Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гидродинамические свойства ДНК-содержащих модельных систем генетического аппарата эукариот в радиобиологическом анализе

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Гидродинамические свойства ДНК-содержащих модельных систем генетического аппарата эукариот в радиобиологическом анализе"

^ ^ о Г1

МОСКОВОШ'ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. М.В.ЛОМОНОСОВА

На правах рукописи

РАДЬКО Сергей Павлович

гидродандмиЧЕСКИЕ СВОЙС^ЗА ДНК-СОДЕРЗЩИХ МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМ ГЕНЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА ЭУКАРИОТ В РАДИОБИОЛОГИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ

03.00.01 - радиобиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1990

Работа 'Выполнен? в Московском ордена Трудового Красного Знамени инхенерно-физическом институте.

Научные руководители - к.б.н. В.Д.Дапонов

к.ф.-м.н. В.Н.Лыоцое

Социальные оппоненты - д.б.н., проф. Н.И.Рябченко

к.б.н., доцент И.М.Пархоменко

Ведущая организация - Институт биофизики АН СССР

Защита состоится " # " А^чх^Ц 1990 г. в /Г час Ъо ш •на заседании Специализированного ученого совета Д.053.05.74 при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Ленинские горы, Биологичес-киГ факультет МГУ.

С диссертацией можно ознакомился в библиотеке 1МГУ им. М.Б.Ломоносова.

Автореферат разослал

Ученый секретарь ' ^

Специализированного совета докт. биол. наук

¿У^

О.Р.Кольс

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш: Гидродинамические методы, в перлита очередь сэдиментационнне к реологические, являются классическими физическими методами исследования дисперсных систем и ж.астворов полиморов и шроко применяются в различных разделах биологии, в том число для анализа ДНК-содержащих модельных систем генетического аппарата клеток эуариот (под этик здесь и далее будут подразумеваться растворы ДКК, препарата выделенного хроматина, клеточные "изаты и продукты г.ыгкого лизис i клеток - пуклеоиды). Знание гидродинамических характеристик позволяет в ряде случаев определять размеры и хонформашао макромолекул ДШ в составе ДНК-содер"-с.эг;«х систем, взаимоотношения их с другим компонентами генетического аппарата, а также их изменения при воздействии различных повг^дцаидих аге.ч-тов, к числу которых относятся и ионмзируьцие излучения.

Наиболее пирокое распространенно получило определение седи-мзнташонных характеристик, что связано с возможностью использования в этих целях препаративных ультршектрифуг и напчием пелуом-пирических зависимостей между константой седиментации и• молекулярной массой линейно;'. ДНК. Сд.чакс а случае сис! м, содержащих внсс • кополнмерпне молекулы ДНК (I0^+I0J Дальточ), наблюдается суцествзн-ная зависимость константы седиментации от скорости зрацения ротора, приводящая к аномальному седпи-.чгационному поведению и возмоя-ности артефактных результатов в определении молекулярных масс (Ormerod M.G. , Lehnann А.Я., 1971 ¡ McBurney 1Í.W. et al., 1971 ). В связи с этим,при седиментанионном анализе висскопо-гамсрной одно-тяжевой ДНК в щелочных сахарозных градиент ах, в частности, при количественном определении радиациошо-и'щуцировздннх разрывов, возникают определенные трудности из-за гидролиза фосфодиофирных связей и деградации ДНК, происходящей с малой скоростью в области щелочных pH (Hin v/.E., Palman W-L., 1973 ). поскольку умен-дение скорости седиментации сопровождается квадратичным увеличением продолжительности центрифугирования. Несмотря на то, что эта проблема давно известна, она не получила своего должного решения, которое мо' 7'о сформулировать кг : опенку допустимой скорости вращения ротора при требовании гяшимизучозать время центрифугирования в условиях конкретного радиобиологического эксперта' нта.

Наряду с изучение;.", поведения лжеГшнх молекул с середины 60-х

годов исследовались гидродинамические характералиси качественно отличных по топодогическг 'у состоянию молекул ДНК - кольцевых ко-валентнс-зсмкнутих 'юрм (vinograd J. et al., 1965; J.C. et „l., 1967 ), ';то пр/вело к ; ¿-зникноьенкю представления о наличии торсионного маяряжьиия п иатимиас кольце шх молекула., Д!:ЛС, прИЕО-дядего " их сверхспарвлизаши. Пргмзнекие развитых на этих системах экспериментальных подходов позволило установить, что ДНК клеток ^укариот также находится в топологическом состоянии, инвариантном к структурным пре<. Зразованиям, происходящим бе:! разрывов полинуклеотвднпх чеиеи к определяется в клетках komtioi энташ ядерного матрикса, форм- _уюцш.а-: суперспирализованные петлеобразные домены из ДНК Геногла (Coole P.R., Brazell I.A., 1975; 1976 ).

Такие шмдетавления oö организации ДНК клеток эукариот пу.Г"-ли к возникновению 1;обых аспектов в проблеме клеточного ответа на радиационное воздействие (^ябченко Н.'Л., Иванннк Б.П., ISÖ6; Сгг пр "i.A.-, 1987 ) и . вопросах, касающихся анализа радлаиионнк/. повреждений на ypoF-e моле кули ДНК. Интерпретация изменений v.^.jo-динашгаеского поведения ДтК-содерчаапх систе:. (клеточных лизат^в, нуклео'чюв) при воздействии ионизчрувцнх излученп;! к;-к на эти системы, так и на клетки, долада учитывать возможность наличия качественно разлг-ных по своему от шику на радиационные поврежден;:.? молекулярных гашений - сулерсгшрализованкых петлеобразных доме;ов и линепних молекул.

Основная трудаость анализа состоит в ыногокожонентности таких систем как нуклеоннд и сложном характере их организации, неизвестно, в частности, какова зависимость глежду гидродннампчэски:/.! характеристиками «чуклеовда и числ л релаксированшк доме нор и как влияет релаксация каадого последующего до?.;ена (¡а вязкость пли скорость седиментации. В связи с этим щюдставляет интерес поиск г.:о-дельшас систем, отражающих особенности структурного состояния ДНК в клеточном ядре, но более простых по комтонентному составу и ор-гйшэшцш, что может облегчить количественную интерпретацию ответ на радиационное воздействие на уровне суперсппратьных петлеобразных доменов ДНК.

Упомянутые зше подходы к исследованию ДгГК-содержадкх систем основываются на равновесиях, то есть не ??яня?х;пхся в течение вре-г.й.чп измерения, ижредияэтнических характеристиках. Другим подходе к изучению модельных /ил-соде ржагих систем генетического аппарате

клеток является исследование ^разновесного поведения талей гидродинамической характеристики к;л< вязкость, это я" Tieч;:е свойственно широкому классу ос?ъпктов: б :оо.<омолгку.7ярно:: ipirono.i Дг!л ( "яазл D.J., 1973 ), неГ.тральним (Лысцов Б.Н. к согвт., IPÖÖ) и 'ipjro'ü.w.i (Uhlenhopp e.l., 1975 ) лизатам бактег тгчьни - клеток, диамроиям д» зокс/рлбонуклеошотегоа из эукяр/отичесу.нх клч'ток (Яготонов 2.Д., 1272; Крючков З.П., 1982). С''о>сненнг тажо.о поведения у разных авторов различны "'--чина этого может состоять либо в 1гр/пципиаль-ком отличии указан шх ДКК-содоржадих систем, либо ., недостаточной изучености пространственной организации этих систем в сильных сдвиговых нолях. Неравновесные свойства наиболее есно свя:,<анк с функциональной динамичностью структурной организации J0-1K в геноме и чувствительность этих свойств к различным воздействиям сравнима с чувствительностью живой клетки (Кркг :ов В.П., IS82). Поэтому изучение механизмов, лежащих в основе неравновесного поведения и его изменения при радиационном воздействии,представляв? песо; энный интерес.

