Генотоксическое действие долгоживущих радикалов белка, индуцированных рентгеновским излучением

Карп, Ольга Эдвиновна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Генотоксическое действие долгоживущих радикалов белка, индуцированных рентгеновским излучением
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Генотоксическое действие долгоживущих радикалов белка, индуцированных рентгеновским излучением"

На правах рукописи

Карп Ольга Эдвиновна

ГЕНОТОКСИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ДОЛГОЖИВУЩИХ РАДИКАЛОВ БЕЛКА, ИНДУЦИРОВАННЫХ РЕНТГЕНОВСКИМ ИЗЛУЧЕНИЕМ

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

0 4 0КТ 2012

Пущино-2012

005052602

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук и в Пущинском государственном естественно-научном институте

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Брусков Вадим Иванович

кандидат биологических наук Гудков Сергей Владимирович

Официальные оппоненты:

Новоселова Елена Григорьевна - доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биофизики клетки РАН, главный научный сотрудник лаборатории механизмов рецепции

Безлепкин Владимир Георгиевич - кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, заведующий лабораторией радиационной молекулярной биологии

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Филиал института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится «18» октября 2012 г. в 15 ч. 30 мин. на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002.038.01 при Федеральном государственном бюджетном Учреждении науки Институте биофизики клетки Российской академии наук по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3.

Автореферат разослан « // » 2012 г.

Ученый секретарь диссертационш кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Воздействие ионизирующего излучения на живые организмы может происходить как за счет прямого действия -возбуждения и ионизации макромолекул, так и путем косвенного действия -образующихся в результате радиолиза воды высокорсакционных свободных радикалов [Кудряшов, 2004]. Преобладающая часть повреждений биополимеров в клетке, индуцированных ионизирующей радиацией, образуется в результате окислительного стресса. Окислительный стресс - это нарушение в биологической системе баланса между прооксидантами и возможностью их нейтрализации в системе антиоксидантной защиты [Halliwell, Gutteridge, 1982]. При воздействии ионизирующего излучения окислительный стресс обусловлен образованием активных форм кислорода (АФК) в результате радиолиза воды [Ward, 1988]. Поскольку АФК, за исключением перекиси водорода, являются короткоживущими продуктами, то этот процесс происходит непосредственно во время облучения.

Для нейтрализации избыточного количества АФК в клетках имеется многофункциональная система антиоксидантной защиты в виде разнообразных перехватчиков радикальных продуктов радиолиза воды, а также ферментных систем нейтрализации радикалов. Увеличение внутриклеточной концентрации АФК свыше возможности их нейтрализации системой антиоксидантной защиты клетки вызывает окислительный стресс, приводящий к повреждениям биологических молекул и необходимости их элиминации или репарации. Возникает необходимость активизации различных защитных и адаптационных клеточных механизмов для преодоления повреждающих последствий окислительного стресса. Определенное количество АФК постоянно образуется в клетке в результате нормальных аэробных биохимических реакций и необходимо для осуществления редокс-регуляции различных клеточных функций. Существенная роль в сигнально-регуляторных клеточных процессах принадлежит перекиси водорода - долгоживущей формы АФК [Stone, Yang, 2006; Forman, Maiorino, Ursini, 2010].

В настоящее время установлено, что при воздействии высоких доз ионизирующей радиации на биологические объекты мишенями являются вода и белки. Белки являются более чувствительной мишеныо, чем ДНК и липиды для реакции с гидроксильным радикалом (ОН') - наиболее реакционноспособной АФК [Du, Gebicki, 2004]. Это обусловлено тем, что среди биополимеров содержание белкового компонента в клетке является наибольшим и составляет около 15% ее общей массы и 70% сухой массы [Gracanin et al., 2011] и они содержат ряд высокореакционных групп [Shtarkman et al., 2008].

al., 2010]. Первичное окисление белков и свободных аминокислот с образованием их пероксидсш может вызывать ряд цепных реакций, что в конечном итоге приводит к повреждению других биомолекул, включая ДНК и белки [Rahmanto et al., 2010]. Предполагается, что окисление белков свободными радикалами участвует в процессе клеточного старения и инициирует ряд болезней человека [Hawkins, Davies, 2001].

