Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гетерологичные плазмиды и фаги в анализе генома возбудителя чумы (Yersinia pestis)

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Гетерологичные плазмиды и фаги в анализе генома возбудителя чумы (Yersinia pestis)"

ГОСУДАРСТВШШЫЙ КОШТВТ САНИТАНЮ-ЭПИДЕШОЛОгаЧВСЖОГО НДДЗОРЛ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Российский научно-исследовательский противочумный институт1 "Микроб"

На правах рукописи • ИБВдаВА СВЕТЛАНА АЛВШНДРСВНА

УДК: 616.981.452+575.192

ГЕТВРОЛОШШШВ 1ШЗШДО И ФАШ В АНАЛИЗЕ ГЕНОМА ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ (YERSINIA PESTIS)

03,00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Саратов, 1993

Работа выполнена в Ростовском-на-Дону государственном ордена Трудового Красного Знамени научно-иссладовагальском противочумном институте

НАУЧНЫЕ КОНСУЛЬТАНТЫ:

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Доктор медицинских наук, профессор Л.Н.Макаровская

Доктор медицинских наук, профессор O.A.Проценко

Доктор медицинских наук, профессор, чяан-корраспонденг

РАЕН Г.М.Щуб

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Ставропольский научно-иссладовагальский противочумный

институт

Автореферат разослан " " Х^с-ё^Ь^ 1993г.

Запита состоится " ¿х^и^ЪлУ 1993г.

в - iV _"_часов на заседании Специализированного Совета Д 074.32.С по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук прв Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" Госкомсанэпиднадзора Российской Федерации (4Ю071, г.Саратов, Университетская, 46)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института "Микроб".

Ученый секретарь Специализированного СоЕета, доктор биологических наук

Г.А .КОШЕВ

I. 0Ы1АЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Род иерсиний объединяет в себа вида микроорганизмов, физиология и наследственность которых исследована далеко не полно. Об эгсм свидетельствуют сомнения исследователей в процесса формирования общего мнения* о таксономической позиции видов, возникающие порой затруднения в дифференциальной диагностике, факты выявления новых видов иерса-ний я, наконец, даннне, которые наводят на шоль о неоднородности отдельных их видов в том числа и прение. Именно этот вид продолжав! оставаться объектом самого пристального внимания, несмотря на довольно широкое распространение дзетах иерсиний,которые приобретают параллельно увеличению объема знаний о них все больший эпидемиологический вес. Однако степень опасности и напредска-зуемосги распространения инфекции оставляют по-прежнему на первом месте возбудителя чумы, который в силу своих уникальных особенностей будит научный интерес не одного поколения чумологов и специалистов широкого микробиологического профиля.

Свойства возбудителя чумы, обеспечивающие его видоспецифич-ность и способность вызывать высококонтагиозное тяжелое инфекционное заболевание, исследуются ео многих специализированных лабораториях мира. Однако многое еще остается загадкой. Характер ь глубина анализа возбудителя и уровень его познания определяются методической и теоретической оснащенностью исследователей в каждый конкретный момент истории. Возвращение специалистов микробиологов нашего отечества на позиции классической генетики в шестидесятых годах открыло новые подходы к исследованию микроорганизмов и рода иерсиний в частности. Методы генетического анализа, созданные на модели разных микробов, и установленная возможность адаптации некоторых из них на других микроорганизмах обнадеживали, открывая п;уть к экспериментам по созданию комплекса эф^ектив-

них методов исследования генома и физиологии возбудигеля чумы, без создания которых практически невозможно решение целого ряда насущных вопросов, касагацихс« механизмов его вирулентности, иммуногенеза, дифференциальной диагностики, таксономии и эволюции. Работа в этом направлении проводилась и проводится за рубежом и практически в одно время была начата в резных научно-асследователь-ских учреждениях СНГ.

Планируя и выполняя исследования, мы старались максимально ио-пользовать научный Сагая, представленный в литературе. Внимательно следила за рсиульгагама работ отечественных и зарубежных коллег» стараясь искать несколько отличающиеся пути и методические приемы,

у

на противопоставлять, а соединять известные и подученные нами результаты, чтобы способствовать созданию как .южно более цельного, разнопланового и детализированного представления о возбудителе чумы и.выбрать очередные назревшие проблемы для их решения.

^Первые-сведения о мутабелыюогя чумного микроба, разработка некоторых специальных сред культнвированияп»зультасы-исследования особенностей питания возбудителя чумы, а также данные генетики других микроорганизмов, связанные с открытием у них-плазмид и рекоыбинационной изменчивости в процессе обмена генетической ин-форлации разными путями, послужили для нас, также, как для других исследователей, отправным пунктом. Совершенно очевидно, что прогресс в познании генетических особенностей чумного микроба находится е прямой зависимоеиа от наличия разработанных эффективных гвтодических приемов исследования. К моменту начала наших экспериментов создание методов обмена генетической информацией а ее анализа, а также подучена с их помощью новых сведений о чумном микробе было предметом первой необходимости и может быть охарак-гер!зовано как одно из самых актуальных направлений исследования.

Цель работы - разработка системы поемов генетического анализа возбудителя чумы я получение о их помощью новых сведений об особенностях гено- а фенотипа, а также Физиологии

Задачи исследования:

1) определить возможность функционирования у бактерий у.рее-ив механизмов ойлена генетической информацией, свойственных данному виду макроорганизмов;

2) проверить способность к инсерцяи в геном возбудителя чу-ми различных транспозонов и транспозонподобногс. профага Ми определив возможные направления использования Тп-элементов и их'эффективность в анализе генома тг. рев«.а !

3) выявить ге те ролопачные шизмиды и фаги, способные к переносу плазмядной и хромосомной генетической информации у чумного иякроба, и определить оптимальные условия для этого процесса;

4) исследовать эффективность разных способов картирования хромосомы У.рез1;1а и получить первичные данные, характеризующие структур!? ев отдельных ¿рагмзнтов;

5) при передаче ДНК ллазмид возбудителя чумы в различное ге-нетячвоков окружение получить дополнительные сведения о их структура в функции, в частности о значимости для вирулентности и им-муногенности бактерии-хозяина;

6) среди штаммов различной родовой принадлежности выявить способные экспрессаровать отдельные йлазмидныз гены и сконструировать модельные рехомбанантныв ьгашн, продуцирующие антигены

х peatiз связанные с плазмядаый да. использования их в качестве продуцентов при изучении и регуляция синтеза структу> продуктов пдазмидвых генов;

7) выявить влияние использованных в опытах гетерологичных плазмид и фагов, в также генетических событий, имевших мьсго пря

постанвка экспериментов, на фенотип бактерий X. pestisи получить новые сведения о структуре и функционировании их генома и роли отдельных аго фрагментов.

Научная новизна. По ходу выполнения экспери~ ментов: селектированы образующие негативные колонии на газые культур Y. pestis И Y.pseudotuberculociч варианты фВГЭ PI cm! clrlOO ts (P1 oral clrlQO to pi И P1 cm1 clrlOO ps соответственно) И H8 ИХ основе создана система общей грансдувдии хромосомных в плазмидных маркеров у возбудителя чумы и псевдогуберкуяаза.

Обнаружена способность бактерий чумы к передаче генетической информации при трансцепции и доказана возможность еа использования при конструировании штаммов.

7 возбудителя чумы обнаружен феномен синитро^изма и апробированы приемы тестирования сходных .¡о фенотипу ауксотрофных мутантов с аго использованием.

С помощью сконструированных на основе фага pi cmi cirloo ts ^эффективных векторов различных гранспозонов выявлена высокая реци-пиентная способность возбудителя чумы к исследованным гетер-логичным трзнспозонами повышенная акгавносгь is-завиашой рекомбинации после их приобратенгя; отработан и внедрен метод транспозон-ного анализа генома Y.pestis и опосредованного та-элементамъ генетического конструирования штаммов.

Докгчана чувствительность бактерий чумы к коли-бак^ердофагу tiu cts, отработаны методы их лвзогеннзации этим фагом и созданы основы для приведения анализа ах генома с использованием фегов i,iu.

Селектирована шшзмида рэтгоо с более высокой, чем у известной г*Lao плазшды, мобилизующей активностью в отношении хромосомных генов г.pestis, включая сцепленные, и показана способность коинте^ратов гетерологичных а-пяаз''чд и собственных высокомолекулярных вкехрокосомнюс репляконов чумного микроба к ауголерено-

- 7 -

су и мобилизации его хромосомных маркеров.

С помощью отработанных нами методов генетического картирования установлена сцепленность ряда генов в различных фрагментах хромосомы Y.pestis.

У бактерий ИССЛедоваНННХ штаммов Y.enterocolitica, К.pneumoniae, c.frsundii посла введения ДНК 65 МД плазмида Y.pestis зарегистрировано появление в препаратах ингактных и обработанных ацетоном клеток антигена, специфически реагирующего с диагносгаку-мами на "фракцию I" чумного микроба; выявлены особенности экспрессии плазшдных ira детерминант в зависимости от вида бактерии-хозяйка и показано преимущество штатов-продуцентов цатробактер и эн-ТерОКОЛИТИКИ перед Y,pseudotuberculosis.

На модели инсерционшх Fra~ мутантов бактерий чумы обнаэдяано, что у морских свинок, но не у белых нишей, способность микроба продуцировать фракцию X играет более существенную роль как при захьа-те бактерий перагонеальннми макрофагами, так и при завершении фагоцитоза ими; у морских свинок, но не у белых мышей противочумная' вакцина индуцирует специфичные в отношении фракции I модификации в перитонеальных макрофагах, которые обусловливают усиление захвата и переваривания ïra+ бактерий, выращенных при 37°С.

Введением недостающих плазмд в дефектные штаммы чумного мнк-роба получеры свидетельства обязательности нескольких хромосомных генов для экспрессии в наивысшей степени вирулентности и иммуноган-ности, свидетельства отличий в наборах детерминант, необходимых для проявлалзя вирулентности и нммуногенности возбудителя чумы вообще и отдельно каждого из свойств конкретно для белых мышей и морских свинок, а также показатели большей значимости хромосомных генов для вирулентности Y.pestis в отношении морских свинок; : то-демонстрирован эффект аддитивности на вирулентность и на иымуноген-ноегь для морских свинок после введения 47 МД плазмида в бактерии,

содержащие 65 МД плазмиду чумного микроба.

При анализа маркеров и условий селекции обнаружена неспособность некоторых Е-вдгаций Y.pestis обеспечивать селективный уровень антибиитикоусгойчиЕости при повышении температуры культивирования и выявлена возможность сочетаний RifR мутаций с утратой отдельных плазшд, ышкениеы продукции пестицина I или степени Са^зависимосжй.