Цепь и задачи исследования. Целью данной рлботч являлось 'изучение особенностей гидродинамического поведение високонолимерпой однотяжезоЯ линейно!'; JuiK в сильных центробежных полях к кольцеобразной суверсшгрп-.. оь лно;1 ДНК в сдвиговых полях в составе ¿jffl-содержл^их модельных систем генетического аппарата эукириот и .х учет при радиобиологическом анализе.

3 ходе рабоии решались' следувдяе задачи: I. Получить соотношение медцу среднечисленнсй .молекулярной массой полкдисперсной од~ нотяжевол ¿ЛК и допустимой скоростью пентрифупфовалия, не искака~ гаэдй существенно нроЛилъ седг?ме.чтацкк, и пропусти аЧ'.лиз зытзкак-'•;:ос из него следствий. 2. С учетом полученных результатов провести количественный анализ индуглии и репарации однотяжевнх разрывов дКК в облученных клетках костного мозга 3. Изу/гь на препа-

ратах выделенного хроматина тимуса теленка их возможности кек мо-дельноЛ систеш, отражая:»!! гообеьности петс "Ы'о-доавшюй организации ядерной ¿¡К, и ее использование для целей радиобиологнчесгах исследований. 4. Г~оаналкзировать неравновесные свойства дисперсий вселенного хроматина и их изменения при радиационном воздействии с, учетом суиерспирализованкого петлеобразного состояния его фибрилл .

Научная новизна. 3 данной работе впервые проанализирована на основании теории аномальной седиментации Цимма оавлсимость такого

параметра как среднечисленный молекулярный вес полкдисперсного образца одаотдаю вой ДНК от скорости центрифугирования. Впервые показано сохранение в выделенном хроматине организации ДНК в виде су-персгсфаглзова.дых кольцеобразных доменов и определяющая роль та. кой организации в явлении структурной гетерогенности препаратов хроматина к их способности к неравновесному течению в сде говых по„.лх. Проанализированы дозовые зависимости вязкости препаратов хроматина с привлечением представления о ядерном матриксе как ра. .иочувстьительной структуре.

Г тактическая ткность работы. Предложенный алгоритм, позволяющий связать среднечисленную молекулярную массу однотяжевой ДКК со скоростью вращения ротора может быть использован для оценки допустимой скорос; : центрифугирования в условиях конкретного седимзнта-тюуюгс ачализа. Развитый и апробированный на ¡тетках костного мозга крнс метод седжг чташонного анализа выхода повреждений ДНК при радиационном воздействии, исключают!!! использование предварительного радиоактивного мечекия ДНгС,может с успехом применяться в радиобиологических исследованиях на неделяндахся или .медленно про-лиферирукцих клетках. Показанное наличие в препаратах хроматина ко зцес1 разной суперспирализованной ДКК дает возможность использовать уту классическую модельную систему в новом качестве - для изучения структурно-функциональной организации хроматина на уровне топологии ДНК в широком спектре мояехулярлобиологических и радиобиологических исследований. Предложенный оригинальный способ фр щионирования препаратов хроматина в сдвиговых полях может быть использован для получения новых результатов в различных исследованиях, касающиеся структуры и функций хроматина.

Апробация работы. Результаты р гботы были доложены и обсузухепн на IX Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Черноголовка, 1387), 32-й Научной конференции ШУЛ (Москва, 1987\ У1 Всесоюзном совещании по ыикродоэпм-зтрии (Канев, 1262), I Всесоюзном радиобиологическом съезде (¡.!ос;<ва, 1532).

Публикации. По теме диссертации опубликовано В печатных работ и получено авторское свидетельство на изобретение.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов нсследова-' ния, результатов собственных исследований и их обсуждешш, заключения, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 151

странице машинописи (из них 9S страниц текста), содержит б таблиц и 28 рисунков. Список литературы содержи 231 работу, в том числе 67 на русском языке.

МАТЕРИАЛЫ Я ШОШ YiCQJJÍPMim

Суспензию клеток костного мозга получали путем мягкого гомогенизирования в охлажденной до 0°С растворе Хенкса пуютота кост-. how чговоц ткани из бедра и голени задних конечностей белиг беспородных крыс массой не более 200 г. Суспензию фильтровали через слой капрона. Жк неспособность, оцениваемая по тесту иокгсоченкя трипанового синего, составляла не менее д0% i* почти не изменилась по крайдзй мере з течение 6 часов как в случае ..лтактннх клеток., так и облученных в дозах до 100 Гр. Ллеис меток осуществляли в среде, содержащей 0,5 И ИаОН, 1% лаурклсаркор^на, 0,5% Лд-доде-шлсульфата и 0,3 1.1 ^ЭДГА с инкубацией при 25°С в течение 24 часов. Лизаты подвергали нормирующее облучению и наносил:« на поверхность caxapoDJii;/ '''рздпентов с помощью шприца с винтовой .лик-роподачей поршня. Количество клеток на грздкер™ не пре нимало 0,25 млн.

Препараты хроматина полыхали из тк~чк тимуса теленка "о ш-тоду Зьнби и Доти (2иЪау G., Doty Р., 1959 ) о пебольашг модификациями и без этапа перевода в условия низкой ионной силы. Получаете в виде суспензии дезокснрибспуклзшювого комплекса в и, 15 MuaCI + 0,7 м'Л На-фооЪатпнй булер (ф.б.), рН 7 препараты -ооло определения в них концентрата ДНК разводили до необходимой консистенции и использовали для запланированных сксперчг.ен.ов. В качестве депротеинизируицих условий использовались: I 1.1 NaCI + 0,1 М Na23J¡TA + I til Три с + С,5% Тритон I-IC0, рН 8; 0,i5 И ffaCI + + 0,7 lid ф.б.+ I/a ыа-додоцнлсу.тъфаг, рН 7; 0,15 И UaC.[ + С,7 tó.I ф.б., рН 7 + гепария в вессвод: соох'лои'ешш гепарин/ДНК разном 2C0/I. Доля РКК по отношению к ДНК при получении лр ларатов хроматина тииуса теленка вышеуказанным способом составляет те не о 1% (Папонов В.Д. и соавт., 197^). Отношение белок/ДНК ъ препаратах, использовавшихся в данной работе, лежало з пределах 1,2+1,4.

ДКК ввделял: из препаратов хроматина комбинированным хлоро-формно-детергеятныгл четодом, основанном на приемах: двпротеиниза-ции описанных Key et al., (1952) и our -(1961) , с иесущеотЕэн-

ныш модификациями. Использованный в реботе препарат ДНК имзл коэффициент удельной экстинкции в 0,15 M NaCI (E^q) равный 200 и "олннй гиперсрЬшш! эффект (отношение удельной экстишщии гидро-лизата к E^gQ) 1,4 . Отношение белок/ДНК было менее 0,01- а молекулярной вас составлял 1,7-Ю7 Да.