Под влиянием ионизирующей радиации, наряду с короткоживущими продуктами радиолиза воды, в клетках млекопитающих образуются долгоживущие радикалы, преимущественно локализованные на белках [Kumagai et al., 2002]. С помощью метода ЭПР установлено, что при воздействии высоких доз ионизирующей радиации (кГр) в клетках и в растворах различных белков образуются долгоживущие радикалы белков (ДЖРБ) [Koyama et al., 1998, Kumagai et al., 2002], время полужизни которых достигает 20 ч [Miyazaki et al., 2002]. В настоящее время возникновение ДЖРБ показано для многих белков под влиянием ионизирующего излучения и ряда других воздействий. ДЖРБ образуются под воздействием гамма, рентгеновского, ультрафиолетового излучений, пероксинитрита и продуктов разложения перекиси водорода иммобилизованной пероксидазой [Гудков и др., 2007]. Под влиянием ДЖРБ в ДНК in vitro происходит образование 8-оксогуанина (8-оксо-7,8-дигидро-8-оксогуанина) - биомаркера повреждений ДНК, вызываемых АФК [Luxford et al., 1999, 2000; Furukawa et al., 2005; Midorikawa, 2005; Гудков и др., 2007]. Установлено, что ДЖРБ in vivo вызывают мутации и приводят к трансформации клеток [Koyama et al., 1998]. В небольших количествах ДЖРБ образуются в клетках животных и растений при их нормальной жизнедеятельности [Miyazaki et al., 2002]. Было показано, что аминокислоты, так же, как и белки, способны к образованию долгоживущих радикалов в результате воздействия ионизирующего излучения [Блюменфельд, Калмансон, 1958; Гудков и др., 2010]. В связи с этим актуальным является исследование возможности индукции пролонгированного окислительного стресса долгоживущими радикалами белка (ДЖРБ) после облучения, их роли в окислительном повреждении ДНК и геиотоксического действия в клетках млекопитающих.

Цель и основные задачи исследования. Цель данной работы заключалась в исследовании генотоксичсского потенциала ДЖРБ, индуцированных рентгеновским излучением.. В соответствии с целью были поставлены основные задачи:

1. Выявить образование ДЖРБ in vitro при воздействии ионизирующего излучения в дозе 10 Гр и определить время их полужизни.

2. Исследовать генерацию активных форм кислорода под влиянием ДЖРБ как механизм индукции пролонгированного окислительного стресса после воздействия ионизирующего излучения.

3. Определить способность ДЖРБ вызывать окислительные повреждения ДНК in vitro и in vivo.

4. Установить возможность нейтрализации окислительного стресса, обусловленного ДЖРБ, некоторыми природными антиоксидантами после облучения.

Научная новизна. Впервые установлено образование АФК ('02, Н02", Н202 и ОН") в водных растворах под действием ДЖРБ, индуцированных рентгеновским излучением, а также исследован физико-химический механизм этого процесса. Образование АФК под влиянием ДЖРБ является причиной повреждении ДНК в модельных системах in vitro и длительного протекания окислительного стресса после воздействия ионизирующей радиации в организме млекопитающих, приводящего к повреждениям ДНК в клетках их красного костного мозга.

Впервые показана способность ДЖРБ, индуцированных рентгеновским излучением, вызывать окислительные повреждения в ДНК in vivo при их внутривенном, внутрибрюшинном и пероральном введении. Установлено, что потребление грызунами некоторых природных антиоксидантов после облучения позволяет значительно снизить окислительные повреждения ДНК, обусловленные ДЖРБ, в клетках их красного костного мозга.

Научно-практическая ценность. Разработана методика регистрации ДЖРБ с применением хемилюминесценции белковых растворов, индуцированной рентгеновским излучением. Показан распад ДЖРБ, индуцированных ионизирующим излучением, и потеря их генотоксических свойств через сутки после облучения. Установлена возможность эффективной нейтрализации окислительного стресса и генотоксического действия, обусловленного ДЖРБ природными антиоксидантами - инозином (рибоксином), метионином и триптофаном.

Апробация работы Материалы диссертации были представлены на 11-12, 14-15-й конференциях молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2007-2008, 2010-2011), на конференции «Биомедицинская инженерия» (Пущино, 2007), на VIII Международном симпозиуме «Биологические механизмы старения» (Харьков, 2008), на Конгрессе «Медико-биологические проблемы токсикологии и радиологии» (Санкт-Петербург, 2008, 2011), на конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Белоруссия, Минск, 2008), на VIII конференции молодых ученых, специалистов и студентов, посвященной Дню космонавтики (Москва, 2009), на IX Международном симпозиуме «Биологические механизмы старения» (Украина, Харьков, 2010), на III Всероссийском конгрессе «Симбиоз-Россия 2010» (Нижний Новгород, 2010), на VIII Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2010), на VI Съезде по радиационным исследованиям (Москва, 2010), на VII Международной Крымской конференции «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии» (Украина, Судак, 2011), на конференции «Радиация и Чернобыль: Наука и практика». (Белоруссия, Гомель, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 29 работ, из них 7 статей в рецензируемых журналах, 4 - из списка ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 94 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы (3 главы), методической части, полученных результатов и их обсуждения (2 главы), заключения, выводов, списка цитируемой литературы (204 источника). Работа иллюстрирована 13 рисунками и содержит 8 таблиц.