Подучены свидетельства влияния некоторых гатерологачных плазшд у y.pestis .на плазшдннй состав, агглюгинабельносгь, чувотав-тельность к фоам, репарационные процессы, щгабальность, деление клеток, ^ирулантносгь в ашуногенность, а также тарлгчувствйтельное гь оакгернй-носиге лей.

Практическая значимость. Разработан комплекс методических приемов и создана материальная база для эффективного исполиавания феноменов трансакции, конъюгации, транс-нозояного мутагенеза, IS- п гесА-зависимой рекомбинации с целью анализа сгрукгурн, функций в регуляции генома иерсиннй и констру-Ерования штаммов с заданнша^свойсгвавга.-Обнаруя^шгм^аш у возбудителя чумы феномен синтрорзыа в способ передачи генетического материала, независимый от гегеролотачных плазмнд п фагов (транс-цепция), а также выявление штаммов различных родов семейства эн-геробактерШ, экспрессирувдих некоторые плаззлидше гены Y.pestis, создают дополнительные бозмокностй для тестирования ауксотрофных мутантов'и конструирования штаммов с нукной характеристикой, модельных штаммов для изучения ^¡зиолотиа возбудителя и взаимодействия его'с макроорганизмом л шташон-продуцегтов. Подученные теоретические- вывода я данные «•артнроззания могут быть ориентирами для повышения корректности планирования пронодашах различными спеша-лпетамл исследований иарсигаш. Скоисгр^иронашше уникальные блягз-кообразуюциа (tarn, плазмнды, мобилизующие хромосомные гены, коеыо-

- 9 -

гативные коинтвграты с ДНК собственных плазмнд чумного iw.iK^jöa, способные передаваться в различное генетическое окружение, и коллекции фагов-векторов транспозонов, 2п -индуцированных мутантов хромосомных и плазмидных генов обеспечивают возможность применения разработанных методов и расширения исследований патогенпостз и таксономических характеристик возбудителя чумы и других иарсяний.

На оснозанпи разработанных с^особсч оформлены ь.-годические рекомендации. Из них 5 приоритетных способов зящщцега авторскими свидетельствами "Способ лизогеназации чумного шкроба" (A.c. & 106-9430), "Способ Получений ауКСОГрОфНЫХ мутантоа Yersinia pos-tis" (A.c. j? IX7J.522), "Способ трансдукцки хромосомных маркеров и плазмид у чумного микроба" (A.c. ¿ 1304406), "Способ передачи плазмидной ДНК и хромосомного материала у ~7мнс t> микроба" (A.c. » I75I986), "Способ получения вакцинного штамма Yersinia " (A.c. is ¿709730 AI). Утверждены 4 рацп.з;, охсанля (РПЧИ: 1580г. а 600, 1981г. ОН 680-682), Методические разработки, касающиеся режимного обеспечения генетических исследований, вошли в практическое руководство "Особенности методических приемов при работе с возбудителями инфекционных болезней человека I и Г.' группы патоганиости бактериальной этиологии (И1ЧИ).- Г^стов-на-дреу,1989.

Коллекция авторских штаммов включает доноры хромосомных генов Y.pesti3, коингеграгивных ингактных плазмид и их делецяоннг . гарантов, моно- я полииаркарнна инсерционные мутанты по x^jmocom-ным и плазмидным генам, лизогены ~о транедуцйруюпдам (пятнообразую-щям) фагам Р1 cml сХгЮо ts pi ?1 cml cirioo рз и векторным вариантам фага P1 cml с!тюо ts с различными тракспозонзш, штаммы иерсинай и других родов сем.энтеробактерий с плазмидной ДНК Y.pcc tis. Tpi штамма-продуцента антигенов y.pr -tin 'мшалого токсна и фракции I), сконструированше на гетерологичной о.лона, депонированы в НИПЧИ "Микроб", "а один из нлх получен патент СССР: "£тэмм

- 10 -..

с^гоЪас+ег freund.ii КМ-1 - продуцент антигена "фракция Iй чумного микроба" (Заявка « 5024172/13 от 03.07.91. Положит.решен, от 06.05.92).

Методические прегды, сконструированные штаммы бактерий и фагов „'.спользуются в генетических микробиологических и биохимических исследованиях в Ростовском противочумном институте, а гакяе в лабораториях Иркутского противочумного института, НИПЧИ "Микроб" и ИЭМ им. Н.Ф.Гамалев РАМ.

Основные теоретические выводы диссертационной работы попользуются при чтении цикла лекций по генетика бактерий и возбудителей 00И на курсах специализапуч бактериологов П1 1 ИМ.

Положения, выносящиеся на защиту.

X. Свидетельства эффективности гагерологичных плазмид и фагов в анализа генома и функций генов у х.реа-Ыв.

2. Высокая продуктивность новых методов анализа генома бактерий Т.резиз.

3. Продуктивность использованных подходов для конструирования модельных и других экспериментальных штаммов '.¿.рез-е1з и других бактерий.

4. Данные о сцепленноста отдельных генов в исследованных фраг-• ментах хромосомы х.ревЬ.з.

5. Дополнительные к известным сведения о функции плазмид г.рез-■Ыз и значимости плазмид и хромосомных генов бактерий чумы для их впруленгпосги и иммуногенности.

6. Показатели суцесгаования различий в детерминированности, вирулентное :и и иммуногенности т.резиз вообще и о различиях в доминантности ог^ельных известных детертшант для реализации этих свойств по отношению к ^зным видам животных.

7. Характеристика возможных направлений изменчивости бактерий чумы пид влиянием при обре генных шла гагерологичных плазмид и про-■Т£Г02.

- II -

8. Новые характерсгики генома и фенотипа возбудителя чумы.

9. Доказательства активности is-зависимых процессов на моде-ля гагарологичных перемещающихся генетических элементов.

10. Передача плазмид в различное генетическое окрукение как новый подход к изучению аддитивного взаимодействия и $оршрованя# сложных комплексов продуктов различных хромосомных и плазмидных генов и к уточнению функциональной значимости последних у возбудителя чумы.

11. Целесообразность поиска Рга+ н Рга± вариантов иерсиний и других бактерий в смешанных чумных эпизоотических очагах и за их пределами и среда атипичных штаммов возбудителя чумы, а такав целесообразность коррекции предпосылок при серологической диагностике чумы.

Апробация работы и публикации.

Материалы диссертанта доложены и обсукдвны: на ежегодных научных конференциях Росговского-на-Доку научно-исследовательского . противочумного института; научной конференции микробиологов Север^-ного Кавказа (Росгов-на-Дону,1969); Всесоюзных совещаниях по проблеме "Плазмида" (Москва,1975; Краснодар,1380*,Пущино-на-0кв,1981 ; Пущино-на-Оке,1985); краевой научной конференции по пряродно-оча-говым инфекциям (Ставрополь,198Г); Всесоюзных конференциях молодых ученых а специалистов Минздрава СССР (Саратов,1982; Ростов-на-Дону ,1284) ; научной конференции "Генетика и биохимия возбудителей особо опасных инфекций" (Волгоград,1992).

По теме диссертации .опубликовано 50 работ, в том числе в соавторстве два книга, 5 авторских свидетельств и один патент. Список работ приведен в конце автореферата.

Диссертация обсуждена и одобрена на конференции Ростовского -на-Дону государственного научно-исследоаательскс л> противочумного института.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, 7 глав, отражающих результаты собственных исследований,изложению каждой из которых прядшесгвует краткое сообщение о состоянии вопрос«, соответственно задачам главы, штаммах и методах, использованных в данной группе экспериментов. Завершают работу заключение и выводы. Диссертация представлена на страницах мапшно-' пвсного текста и иллюстрирована таблицами и 28 рисунками. Указатель литературы содержит 253 огечессвенных и 271 иностранных источников .

Эксперамг тгая^нке результаты, описанные в диссертации, подучены личн^ диссертантом и под его руководством в соавторстве с сок-руднЕ^аш лаборатории микробиология в генетики чумы Ростовского нау .но-исследоветельского противочумного института.

Глава I, РАЗРАБОТКА МЕТОДА КШЪШЩОННОГО АНАЛИЗА ХРОМОСОМЫ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ Пои 0101 подходов к коныэгавдонному анализу структуры ген ж а у.рзсиа проводилась различными специалистам в двух направлениях: тестирование на конъюгагивносгь ранее предполагаемых собс?--

венных плазмид чумного микроба и исследование эффективности гето-рологичных. Тестя^лвалз при совместном выращивании пар разкомар-керннх штаммов х.рей-из с последующим поиском проготрофтсс ре-комбинантных гарантов. Результаты позволила сделать заключение об отсутствии у возбудителя чуш свойства фертильносги, которое у кишечной палочка определяется плазмидаш ? -типа (Анисимов,Про-ынко,1,970; Сучков »Мишанькан,Лебедева,1974). Однако в ряде наших опытов появлялись прототрофныа варианты, различные по стабильнос-41, но отсутствующие ч контроле.Еестайишые клоны, постоянно от-щзпяяда субклоны с признаками ¿чавдого из родительских шгашов в отделъностя. Последние, исследованные при смешанном культивирова-

- 13 -

нии (метод реплик, штрихов, смешанных культур, нефе^ометрический), проявляли синтрофизм. Этот феномен обнаружен кч только у бактерий двух разных штаммов, но также в одной лопуляпи" при наличия гипотрофных вариантов, которые ка дефинитной среде способствовали поддержанию жизнеспособности и некоторому размножению основной части популяции. За счет проявления синтрофпзма показана возможность дифференциации сходных по фенотипу, но отличающихся по блоку аук-сотрофных мутантов. Стабильные рекомблнантнне клоны со смешанными свойствами больше напоминали результат слияния протопластов» При электронной микроскопии бактериальных смесей ''ротопластных или сферопластных форл не обнаружено, но зарегистрированы конгломераты бчтерий, сформировавшиеся за счет тесного контакта их боковими поверхностями при наличии брешей в наружном слое клеточной стенки и соприкосновении болев глубоких слоев. Возможность трансдукции ч трансформация исклотена контролями. Передача ннфорлатп1И шла в обеих направлениях. При сопоставлении с данными литературы (вопааХоз et аЗ-Д982; Смирнова с соавт.,1983) сделано заключение о. проявлении у У.ревиз феномена трансцепции. Подобраны наиболее оптимальные условия для подобной передачи. Наиболее активно она шла при инкубации бактериальной смеси в гонком слое бульона при медленном ту-теллировании, когда высок уровень аэравдп. В этих усло"зях зарегистрирована передача хромосомных аук.сотрофных маркеров с "астотой 10*"', собственных плазмид У.реаЫз в разном сочетании и гетеро-логичных плазмид у разных штаммов и разномаркерных клонов одного штамма. Плазмида возбудителя чууч передавались такя бактериятл возбудителя псевдогуберкулеза прт* смеренном культивировании. Перечисленное позволило гтнести трансцепцию к феноменам,свойственным природным штаммам чумного микроба наряду с оинтро^Я'-чом, занят,гаь-да определенное метто в физиологии вида у.роз-Цз я его поддержания.

