более ранние изменения величины показателей. Изменения количественных показателей среди СО- и Репродуцирующих нейронов в соответствующих ядрах наступают позднее и выражены не так значительно, как среди нитроксидергических нейронов. В результате этих процессов происходят преобразования пространственного положения различных типов газотрансмитгерных нейронов, что приводит к изменению структурно-функциональной организации нервного центра.

12. При экспериментальной гипертензии установлена общая тенденция артерий мягкой оболочки мозга крыс к вазоконстрикции и разрежению сосудистой сети. Выраженность сосудистой реакции зависят от калибра пиальных артерий и времени, прошедшего после операции: в течение первых 4 недель сокращение диаметра отмечается преимущественно в пиальных ветвях I и II порядков, на 6-10-й неделях соотвествующие изменения диаметра наблюдаются в более мелких ветвях. На 16-й неделе РВГ появляются артерии, по ходу которых образуются одиночные или множественные булавовидные выбухания («сосисочные деформации»), свидетельствующие о нарушениях ауторегуляторных процессов. В эндотелии, а позднее и в мышечных клетках таких сосудов, выявляется ¡ЫОБ.

13. При артериальной гипертензии в артериях продолговатого мозга человека отмечаются реактивные и деструктивные изменения афферентных и эфферентных нервных сплетений, выраженность которых тесно связана с тяжестью болезни, калибром артерий и их локализацией. На ранней стадии развития АГ преобладают изменения афферентного звена сосудистой иннервации. В пиальных артериях в этот период часто обнаруживаются рецепторы с явлениями реактивного раздражения (усиленным разрастанием концевых ретикуляров, избыточном росте нервных терминалей, участвующих в формировании рецепторов, умеренном повышении в них активности НАОРИСЬ. В более тяжелых случаях АГ в нервных сплетениях пиальных артерий возрастает доля нервных проводников с деструктивными изменениями (появлением вздутий и сужений по ходу нервных волокон, их повышенной извитостью, разрежением нервных сплетений, чередующихся участков с исключительно высокой и низкой активностью ферментов). Во внутримозговых сосудах отмечаются сходные преобразования нервного аппарата, однако в качественном и количественном отношении они уступают изменениям, установленным в пиальных сосудах.

14. Данные, полученные в настоящем исследовании, явились основанием для формирования принципиально новой концепции об участии системы газотрансмиттеров в организации работы бульбарного отдела сердечно-сосудистого центра, в котором артериальные сосуды, с одной стороны, представляют собой мишень для регулирующих воздействий N0-, СО- и НзБ-продуцируюших нейронов, с другой, обеспечивая кровоснабжение нервного центра, являются одним из механизмов его управляющих воздействий.

СПИСОК ОСНОВНЫХ НАУЧНЫХ РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Монографии:

1. Черток В.М., Коцюба А.Е. Морфофункциональная организация бульбарного отдела сердечно-сосудистого центра. Владивосток : Медицина ДВ. 2013. - 164 с.

Публикации в журналах, рекомендованных ВАКМинобрнауки РФ:

2. Черток В.М., Афанасьев A.A., Коцюба А.Е. Применение автоматизированной системы анализа изображений ALLEGRO-MC для морфологических исследований // Морфология. 2003. Т. 124, № 4. С. 8893.

3. Коцюба А.Е., Беспалова Е.В., Черток В.М. Влияние оксида азота на реактивность сосудов микроциркуляторного русла при воздействии лазером // Тихоокеанский мед. журн. 2007. Т. 30, № 4. С. 44^16.

4. Черток В.М., Коцюба А.Е., Беспалова Е.В. Особенности реакции сосудов микроциркуляторного русла некоторых органов на воздействие гелий-неонового лазера // Тихоокеанский мед. журн. 2007. Т. 29, № 3. С. 48-52.

5. Черток В.М., Коцюба А.Е., Беспалова Е.В. Роль оксида азота в реакции артериальных сосудов на лазерное облучение // Бюлл. эксп. биол. и мед.

2008. Т. 145. № 6. С. 699-703.

6. Коцюба А.Е., Черток В.М., Коцюба Е.П., Бабич Е.В. Особенности цитохимии тучных клеток в некоторых органах крысы // Цитология. 2008. Т. 50, № 12. С. 1023-1029.

7. Черток В.М., Коцюба А.Е., Беспалова Е.В. Реакция микрососудов некоторых органов на лазерное излучение // Морфология. 2008. Т. 133, №2. С. 150-151.