Концентрацию ДНК в препаратах хроматина и ДНК определяли по методу Старина (Опарин A.C., 1958), содержание белна - согласно методу Доури ( lowry О.H et al., 195t).

Седименгационные исследования проводили в роторе sw2?.1 на центрифуге Spinco LP-70 при 18°С. Изокинетический градиент сахарозы 10-30^ содержал 0,1 Л Nñ0H, ü,8 M líaOI, 5 мМ на2ЭДТА. Седа-ментоградаи регистрировали по поглощению на 254 нм при непрерывном пропускании со дна содержимого центрифужных стаканов через проточпо кювету увикорда j помоцыо перистальтического насоса. Профили седиментации прописывались на потэнциометричепком самописце с регулируемой чувствительностью, которая составляла 0,1 единица поглощения на полную шкалу самописце относительно 10$ сахарозы. Градиент был калиброван по методу Мартина-Эймса ( Martin .R.G., Asses в.H., 1961 ). Определяемый из калибровки параметр К(х позволяет няходигь молекулярный вес 1-й фракции:

Mi=[K(x1)/oj2bt]1/a, где Хд - расстояние от старта до i-й фракции, а значения а и Ъ для иг юльзовавишхся гоадиентов составляет соответственно 0,4 и 0,0528 < studier F.iy., 1965). Средне весовую молекулярную массу определяли по формуле :

где Cjl - концентрация вещества в i-й фракции о учетом сорбции се даментирувдего материала на стенках центрифужной пробирки (Abelsott J., ïhoaaa С.А., 1966).

Для определения вязкости растворов препаратов хроматина и ДНК был использован ротационный вискозиметр, в основу конструкт которого положен вариант вискозиметра Цимма-Крозерса ( zinm в.н, Crothers Ь., 1962 ), Точность измерения относительной вязкости составляла -0,"$. Все измерения проводились при 25°С. Вискозиме' рическое титрование препаратов хроматина интеркалятором осущест ,-ляли путем добавления к пробе одной тысячной по объему доли вод

ного раствора бромида этвдия ( stBr) определенной концентрации. Пробу помещали в рабочую ячейку вискозиметра и после Ю-минуткой инкубации определяли вязкость. Кривые вискозшл.;рического титрования и дозовые зависимости вязкости сняты я области ньютоновского течения исключением экспериментов, * ъсаюцихся неравновесного поведения вязкостных характеристик).

Облучение клеток костного мозга крно проводили на установке РУМ-7 рентгеновским излучением в режиме: ток - 20 мА, напрягекш 40 кВ, с алюминиевым фильтром толад/.ой 0,47 мм. Мощность дозы составляла 10,2 ]>/шн. Во время облучения шгстки находились в стеклянной кювете на ледяной бане при 0°С, толщина слоя суспензии над дном ответы была 1,5-2 т. Препараты хроматина и ДИК облучали на гамма-установке Института общзй генетики АН СССР излучением ®Со о мощностью дозы 0,455 Рр/мин.

Ультразвуковая деградация препаратов хроматина и ДНК проводилась на ультразвуковом дезинтеграторе фирмы use (Англия). При использованных режимах озвучивания происходила лишь деполимеризация ДНК, изменений во вторичной структуре не выявлялось.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ^СЛЩЕНИЕ

I. Седиментациониоз поведение ДНС щелочных лиэатов клеток костиото мозга стно

Как уже отмечалось выше, коэффициент седиментации ( S) линейных высокополимерньис молекул ДНК надает с увеличением скорости центрифугирования, что связано с деформацией макромолекулярно-го клубка при движении через вязкую среду, приводящей к увеличению его коэффициента трения;и реализуется з искажена седимекта-шоняого профиля ДНК. Это явление наблюдалось и при седамзнтаци-онном исследовании вксокополимерной ДНК щелочных лизатов ллеток костного мозга крыс (Тронов Б.А. и соавт., 1983). Длрт оценки этого явления нами была использована теоретическая зависимость, предложенная: ранее Цяммом ( Ziam В.Н,, SchumsJcer Т.К., 1976) и связывающая константу седиментации полимера с его молекулярным весом, скоростью вращения ротора, расстоянием от центра вращения, характеристиками среды и рядом других параш тров. Проведенный нами анализ показал, что влиянием расстояния от центра вращения, по

крайней марс в случае изсг"ткетических сахарозных градиентов, можно примебрачь. Если считать, что имеется набор макромолекул со с /чайным распределением молекулярных весов, то можно рассчитать их распределение по константам седиментации в зависим эти от скорости в; здания ротора. Проведенное моделирование на компьютере показало хорошее соответствие кевду рассчетными и получаемыми нами экспериментальными седнкентограмыами, что позволило для учета влияния фактора скорости : ^пользовать полученные соогног -н :я, за-давшсь максима®-о допустимым отклонением истинного мол.екулярно-„ го веса от "кажущегос- :", то есть получаемого из обсчета седимен-тограмм. На практике в случае полидисперсных образцов обычно оперируют среднечислекной молекулярной массой. Однако связь между ней и скоростью центрифугирования но выражается аналитически. Для • получеш... такой зависимости в грарической форме проводилось вы-чисзние "кажущейся" с_ э дне числен. й молекулярной массы, задаваясь значениями истиг 'ого среднечисленного молекулярного веса по-лидкешрсного образна ДНК и набор.);.- значений скорости центрифугирования Допустимое отклонение принималось равным 20%. Расчет " цроводился ь соответствии с выражением:

s1/a.s1-Q/a з1/0- 1 w(s)= -2--ехр(--)--г- ,

a.K1+Q/*.K2 к1/а.ы ds/as

П по

S=SoC1 .j0-u>4(s0/k)4-2^] -1/4 ,

где WCS > - плотность распределения макромолекул по константам седиментации S, "п - средне числе" ный молекулярный вес (Да), so-константа седиментации макромолекулы, кг^да скорость врэдения ротора -со (об/мил) стремится к нулю, а=0,4, К=0,0528, q = =1,24» 10"^.

Полученная зависимость представлена на кривой 2 номограммы (рис.1). Видно, что если для образца со среднечиеленной "молекулярной массой, яапример, З'Ю® Да скорость вращения ротора будет больше, чем II тне.об/мин, то ошибка в .определении молекулярной-массы из-за зффекта скорости будет более 20%. Влияние фактора скорости на результаты при еедиментадионном анализе полидисперсного образца однотяжеззой ДНК со случайным распределением длин молекул более существенно, чем' в случае монодисперсного образца

ю-

10'

ß

с

О 8

Б

с молекулярной массой, равной среднечисленной молекулярной массе полвдисперсного. Это следует из сопоставления кривой 2 с кривой I (рисЛ), соответствующей монодисперсному образцу и принятому допустимому отклонению не долее Ограничения на спорость во втором случае более жесткие даже при более слабом требовании к точности.

тр Рис.1. Нсмогрвмла, связывающая

Ю 1,1 И И молекулярную массу и скорость

вращения ротора для случая седиментации одлотяжевой ДНК в роторе 3\727.1 в градпнте 10-30/1 сахарозы. I - монодиспевсная ДНК, 2 - полидисперсная ДКК со случайным распределением по молекулярным весам. Но оси абсцисс - ско-' рость центрифугирования, об/глш; по оси ординат - молекулярная масса, Да.