Исследование эффектности гетерологячг ас ? и а клттьягя';.:п-

- 14 -

них плазмид в генетическом обмене у Y.pestis стало возможным после доказательства способности этого микроорганизма быть реципиентом И последующим донором этих репликонов (Martin, Jacob , IÖ62; Knapp,ЬеЬеЬ, 1367; Анисимов, Синичкина,ху69; Лебедева, If.39). Опыты с широко известной 2" lac плазмидой показали ее сомнительную мобилизующую активность (Lawton, Stull ,1972; Процен-KO,iS72). Перенос четырех маркерив (arg,his, pgm, trp ) зарегистрирован после включения в эксперименты ï'Cm плазмидда (производной F» lac ) (lawton,Stull, 1972).

В наших эксперзментах подтверждена низкая эффективность Р'lac плазмиды и проведян поиск плазмид, ■ аособных переносить хромосомные маркеры с более высокой частотой среди p'argE.p'iac Cm ta, ï'lao : : МО, Hly 241::Гп1, pCG8é/Ent, R64, R1drd19, НЮО, R1¿4, R245,bp 4,pKA7/ApR,piiî200/Lec+. Последняя плазмида подучена нами в результате рекомбинации рчас и плазмид и отличает-

ся os í"iac целым рядом свойств. Только в опытах с ркргоо поп о

лгчеяы рвкомбинанта с частотой 10 - 10 по маркерам leu, arg, -pro,-iys,-iiT,'_hiB,_pur,nie. Рвкшбинанты могли быть донорами. В отдельных случаях частота последующей передачи достигала 1-60$ на клетку реципиента. Анализ рекомбинантов привел к заключению о возможности формирования нестабильных плазмидных структур и ла I". ■ '

Глава 2. ТЕАНСЛОКАВДЯ ТРАНСПОЗОНОВ В ХРОМОСОМУ И ПЛАЗМИДЫ Y.PESTIS парике- распространение и удивительная полу^ункцаональность ставят мигрирующие элементы в ряд очень вакных структур любого организма. Относящиеся " этому классу Тп- и is -элементы бактерий способны самостоятельно встраиваться в молекулу ДНК, переноситься s составе вектора or одного хсчина к другому, обеспечивать

- 15 -

ракомбанацйонные гесА -независимые события, индуцировать инсер-ционные и вторичные мутации широкого профиля, влиять на экспрессию близлежащих генов, участвуя .в их. регуляции, обеспечивать перестройки renoi 1, выступая в качестве подвижных областей гомологии, способствовать гесА -зависимой рекомбинации и коинтеграции • разных молекул ДНК. Локализация в некоторых тп-элементах детерминант антибиотикоустойчивости позволяет оценивать нх как легко селекгабельные маркеры, которым могут быть"помечены" молекулы ДНК хромосом, фагов, плазмид я маркированы штаммы (Kieckner, 1981; Ильина,1986).

В наших экспериментах использовала транспозоны цni/ApR , Tn5/KraR ,Tn7/SmHTpR ,Tn9/cmH ,?nio/TcR и выделенный нами по ходу экспериментов новый in -подобный элемент Tn(j&r>-Cm)R из е.coli 323 в транспозоннодобный фаг Пц cts. После изучения плазмид RP4ts и RUs, фагов Р22 и Р1 в качества вектора по эффективности переноса in -элементов был выбран варанг и cni cirioo ^Сконструированы его варианта, каждый-из которых нес один из указанных транспозонов. ТарлочувстЕИтельность этого фага использовалась для элиминации векторной ДНК. Модифицированные для возбудителя чумы методики эксперимента позволили осуществить встройку всех перечисленных выше транспозонов в геном x.pe3tie, что подтвердило активность IS-зависимых процессов у этого микроорганизма. Контрольные тесты на наличие фагового вектора доказали его отсутствие в Га-содержащих клонах я подтвердили перагранспо-зицпю мигрирующих элемантов в геном возбудителя чумы. Частота транспозиции отличалась в зависимости от тп-злемвнта, составляя в среднем Ю"^, Ю"4, 10~6-10~® для Та5, Тп7 и остальных соответственно. Инсерцноннне мутанты выявляли в среднем на два порядка реже. Наибольшим разнообразием мутавтных маркеров характь^зо-вались трапспозанты с ТпЮ (II типов) и Тп5 (8 типов) элемента-

-levai. Помимо неидентиЗицированных зарегистрированы мутации по маркерам ilv, arg, ses, tyr, pur, ade, gua, ига, pro, trp, lys, his, nie, pan. С ПОМОЩЬЮ Гп7 ПОЛУЧвНЫ мутанты ПО arg, ilv, trp И leu ыаркетпм, ïnl -arg,ilv, Tn9 - leu, h_s, В опытах С In(Gm-Km)s

~ hio,ieu,trp и arg ауксотрофи. Ревертанты выявлялись с частого С

той - 10"° и, правило, охраняли маркер транспозона, да- • ке в гда случае, когда мутация в специальном опыте котрэндуцирова-лась с маркером ïn-элемента с частотой 100$, что подтверждало их непосредственную связь и инсерцаовдую природу. Мутанты бактерий чумы отличались от иневрвдошшх мутантов кишечной палочки обычно теряющих гранспозон пра реверсировании к исходному типу ( Вех&1977'; Kieckner, Ï98I)/но имели сходство с мутантами других видов,например R.meliloti (Baringer et al., 1978). Возбудителя чумы С последние микроорганизмом объединяет также выявленная наш способность считывать smR ген в составе ад? элемента, который не транскрибируется РИК-полшеразойк.соИ (O'Neii et ca., 1984). Полученные наш данные об нноврционноы мутагенезе, индуцированном_ ^гетерологачныш—2п-эяементаш5, JO__OCHOBHUM позициям, совпадг эз с результатами исследований ад элемента в BSKíopa F'lac, проведенных параллельно с наш в другой лаборатории (Филиппов,1982), хотя перечень полученных мутаций несколько отличается.

В исследованиях транспозон-подобного рта ыи eta доказана чувствительность к навд возбудителя чумы, отработаны условия его лизoreнизащш активным фагом, непосредственно воздействуя им на бактерш, предварительно получившие плазмиду pKA7/ApR , так и с помощью передачи плазшдн Ю4::Ии cts62 . Лизогены продуцировали активный бактериофаг, по основным свойствам на отличающийся от продуцируемого ¿.coii.E соответствии с особенностями"культивирования . бактерий чумы известные г&тодаки работы с Vm фагом были кодифицированы. Среди лизогенов после полуиндукции фага с частотой,

- 1? -

HS 2 порядка превышающей спонтанный мутагенез, обна^укеьы ..уксог-рофы. Селектированы мутанты по маркерам iiv, ßua, риг, pro,.arg, 1уэ, Ы.з, ига, glu, leu, я or, aap, trp. Большинство из них проявляли нестабильность, хотя у части мутантов с маркерами um,trp, ser, hia, arg, ade, ilv, glu, pro p'jepCIlH бЫЛИ'Нв ЧЭ-

сэ у

ще . Большое количество ревертантов, очевидно, следст-

вие высокой частоты перетранспозь^ии п^офага в другие сайты хромосомы и плазшды Y.pestia. Варианты последних со эстролкой про-фага выявлены нами в лизогенах. Вставка подтверкдена с помощью гель-электрофореза ДНК и продукцией фага рекомбинангами. Обнаруженная нами чувствительность бактерий чумы к фагу i,iu и способность последнего лнзогенизироЕать их со встройкой лрофага в хромосому и плазмида открывают возможность пгроко- о и многопланового использования Mu фага и его вариантов в генно-инженерных работах при изучении структуры, функций -_згуляции генома возбудителя ', чумы. Это подтверждают эксперименты недавно выполненные в нашей лаборатории (Ракин,Рыкова,1989,1990) и за рубежом. Работы с аьлэм проводились также в других лаборат'риях (Плотников ,1982).

Аналогично фагу ы в плазшды ï.pé: ;i's удалось встроить различные Тп-элеменгы. Обнаруясс .ы варианты внехромос'омных реп-ликонов с инсерцяоннымп мутациями известных 'плаанидных генов и с сохранением их функций. В общей сложности получены следующие в -рианты плазмид ï.pastis EY76: pïP76::Tn10 И' pY?76::i'nVPr;t+ Slb+Cgl+, pïî231 : : Гп (Qra-Km)R /Prt+îib+Csl+, pYP7С : : Tn( Grn-Km) Sst"Fib+Cgl+ ,pYV: :ТпЮ/Рга~ Tox4", pYT76: :Гп7/Рга+ Tox+,pYS7C: : ?п9/Ргв+ To2+, рУТ7б::2?п9/Рга- pYT76: :Тп1/?га-1Ъ2:+,руа'7б: :

гп7/Рга+Топ~, рГ77б: :Тп7/Cad"1, pYvyö: sTn7/cad~. Отработанную на модели штамма ^76 методику использовали в цаль.ейшем для получения маркированных плазмид других штаммов. •

Маркированные ллазмиды удалось передавать в другие rrsr.îr.?;

трансформацией по известной методике (Кокушкаи,1984), трансакцией по собственному методу и при мобилизации конъюгатиЕнша плаз-ыидами. Высокая частота сопередачи Pst+ признака с плазмидойрКА7 при отсутствии переноса хромосомных генов позволила предположить вн^.фомосшную природу этого детерминанта еще до обнаружения плаз-мидвой ДНК. В процессе передачи различным раципиентным штаммам подтвервден мутантный фенотип части маркированных плазмяд, установлена гесд и polA зависимость 6 ВД плазмиды пестицинох'внносги, несовместимость резидентных исходных плазшд и их тп -маркированных вариантов, трансдукцаонноа укорочениа 65 МД плазмидн в области fra генов при передачи гзркнрованных варилтов фагом P1 cml cirioo ts и образование коинтегратов о мобилизующими коингегра-тивныли плазмидами pKA7/ApR, RP4, R245 , которые с высокой частотой можно было передавать в различное генетическое окружение. В результате селектированы коинтегратн: рад :(pYV76;:Tn7)/Cad'f' , Ri 4: :(pYV76:: ВД)/Сай+ ,R245i :(рГУ231: t Tn7)/Cad+, названные ,COOS-ве'-отвенно, pSI77/Cad+ , pSL47/Cad+ ,pLG7/Cad+ . И Tausa pKA7i: (pYT::'Pn5, Тп9)/Рга+Тох+ pKA7:: CpYT76: : 5М10)/1'га~Гозс+ , pKA7 :: (pYT377• :Tn.10, In5)/Fra+ 3?оз:~ , обозначенные рЬ3759/Уга+ Toz+, pLS7io/Fra~'To3+ , pLs7i 5/ii&+ Tox~ . Сообщения о встройке отдельных транспозонов в 6 и 47 МД плазмиды чумного микроба появлюсь в литературе (Гончаров с соавг.,1982; MosapoB,I982;Portnoy et al.^984).