8. Черток В.М., Коцюба А.Е., Бабич Е.В. Эфферентная иннервация артерий мягкой оболочки мозга человека при артериальной гипертензии // Морфология. 2009. Т. 135, № 3. С. 35^11.

9. Черток В.М., Коцюба А.Е., Бабич Е.В. Ультраструктура внутренней оболочки артерий мягкой мозговой оболочки человека при артериальной гипертензии // Морфология. 2009. Т. 135, № 5. С. 50-54.

10. Коцюба А.Е., Бабич Е.В., Черток В.М. Вазомоторная иннервация мягкой оболочки головного мозга человека при артериальной гипертензии // Журнал неврол. и психиатр. 2009. Т. 109, № 9. С. 56-62.

11. Черток В.М., Коцюба А.Е., Бабич Е.В. Нитроксидергические нейроны в некоторых ядрах продолговатого мозга человека и крысы // Цитология.

2009. Т. 51, №7. С. 612-616.

12. Черток В.М., Коцюба А.Е. NO-позитивные нейроны в ядрах бульбарного вазомоторного центра человека при артериальной гипертензии // Бюлл. эксп. биол. и мед. 2009. Т. 147, № 5. с. 571-575.

13. Коцюба А.Е. Активность NADPH-диафоразы и ацетилхолинэстеразы в рецепторном аппарате артерий мягкой оболочки головного мозга человека и ее изменения при артериальной гипертензии // Дальневост. мед. журн. 2009. №2. С. 99-101.

14. Бабич Е.В., Черток В.М., Коцюба А.Е. Нитроксидергические нейроны в ядрах продолговатого мозга у нормо- и гипертензивных крыс // Бюлл. эксп. биол. и мед. 2009. Т. 147, № 8. С. 157-160.

15. Коцюба А.Е., Черток В.М. Нитроксидсодержащие элементы чувствительной иннервации артерий головного мозга // Тихоокеанский мед. журн. 2009. Т. 36, № 2. С. 69-72.

16. Коцюба А.Е., Кокошина В.В., Черток В.М. Возрастные преобразования нитроксидергических нейронов в ядре солитарного тракта у крыс // Тихоокеанский мед. журн. 2009. Т. 38, № 4. С.76-80.

17. Kotsyuba А.Е., Kotsyuba Е.Р., Chertok V.M. Nitroxidergic nerve fibers of intracerebral vessels // Neuroscience and behavioral physiology. 2010. V. 40, N. 4. P. 451-455.

18. Черток B.M., Коцюба A.E. Оксид азота в механизмах афферентной иннервации артерий головного мозга// Цитология. 2010. № 1. С. 24-29.

19. Коцюба А.Е., Черток В.М., Бабич Е.В. Нитроксидергические нейроны бульбарного вазомоторного центра человека при артериальной гипертензии // Журнал неврол. и психиатр. 2010. № 2. С. 61-65.

20. Черток В.М., Коцюба А.Е. Возрастные особенности вазомоторной регуляции артерий мягкой оболочки мозга у крыс // Бюлл. эксп. биол. и мед. 2010. Т. 148, № 3. С. 340-344.

21. Черток В.М., Коцюба А.Е. Локальные особенности возрастных изменений нитроксидергических нейронов в некоторых ядрах продолговатого мозга крысы // Онтогенез. 2010. Т. 41, № 4. С. 292-299.

22. Черток В.М., Коцюба А.Е. Рецепторный аппарат сосудов головного мозга при артериальной гипертензии // Журнал неврол. и психиатр. 2010. № 10. С. 40^17.

23. Черток В.М., Коцюба А.Е. Пространственная организация серотонинергических и нитроксидергических нейронов в некоторых ядрах бульбарного отдела сердечно-сосудистого центра человека // Тихоокеанский мед. журн. 2010. Т. 42, № 4. С. 43^16.

24. Черток В.М., Коцюба А.Е., Коцюба Е.П. Серотонин- и нитроксидергические нейроны продолговатого мозга у крыс // Морфология. 2011. Т. 139, № 1. С. 32-37.

25. Черток В.М., Коцюба А.Е. Изменения нейронов в ядрах продолговатого мозга при хроническом подавлении активности NO-синтазы // Бюлл. эксп. биол. и мед. 2011. Т. 151, № 1.С. 116-120.

26. Коцюба А.Е. Распределение НАДФН-диафоразы и ферментов синтеза сероводорода в стенке артерий головного мозга // Вестн. новых мед. технол. 2011. №2. С. 255-256.

27.

28.

29.

30.

31.

32.

33.

34.