24vt0~3

Если считать, что кривая 2 задает критическое значение скорости центрифугирования, ниже которого скоростной зависимостью коэффициента седиментации можно принебречь, то несложно получить связь между временем достижения максимумом седиментограммы сер едины градиента, скоростью вращения ротора и среднечислеиной молекулярной массой образца ДНК. Она задается для рассмотренного нами случая выражением:

t=2,76-10U/CJ2M°'4,

где t в минутах, в Дальтонах, о) в об/мин.

Из представленной номограммы видно, что для образца с молекулярной массой 7-I08 Да максимально допустимая скорость врадения ротора равна 6 тыс. об/мин. Оценка длительности центрифугирования в этом случае дает 37 часов. Ясно, что для однотяжэвой ДНК такого размера столь длительное преосшание в щелочной среде не может быть безразличным из-за гидролиза фосфоафирных связей. Исходя из приводимой Хиллом И Фэгмэном (Hill W.E., Fagraan W.L., 1973 ) скорости гидролиза, можно оценить количество однотяжевых разрывов, возникших за время центрифугирования в градиенте, содержащем ОД М ;е~

лочи. Оно составит свыше 6 разривов на исходную молекулу. Ясно, что такое изменение размэ}а макромолекулы и, следовательно, константы седиментации 5 процессе центрифугирования будет вносить собственное искажение в получаемые результаты, причем учесть его весьма слохно. С другой стороны, для средаечисленной молекулярной массы 1,3*10® Да имеем 16,5 тыс. об/мин, откуда время центрифугирования - 3,3 часа. Для количества разрывов, возникших в исходной макро--олекулв в процессе центрифугирования, получаем величину 0,12. Очевглио, что влиянии такой деградации можно пренебречь.

Ие приведенн ?о рассмотрения влиялия фактора скорости на се-'димеитацкю однотяжевс.. ДНК можно заключить, что достигаемая тем или иным лугом контролируемая деполимеризация (например, благодаря использованию нормирующего облучения лизатов клеток перед центрифугированием) позглляет, не входя-в область аномальной седиментации, сократить время центрифугирования до приемлемых значений; когда спонтанной деградацией можно пренебречь, ¿тот результат был положен в ос..ову седидадтационных исследований индукции и репарации однотяжевых разрывов ДНК в клетках такого критического для развития лучевой патологии органа как костный мозг.

•В качестве модели для изучения индукции и репарации разрывов ДНК в тотальн й популяции клеток костного мозга были выбраны клетки костного мозга крьгс, находящееся в условиях "т витро" в суспензии. Это позволило исключить как влияние репарации разрывов в процессе облучения и изъятия органа из облученного животного, так и изменений в клеточном составе костного мозга, происходящих в ответ на радиационное воздействие на организм.

Клеточные лизаты подвергали деполимеризации облучением в доза 15 Гр, которая являлась оптимальной дда наших условий седимон-танионного анализа. При этом аномальный характер седиментации исчезал и получаемые седиментограммы можно было интерпретировать в терминах молекулярных масс ДНК, а скорость вращения ротора была таковой, что время центрифугирования составляло от 2-х до 4-х часов. Определение зависимости величины, обратно,! среднечисленнои молекулярной тесе, от дозы облучения лизатов клеток позволило рассчитать величину Ер - энергии, приходящейся на образование од ного. одяотяжевого разрыва в I грамш облученной ДНК. Она состави ла в нашем случав 20 эВ/разрыв. Знание Ер при облучении лизатов прзволяет, воспользовавшись выражением для ее г-'гчисления, ввести

поправку'на радиационную деполимеризацию. Эта коррекция осуществлялась по формуле:

М°=(~ _ 1,03б'10~®-—— - 7,93-ю-9)-1,

а \ бр \

в которой Ып - молекулярная масса ДНК, найденная в эксперименте после нормирующего облучения лизатов, R - доза облучения ли-заточ в Гр, а - "скорректированная" молекулярная масса ДНК, соответствующая ее значению в облученной или необдуманной клетке после лизиса.

Зависимость величины, обратной м° от дозы облучения клеток костного мозга крыс (КМК), имела линейный хаг актер и ее наклон дал для энергии на образование однотяжевого разрыва (ОР) величину (55^) эВ/разрыв. Здесь под однотяжввьют разрывами подразумеваются тестируемые данным методов, т.е. сутша истинных разрывов тяжей ДНК и щелочелабильннх сайтов. Таким образом, по этому параметру радиочувствительность тотальной популяции клеток К...К в условиях in vitro не отличается существенно от радиочувствительности других клеток млекопитавдих, для которых. энергия выхода ОР при облучении в суспензии при 0°С по сводке литературных драных, приводимых Н.И.Рябченко (Рябченко К.11., 1979), лекит в диапазоне от 30 до 60 аВ. Возмогло, такой разброс является отражением каких-либо различий исследованных видов клеток. Но нельзя исключить, что он является следствием также и методических артефактов в том числе и следствием влияния скорости центрифугирования, т.к. большинство таких исследований основано на седиментационном анализе.

Пострадиационная инкубация для исследования динамики репарации разрывов ДНК проводилась в среде 199 при- 25°С, i.k. в процессе инкубации при 37°С число нежизнеспособных клеток в этих условиях даже в суспензии интактных клеток заметно возрастало. К 3-м часам инкубации происходила репарация около 60-70$ Г" и дальнейшая инкубация не изменяла объема репарации, а доля нерепаряровак-ных дефектов сохранялась при^тезительно постоянной в диапазоне доз 20-100 Гр.

Для объяснения столь высокого уровня кедорепарации можно предположить, что в популяции клеток КМК наряду с репарацией происходит эндонуклеазиая деградация ДНК ч погибающих клетках, которая вносит свой вклад, привод.; к эффекту недорепарации. Но в этом случае доля нерепарированных дефектов должна нарастать с дозой

облучения и временем инкубации как следствие увеличения количества гибнущих клеток Однако подобного не наблюдается. Кроме того, ./го противоречит тому факту, что жизнеспособность клеток не изменялась после облучения и в процессе инкубации в исследованном диапазоне доз. Другой возможностью является образование в процессе репарации таких трудно репарируемых дефектов как двутяжевые разрывы (ДР) в результате суперпозиции эксцхзионных брешей в комплементарных тяжах {Бретер С.Е., Коскнн Д.А., 1976). Однако это также долото приводить к росту доли нерепарируемцх ОР с увеличением -доз ы облучения

Более логично связать ограниченную репарацию клеток КАК в условиях in vitro с наличием в костномозговой популяции клеток, изначально различающиеся по степени дкфференцированности. Известно, чте по мере созревания и диф]реренцкроЕки репарация замедляется (Murray В., Heyn R.E., 1?87 ), а в некоторых типах высокодиф-ференцкрованных клеток она может вообще отсутствовать (Karran Р., Ormerod U.G., 1973 ). Если предположить, что подобное явление имеет место и для клеток КМК в выбранных условиях пострадиационной инкубации, то можно представить их как смесь субпопуляций с полностью репарирущиш разрывы ДНК клетками и клетками, репарация в . которых сильно подавлена. Тогда при каздой дозе облучения, не изменяющей их соотношения в тотальной популяции будет наблюдаться постоянная доля нерепарированных разрывов.