Список принятых сокращений. АФК - активные формы кислорода; ДЖРБ - долгоживущие радикалы белка; 8-OG - 8-оксо1уанин (8-оксо-7,8-дигидро-8-оксогуанин); ОН* - гидроксильный радикал; 02*" - супероксид-анион радикал; '02 - синглетный кислород; Guo - гуанозин; Ino - инозин; ПХЭ - полихроматофильные эритроциты; МЯ - микроядра; ЭПР -электронный парамагнитный резонанс; БСЛ - бычий сывороточный альбумин; КСА - крысиный сывороточный альбумин.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение крысиного сывороточного альбумина

Крысиный альбумин был получен методом гель-фильтрации крысиной сыворотки на сефадексе G-100. В качестве свидетеля был использован БСА. Собранная фракция альбумина была лиофильно высушена, после чего сухой белок был растворен в изотоническом растворе NaCl. Раствор альбумина вводился животным в хвостовую вену в объеме 1 мл из расчета 1 мг/г живого веса. Концентрация альбумина определялась по методу Лоури [Lowry et al., 1951].

Обезвоживание творога

Для скармливания мышам использовали полностью обезжиренный пищевой творог, содержащий 18% белка, который дополнительно обезвоживали. Избыток влаги удаляли с помощью фильтровальной бумаги и высушивали потоком теплого воздуха в течение 6 ч. В результате такой сушки содержание белка в используемом твороге составляло 45%, а мыши им охотно питались.

Облучение

Облучение проводили иа рентгеновской терапевтической установке РУТ-15 (15 мА, 200 кВ) (МосРентген, Россия) при мощности дозы 1 Гр/мин (фокусное расстояние 0,375 м). При облучении ДИК in vitro использовалась мощность 4 Гр/мин (фокусное расстояние 0,195 м) [Гудков и др., 2009]. Тотальное облучение животных проводили в специальной клетке, препятствуя их перемещению.

Животные

В экспериментах были использованы самцы аутбредных мышей Kv: SHK в возрасте от пяти до шести недель и весом 18 22 г, а также самцы крыс линии Вистар массой 140 ± 15 г и возрастом 5 недель (питомник Крюково, Российская академия медицинских наук). Животные содержались в

виварии при температуре 23 ± 3°С и получали стандартную диету со свободным доступом к гранулированному коммерческому корму для мышей (Арно, Москва) и водопроводной воде.

Хемилюминесценция белковых растворов

Исследование долгоживущих радикалов белка (ДЖРБ) осуществляли методом измерения хемилюминесценции растворов белков, индуцированной рентгеновским излучением с использованием высокочувствительного хемилюминометра Биотокс-7АМ (Экон, Москва). Измерения проводили в темноте, при комнатной температуре, в пластиковых полипропиленовых флаконах для жидкостного сцинтилляционного счета объемом 20 мл (Beckman, США). Использование больших по сравнению со стандартными (0,1 мл) объемов позволило повысить чувствительность почти в 200 раз. После воздействия рентгеновского излучения все образцы выдерживали в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин. Контролями служили исследуемые белки, не подвергавшиеся воздействию рентгеновского излучения, необлученные и облученные в дозах 10, 20 Гр среды для растворения данных соединений.

Иммуноферментный анализ (ИФА)