Сконструированные наш 1ц-маркирЕанные плазмиди Y.pestis и их конъюгативные варианты *егдя в основу коллекции, которая постоянно дополняется и представляет собой один из основных моментов матер" зльного обеспечения исследований генома Y.pestis.

Глава 3. БАКТЕРИОФАГИ И ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ВОЗБУДИТЕЛЯ

зшы

Трансдукцич - перенос генетического материала фагами - при исследовании генома бактерий и конструировании штаммов используется широко. Несмотря на публикации о Н и Л-413 фагах (Новосельцев, 1970; Ларина,1S69), вопрос о собственных бактериофагах и лизоге-нии у чумного микроба дискутируется или решается отрицательно ( Smith,1972). Но именно о этими фагами связаны первые сообщения о передаче с их помощью генетического материала у Y.pe-tis, в частности маркеров glp и str, а фагом Л-413 и некоторых других. Однако без дальнейшего развития этих работ проблема трансакции у Y.peatlg до последнего времени нуждалась в решении. Использование для этих целей гетерологичных фагов, в отсутствие собственных, вполне оправдано. Простимулировали и сориентировали поиски трансдуцирующих фагов сообщения о лизогвнах бактерий чумы по фагам 51dlac и рют, хотя и не способных к их репродукции ( Zit-шап, Ben-Gurion, 1972; Lawton, Molnar, 1972).

Нами исследована грансдуцирующая активность нескольких фагов, включая pivir и его варианты, Т4, Р22 и варианты фага ми. По данным предварительных опытов для дальнейших экспериментов были взяты бактериофаг Mu ota, й также pivix и P1 cmi eirioo ts. Последние, невзирая на неспособность форлировать негативные колонии на газоне культур чумного микроба и очень низкую эффективность воспроизведения БОН в бульонных культурах, проявили трансдуцирую-щую активность в отношении R -плазмид, транспозонов и хромосомного маркера leu, что отличало их от фага Mu ota, оказавшегося способным к переносу только низкомолекулярных плазмид. Параллельно с наш фаг Pivir наряду с Р1кс успешно использовали для разработки межвидовых систем грансдукционного переноса гетерологичных

- 20 1

конъюгативных плазмид на модели кишечной палочки, возбудителя чумы и псе едо туберкула за (Илотников,1982). В тех же опытах при использовании фагов И ХпЮ, Дс1 85757, Р1 cml clrioo ta зара-nicipipo: ана фаговая конверсия, а после воздействия фагами Р1 сых ciri оо ta и üu ota получены дияизогени y.poatis._

В наших экспериментах прь создаши и детальной разработке систем« грансдукцид хромосомных маркеров, транспозонов и собственных плазмид Y.pestis использовали фаг и cml clr Юо ta. Хотя он не форлировал негативных колоний на газоне культуры Y.pes-tia, но адсорбировался на поверхности бактерий чумы, вызывал лизис "г-звне" при высокой множественности инфекции и лизогенизиро-вал бакгери. Лизогани подтверждена эффектом конверсии по приз-HP4J хлорамфаниколустойчивости ( CnR ) и ограничению фагов Т7 и чумноп диагностического (активность üoopi ), по появлению внехромосош'рй фракции ДНК с М.м. соответствующей ДНК PI (около

70 МД) и способности продуцировать фаг после таршиндукции, хотя

4 4.

и в низком титре БОЕ (10 - 10 ), но серологически и литически "идентичшй-фагу_íJ__oi.u clrioo ta. Сохранение числа живы:, клеток возбудителя чумы пр снижении тигр фага и нарастаншГво времени числа корпускул с "пустыми" головками среди адсорбированных частиц при отсутствии npiзнаков чувствительности бактерй к лигическому действию фага позволила сделать заключение о существенном ограничении лятической активности и репродукции фага П cml clrioo ta в чумном шкробв. Pl-лизогенн Y.pestis различались по стабильности, и со временем часть из них утрачиЕала профаг. Длм поддержания этих лизогенов нужны были повторные циклы селекции. В то ке крепя клони, сохраняющие профаг, могли быть источником "чумного бактериофага íi eral clrioo ta. В сравнительны: экспериментах с двумя штаммами возбудителя псевдотубер-кулзза и четырит - м.onterocolitica лизогенизаровать этш

- 21 -

фагом удалось голысо один штамм энтероколитам.

Препараты фага из лизогенов испытывали на способность к общей •трансдукции. Применяя исходные и концентрированные разными способами препараты фага установили широкий диапазон маториала, которий может быть трансдуцирован исследуемым фагом. г ^.активная трансакция зарегистрирована в опытах с препаратами фага, сконцентррован-ными удьтраценгрифугированаам до ! тра 10® БОЕ/мл при М.И. 0,1 - X после контакта Ю7 - Ю^м.к./мл с фагом в течение 40 мин при 20°С. Условия трансдукции, описанные для е.coli (Дк.Миллер, 1976) не обеспечивали желаемог результата. Трансдуктанты по маркерам pur, tyr, leu, his, ига, arg, nie, trp, ¿ly, ilv, pro, ade селектировали с частотой Ю-7 - Ю^/БОЕ. Первоначально среди них были и лизогены. Селекция по tr маркеру способствовала двлизогени-зации при сохранении транедуцированного марсера. Установлено, что препараты фага из трансдукгантов-тасогенов более активны в транс

дукции. Фаг из транедуктанта-лизогана Iii порядка (3 по-ледователь-

.

ных цикла трансдукции) был с низкой литичеи й активностью (Ю -г 105 БОВ/мл), но настолько высокой гранедуцнрующей активностью (Ю-4 - ЯР^/БОЕ), что ..е было необходимости центрифугировать фаговый препарат. В одном из экспериментов с Тп -элементйми был получен .'лизоген, у которого профаг с транспозонбм ТпЮ встроился в хромосому. Из него селектирован фог, формирующий негативные колонии на газоне культуры Y.pe^tis с ■высокой эффективности, такой же, как у s.coli. Фаг по морфологическим, конверсирующим и серологическим свойствам оказался аналогичным i|ary pi emi clrioo te. Трансдукция хромосомных маркеров я плазмид с помощь» этого çfara осуществлялась с высокой эффек; явностью без специальной подготовки донорного штамм, и концентр1роЕания препаратов вибрионов. Последний вариант íara ста, источшг-ом выделения второго варианта, способного лизи^вать и лизогенизировать некоторые ста:/.:.:и возбуд::-

- 22 -

геля лсевдотуберкулвза при сохранении его активности по отношению к возбудителю чумы и кишечной палочке (р1 сш1 с1г1'оо гз ). С! его помощью осуществлена меквидовая трансдукция.

Таким образом, селектированные уникальные гариэнгы фага сш1 с1гЮо гв, способные к бляжкообразовашю на газоне возбудителей чумы и псавдогуберкулеза и методический прием выделишя трансдупирующего фага Р1 ст1 го от трансдуктантов-лизоге-

ков х.ревив 3-го порядка, обладавшего высокой трансдуцирующей активностью, наряду с полученными данными об оптимальных параметрах условий эксперимента позволили создать высокоэффективную систему трансдукционного анализа ^.рее^а, 'у. ре^иаогиЪвгси1ов1а и обеспечить возможность межвидовой трансдукции.

Глава 4. ЮДОЛИ К КАРТИГОВАШЮ ХРОМОСОМЫ данэнаА РИЗТИ

Составление генетических карт микроорганизмов - одно из самых важных направлений грнетики прокариотов. Для этой цели используют разлйчные"методы?-Сради-шх-_трансформадая и трансдукция, обеспечивающие передачу коротких фрагментов ДНК, конъюгация, до^ пускающая ориентированный градиентный перенос протяженных участков XI ллосомы, другие известные способы рекомбинационного обмена, результативные при высокой частоте совместного переноса паргтх маркеров. Данще транслозонного и другого мутагенеза, характеризующие частоту совместного мутирования или пики частот одиночных мутаций в синхронизированных культурах. Все эти приемы у возбуди-'ж-ля ч^'мы находятся в стадии исследования. По дан'-м литературы специалисты находятся лишь на подступах к картированию его хромосомы. Так, мутагенез синхронизированных культур позволил предположить сцепленность маркеров поп..р1ге..пе1;..£;1:г (Сучков, Мишань-кин,^.£72), рог..Ы.з..сгЕ. «ига (Степанов с соавт. ,1977), кап..

- 23 -

tet..psb..rif..str..nal (КудйЧвнко,1й82), а также (Маютиневс-квл,1977) локализацию на хромосоме Y.peotia генов в следующей - последовательности:о/pir..leu..пя±..pro..arc.•руг«-aor (3Q1 ) pur. .pur.. arg. ,hio. .pur. . gly (бб"'") his. .nrg. .3 -я. .arg. ,anp.. his..hla {90"^) rha.,or5..thi..pur..Glp..pyr,.pyr lSC"1". Однако этот метод картирования в литературе подвергается сомнению в связи с двунаправленностью репликаций многих бактерий, возможностью появления большего числа мутацик за пределами вилки и наличием случаев несовпадения полученных даннгос j ре:ультатами использования других методов. Ошентировочнов картирование с помощью Тп5 -индуцированного мутагенеза,проведенное пгталлельно с нами (Филиппов,1982} позволило прадположить соседство ганов met..cly.. phe.-руг.„trp, leu..ilv, руг..ilvf nie..ilv,pur..val.Сведения в литературе о классических методах картирования хромосомы у.рея-tia весила скромны и включают данные, полученные с помощью транедукции о сцепланности str за glp маркеров (Новосельцев, 1970; Ларина,1968) и с помощью конъюгации - пгс..1уз (Проценко, 1972) arg..pera (psb)..hia.. (Lan ton, Stull ,1972) И val... ilv. .ile. .pgra(pab). .Ы т. .hia.. arg1. .leu. .'pro. , lyc (Кутырев , 1992).