2. Препараты хроматика как модельная система для изучения топологии ядецной ДНК

Препараты выделенного хроматина тимуса теленка являются клас-■сической модельной системой для изучения организации и функционирования генома эукариот. Однако как модельная система для изучения суперспкрализованяого состояния ДНК генома эукариот они не раосматривались, т.к. априори предполагалось разрушение этого уровня организации ядерной ДНК в процессе механического диспергирования при ввделеши препаратов.

Возможность наличия кольцеобразной суперспирализованной ДНК (кссДНК) в препаратах хроматина была проанализирована наш по критерию феномена экстремальной зависимости вязкости от концентрации интеркалятора (Нечаевский Ю.Б., Стражэвская Н.Б., 1985; Ide Г. et al., 1975; Jones H.L. et al., 1979; Huang С.-И. et al.

1980). На рис.2 представлена зависимость приведенной вязкостт препарата хроматина в I М NаС1 + 0,1 Ы яа^ЭДГА + 0,5% Тритон 1-100 + I мМ Трис, рН 8 от концентрации бромида этидня. В настоящее время общепринято, что экстремальная зависимость гидродл ;ами-ческих характеристик ДНК-содержалдах систем, подобная кривой I на рис.2, свидетельствует о наличии в систем? суперспирализованных кольцевых или кольцеобразных молекул ДНК. Аналогичные экст зма ь-ные зависимости вязкости бшш получены наш и при титровании ин-терхалятором препаратов хроматина в других использованных ь данной работе депротеинизируюцих средах. Наличие двух экстремумов на кривой титрования идтеркалятором может отражать факт существования различных групп доменов, отличающихся, возможно, по исходной степени супзрспирадизации. При ультразвуковой обработке препаратов хроматина наблвдается исчезновение максимумов (кривые 2 и 3),

Рис.2. Зависимость приведенной вязкости препарата хроматина в деггротеинизируидей среде от концентрации Е-ЙЗг. Кривая I - исходный препарат хроматина, I - после обработки ультразвуком в течение I мин, 3 - после обработки ультразвуком в течение 15 мин. Концентрация ДНК в препарате 10 мкг/мл. По оси абсцисс - концентрация Е-ьВг, мкг/мл; по оси ординат - приведенная вязкость, дл/г.

что можно трактовать как линеаризацию кольцеобразной ДНК в препаратах, как и в известном случае озвучивания растворов сугэрспи-ральной кольцевой ДНК (¿опоз 11.1.. е* а1., 1979 ). К устранению максимумов приводило и добавление к деиротеиниэирумдей среде 2-меркаптоэтанола, что говорит о существенной роли белков в поддержании доменов кссДНК в препаратах хроматина.

Следует отметить, что посла перевода в депротеинизирувдие условия препараты хроматина в течение первых нескольких часов проявляли неравновесное поведение, что затрудняло проведение титрования препаратов EtBr. Некоторые препараты демонстрировали кривые, содержащие только один максимум, которые трансформировались в содержащие два по прошествии нескольких часов. Поэтому вискози-метрическое титрование EtBr (а также снятие дозовых зависимостей

вязкости) препаратов хроматина проводилось ч„рез 20-25 часов их инкубации в депротеинизирущих условиях при +4°С.

Тот факт, что в препаратах хроматина при их ввделеяии сохраняется фрагменты кссДЙК, позволил нам по-новому рассмотреть проблему структурной гетерогенности препаратов хроматина, известную уже около тр-'Х десятилетий (Рге<3ег1сч Е., НоизМег е., 1967;

А. ь., л 471 ). Сущестгует много работ по сравнительному анализу растворимой и нерастворимой фракций, получаемых, когда пре^арг '•ы зг оматиня после отмыв я от рибонуклеопротевдов в среде физиологической ионной силы диспергируют в среде низкой или высо-I й ионной силы. Однако проведенные исследования не выявили окончательно природу структурной гетерогенности препаратов хроматина.

Как правило, при работе с препаратами хроматина после их пере .ода в среду с 0,7 М ИаС1 нерастворимую, т.е. обладающую существенно боле^ высокой в этих условиях способностью к гелеобразова-лию фракцию роматкяа удаляют либо центрифугированием, либо длительным диспергированием вращали йся палочкой с последующим удалением здсорбиругчейся на ней части препарата, либо применяют обе процедуры последовательно. Мы использовали кач центрифугирование (Сднк=100 мкг/мл, 20000 в , 30 мин), так и адсорбцию на вращающейся пал чке.. В последнем случае хроматин, находящийся в 0,7 М НаС1 + 0 7 мМ ф.б., рК 7 (Сдак=Ю0 мкг/мл) помещали ;. пробирку (50 га, внутренний диаметр 28 мм), опускали в раствор коаксиально закрепленную стеклянную палочку (диамего 5 мм) и вращали ее электромотором со скоростью 60 об/мин в течение 60-1., мин. Доля адсорбирующаяся части препарата не менялась за указанный период. Анализ в депротеинизирукадах условиях исходного препарата и остающегося поел^ эг'х процедур материала показал, что кадгая из них приводит з устранению экстремального характера зависимости вязкости от концентрации Е-Пг. Это позволяет заключить, что фракция хроматина, проявллвдач гелаобразуицие свойства и адсорбирующаяся на вращающейся палочке ^ 0,7 М КаС1 или удаляемая при осветлении центрифу гивованием, представлена фрагментами кссДНК, а остающаяся фракция - лияеари: давшимися в процессе выделения и существенно дег-^ адированными (последнее очевидно из наблюдавшегося значительног паден: 1 начальной вязкости) молекулами ДНК.

Можно предпедожить, что природа гелеобразувдих и адсорбцион ных свойств ксо£НК одинакова. В пользу этого говорит тот факт.чт

выделенный хроматин совершено че способен адсорбироваться на вра-цагадейся палочке в 0,7 MHaCI в присутствии 5% 2-меркалтоэтанола; С другой стороны, известно, что определящий вкчад в гелеобразую-циз свойства препаратов хроматина дают остаточные кислые белк" и что различи'"? агенты, разрушающие s-s- связи (аналогично 2-меркап-тоэтанолу), приводили к полной потере гелеобраз „ ицих способностей (Daunce A.L., 1971 ). Таким образом, 1.л гелеобразующие, так и рч-сорбвдонньгз свойства нерастворимой фракции хроматина определяются скорее всего поддерживающими организацию кссДНК белками яде] огс матрикса, от утствующими в линеаризованных ^лбрима^

Количество ДНК во фракции, неадсорбирующейся на вращающейся палочке, составляло в конечном итоге в среднем 10-20$ от общего количеств до проведения такого фракционирования. Нельзя исключить наличие фибрилл с ли-эаризованной ДНК во й^акпии адсорбирующегося хроматина, ассоциированных с белками ядерного матрикса. Поэтому количество ДОС в неадсорбирующейся фракции хроматина можно рассматривать Kfx точную или заниженную оценку доли линеаризованной ДНК в препаратах хроматина.