Для количественного определения 8-оксогуанина в ДНК использовали неконкурентный иммуноферментный анализ с использованием моноклональных антител, специфичных к 8-оксогуанину. Использовали метод иммобилизации ДНК [Hirayama, Tamaoka, Horikoshi, 1996]. Облученные образцы ДНК (800 мкг/мл) денатурировали кипячением на водяной бане 6 мин и охлаждали во льду 20 мин. Аликвоты (40 мкл) наносили на дно лунок 96-луночных планшет Costar. ДНК иммобилизовали с помощью простой процедуры адсорбции при высушивании в течение 1,5 ч при 80°С. Блокировали неспецифические места адсорбции, используя на каждую лунку планшета 300 мкл блокирующего раствора, содержащего 1% казеина в 0,15 М Трис-HCl буфере, рН 8,5, и 0,15 М NaCl. После этого планшеты инкубировали при 30°С в течение 2 ч на планшетном шейкере ST-3 (Elmi, Латвия). Образование комплекса антиген-антитело с антителами (50 мкл/лунку), специфичными к 8-оксогуанину (в разведении 1:1000), проводили в блокирующем растворе путем инкубации в течение 2 ч при 37°С. Дважды промывали (300 мкл/лунка) раствором 50 мМ Трис-HCl буфер, рН 8,5, и 0,15 М NaCl на шейкере. Затем формировали комплекс с конъюгатом (анти-мышиным иммуноглобулином, меченным пероксидазой хрена (1:1000) в блокирующем растворе (50 мкл/лунка), инкубируя 2 ч при 37°С. Промывали лунки 1 раз с добавлением 1% Тритон Х-100 и 2 раза аналогично тому, как описано выше. Далее добавляли хромогенный субстрат - 18,2 мМ ABTS и перекись водорода (2.6 мМ) в 0,05 М нитратном буфере, рН 4.0 (100 мкл/лунку). По достижении окрашивания, реакцию останавливали добавлением равного объема 1,5 мМ NaN3 в 0,1 М цитратном буфере, рН 4,0. Оптическую плотность образцов измеряли на планшетном фотометре (Titertek Multiscan, Финляндия) при >.=405 им.

Микроядерный тест

Цитогенетические повреждения клеток красного костного мозга крыс и мышей определяли по образованию полихроматофильных эритроцитов (ПХЭ), содержащих микроядра (МЯ). Мышей умерщвляли методом цервикалыюй дислокации через 28 ч после воздействия (рентгеновское излучение, введение крысиного сывороточного альбумина, потребление творога), поскольку максимальный выход ПХЭ с МЯ наблюдается примерно через сутки [Gudkov et al., 2009]. Гистологические препараты готовили по стандартной методике с некоторыми модификациями [Asadullina et al., 2010]. При подсчете ПХЭ, содержащих МЯ, использовали световой микроскоп "МикМед-2"(ЛОМО, Спб) с иммерсионным объективом при увеличении хЮОО.

Определение перекиси водорода

Для количественного определения перекиси водорода использовали высокочувствительный метод усиленной хемилюминесценции в системе люминол-р-йодофенол-пероксидаза [Bruskov et al., 2002; Gudkov et al., 2006]. В качестве хемилюминометра использовали жидкостный сцинтилляционный счетчик «Бета-1» (МедАппаратура, Украина) для измерения [3-излучения, работающий в режиме счета одиночных фотонов (без схемы совпадений). Чувствительность метода позволяла определять Н202 в концентрации менее 1 нМ. Содержание Н202 рассчитывали, используя калибровочные графики зависимости интенсивности хемилюминесценции от известной концентрации перекиси водорода в растворе. Исходную концентрацию Н202, используемую для калибровки, определяли спектрофотометрически при длине волны 240 нм с использованием коэффициента молярного поглощения 43,6 М"1 см"1.

Определение концентрации гидроксильных радикалов

Для количественного определения концентрации гидроксильных радикалов в растворе использовали специфичный для ОН-радикалов флуоресцентный зонд - кумарин-3-карбоповую кислоту [Manevich, Held, Biaglow, 1997]. Интенсивность флуоресценции измеряли на спсктрофлуориметре Сагу Eclipse (Varían, Австралия) с = 400 нм, Х.ст = 450 нм. Калибровку производили с помощью коммерческой 7-ОН-кумарин-З-карбоновой кислоты.

Определение концентрации растворенного кислорода

Бидистиллированную воду дополнительно насыщали аргоном или кислородом путем барботирования в течение 15 мин. Сухие облученные навески БСА растворяли в концентрации 1 г/л в обогащенной этими газами воде. Концентрацию кислорода в растворе измеряли на приборе Oxygraph-2K (Oroboros, Австрия) и на приборе Экспсрт-001 (Эконикс, Москва).

Статистический анализ

Все данные представлены как средние значения и их стандартные ошибки. При проверке статистической достоверности различий между группами сравнения использовали Г-критерий Стъюдснта.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Образование долгоживущихрадикалов белка

Методом индуцированной рентгеновским излучением хемилюминесценции белка исследовано влияние различных доз рентгеновского излучения на образование долгоживущих радикалов. Установлено, что интенсивность хемилюминесценции растворов бычьего сывороточного альбумина (БСА), овальбумина и казеина линейно зависит от поглощенной дозы рентгеновского излучения в интервале 5-50 Гр.