В своих экспершентах для выделения оцепленноети хромосомных генов Y.pestis мы использовали конъюгацию (мобилизация генов плазмидой ротгоо и конъюгагивными коинтегратами, пясашш-ми выше) и транедукцию фагами ïi cni cirioo ta pi и P1 eni olrioo ts ill, хотя весомый вклад сделан такие и о помощью транспозонного мутагенеза, а не'-оторпе предположен! : - на основания трансцепции. Свидетельства сепленности генов, выявленные при транспозонном анализе, которм первоначально оггчивали как ориентировочные, были подтверждены в опытах траг^дуклии п кооптации, где реципиенты были индуцированные -элс.ектргз мугзнгм.

Единичные данные не удалось подтвердить, что свидетельствует в пользу предположения о появлении вторичных мутантов за счет перетранспозиции 2п -элемента в отдаленный сайт. Результаты экспериментов представлены в таблице и, на гаи взгляд,могут рассматриваться как элег..ч.нты при составлении первичной карты хромосомы У.рез-Из. Эти данные позволяют оценивать разработанные нами методы и селектированные штаммы, плазмиды и фага как эффективные для целей картирования хромосомы х.резиз.

Таблица

Сводные данные о вероятной сцапленноети различных хромосомных генов У.реа-Ыг., полученные в 01 лах с транспозо-нами, пр гранедуквди, конъюгации и трансцепвди (собственные данные)

Маркеры

! Метод выявления ! сцепленности

1уэ.. .зог..аге. .Цу..-1ец..диа(ас1е). .рго.

_ ^ ______

. ига., Ну. . Ыв.. 1еи 1 1з.^иа„ . 1Г0-

1у5..а1^..Цу..1еи..еиа.. .рго.«111з..рцг..1;гр/^ ^/Чгр..руг Цу. .риг 1уз..зег

агд. . "

аг£252..1еи1 пг-256, вег7 Ыв..раЬ5 4уг9..вгг2 айсЭ..рзЪ4 .уг.1..11с . 1 уг. . ига. . £иа

ГпЮ-_

'ТпЮ Еп(Ст~Кт) Тп(От-Кш)

Тп5

1.1и с!зб1 рКР200 х Н

рКР200 т. Йг

Еио..Ь1а агг». .а^. ,у1р Ь1о..еиа ига. .Ма. .1еи диа. ,Мв. ,1еи рго..Мз..аг£

Ь1э. Леи рго..Ь1з

агг.Луг(1уг. .а^ ?)..ига..еиа

ИФ. .1;гр.^уг 1уг2..аге4 tyг2..огп5 Ыз7. .ига

Ь1в1. .ига. .агйО. ...Ъуг..а£е1 ..nlc.leu.ada3... 'Тгр.-.рго ~~ "

агеЕ... .риг.. tyг1.. аде2(?). .2иа..]гур.... .рго

Мэ... .рго. .гиа. •««риг Ь1в..1еи

рИ?200 х Тп Й!: (р:: 1'п) х 1'п

„К,

Н: !(р:!Тп) х Тп Р1 х Н

тц

Пояснения: тлю, Гп5 - анализ, вторичных перестроек индуцированных указанными транспозонами; Ми ctsб1 - вторчныа перестройки.индуцированные этим профагом; ИГ х рдргоо Тп -X рнвгоо. . -скрещивания ЕГ- и Тп - индуцированных мутантов, с донором плазмида рнргоо ; ИХ* х Р1, Тп х р1 .. трансдукцая Р1 ст1 с1гЮо га фагом маре ров в ПГ- и Тп, -индуцированные мутант; Вл(р::Тп) - скрещивания с донором, содержащим конъюгативные коинтеграгн плазмад У. ресЬ1а и . й -плазшд. ТЦ - трансцелция.

Глава 5. ПОДХОДЫ К АНАЛИЗУ ФУНКЦИИ ШЗШДНЫХ ГЕНОВ

Еозбу; '.гель чумы, как правило, содер..ит три плазвдды о М.м. около 65, 47 и 6 ВД, хотя последнее время у него обнаружены и другие (Иванова с соаь.'.,1990; Pilxppov et oi., 1990; Сердюкова с co-авт. ,I9SC; Балахонов, Ценджав,i9S2). Первые тр, которые содержат детерминанты вирулентности, исследованы в большей степени, хотя остается еще много неопределенного. Утварздается ответственность 65 ВД плазмиды за синтез "мышиного" токсина или антигена "фракция I" и "ми'чиного" токсина ( straley.Brubaiier, 1982; Проценко с со-' авт.,1983), хотя'последняя позиция подвергается некоторыми зарубежными авторами сомнению. Плазмида 47 МД, хроактерная для разных

2+

мерсиний определена как связанная с Са зависимостью и продукцией VW антигенов (Perry et al.,L986; Yother et el., 1986), ин-вазивносгью и вирулентностью (Хабаров,1990), температурным контролем роста (Yother ot til., IS86), проницаемостью стенки бактерий

~("l,ioncla~e t-«l.,-КОМПОЗИЦИвЙ ЛПС ( Г гг-

veau et ai.,1983). Обе плазмиды вовлечены в ^спреЪсикгвирулентнос-__

ти чумного микроба и определяют продукцию антигенов не только стимулирующих антигелиобразование, но и обладающих антифагоцитарыми свойствами. Плазмида 1.1.м. 6 МД детермшшрует группу прзнаков.присущих песгициноганнш штаммам и также связана с вирулентностью и ннвазивнрстью возбудатздя чумы { Surgalla, Beesley, 1971).

Для получения дополнительных сведений о функциях плазмид y.pes tic мы использовали их конъюгативные коинтеграты с r -плаз-индами в различном генетическом окружении и транспозонный мутагенез плазшдных генов. Т£01штеграт рХ^ТЭЭ/Рга+Тох4" передан бактериям в.збудителей чумы, килечного иерсиниоза и псевдотуберкуле-'ja. Для первых двух видов был характерен одинаковый уровень экспрессии гга генов (в ШГА.РНА) и наличие 1'1 антигена у всех ре комби-

нангов. Особенность:-5 энтероколитами не было разл чий в ¿ровне продукций еч при 28° и 37°С культивирования. 7 возбудителя, псевдотуберкулеза обнаружена только у части клонов, получили ших коинтаграт; продукция гч была re рыоинду ни бальной. Наиболее высокий уровень продукции з?1 зарегистрирован при 40°С. У реком-банантов е.coli антиген Л не обнаружен. Передача ковнтеграта pSL77/Cad+ обеспечивала экспрессию признака Ca . зависимости у трех еидов иерсиний, но не у е.coli. Особенность экспрессии у г.enteroeolítica -гибель бактерий npi 37°С на полной среде Хя17чи-Смита и только стаз их. при отсутствии крови в ней. У чумного микроба в этих условиях гибли единичные клетки или меньшая часть популяции.

У сконструированных рекомбинантов ш: ято'и Y.peatia та, 556/ Otten, Y.enterooolitica lucas 421 И Y.pseudotuberculocia 463 определяли летальный и протекtm_hlJ эффект при подкожном введении бактерий белым мышам и морским свинкам.. Ни один из рекомби-нангов с одиночными и совмещенными'65 Щ и 47 МД плазмидами не • вызывал гибели морских свинок в aljc 10^ м.кл. Защиту 100$ животных от заражения вирулентным штаммом возбудителя чумы (200 dcl Y.pestis 231) обеспечивал только ракомбинант штамма '-CS с двумя плазмидами, а таксе исходный и рекомбинантные варианты штамма y.pseudotuberculosis 463. Результаты опытов на белых мышах приедены в таблице. По итогам исследований можно заключить, ч ±о для летального действия на морских синках недостаточно присутствия двух (47 МД и 65 ВД) ила грех (6 МД, 47 МД и 65 ЩО плазмид чумного микроба, а также участия хромосомных генов, фушшцониругадах у исследованных шгакмов TS(Psb+) и 556/btten(P;:t+). Тогда гл.. протективная активность бактерий на морсгчх ci ni-iax проявилась сразу после приобретения ДНК Бо ОД плазыидн не изменилась с приобретением только 47 МД "лазшды и явно возшсла после собесе-

ния .тщ обеих плазмид. Наличие описанного эффекта у штамма ча, но не 556/6^еп свидетельствует о необходимости функций хромосомных генов, дефектных у последнего штамма. Сравнительное детальнее исследование фенотипа обоих штаммов дает фактический материал, полезный для решения проблемы вирулентности у.рез!1а.

.. .. Таблица

Летальный и протекствный эф^кг трансдукгантов-иерсиний с коин те гратами рЗЪ77/С&<1+ рЬ375Э/Рга+Тозс+

Штамм

Отношение числа животных,инфицированных различными дозами грансконъюгантов

_к числу 1_

¡выживших после в торичного заражения 200 всь

•у.рез1:1з "231

выживших

! Ю9 ! юа ! юа

Х.ре,-зив И, /рХС 6/2(33««) 6/0(055) 6/3(50%)

- 9рЬ3759/Рга+ 12/8(6755) б/осе ') 6/ 4(6755)

- 18р15759, рЬЭ77 12/10(8355) 6/0(055) 6/6(100%)

-556/ _ /рХР 10/0 (еда 12/0(0%) 4/0(055)

- ирЭЬ77/Сай-1" - -12/0 (0^3)__ 12/0(0%) ' 6/2(33%)

- 4рЬЭ759/1':га+Тозс+ 6/6(10055) 12/0(ОЙ) ~6/6(100%)_____

- 12рЭ1)77, рМ759 6/6(10055) 12/2(1755) 4/4(100/.))

Х.ег^ госоИ1;1са Ьисеа 421 6/6(055) 6/6(0») 6/0(055)

- 14рЗЬ77 6/0(0/5) 6/0(0%) 14/1(7%)

- *"рЬ3759 12/1 2(Ю0?£) 12/2(1755) 4/3(7555)

- 23р3177, рШП

24/24(10055) 24/2(87+14%) Н/0

463 б/0(6%)

рЗ£77 б/О (с/О

6/4(67%)

р1£759, рЗЬ77 ' 6/6(100%)

Х.рсэ^с 231 рГГ.рУУ.рИ1 6/6(10055)

ЗС.везиз 231 р1В759,р-^>77»

р'Л -6/6(100%)

Г.рег-Ие Е776 ?1'Т,рУУ,рУ1 н/0

5/0(ОЙ) 6/„(100%) 6/0 (0/5) Н/0

6/0(055) 6/6(100/5) 16/1 5(94+11/5) 6/6(10055) 6/6(100%) Н/0

6/6(1005«)

Н/0

Н/0 6/6(10055)

Связь легального эффекта У белых мышей с 65 МД п лажи доя, но не с 47 МД репликоном, и усиление его пра наличии двух пяаз-мид выявлена в другой серии опытов. Анализ прогективносги бактерий для белых мышей выявил: X) явную тенденцию к проявлению ее у всех pYV/cad+ траноконъюгантов; 2) протективность всех трансконыогантов с коинтеграгом рЬ3759/Рга"|'Тох+ и 3) повышение иммуногенносги при совмещении обеих плазмид. Степень повышения протективности при введении 65 !ЛД плазмиды была большей. Обнаруженные закономерности проявлялись аналогично у всех рекомби-нантов независимо от вида.