35,

36,

37,

38

39

40

Коцюба А.Е., Черток В.М., Коцюба Е.П. Сравнительная характеристика серотонинергических нейронов в некоторых ядрах продолговатого мозга крысы человека // Цитология. 2011. Т. 53, № 6. С. 498-504. Черток В.М., Коцюба А.Е. Изменения индуцибильной NO-синтазы в пиальных артериях разного диаметра у гипертензивных крыс // Бюлл. эксп. биол. и мед. 2011. Т. 152, № 8. С. 220-224.

Черток В.М., Коцюба А.Е., Коцюба Е.П. Цистатионин ß-синтаза в структурных элементах головного и спинного мозга человека // Цитология. 2011. Т. 53, № 8. С. 664-669.

Старцева М.С., Коцюба А.Е., Колдаев В.М. Применение методов системного анализа для оценки значимости изменений нитроксидергических нейронов в ядрах продолговатого мозга крыс при экспериментальной гипертензии //Тихоокеанский, мед. журн. 2011. Т. 45, № 3. С. 61-64.

Коцюба А.Е., Черток В.М. Иммуногистохимическое исследование H2S-позитивных нейронов в некоторых структурах мозга человекапри артериальной гипертензии // Журнал неврол. и психиатр. 2012. № 1. С. 54-59.

Черток В.М., Коцюба А.Е. Эндотелиальный (интимальный) механизм регуляции мозговой гемодинамики: трансформация взглядов // Тихоокеанский мед. журн. 2012. Т. 48, № 2. С. 17-26.

Черток В.М., Коцюба А.Е. Иммуноцитохимическая характеристика H2S-позитивных нейронов в ядрах бульбарного отдела сердечно сосудистого центра при развитии вазоренальной гипертензии // Вестн. Росс. акад. мед. наук. 2012. №4. С. 50-54.

Черток В.М., Коцюба А.Е. Особенности распределения ферментов синтеза H2S в стенке церебральных артерий у крыс // Бюлл. эксп. биол. и мед. 2012. №7. С. 116-120.

Черток В.М., Коцюба А.Е. Иммунолокализация цистатионин ß-синтазы и цистатионин у-лиазы в стенке артерий головного мозга у нормо- и гипертензивных крыс // Докл. Акад. наук. 2012. Т. 445, № 5. С. 602-605. Черток В.М., Коцюба А.Е., Коцюба Е.П. Гемоксигеназа-2 в нейронах головного и спинного мозга человека // Вестн. Росс. акад. мед. наук. 1012. №6. С. 36-41.

Черток В.М., Старцева М.С., Коцюба А.Е. Применения «пиксельного метода» в количественной оценке результатов гистохимических исследований // Морфология. 2012. Т.142, № 5. С. 71—75. Коцюба А.Е., Черток В.М. Иммунолокализация цистатионин ß-синтазы в ядрах моста головного мозга человека // Бюлл. эксп. биол. и мед. 2013. Т. 155, №2. С. 247-250.

Черток В.М., Коцюба А.Е. Иммунолокализация гемоксигеназы-2 в нейронах сосудодвигательного центра человека при артериальной гипертензии // Журнал неврол. и психиатр. 2013. № 2. С. 44-48. Chertok V.M., Kotsyuba А.Е. H2S-positive neurons in some nuclei of the cardiovascular centers of the rat brain // Neuroscience and behavioral physiology. 2013. V. 43. N. 2. P. 139-143.

41. Черток В.М., Коцюба А.Е. Новые нейротрансмитгеры и их роль в центральных механизмах регуляции кровообращения // Тихоокеанский мед. журн. 2013. Т. 54, № 4. С. 27-36.

42. Коцюба А.Е., Черток В.М. Гистофизиологическая и иммуногистохимическая локализация холинацетилтрансфераз в ядрах продолговатого мозга крыс // Цитология. 2013. Т.55, № 11. С. 821-827.

43. Kotsyuba А.Е., Chertok V.M. Distribution of Heme Oxygenase-2 in the Brainstem Nuclei of Rats // Neuroscience andT behavioral physiology. 2013. V. 43. №.8. P. 979-983.

44. Черток B.M., Коцюба А.Е. Распределения NADPH-диафоразы и нейронапьной NO-синтазы в ядрах продолговатого мозга крысы // Морфология. 2013. Т. 144, № 6. С. 9-14.