Определенную информацию об особенностях структурной организации кссДНК в препаратах хроматина можно получить из анализа глия-ния длительности механической гомогенизации суспензии хроматина в среде физиологической ионной силы на его вязкость в депротеинизи-рувдих условиях. Из таблицы I видно, что увеличение длительности

Таблица I

Длительность дополнительной гомогенизации, секунды Доля ДНК в неадсорбирующейся фракции, % Приведенная вязкость, дл/г, Сднк=10 мкг/мл сушарнш неадсороирухгтяся хроматин фр-шя хроматина

0 33 176 46

50 42 77 64

100 44 64 51 ,

0 50 100 19 26 20 272 211 204 о4 109 112

гомогенизации повивает долю яеадсорбирунцейся фракции с линеаризованной ДНК и увеличивает вязкость этой фракции в депротеинизирую-цей среде, если превалирует эффект роста вязкости за счет линеаризации кссДНК, но моулт и уменьшать вязкость, если превалирует г»т>-

фект падения вязкости за счет деградации лингризованных молекул. Вязкость суммарного хроматина, напротив, монотонно уменьшается в депрохеинизирукцей среде по мере его гомогенизации, причем даже прл условии возрс '.тания вязкости неадсорбирующейся фракции. Это говорит против наличия в адсорбирующейся фракции существенной доли линеаризованной кссДНК, связанной с белками ядерного магрикса, ч э мс-ло бы приводить к росту вязкости суммарного депротеинизи-рованного хроматина. Падение вязкости суммарного хроматина при гомоген™зацич трудно понять, если допускать, что препараты хроматина содерзкат только индивидуальные домены, так как их деградация д~.гогла приводить к росту вязкости, что видно на не адсорбирующейся фракции хроматина. Однако, оно становится ясным, если предположив, что кссДНК организована в препаратах хроматина за счет "обловов" ядерного матрикса, т.е. сохранившихся при механическом разрушении гтерфазного ядра участков ядерной ламины и/или внутренней фибриллярно-глобулярной сети, к которым крепится набор пе-лель ДНК. В дальнейшем условно будем именовать их "розеткообраз-ндаи частицами". Тогда вязкость суммарного хроматина будет уменьшаться за счет деградации "розеткообразных частиц", а вязкость неадсорбирующейся фракции будет повышаться за счет линеаризации отделычх петель.

Ка рии.З представлены зависимости вязкости препаратов хроматина от дозы гамма-облучения. Препараты облучались в виде суспен-

Рис.З. Зависимость вязкости препаратов хроматина-в депротеинизирую-цих условиях от дозы гамма-облучения. Концентрация ДНК в препарате 5 ыкг/мл. Кривые I и 2 - различные препараты хроматина, кривая 3 -препарат хроматина, соответствуя-дай кривой I, но дополнительно гомогенизировавшийся перед облучением в течение 100 сек. По оси абсцисс - доза облучения, Гр, по оси ординат - отношение вязкости облученного образна к кеоблученному.

2ии в 0,15 М HaCI + 0,7 мМ ф.б., рК 7, после чего проводили их де-г^отеинпзашю ппарнном. Водно, что вязкость выходит на плато для

исходных препаратов (кривые I и 2), которое трансформируется з острый максимум при дополнительной гомог тизации суспензии хрома-"•ша до об /чения (кривые I и 3). Первоначальный рост вязкости естественно связать с релаксш ¡ей доменов кссДНК из-за образования ОР. Спад вязкости о увеличением дозы может быть связ ч с радиационной деградацией ДНК вслодстеиг образования ДР, либо с образованием сивок белок-ДНК, приводящих к отсутствии дексмгикти-зации кссДНК при переводе препаратов хроматина в депротеишгчрую-ше условия. Однако, поскольку характер дозовой зависимости вязкости при облучении прапара.ов хроматина в уже депротеинизирован-ном виде качественно не ..¡енялся, тс второе предпологсение нами было отброшено.

Выход критых I и 2 на плато можно расценивать как релаксацию практически всех доменов к ;ДНН из-за образования в них ОР. Если считать, что распределение разрывов пуассоновские, то в среднем два разр'тпа на петлю дают релаксацию почти 90$ доменов, что в практическом зхяанв будет означать выход зависимости вязкости препарата на плато и соответствует в нашем случае дозе с^оло 0,5 1р. Из приводимых в ряде монографий (Рябчеяко Н.И., 1979; Тимофеев-Ресовский Н.В. и соавг., 1981) литературных данных по радиацион-но-химичесюш выходам ОР и ДР кс:с при облучении клеток, так и растворов ДНК в широком диапазоне концентраций следует, что на один ДР допно приходиться по крайней мера несколько десятков ОР. В нашем случае ото означает, что при д^чах 2-3 Гр будет лшпь незначительное число раскрытых петель из-за ДР и этот процесс должен медленно нарастать, сопровождаясь повышением вязкости системы. Однако, как видно из рис.3, наблюдается обратное. 0ст1 ¿аясь в рамках предположения о радиационной деградации только ДНК как пр1. мне падения вязкости, трудно -хакже объяснить как его двухфазный характер, так и трансформацию дозовой зависимости при дополнительной механической обработке препарата.

Анализ дозовой зависимости вязкости.препарата хроматина, де-протеинизированного избытком гепарина и облученного в этих условиях (при этом ДНК хроматина существенно декомпактизована и свободна от большинства белков, т.е. более близка к ее состоянию в растворах ДНК), показал, что после роста, вызванного релаксацией доменов кссДНК из-за образования ОР, достигающего максимума при С,5 Гр, наблюдается падение, выходящее в районе дозы 3 Гр на бо-

лее пологий участок, который в полулогарифшг ,ских координатах хорошо апроксимяруегся прямолинейной зависимостью. Прямолинейная зависимость наблюдалась нами и при сблу тании растворов тимусноЗ в той яр средс. Это'позволило сделать предположение, что более пологий участок падения вязкости с ростом дозы в случае препаратов хроматина соответствует деградации линейных молекул. Та-КиА переход к гтбору линейны:" молекул может произойти лишь в том случае, если допускать, что сохранившиеся при выделении хроматина учас-ки хдер'ого матриксь. являются структурой с высокой радиочувствительностью, Ее поражение должно вызывать распад "розеткооб-р, зной частицы". Поскольку в процессе выделения хроматина происходит его фрагментация, то снятие конформационных ограничений из-за радиационного повреждения надмолекулярных белковых (или, воз-мо:—.о, белково-липидных) структур, к которым крепится набор петель ДНК, сопровождается линеаризацией ДМ.;, т.е. переходом ранее организованно!' в пе^та молекулы в линейную форму. При этом не исключен распад "розеткообраэной ч; )тицы" кссДНК на несколько линейных молекул ДНГ. Этот процесс и будет определять предшествующий прямолинейному участок более резкого паде чя вязкости препаратов хроматина в депротеинизкруиг?й среде с ростом дозы облучения.

Считая, что "розеткообразная частица" содерглгг в среднем - т петель ДПК с радиочувствительным объемом V , определяемым средним молекулярным размером петли, и сформирована из к молекул ДНК, причем к^а , мы получили после ряда упрощащих допупений выражение зля вязкости в зависимости от дозы облучения:

+.'Ь<1-*»Р(-Т1»)(1-Р1(П)).