Таким образом, 65 МД и 47 МД плазмиды играли различную роль в обеспечении прогективносги и летального эффекта бактерии-носителей. Вклад плазмид изменялся в зависимости от вида животных. Важно было отсутствие дефекта хромосомных генов, участвующих а экспрессии исследованных свойств.

Передача коинтегратов с ДНК полноценных плазмид чумного микроба различным штаммам со сниженным уровнем- вирулентности и им-муногенности или с утратой этих свойств при контроле их восстановления после приобретения'плазмид использовалась как методический прием для первичной локализации дефектов детерминант вирулентности и иммуногенносги. В зависимости от положительного или отрицательного эффекта передачи показана связь дефекта 65 МД плазмиды (вне £га и tox генов) со снижением вирулентности у штамма Y.pestia 363; хромосомных генов со снижением иммуногенносги у штамма Yawa- и нарушений в 47 МД плазмиде со снижением иммуноган-ности у штамма Y.pe3tia as. Выявлена зависимость вирулентности и иммуногенносги от хромосомных генов у штамма Y.peatia /ai45 и частичная "виновность" дефекта его 47 ЦП плазмиды (локализация за пределами сад -детерминанты) в снижении его ишуногенносг'.

На модели тп -и иду даров аиного pst- мутанта штамма у.рее-

231 и ьт76 показано, что неспособность продуцировать песги-цин I не сказывается на вирулентности и иммуногенности бактерий.

для морских свинок а белых мышей независимо от продукции лео-тицина при подкожном введении была в среднем на уровне 10 ы.кл. 1и1)50 для белых мышей колебалась в пределах 200(8*316) и 170(68|> 269) соответственно.

Тп -индуцированная мутация с Рга" фенотипом использовалась для уточнения роли 14 антигена х.ресИа в антимакрофагальной функции у бе лих-мышей и морских свинок. Выявлено, что антиген способствует ахврту 37°-бактерий перигонеальными макрофсгами у морских свинок независимо от иммунизации, а у белых мыше!: только

у

после их иммунизации, что наводит на мысль о двойном механизме (специфическом и неспецифическом) действия "1 у морских свинок и о необходимости специфических иммунологических перестроек в макрофагах белых М1 ¡ей. В антимакрофагальной защите фракция 1 более значима в организме морских свинок, независимо от их вакцинации, и ~оказьшаег~лпшь-слабо8^воздействие на макрофаги вакцинированных

белых мышей. Показана несколько большая завденностъ-г\г?а~~биКте^_ рий от макрофагов, после выращивания про 28°0, что свидетельствует о более активном синтезе в этих условиях ангшакрофагальных факторов, не обладающих серологической активностью гч антигенов.

Таким образом, подученные данные, представляя новые сведения о возбудителе чумн и конкретно об исследованных штаммах, демонстрируют продуктивность предлагаемого нами подхода для анализа функций плазмид х.рез'Ь±с с помощью коинтагратов п маркированных транспозонами плазшдных вариантов.

Глава 6. КОНСТРУИРОВАНИЕ ШДЕЛЬННХ ШШ0В,' ИН-

ткзируюш некоторые антигш, дотрш-

НИРУЕШВ ПЛАЗШДПШИ га-НШ X. pbstis

Антигенные компоненты Y.pea tig, влияющие на гуморальные ц клеточные факторы защиты макроорганизма от чумн, широко исследуются, но имеющихся сведений явно недостаточно для расшифровки механизмов иммуногенносги. Даже наиболе изученные антигены, такие как фракция I, "мышиный" токсин, vvv античны и некоторые другие охарактеризованы не полностью. Одним из подходов к изучению антигенов является введение соответствующих клонированных детерминант в гвтерологичное окружение с последующим изучением их экспрессии, свойств продукта данных генов и его влияния на фенотип бактерии-хозяина.

Не применяя клонирование, интересующие пяазмвдные гены мн передавали в составе конъюгативньх пойнтегратов внехромосомннх репликонов. чумного микроба и н -плазмид разным иерсиниям и другим бактериям сем. Enterobacteriaceae (P.mirabilis,P.vulgaris, E.ooli,S.dyaenteriae,IC.pneumoniae, C.ireundii), Cad -оперок 47 МД плазмиды экспрессировалсд только в исследованных штаммах Y.pestis, Y.enterocolitica, Т.pseudotuberculosis. Антигенная детерминанта "мышиного" токсина определялась в .реакции ^ДП. с антитоксической сывороткой при изучении сконструированных модель-то: тгаммоЕ всех исследованных видов. Вариабельность интенсивности линий преципитации и различная jx локализация обусловили заключение о разном характера экспрессии tox детермиг-нты и образования продуктов, отличающихся по структуре и количеству.

Продукция фракции I в присутствии ДНК 65 ЦД плазмиды обнаружена у рекомбинангов r.pestis, С. freundi„, Y.^iterocolitica, У.pseudotuberculosis, К. pneumoniae (указанны:: В Порядке убывания уровня 1.ШД у интактны йактерай), но не " исследование vrz:.~

- 32 -

MOB E.coli, S. dysenteriae и протея ДВУХ еидов. отличия" МНД в И1ГА колебались в Пределах 2-3 порядков и почти неЕелироЕались npi исследовании бактер1й, обработанных ацетоном, что позволило предположить существование определенных сложностей в процессе Е.'.скрецяи на поверхность бактериальной клетки у к.pneumoHiae а меньшую продущруюцую активность у у. pseudotuberculosis .Особый интерес представляли штаммы бактерий, не относящихся к иереи-няям. Активный синтез фракции I, сохраняющей протектпЕьую активность, но имеющей более высокую, чем у Y.pestis ищунохимичаску ю активность, дали возможность прдложить их как модельные штаммы-продуценты антигена 14. ¿нализ личных штаммов к.pneumoniae показал отличия по способности их рекомбинангов продуцировать антиген F1, что подчеркивает необходимость предвартель-ниго отбора перлиссавных штаммов при конструировании продуцентов.

Рекомбинангы "наверсяниозных" шгаммог, подучившие ДНК 47 и 65 МД плазмид чумного микроба, практически не меняли уровня сво-еч~исходной-низкой пагогенноета или авирулантности и не представляли опасности при работе с ними. Установленот~что-рекомбинанты_

одного из исследованных штаммов клебсиеллы, первоначально охарактеризованного как РеЪ4", Cgi^Pib* и продуцирующий бактериоцин ( Рпо+) проявлявшие ^нотид Fra+a?ox+ после приобретения 65 Щ сазмиды и получившие ДНК 47 МД плазмиды, не вызывали гибели белых мышей посла подкожного введения 10^ м.кл., а при вкутрибрю-пшнно... инфицировании той se дозой пс выракенности ле .-ального эффекта не отличались от исходного штамма и были "слабее" чумной вакцины 'iiljmm ev76). Перечисленное подчеркивает полезность ре-комбинантор этого штамма.как модельных при изучении механизмов вирулентности и ишу..эгвнносги Y.pestis.

Глава 7. СВОЙСТВА ДОНОРНЫХ ШИЛОВ y.PESKS,

ОБУСЛОВЛЕННЫЕ ПРИОБРЕТЕНИЕМ РАЗЛИЧНЫХ КОИЫаГАТИВИК ПЛАЗШД

Широкое применение генетических"методов исследования возбудителя чумы, предусматривающих использование различных гетероло-гичных плазмид а фагов, обусловливают необходимость анализа подученных результатов в двух аспектах. С одной стороны, выступая "индикатором" функций определенных генов, эти плазмида и фага могут способствовать получению новых характеристик генома бактерии-носителя, с другой - они могут оказывать дополнительный, нежелательный, в том числа и неизвестный, эффект на фенотип рекомбинан-тов, который создаст сложности выполнения экспериментов и приведет к ошибкам трактовки их результатов.

По ходу исследования и в итоге анализа полученных рекомбинан-тов y.pestis наш обнаружен эффект некоторых плазмид и фагов на фенотип бактерий чумы. Так, напрмер,Р«1ас, рСйвб, рнргоо влияли на чувствительность к различным фагам (чумной диагностический фаг Покровской, Л-й13"С", Н-3, Ш,Т7) за счет снижения рецепции я ограничения внутри бактерий. Плазмида у lac индуцировала формирование 1ои -типов бактерий у исследованных штаммов, а рнргоо - снижала агглюгинабельносгь чумной диагностической сывороткой. Помимо нарушения экспрессии cat -признака и интеграции или 3,_î-минацин 47 ЦЦ плазмиды, свойства присущего F" lac и рстгоо плаз-мидам, их присутствие неблагопрятно влияло на проявление РоЪ+ признака. В меньшей степени это было характерно для pCG86 и R6 плазмид. Все перечисленные вшпе плазмида у значительной части ре-комбинанюв заметно или в значительной степени снижали вирулентность, а иногда и нммуногенносгь бактерий-носителей. Относительно первой зто проявлялось либо увеличением либо удлинением

срока казш павших животных, а иногда уменьшение., обсемененности их органов. По всей вероятности, опосредованное плазмида;,;:! пзме-

- 34 -

неше поверхностных структур, включая ЛПС, проницаемости клеточной сгенки у Y.pestia нарушает и функции бактериальных компонентов, существенных для инвазивносм и токсической активности возбудителя. Bawo учитывать а способность некоторых плазмид { R245, EidrdT9) усиливать мутагенез и устойчивость к УФ-свету, феномены, связанные с механизмами защиты бактерй в условиях стрессов. Выполнение экспериментов по генетическому анализу редко обходится без необходимости наведения селактабзльного признака, чаща ангибиога-коустойчивосги..При селекции híxr реципиентов r.pestis обнарука-на сопрякеншгть этого маркера со снижением урогня продукции пес-тицина -t, повышением частоты утраты или возможности интеграции с хромосомой резидентных пльзммд, снижением степени Ca¿* зависимос-

?4

ти, появлением Са , - независимой терлочувсгптельности, индуцируемой таю-j некоторыми плазмидами ( м?4 ).

Использование плазмид и фагов в качества "индикаторов" позволило определить дефектность Y.pestis по umu CD генам sos -ре-"ларадаи^функцаонироваыиа^розл, lexA. и гесА генов, ингибицаю экспрессии hijr генов кишечной палочки генами 6~ЩГплазмидн-чум-— ного микроба, сохраняющими активность и после "выключения" ist+ признака инсерцией гранспозона, особенности ШК-полимеразн возбудителя чумы.