Для определения времени полужизни ДЖРБ исследовано изменение интенсивности хемилюминесценции раствора облученного БСА, овальбумина и гидролизата казеина в дозе 10 Гр от времени после воздействия рентгеновского излучения. Результаты представлены на рис.1.

400

X £

Е S

і 300

:г

Í» 200

100

О х D s и

X О)

гидролизат казеина

овальбумин

БСА

2 3 4 5

Время после облучения, Ч

Рис.1. Изменение во времени интенсивности люминесценции растворов бычьего сывороточного альбумина (1 г/л), овальбумина (10 г/л) и гидролизата казеина (1 г/л), облученных

рентгеновскими лучами в дозе 10 Гр

Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего значеній для трех независимых

экспериментов. Фоновые значення люминесценции вычтены из полученных результатов

Время полужизни радикалов овальбумина и казеина, установленное данным методом при дозе 10 Гр, составляет около 5,5 ч и 2,5 ч соответственно.

2. Образование АФК в водной среде под влиянием долгоживущих радикалов бычьего сывороточного альбумина

В ряде исследований показано, что наиболее вероятный механизм индуцированного ДЖРБ повреждения других биологических молекул, включая ДНК [Гудков и др., 2010; Гудков и др., 2010а; Luxford et al., 2000; Furukawa et al., 2005], может быть обусловлен радикал-индуцировапным процессом, происходящим после радиационного воздействия [Davies et al., 1995]. В данной работе была исследована способность индуцированных рентгеновским излучением ДЖРБ БСА генерировать АФК в водном

растворе. Сухие навески БСА облучали в дозах 10-50 Гр, растворяли в 20 мМ ТрисНС! буфере (рН 8,5) до конечной концентрации 1 г/л и определяли продукцию Н202 методом усиленной хемилюминесценции в системе люминол-4-йодфенол-пероксидаза хрена [Вгивкоу й а1., 2002; Вгивкоу е1 а1., 2012]. Такая постановка опыта позволила избавиться от перекиси водорода, образующейся в водных растворах при радиолизе воды, и регистрировать только перекись водорода, образующуюся под влиянием ДЖРБ.

Установлена генерация перекиси водорода в водных растворах под действием ДЖРБ. Показана зависимость образования перекиси водорода под влиянием облученного БСА (1 г/л) при различных временах после облучения (рис. 2). Способность к генерации Н202 в растворе уменьшается примерно в два раза через 2,5-3 часа с зависимостью, близкой к экспоненциальной.

• ю Гр

Рис.2. Образование перекиси водорода, индуцированное

долгоживущими радикалами БСА, образующимися при рентгеновском облучении in vitro в дозах 10-50 Гр, через различные промежутки времени

Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего значения для трех независимых экспериментов.

Фоновые концентрации перекиси водорода вычтены из полученных результатов

о 1 2

Время после облучения, ч

Для выяснения механизма образования перекиси водорода в растворе облученного БСА было исследовано влияние различных факторов на этот процесс. Установлен кислородный эффект - влияние концентрации растворенного кислорода на продукцию перекиси водорода, индуцированную ДЖРБ (табл. 1). Генерация перекиси водорода под влиянием облученного БСА через 15 мин после облучения в дополнительно насыщенной кислородом воде на 30% выше, чем в контроле, и на 50% ниже при насыщении аргоном (табл.1). С помощью супероксидцисмутазы (СОД) показано участие супероксиданион-радикалов в образовании перекиси водорода в воде при воздействии ДЖРБ. СОД увеличивает концентрацию Н202 в результате дополнительной дисмутации этих радикалов на 30%. Добавление тирона, являющегося спиновой ловушкой радикалов, уменьшает концентрацию перекиси водорода в растворе на 90%. Была исследована возможная роль синглетного кислорода в процессе генерации Н202, индуцированной ДЖРБ. Добавление азида натрия, избирательного тушителя

'02, на 30% уменьшает генерацию перекиси водорода под действием ДЖРБ. Добавление гуанозина - перехватчика синглетного кислорода, уменьшает генерацию перекиси водорода под воздействием ДЖРБ на 70%. Под влиянием 25% ГЛ20, которое увеличивает время жизни '02 в растворе, в 1,5 раза увеличивается концентрация Н202 . Эти данные доказывают участие синглетного кислорода в процессе образования Н202.