где ^ и (р ^ - вязкосгь лосле 1. до облучения дозой в , ь -параметр, характеризующий отношение вязкости системы "розеткооб-разных шсгиц" с полностью релаксированными доменами к первоначальной, ^(э) -вероятность распада "розеткообразной частицы" л^и дозе В . Было "рассмотрено две возможности распада "розеткооб-раьноГ частицы": I. поражение а структур с радиочувствительным объемом в кадггя, по одяоударному механизму (Р1»(1-ехр(-аБ))п); 2. и "опаданий в одну радиочувствительную область размером в

)., В обоих случаях получаемые теоретические кривые находились в качественном соответстшш о экспериментально

у - 20 -

наблюдавшимися дозовыми Зависмостяш, а также их трансформацией при дополнительном м ханическом воздействий на выделенный хроматин, что моделировалось относительным изиэно1г-*м значений пара-мэтров а и п.,

Сдела... как - 2-либо вывод о механизме, тем более молекулярном, на данном этапе не представляется возможный. Ijm на меРьв, проведенный анализ изменений вязкости растворов вэделенного хроматина при облучении показывает, что их интерпретация требует привлечения представления о ядерном матриксе как весьма радиочувгт. .печной структуре. Это необходимо учитывать к^к пр** р?лсмотрении новых, так и уже известно данных, касающихся гидродинамического неведения нуклеоидов или клеточных лизатов, содержащих кссДНК. Так, например, пвлятв двух юг.и трех прямолинейных з'частков, имэ-идих разный наклон да зависимости лотарг'Чи относительной скорости седиментации нуклеоидов от дозы облучения, трактуемое обычно как указание на существование групп доменов о разные молекулярным размером (Филиппович И .В., Сорокина H.H., IS83; Oook Brazeii i.A., 1975) может hp самом дела отражать гх>цв^о двком-пактизаши релаксироваяной жсоДНК нуклеоида из-за радиационного '.ювреждения ядерного матрикса.

Сопоставление результатов теоретического анализа изменений вязкости системы "розеткообразных частиц" и экспериментальных данных позволило оценить средний размер петли-домана ДНК в препаратах хроматина . лмуса теленка. Он составил (5+10) 10 Да, ч о находится в хорошем соответствии с размерам ..етель, полз энными различньпди мэтрами на разных эукариотических клетках.

3. Неравновесное поведение вязкости растворов препаратов хроматина

Представленные выше.результаты получены при анализе равновесных вязкостных характеристик. Однако препараты хроматина в течение некоторого времени посла перевода в депротеиьлзирущие условия характеризуются, как правило, неравновесным поведением, то есть.их вязкость изменяется с течением времени приложения сдвигового напряжения. Для различных itpeпаратов период проявления способности к неравновесному течению составлял от 2-3-х часов до суток с момента перевода в.депротеинизирувдиа условия, с постепенным ее ослаблением до полного исчезновения. В среде с 0,7 MHaCI

способность к Неравновесному течению сохранялась без существенного ослабления в течение по крайней мере суток.

Гипичлая зависимость вязкости от времени для случая неравно-т Юного течения растворов выделенного хроматина представлена на рис.4. Видно, -гго не равновесность состоит в увеличении вязкости раствора во времени гчилоЕвния сдвигового напряжения (X ) с последую "ш падением, причем этот переход характеризуется большей скоростью л величиной максимальной вязкости с ростом t .'Увеличение концентрации препарг-а тают приводило к более'вырачсенному пронвлению неравно. эсности. Есуы отложить величину максимального гпироста приведенной вязкости (дт^) против логарифма К , то получается линейная зависимость, экстраполяция которой к нулевому s .аченик) Мрдр дает величину, характеризующую отсутствие неравновесного поведения раствора выделенного хроматина в данных условиях. Аналогичная ситуация наблк, злась и д-я концентрационной зависимое [.

Наличие пороговых значений напряжения сдвига и концентрации для йеномена роста вязкости во времени сдвигового течения однозначно свидетельствует об индуцированном сдвигом структурообразо-г вании (ИСС) в растворе (Silas H., 1978). При осветлении препаратов хроматина способность к струк^урообразовашно резко уменьшается вплоть до полного исчезновения при тех же условиях. Это говорит о том, что основная роль в этом процессе принадлежит фракции хроматина, содержащей кссДЖ. Определяющая рель кссДИК в явлении

500 ■

300"

ТОО-

о ЗГ~ ¿о з'о 25

Рис.4. Зависимость приведенной вязкости - ггоепарата хроматина в

1 М НаС1 + 0.1 Н НаоЭДТА + I мМ Трис + 0,5$ Тритон ТС-100, рН 8 от времени -риложения сдвига для различных доз гамма-облучения. Кривая I - исходный препарат,

2 - облученный в дозе 0,8 Тр.

3 - 1.6 Гр, 4 я 2,4 Гр, 5 - 4 Гр. X =0,01 дин/см*, С =10 мкг/мл. Препарат облучался^ пз виде суспензии в физиологической ионной силе. Образцы переводились в де-протеинкзирумдие условия за час до начала сдвиговой деформации.' II- оси абсцисс - время приложения сдвига, мин; по оси ординат - приведенная вязкость, дл/г.

? г)

особенно при малых сдвиговых напряжениях + 10 ),

может быть связана как с зе существенно более высокой г глекуяр-ной массой по сравнению с линеаризованной частью ДНК хроматина, так и с наличием ассоциированных с ней бьлковых и/или лигшдо-бел-кових структур. Так, например, для ДНК фага Т2 (М=1,2*ьЛЕа) в случае малых напряжений сдвига неравновесность течгчия отсутствует, в то время как в том э диапазоне значений t для ДНК лизатов В. subtllis (Ми2-1С9Да) наблюдается индуцированная даиом агрегация, которую связывают с возникновением физических зацеплений мезвду сверхполимерными мосекулами ДНК из-за сталкивания np,i движении с различной скоростью на перифс та .. эсе^.жх ламинарных слоев (иааоа D.J., 1'?з). Поскольку "розеткообразная частица"кссДНК может состоять из нескольких организованных в петли линейных молекул со средним молекулярным весом порядка 10® Да, то ее собственный молекулярный Г"с может бнть близок к 10®. Однако очевидно, что кссДНК является достаточно компактной структурой и при ог ом молекулярном весе ее гидродинамический размер существенно меньше, что эквивалентно более низким значениям молекулярной массы. Таким образом, в осног.з ИСС в сучае препаратов грот, .на лежит скорее высокая способность кссДЩ к агрегации в потоке из-за ассоциированных с ней структур ядерного матрикса, чем более высокая молекулярная масса.

Наряду с ростом вязкости во времени сдвигового течения после достижения ею некоторого значения начинается достаточно быстрое падеже. Причем, если препарат хроматина в 0,7 М г:С1 подвергнуть повторной деформации после достижения стационарного значения, то наблюдается лишь небольшое по отношению к предшествующему увеличение вязкости системы с выходом на то же значение в-зкости стационарного течения, что и при первом деформировании. Ясли аккуратно извлечь ротор вискозиметра из раствора после достижения стационарной фазы, то можно наблюдать адсорбировавшийся на нем гелеобразный слой, при этом концентрация ДНК в -ставился в статоре части раствора хроматина существенно падает.

"стественло предположить, что здесь протекает процесс, аналогичный фракционированию препарата хроматина путем адсорбции его части, содержащей кссДНК, на вращающейся палочке. Адсорбирук'.лнЛс.; на роторе материал исключается из раствора, что и приводит к падению вязкости со временем течения. Это предположение подтверуда-

.¡тся результатом спвитоеого деформирования раствора хребтина в 0,7 М^аСГ, предварительно осветленного центрифугированием (30 гг , 2С000 е ) и, лпедователь""), не содержащего кссДНК. Только при наибольшем из ».¿пользовавшихся наш напряжений сде га, 0,4 дин/с и, наблюдалось в этом сл"те незначительное падение вязкости после д' стих ния максимума.