Таким образом, целенаправленное'проведение экспериментов в обсуждаемых аспектах может быть крайне полезным не только для коррекции и' совершенствования методических приемов конструирования штаммов с заданными свойствами, но и-при выяснении механизмов, -обеспечивающих физиологические проявления возбудителя чумы и формирования его фенотипа.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В заключении подведены итога разработки методов генетического обмена и картирования хромосомы у Y.pestia с использованием ге те ро логичных фагов, плазмид и грэнслозонов. Обсувдены факты обнаружения трансцепции и синтрофизма у возбудителя чумы и, с учетом новизны полученных данных, эффективность использования конъюгатив-ных плазмидных коинтегратоз с ДНК чум^.х плазмид и гарантов последних, маркированных га-элементами в иссле, званиях вирулентности и иммуногенности возбудителя чумы. Проанализированы эффекты использованных гетерологичных плазмид и фагов ня фенотип возбудителя чумы. Суммированы результаты разных экспериментов и на их основе сделан ряд предположений относительно особенностей возбудителя чумы, анализ которых будет полезен для диигносх'ики и понимания механизма патогенеза. Показан вклад данного исследования в развитие генетики возбудителя чумы.

ВЫВОДЫ

1. На основе сконструированной рекомбинантной плззмиды PKP200 и селектировг-лных из лизогенов-Р^нсдуктантов Y.pestis вариантов фага Pi cml cirioo ts, образующих бляпки на' газоне культур возбудителя чумы и псевдотубаркулеза,разработаны системы конъюгаиконного о&шна генетическим материалом и высокоэффективной общей грансдукцаи внутри вида "jf.pestia и-между ро^сченными видами.

2. Обнаружена слособкосгь Y.pestis к передачи генетического материала в условиях, характерных для трансцепции.

3. Доказана эффективное!j использования гетерологичных in -элементов и ми -бактериофага в экспериментах о x.pcatia

для инсерционных мутаг !й, образования коинтегрзг вних связей, обличающихся реп.\.:конов, маркировки плазмидных и хромоссмшх Дй, исследуемых штаммов и конструирования шт^-в с задашь: : с:?-:;:-

стзгми,з том числе донорных.

4. Отработаны методики и показана возможность использования котрансдукцив, транспозонного анализа, трансцепции и мобилизации коиъюгатайными плазмидами генов ï.pestis дль картирования ее хромосомы. Выявлено несколько групп сцепления хромосомных маркеров.

5. Обнарукен феномен сингрог'чзма у возбудителя чумы и отработаны тесты с его использованием.

6. Сконструированы конъюгативные коингеграгы ДНК маркированных транспозабельными элементами 47 МД и 65 МД плазмид возбудителя чумы с в -плазмидами и с их помощью разработаны методы анализа структуры, функций генома возбудителя чумы и особенностей его рефляции, а такяе способы конструирования штаммов, продуцирующих ан нгены Y.pestis, и модельных штаммов на основе гвтерологичных бактерий и в различной степени „зфектных штаммов возбудителя чумы.

7. Помимо трзх основных видов иерсиний экспрессия £т& генов "в0йудителя_чумы-в-сос1::ва_65_ВД_резидвнгной плазмиды доказана у бактерий испытанных штаммов K.pneuEoniae И C.~£reundii,-HO-He__ P.vulgaris, S.dysenteriae, P.mirabilis, E.coli. Видовая специфика бакгерий-хозяина, обусловливает особенности регуляции генов, ypoBbi синтеза я экскрпцаи генного продукта. Подучены свидетельства экспрессии антигенной tos -дете^шнанты ï.pestis е Сактери-ях испытанных в."дов сем. Enterobacteriaceae. Прямыми опытами подтверждена специфичность экспрессии cad -оперона для трех испытанных видов иерсиний. Сконструированы модельные рекомбинантные «атамаы различной ендовой принадлежности для изучьлия регуляции плазмидных генов возбудителя чумы, структуры и фушший их продуктов,

8. Бри введении ДНК 47 МД и 65 МД плазщд Еозбудителя чумы в бактериях испытанных штаммов y.^-stis, Y. pseudotuberculosis

x.entorocoiitica и к.pneumoniae получены доказательства различной значимости эт. рапликонов для летального и протективного эффектов бактерий-носителей и усиления их при совмещении двух плазмид. Методы передачи полноценных плазмид в дефектные по ним штаммы возбудителя чумы выявлены свидетельства большей значимости для вирулентности комплекса хромосомных генов бактерий, в частности для морских свинок. Показаны отличия в детерминировании вирулентности и иммуногенности y.peatis вообще и в отношении морских свинок в частности.

9. Присутствие ДНК 65 ВД и 47 !ДД плазмид чумного микроба при наличии собственных Psb+ Cgl+ и.ъ+ маркеров, а также собственного бактериоцина у бактерий штамма к.pneumoniae 1017 не обеспечивает их легального и протективного эффекта при подкожном введении белым мышам и морским свинкам, но способствует гибели белых мышей при введении I млрд режомбинангных бактерий вцуграбршшннг аналогично противочумной вакцине, при наличии лишь слабой иммуногенности.

10. Введение гегерологичных плазмид в бактерии чумы может без учета плазмидных маркеров и е зависимости от свойств плазмидц вызывать изменение генотипа и фенотипа r.pestis, включая изменение плазмидного состава, шрушепе процесса клеточного деление, снижение чувстнительноеей к различным, в том числе специфическим бактериофагам, изменение бактериальных поверхностных структур, степени Ca „ -зависимости, шшлентсорбдаи, зроЕня продукции фрак-цгш I, песгидана 1» чувствительности к УФ-дучам, уровня УФ-индуци-рованной и спонтанной мутабельности, снижение степени вирулентности и иммуногенности, особенно при поднеиноы способа введения бак-торий, и другие свойства. Введение гегерологичных плазмид с последующим изучением свойств бактерии-носителя может 1ыть тестом,позволяюsat*. распирать ее характеристику: у возбудителя чумы выявлен

дефект unu cd генов, особенности поЕеденяя orí собственных плаз-шд и их доминантность над ori к -плазмид в составе коинтеграта, полноценность гесл и polA г^нов, функциональность генов, ооеспе-чивающих is -зависимую рекомбинацию, и их высокую активность, наличие рестрицирующей активности в отношении плазмиды-фага Р1, кон-

2+

г.'рентностъ плазмиды Ca .- зависимости и исследованных двух Lao+ - ' плазмид, особенгюоги регуляции pat -гена и конкуренция его с hly -генами.

сти00к научных работ, опубликованных по теле • диссертации

I. Лебедева. Q, А. Раком'акация у чумного микроба//-Генетика,' биохимия,ишунол.особо опасн.инй.-Ростов-на-Дону.,1-67„-С.З-5.

Лебедева С.А. Некоторые свойства рекомоинантов чумного микроба, несших эдасомы множественной лекарственной-устойчивостй. //Физиол» и генгдака микроорг.:Матер.конф.микробиологоЕ Сев.Кавка-за/сект.,1969/. - РостоЕс-на-Дону,1969. - С.36-39. .

- 3. Лебедева С.А., Сучков Ю.Г,,~Дбмарадский Й.В./ Синтрофизм. ~у~^чумного"шкроба//-Бол.экс5П8р.0иол. и мед. -М., 1970.-Т.69, 1<¡ 3.

- С.79-81. ' . . . -. ' ' . -------

4» Кольцова Е.Г., Сучков Ю.Г., Лебедева. С А. Передача факкь-ра бак те роди но гении у чумного микроба при конъюгации //Генетика.

- 1971. - Т.7, ¡h 4. - С. 126-128......

"* 5. Лебедева С.А. ,1.1ишанькш Б.Н. Инактивация, хлорамфеникола чумными бактериями с эпноомной устойчивостью к антибиотику// Антибиотики. - i£?2..- tf 9. - С. 806-808, .

6. Лебедева С.А,, Мишанькин 'Б.Н., Сучков Ю.Г. ..Зписомная резистентность чумного микроба к пеницпллинам // Антибиотики. -1972.

-.'¿Ю. -.С.908-912. . .

7. Биохимия и генетика возбудителя чумы / Домарадский И.В.,-Голубинский E.H., Лебедева С.А., Сучков Ю.Г. - М.: Медицина,ÍS74

Б. СучкоЕ Ю.Г., Mr анъкин Б.Н., Лебедева O.A. О возможных путях генетического картирования хромосоимы.чумного ршрюба //QpocS— ламы особо оласн.инф. - Саратов,±974, - В.2/36/. - C.I55-I58.

9. Лебедева С.Д., Полушковекая С.С. Влияние д -факторов на поведение РЧас. эписомн в бактериях чумы//Внехромосошая наследственность бактерий: Матер.Всесоюзн.совещания по программе "Плазмида": I/.оскза, 1Ь75г. - Ы. ,1975 - С. 56

10. Коробейник Н.В., Домарадский И.В., Лебедева С.А. Резистентность к левомицетину и активность некоторых фериенгов у возбудителя чумы и юшечлой палочки// Ж.млкробиол. /Москва/. - iS76.

- л* 6..- 0. 45-52. .

11. Лебедева С.А., Полушковская С.С. Влияние клетки-:">зяина на поведение Д-плазшдн// Структура п функци», плазмид: Тез. докл.: Всесозн.совещание по программе "Плазшда": Краснодар,iS80.-М.,1980. - С.145.

"12." Лебедева С.А., Манысова Л.И. О стабильности ЕЧас . плаз-мид в бактериях Yersinia резЫз // Структура и фикции плазмяд: Тез.докл.: Всесоюзн.совещание по програше "Плазмида", Пущино-на-0ке,1а81г. - U.,1981. - C.I23-125.

13."Лебедева С.А., Ракин A.B., Гуревич Г.К.// Чувствительность Yersinia pestis к кишечным умереннш бактериофагам. pi omi cirioo ts и Mu cta62 // Внехроыосомнь- генетические элементы: значение для науки и прктики: Всесоюзн.совещ.по программе "Плазмида": Тез. докл.: .Пущянс-на--Оке. х981г. - И.,1951. - С.123-124.

14. Ракин A.B., Лебедева С.А. Лйзогеиязация 'Yerainia peatis бактериофагом Mu с пшощьш плазмидь. EP4s:Uu ct352 "// Внехрсмо-сомные генетические элементы: значение длй" чауки и практики: Тез. докл.: Всесоюзн.совещание по программе "Плазмида". Пущино-на-Оке, 1981г,.- M.,I98I. -C.I24-125.