Таблица 1. Влияние различных условий на образование Н2О2 в водных растворах под воздействием БСА, предварительно облученного в дозе 10 Гр. Приведены средние значения трех независимых экспериментов и их стандартные ошибки. Фоновые концентрации перекиси водорода вычтены из полученных результатов

Воздействие [02], мкМ [Н202],нМ К**

Контроль 270 5.1 ±0,4 1,0

СОД (Ю-3 сд./мл) 270 6,8 ± 0,4* 1,3

Тирон (100 нМ) 270 0,7 ± 0,4* 0,1

Барботирование Аг(15 мин)*** 130 2,4 ±0,1* 0,5

Барботирование 02(15 мин)*** 475 6,6 ±0,2* 1,3

020 (25%) 270 7,5 ±0,5* 1,5

Азид натрия (100 мкМ)**** 270 3,6 ±0,3* 0,7

Гуанозин (1 мМ) 270 1,4 ±0,2 0,3

* - Статистически достоверное отличие относительно контрольных образцов (р < 0,05) ** - К - относительное изменение величин концентрации Н202 к контролю *** _ Перед воздействием ионизирующего излучения вода в теченне 15 мин была насыщена газом при помощи барботировния

**** - Азид натрия при данной концентрации не оказывает значительного ингибирующего действия на активность пероксидазы

Полученные результаты можно обобщить с помощью следующей схемы последовательных реакций образования Н202 под действием ДЖРБ. -NH-RCJl-CO—> -NH-RCa*-CO- + If (1) Н* + '02 -> Н02* (2)

Н02* + Н02* -> Н202 + *02 (3)

В результате воздействия рентгеновского излучения на белковую молекулу происходит отщепление радикала водорода от а-углеродных атомов полипептидной цепи (реакция 1). Образование а-углеродного радикала в БСА показано методом ЭПР [Davies et al., 1995]. Радикал водорода, реагируя с растворенным в воде кислородом в синглетном состоянии [Bruskov et al., 2002], продуцирует гидроперекисный радикал (реакция 2). Дальнейшая дисмутация этих радикалов приводит к образованию Н202 (реакция 3). Следует отметить, что в реакции спонтанной дисмутации гидроперекисных радикалов возникает кислород в электронно-возбужденном синглетном состоянии, а его удаление должно способствовать более интенсивному протеканию реакции образования Н202. Наряду с этим, существует еще один возможный путь образования Н202 [Stadtman, 1993]: -NH-RCa'-CO- + ()2ч> -NH-RCaOO-СО- (4)

-NH-RCaOO*-CO—> -N=RCa-CO- + H02' (5) H02" + H02' -> H202 + '02 (3)

Реакция a-углеродного радикала с кислородом приведет к формированию алкилпероксилыюго радикала (реакция 4). Быстрая внутримолекулярная элиминация пероксильных радикалов при а-углеродном атоме приводит к генерации гидроперекисного радикала в растворе (реакция 5) [Hawkins, Davies, 2001]. Образование Н202 в этом случае также будет продуктом дисмутации этих радикалов (реакция 3).

Была исследована возможность образования гидроксильных радикалов в растворе под влиянием облученного БСА. Гидроксильные радикалы определяли с помощью высокоспецифичного фуоресцентного зонда кумарин-3-карбоновой кислоты (ККК) [Гудков и др., 2012]. Схема проведения опытов была аналогична схеме определения иерекиси водорода. В течение пострадиационного периода наблюдается экспоненциальное уменьшение способности облученного БСА к генерации гидроксильных радикалов, так же, как и к генерации перекиси водорода. Образование гидроксильных радикалов в воде при действии ДЖРБ, вероятно, происходит за счет распада образовавшейся перекиси водорода в присутствии восстановителя. Известно, что сывороточные альбумины связывают ионы металлов переменной валентности (железо, медь), которые играют роль восстановителя перекиси водорода, вызывая ее распад до гидроксильных радикалов и гидроксил-анионов [Roche et al., 2008].

Полученные данные свидетельствуют о том, что • ДЖРБ могут длительное время осуществлять генерацию АФК - перекиси водорода и гидроксильных радикалов. Этот процесс может быть причиной длительного протекания окислительного стресса после воздействия исследованных доз ионизирующей радиации и повреждений ДНК в клетке и модельных системах in vitro.

3. Образование 8-оксогуанина в ДНК in vitro под действием долгоживущих радикалов бычьего сывороточного альбумина

Можно полагать, что АФК, индуцированные ДЖРБ, продлевают окислительный стресс и являются причиной окислительного повреждения других биологических молекул, включая ДНК. Методом иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител исследовано образование 8-оксогуанина - биомаркера окислительных повреждений ДНК - в растворе ДНК под действием облученного БСА in vitro. На рис.3 показана дозовая зависимость образования 8-оксогуанина в ДНК иод действием рентгеновского излучения или долгоживущих радикалов БСА.