В таблице 2 представлены результаты определения характеристической вязкости адсорб рущеЯся при различных режимах деформирования фракции хрс..;атина после ее растворения в 0,15 Г.! Ка'Л + I% н.^-додешлсульфате. Видно, что по мере увеличения сдвигового на-

Таблица 2

X , дгч/см? | 0,2 | 0,3 j 0,

lVl . дл/г__! TQP7 ' G53 ! 555_

ггояжения характеристическая вязкость кссДНК, адсорбирующейся на роторе, уменьшается, ^о зстесгв ¡но трактовать как вовлечение в агрегацию с после "логдей адсорбцией на роторе все более мелких "розеткообразных частиц" кссДНК по мере увелгт-;кия t. Таким образом, используя различные по величине сдвиговые напряжения и ста-билизаг зо течения крк критерий завершенности адсорбции, можно по-тучг чь фракции зфомагина, различающиеся по размерам фрагментов кссДНК.

Видно (рис.4), что облучение препаратов хроматина не устраняет неравновесного течения, однако влияет- „а величину макекмаль-ноГ и начальной вязкостен. При изучении влияния ионизирующих излучений на неравновесное поведение вязкости осветленных препарате- хречатина в 0,7 М HaCI было обнаружено редкое, но монотонное падение величины прироста вяйкости в этом доз ном диапазоне 'Крючков В.П. , Г982). Очевидно, что наблодаемое различие связано с принципиально разным откликом на радиационное воздействие лине-аиизовадных фибрилл и кссДНК. Релаксация суперспирализопаннкх петель приводит к ро"ту "ачаяьяой вязкости с дозой, о изменение размера arpera.ов как из-за увеличения размера составляющих его ' гастиц", так и, возможно, за счет изменения кх количества в агрегат«. при том же сдвиговом напряжении, вызывает рост максямать-н^го значения вя^.сости. Следует отметите, что резкое ослабление ИСС после дозы ¿*S Гр хорошо согласуется с налим предположением < распаде "розеткообразш.с частиц" в этом дозном диапазоне.

- -

К.пользование изменения максимальной вязкости гш радиационном воздействии как критерия для оцентг степени поврезденнооти генетического материала весьма привлекательно, поскольку этот параметр мо-чо сделать весьма чувствительным пу.ем подбора значения X. Его недостатком является существенная неопределенность г твиси-мости характерис.ик ЯСС от характеристик индивидуальных макромолекул и различных факторов метаолекулярного взаимодействия, что затрудняет количественную интерпретацию на ¿-ровне по.-'ровдеггЧ ДНЧ. Однако как способ качественного тестирования поврезден.:ости генетического материала такой подход может оказаться перспективный для изучения влияния мачы: доз ионизируюг-х ипуче шй.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что контролируемая деполимеризация ДНК перед ультрацентрифугированием позволяет, не входя в область аномальной седиментации, сократить время центрифугирования однотяжевой высокоп^.-лимернс": ДНК до значений, когда спонтанная деградация не будет сказываться на результатах эксперимента.

2. Разработана методика определения молекулярной ма^-сы однотгтз-вол ДНК без использования радиоактивней, метки путем седименташюн-ного анализа с учетом фактора скорости, с помощью которой охарактеризованы радиочувствительность и репарационная способность "г1 витро" клеток костного мозга крыо по выходу однотяяеьых разрывов.

3. Иоказс.ю, что в препаратах выделенного хроматина тимуса теленка сохраняется организация ДНК в видр суперспират.зов иных ь^тле-образных доменов, что позволяет использовать эти препараты в качестве модельной системы для изучения структурно-функциональной организации генома эунариот на уровне суперсшрализоБаи'^й ДНК.

4. Установлено, что в основе структурной гетерогенности препаратов выделенного хроматина лежат различи меяду фракциями, содер-поцимк, соответственно, линеаризовав;.:увся в процессе выделение и кольцеобразную суперспирализованную ДНК.

5. Проанализированы изменения вязкости растворов выделенного хроматика при радиационном воздействии и пока-зано, что для их интерпретации необходимо привлечение представления о ядерном матршссе как радиочувствительно"; структуре.

6. Показало, что в основе неравновесного поведения растворов наделенного хроматина при куэттовом течении лежат процессы индуцированного сдютсм структурообрззования и радиальной митрата,; с

- ¿', -

пос здукцей адсорбцией материала на роторе, в которых определшо-ипто роль ..гразт кольцеобразная суперспирализованная ДНК. 7. Об1гружено, что вс можно фракционирование препаратов хроматина в сдвиговых поллх j размерам фрагментов кольцеобразной суперспи-ралиьованнс.. ДНК путем адсорбции части материала на поверхности ротор' прг различных напряжениях сдвига и использовании стабилизации течения как критерия завершенности фракционирования.

Д^чатные работы по тв:.е диссертации

1. Krj'rchkov V.P., Paponov V.D., Rad'ko S.P., Tvar.ov V.I. Structure-forming properties of chromatin fibrils in various rr.edia: rheo-iogica. analysis. Studia uiophysica, 1902, 82, Ii2/3, 123-124.

2. Тронов Б.Л., Провоторов А.В., Радько С.П., Шагалов Д.Б. Образование и репаре"ад разрывов ДНК в Слученных клетках костного

г. j3ra крыс. Радиобиология, 1984, 24, КЗ, 296-2S9.

3. Tj нов Б.А., Радько О.П., Провоторов А.В. Фактор скорости в седимзнгальных исследованиях ДНК. Радиобиология, 1985, 25, И2, I5S-I64.

Папонов В.Д., Сигора Г.А., Радько С.П., Лысцов В.Н. О динамичном и статичном хроматине. Еюлл. экопер. биол. и мед., 1986, J.02. JI2, 741-'. 43.

5. кипонов В.Д., Радько С.П., Крючков З.П. Способ препаративного фракционирования хрокатина эукариот. Авторское свидетельство на изобретение JSI3I3I69.

6. Папонов В.Д., Радько С.П., Сигора Г.А. Проблема структурной гетерогенности препаратов хроматина в свете представлений о топологии ДНК генома. IX Всес. скмп. "Структура и функции клеточного ядра", -1ерниголовка, 1987. Тез. докл., с.76.

7. Папонов В.Д., Сигора Г.А., Радько С.П., Лысцов В.Н. Топологическое сос яние генома эукариотов и структурная гетерогенность препаратов хроматина. Докл. АН СССР, 1987, 296, №2, 453-457.

о. Рг ¿ко С.П., Папонов В.Д., Сигора Г.А., Лысцов В.Н. Радиационное воо^еГгтвие на хроматин как новый подход к анализу суперспи-^тльних кольцеобразных доменов ДН.. генома клетки. УГ Всес. совещание по сткродозиметрш, Канев, 1989. '.ез. докл., с.148-149. Э. Радько С.П., Папонов В.Д. Радиочувствительность кольцеобразных домена ДНК в препаратах хроматина. I Всес. радиобиологический съезд, Ртсква, 1939. Тез. докл., с.121.