"15.. Гуревйч'Т.К., Лебедева С.А. Особенности поведения кишечного'-'бактериофага PI в бактериях возбудителя чуми// Молекул, .биология.и генетика Еозбудиг.особо опасн.инф. - .СаратоЕ,, 382.-Ч.х. -С. 18-20. .... "

Т6. Заренков М.И., Лебедева СЛ. Транслокация транспозонов в плазмида Yersinia pectis . // Ыолекул.биология.п генетика возбудителей особо, опасн.аиф. - Сарат 2,1982. - 4.2. - С.¿7-28.

.17h. Лебедева С.А., Маньков* Л.И.', Рихков B.C. Влияние плаз:.::;д на эффективность мутагенеза у Yersinia pectis // Селекция и генетика возбудителей особо опасн.инф. Др.ппотиЕ^чумк у. учр./. -Саратов,1982. - С.31-Г'.

18. ¡.йньковя Л.И., Лебедева С.А. Зли: ш пирующий о^ект акрид:: -нового оранжевого на ?Чг- плазмядн в бактериях Yersinia tis // Болезни с природной о'чговостыо на Кавказе:

научн.тсонф., посвящ. 60-лет.образов.СССР. -Ставрополь,1982.-С.97-

98. .

19. Ракин A.B., Заренков М.И., Лебедева С.А.-Взаимодействие бактерВй иозбудателя чумы с гетерогенными бактериофагами// Болезни с природной-очаговостью на Кавказе: Магер.краевой научн.конф., посвящ. 60-лет.образов.СССР. - Ставрополь,1982. - C.89-SO.

20. Руревач Г.К., Дегтярев Б.М., Лебедева С.А. Лйтйческая активность бактериофага P1 cmi cirioo ts в отношении Yersinia postin //poс TOB-на-Дону,1983. - Юс.-Деп. в ВИНЯМИ мз СССР,-

>iK 6725-83. - Мед.реф.журиал.- -IS83, -.Раздел I2.--C.37I2.

21. Заренков М.И., Гребцова H.H., Лебедева С.А. Транслокация Транспозонов.ЗСпЮ и Тпб В хромосому Yersinia pestis /ДвНвТИ-ка. - 1983. - T.i9, ¡> Ю. - С.1593-1603.

22. Ракин A.B., Лебедева С.А. Способ ллзогенизации чумного микроба: A.c. а 1069430 СССР МКИ CI2 И15/63/Росговский-на-Дону научно-исслед.прогивочумн.ин-г 33042; Заявл. 18.06.81,.

23. Заренков М.И., Лебедева C.Ä. Способ получения ауксстроф-ных мутантов Yersinia pestis; A.C. « 1171522 СССР МКИ С12И15/ Ростов ский-на-Дону научно-исслед.прогивочумн.ин-г л 3559249/28-13 Заявл. 28.02.83. '

24. Лебедева С.А., Руревич Г.К., Милютин В.Н., Кирдеев В.К.

_Лизсгенпзация Yersinia pestis бактериофагом PI cml сМООV"A'o-

лекул.генетикаТ^^984Г^^ I. - C.j.8-21.--- -^______

25. Лебедева С.А., Руревич Т.К., Заренков Ы.И-,, Милютин В.Н. Трансдущия у Yersinia pestis, осуществляемая бактериофагами

л vir и Р1 cmi cirioo ts /Д1олекул.генетика. - 1984.-й.-С.18-

» а.

26. Стыценко Т.М., Лебедева С.А. Чувствительность к УФ-ду-чам накогоры штечыов возбудителя чумы// Молекул.биология,генетика и шзднол.возбудателей особо опасн.инф.:Всесоюзн.конф.мододых ученых 1,3 СССР: Таз.докл. - Ростов-на-Дону, 1984. - C.Si-63.

27. Гребцова H.H.,Лебедева С.А., Чернявская A.C. Мутагенный OuieKT грансДУКЦИИ ( am-Km)R гена плазмиды ВЭ23 в Yersinia pestis// Уолекул.генетика. - J.S85. - 3. - С.22-27. 1

28. Заре-шоЕ М.1Г., Лебедева С.А. Коинтеграты тяжелых плаз-кид чумного микроба// проблемы переноса генетич.инфор,1.: Тез. дом.: X Всесоюзн.совещ. по программе "Плазмида" Пущино-на-Оке,

г., ;.1.,х985. - С.73-74.

2 . Заренков К.И., Лебедева С..'.. Получение маркированных

транспозоноы плазшл Yersinia pestle //Лолекул.генешка.-19ъ5. - Ju.0. - С.20-25.

30. ЗаренкоЕ М.И., Лебедева С.А., Гуревич Г.К. Способ трансакции хромосомных маркеров и плазшд у чумного микроба: A.c. а 1304406 СССР "КИ С12 И 15/63/Ростовский-на-Дону научно-исслед. протЙЕочумн.ин—г J* 3858282/28-14. Заявл.25.02.85.

3i. Лебедева O.k. Использование конънгагивных плазмид при анализе генома Y.pestis //Проблемы переноса генетич.инфорл.: . Всесоюзн.совещание,по программе "Плазмида".:Тез.докл.:Пущино-на-Оке,i985 г.; - M.,iS85. - С.Ю2-103.

'32. Лебедева С.А., Иванова B.C. Влияние некоторых i"lac плазмид на' свойства трансконъюгантов. Y. pestle //Проблемы переноса генегич.информ.: Всесоюзн.совещ.по программе "Плазмида". Тез.докл.-И., 1Ö85. - С.ЮЗ-104.

'33. Ракин A.B., Лебедева С.А., Алешин Г.И. Взаимодействие бактерий Yersinia pestis с бактериофагом Uu ots62 /Д1олекул. генетика.'- 1S85. - w 9.- С.6-11.

34. Заренков М.И., Лебедева С.А. Мобилизация плазмидных детерминант чумного микроба с помощью плазмида рКА7 /Д1олекул.гене тика - iS86. - ji 5. -.С.16-20. . .

35. Лебедева С.А., Заренков Н.И., Алешкин Г.И. Влияние плаз-мида R245 на индуцированный мутагенез у Yersinia pestis /Д1о-лекул.генетика. - 1S86. - j/7. - С.15-1.9.

36. 1^реЕИч Г.К., Лебедева С.А. Трансдукция и котрансдукция хромосомных генов У Yersinia pestis фагом cml clrlOO ts // Изв.Сев.-Кавказ.Высш.школы.-Х987. - ¿s I. -C.100-i007.

37. Особенности методических приемов при работе с возбудителями инспекционных болезней человека I и П группы патогенности 'акте риальной этиологии. (Практическое руководство ГОЧИ).Составили Уралева B.C., Гулида М.М., Лебедева С.А. и др. - Ростов-на-Дону, 1989. - 208с.

38. Косое Л.В., Лебедева С.А., Тигенно М.Ы. и др. Изучение протективного антигена Fl оболочки чумного микроба,зкспрессиро-ванного е трансконъюганге нетипичного хозяина// Эпидешол.,микро-биол.»иммунология бактериальн. и вирусн.инф.: Тез.докл.:Всесоюзн. научн.конф. 17-20 окт«. 1989г.. Ростов-на-Дону, IS6S, -С.29-30.

39. Гребцога H.H.,'Лебедева С.А., Чернявская A.C. Изучение значимости пестццина i для вирулентности и имкуногенности чугпого микроба// Ж.микробиол.Д1осква/. - 1991. - - С.8-11.

40. Гребцова H.H..Лебедева С.А.,Чернявекая A.C..Иванова B.C. Изучение фагоцитарной активности пери тонаальнше макрофагов в от- . ношении Yersinia peatio с дефектными и полноценными £га гена-ми/Д.микробиол./Москва/, - 1990.- ^ 5. -C.7-J-i.

41. Г^ревич Т.К. .Лебедева С.А".Способ передачи плазмидной ДНК и хромосомного материала у чумного микроба" А.с.4798622 СССР МНИ 12Ш5/63/Росговскйа-на-Дону научно-исслед.прогивочумн.ин-г

И 4798622.Заявл. 05.03.90.

42. Иванова В.С.,Лебедева С.А.,ГУрлева Х'.Г..Гончарова Н.А.Скри-нинг плазмид чумного иикроба/Д1олеку л.гена тика.-J.990.-^¿3.-0.44-47.

43. Чернявская A.C..Лебедева С.А..Гребцова H.H.,Кузнецова Д.С.. Значимость некоторых плазмидных и хромосомных детерлинант вирулентности чумного микроба для специфического имыуногенеза//Бактериаль-ныа плазшды.Всесоюзн.научн.конф.:Тез.доклд.-Нальчик,19S0.-C.44-46.

44. ЛебедеватС.А..Гребцова H.H...Чершвская А.С.и др'.Способ получения вакцинного штамма Yersinia. к.с.'» 1709730Я СССР ШИ Ci2 Н 15/01/ Ростовскнй-па-Дону научно-исслед.противочумный ин-т ¿*48Ö0323/i3. Заявл.хх.Oi.üO.

45. Лебедева С.А..Гребцова Н.Н.Чернявская A.C. и др. Влияние плазмид чумного микроба на летальность и имыуногенность/ДЛолекул. генетика,--1.991. - 3. - С.5-10.

_46._Дебедева С.А..Кузнецова Л.С.,Еичуль O.K. и др. Изучение зависимости экспрессии 65 МД плазмиды чумного микроба от специфичности генома бактерии-хозяина/Д1олекул.генетика,--1.991 .«f4.-C.7-i0.

47. Кузнецова Д.С..Лебедева С.А.,Гребцова H.H. и др.Влияние генома бактерии на экспрессию и поведение плазмиды,определяющей Са^ зависимость чумною шшроба/Д.юлекул.генетика.-i99i.-4>4.-С.iO-хЗ.

48. Лебедева С.А.,Евтееиа Е .11. .Иванова В .С.Некоторие свойства RifK мутантов чумного ми к роба//.Антибиотики .-i99i.-^36.-C.7.

■49.'Лебедева С.А..Кузнецова Л.С.,Коссе Л.В. Штамм Citrobacter "freundii ЫЛ-j. - продуцент антигена "фракция i" чумного микроба: Патент Росговского-на-Дону научь.-исслед.пропшочуын.ин-та: Заявка a 5024x72/i3 приоритет от 03.07.9i положит.решение от 06.05.92.

50,ГГуревич Г.К.,Лебедева С.А. Локализация хромосомного генетического де терли нанга, влияющего на вирулентность возбудителя чумы// Генетика и биохимия вирулентности ¿зозбудителе«; особо опасн. инф.: Матер.Россилск.научи.кон> Волго1рад 2—22 окт.-9ь2г. -Волгоград, itb2. - С.х4.