Рис.3. Зависимость образования 8-оксогуаннна (8-ОГ) в ДНК под действием ионизирующей радиации или молекул БСА (1 г/л), подвергнутых воздействию ионизирующей радиации. Фоновые значения вычтены из полученных результатов. Данные представлены как средине значения и их стандартные ошибки для трех независимых эксперимешад

• - ДНК (10 и 20 Гр), проинкубированная в течение 2,5 ч с раствором БСА (0 Гр) о - ДНК (0 Гр), проинкубированная в течение 2,5 ч с раствором БСА (10 и 20 Гр) Т - ДНК (0 Гр), проинкубированная в течение 2,5 ч с буфером для растворения БСА (0 Гр), облученным в дозах 10 и 20 Гр

Инкубация ДНК с облученным в дозах 10 или 20 Гр раствором БСА в течение 2,5 ч в присутствии иммобилизованной каталазы приводит к образованию в ДНК 8-оксогуанина. Доля повреждений, опосредованная облученным белком, по сравнению с тотальным облучением ДНК в той же дозе, является значительной, и составляет 35 %. При увеличении (свыше 2,5 часов) времени инкубации ДНК с облученным белком дополнительного образования 8-оксогуанина не наблюдалось. Полученный результат показывает высокую эффективность повреждения ДНК, опосредованную облученным белком. Инкубация ДНК с облученным в дозах 10 или 20 Гр буфером для растворения БСА в течение 2,5 ч не приводит к образованию в ДНК 8-оксогуанина. Кросс-реакций первичных антител с молекулами БСА не наблюдалось. Аналогичные результаты были получены и для облученных рентгеновским излучением растворов овальбумина.

Некоторые низкомолекулярные биоантиоксиданты способны элиминировать ДЖРБ. Установлено, что эффективным перехватчиком ДЖРБ является витамин С [Коуата й а1., 1998; Киша£а1 а а1., 2002; Ьих1Ъгс1 й а1., 1999]. Эпигаплокатехингаллат, компонент зеленого чая, при добавлении после воздействия ионизирующего излучения элиминирует белковые радикалы и уменьшает частоту мутаций в облученных клетках [Кигг^а! е1 а1., 2002]. Показано, что галловая [Кигг^а1 (Л а1., 2003] и мочевая ¡Кей-айэЛе, МтеШ, 1997] кислоты также нейтрализуют ДЖРБ.

Ранее установлено, что пуриновые рибонуклеозиды гуапозин и инозин - являются природными биоантиоксидантами и радиопротекторами, и увеличивают выживаемость животных при введении их после воздействия ионизирующей радиации [Гудков и др., 2008]. Поэтому нами была исследована возможность элиминации окислительных повреждений ДНК долгоживущими радикалами БСА с помощью ряда природных антиоксидантов. Были использоваиы гуанозин, инозин, Ь-аминокислоты -метионин и триптофан, а также витамин С в концентрации ] мМ. Полученные результаты представлены на рис.4.

Рис.4. Образование 8-оксогуанина в ДНК под действием долгоживущих радикалов облученного в дозе 10 Гр БСА (1 г/л) и влияше некоторых антиоксидантов (1 мМ) на этот процесс. Фоновые значения вычтены из полученных результатов. Данные представлены как средние значения и их стандартные ошибки для трех независимых экспериментов

1 - ДНК, облученная в дозе 10 Гр; 2 - БСА, облученный в дозе 10 Гр 3 - БСА, облученный в дозе 10 Гр с добавлением Guo, 4 - Ino, 5 - Met L, 6 - Trp L, 7 - vit. С * - Статистически достоверное отличие относительно контрольных образцов группа -2-(Р < 0,05)

Было показано, что с помощью этих антиоксидантов можно существенно уменьшить повреждающий эффект долгоживущих радикалов БСА. Данные вещества снижали уровень окисленного гуанина в ДНК, образующегося под воздействием долгоживущих радикалов БСА, гуанозин -на 56%, инозин - на 93 % , метионин - на 80 %, триптофан - на 67 % и витамин С - на 50 %.

4. Образование полихроматофильных эритроцитов с микроядрами в -клетках красного костного мозга животных под влиянием долгоживущих радикалов белка

Методом микроядерного теста исследована способность ДЖРБ, индуцированных рентгеновским излучением, вызывать пролонгированный окислительный стресс и приводить к окислительным повреждениям в ДНК in vivo.