Работы, опубликованные в научных журналах, сборниках трудов и материалах конференций:

45. Коцюба А.Е. NO-синтаза сосудов мягкой оболочки головного мозга человека при артериальной гипертензии / А.Е. Коцюба, Е.В. Бабич, Е.В. Беспалова // Материалы докладов IX Конгресса Междун. асс. морфологов (14-17 мая 2008). Бухара, Республика Узбекистан / Морфология. 2008. Т. 134, № 5. С. 76.

46. Коцюба А.Е. Иннервация интрамедуллярных сосудов продолговатого мозга при артериальной гипертензии / А.Е. Коцюба // Фундаментальные и прикладные аспекты медико-биологических исследований : Мат. юбил. конф., поев. 25-летию НИИ MKBJI 14-16 октября 2009 г. в г. Владивостоке / Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2009. Т. 39-40, № 4-5. С. 83-85.

47. Коцюба А.Е. Нитроксидергическая иннервация сосудов мозга / А.Е. Коцюба // X Конгресс междунар. ассоциации морфологов (29-30.09.2010). Ярославль / Морфология. 2010. Т. 137, № 4. С. 102.

48. Коцюба А.Е. Топохимия NO-синтазы в некоторых ядрах продолговатого мозга крысы / А.Е. Коцюба // Однораловские морфологические чтения / Журнал теор. и практич. мед. 2010. Т.8. С. 135-137.

49. Черток В.М. Газообразные посредники в регуляции функций сосудов микроциркуляторного русла / В.М. Черток, А.Е. Коцюба, М.С. Старцева // Микроциркуляция в клинической практике: IV всеросс. науч. конф. с междунар. участием (19-20 апреля 2012). Москва / Ангиол. и сосуд, хирургия. 2012. Т. 18. С. 58-59.

50. Коцюба А.Е. Изменения норадреналинергических нейронов ядер продолговатого мозга при развитии экспериментальной реноваскулярной гипертензии / А.Е. Коцюба, А.В. Ларюшкина, Л.Н. Кацук и др. // Сб. науч. трудов Междунар. заоч. научно-практич. конф. «Наука и образование в XXI веке» (30 сентября 2013). Россия, Тамбов. 2013. Т.7. С. 86-87.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГ — артериальная гипертензия; АД - артериальное давление;

БОСЦ - бульбарный отдел сосудо-двигательного центра; ДЯ - двойное ядро;

ДЯБН - дорсальное ядро блуждающего нерва; МОГМ - мягкая оболочка головного мозга;

НАДФН-диафораза-никотинамиддинуклеотид-фосфат — диафораза;

НА - норадреналин;

РВГ — реноваскулярная гипертензия;

РГЯ - ретикулярное гигантоклеточное ядро;

РКЯМ - ретикулярное каудальное ядро моста;

РЛЯ — ретикулярное латеральное ядро;

РМЯ - ретикулярное мелкоклеточное ядро;

РОЯМ - ретикулярное оральное ядро моста;

РПГЯ - ретикулярное парагигантоклеточное ядро;

С Н - серотонин;

СПМЯ - спинномозговое ядро тройничного нерва;

СПОП - средний показатель оптической плотности;

ХАТ - холинацетилтрансфераза;

цАМФ — циклический аденозинмонофосфат;

цГМФ - циклический гуанозинмонофосфат;

ЯЛН - ядро лицевого нерва;

ЯПН - ядро подъязычного нерва;

ЯСТ - ядро солитарного тракта;

Allegro-MC - автоматизированная система анализа изображений (АСАИ);

EDHF - единая функциональная система;

eNOS - эндотелиальная нитрооксидсинтаза;

CBS - цистатионин ß-синтаза;

СО - углекислый газ (монооксид углерода);

CSE - цистатионин у-лиаза;

H2S - сероводород;

НО - гемоксигеназа;

iNOS - индуцибильная нитрооксидсинтаза;

NADPH-d — никотинамидаденин-динуклеотидфосфат-диафораза;

N0 - оксид азота;

nNOS - нейрональная нитрооксидсинтаза; L-NAME - метиловый эфир№-нитро-Ь-аргинина.

КОЦЮБА

Александр Евгеньевич

ГИСТОФИЗИОЛОГИЯ ГАЗОТРАНСМИТТЕРНЫХ СИСТЕМ НЕРВНО-СОСУДИСТЫХ ОБРАЗОВАНИЙ МОЗГА

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Подписано в печать 16.06.2014 г. Формат 60.90/16. Усл. печ. л. 2,0. Тираж 100 экз. Заказ 46. Отпечатано на участке оперативной полиграфии типографии «Рея» 690075, г. Владивосток, Адм. Юмашева, 426