Изучено влияние облученного крысиного сывороточного альбумина (КСА) при внутривенном введении его самцам крыс Вистар на образование микроядер (МЯ) в полихроматофильных эритроцитах (ПХЭ) костного мозга. Опытной группе из четырех животных внутривенно был введен растворенный в 0,9%-ом растворе NaCl крысиный сывороточный альбумин в дозе 1 мкг/г, облученный в дозе 100 Гр через 15 мин после облучения. Контрольные группы состояли из четырех-пяти особей каждая: 1) интактные животные, которым внутривенно был введен 0,9% NaCl; 2) животные, которым был введен 0,9% NaCl, облученный в дозе 100 Гр; 3) животные, которым был введен раствор КСА в 0,9% NaCl, облученный в дозе 100 Гр и выдержанный 24 ч после облучения; 4) животные, тотально облученные в дозе 1 Гр. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2. Образование микроядер (МЯ) в полихроматофильных эритроцитах (ПХЭ) костного мозга крыс при внутривенном введении КСА, облученного в дозе 100 Гр. Данные представлены как средние значения и их стандартные ошибки

№ Воздействие N Число ПХЭ Число ПХЭ с МЯ ПХЭ с МЯ, %

1 ОГр 4 13851 65 0,47 ± 0,03

2 NaCl 0,9% 100 Гр 4 16187 128 0,79 ±0,02**

3 КСА 100 Гр (24 ч) 4 10961 71 0,64 ± 0,06

4 КСА 100 Гр 4 9706 127 1,26 ±0,18**

5 1Гр 5 13927 305 2,19 ±0,12**

1 - введение 0,9% №С1 без облучения; 2 - введение 0,9% ИаС!, облученного в дозе 100 Гр

3 - введение КСА через 24 ч после облучения в дозе 100 Гр

4 - введение КСА, облученного в дозе 100 Гр, сразу после облучения

5 - крысы, тотально облученные в дозе 1 Гр

* - статистически достоверное отличие от группы 1 (р < 0,05)

Процент ПХЭ, содержащих МЯ, в группе животных, которым внутривенно вводили КСА, облученный в дозе 100 Гр, был в 2,7 раза больше, чем у контрольных животных.

Для оценки генотоксичсского влияния продуктов, образующихся при радиолизе раствора ЫаС1, крысам вводили изотонический раствор №С1, облученный в дозе 100 Гр. Установлено, что около 40% генотоксического эффекта раствора КСА обусловлено эффектом облученного раствора ЫаС1. Введение белка через 24 ч после его облучения, когда, по нашим данным, происходит полный распад ДЖРБ, не показало достоверных отличий в содержании МЯ по сравнению с группой интактных животных.

Поскольку нами была показана линейная дозовая зависимость образования микроядер при тотальном рентгеновском облучении мышей (рис. 5), можно полагать о существовании линейной зависимости также и у крыс. Таким образом, можно рассчитать, что внутривенное введение раствора альбумина, облученного в дозе 100 Гр, вызывает такое же количество цитогенетических повреждений, как тотальное разовое облучение в дозе около 0,3 Гр.

0,0

0,5 1,0

Доза, Гр

Рис.5. Зависимость количества микроядер (МЯ) в

полихроматофильных эритроцитах (ПХЭ) красного костного мозга мышей от дозы рентгеновского излучения

1,5

Было исследовано влияние скармливания облученного обезжиренного и обезвоженного творога самцам белых мышей Ку^НК на формирование МЯ в ПХЭ их костного мозга. Мыши в течение 24 ч в качестве пищи получали творог, облученный рентгеновскими лучами в дозе 100 Гр. Были использованы следующие группы мышей: 1) получавшие необлученный творог; 2) получавшие творог, облученный в дозе 100 Гр и выдержанный в течение 24 ч для элиминации долгоживущих радикалов белка; 3) получавшие творог, облученный в дозе 100 Гр. Мыши потребляли в среднем 2,5 г творога на животное за 24 ч, т.е. около 0,1 г облученного белка на грамм живого веса. Для питья использовали растворы природных антиоксидантов: инозина, Ь-метиошша, Ь-триптофана и аскорбиновой кислоты в дистиллированной воде в концентрации 5 мМ. Полученные результаты представлены в таблице 3 и на рис. 6.

При потреблении мышами облученного в дозе 100 Гр творога в течение 24 ч происходит увеличение содержания МЯ в ПХЭ их костного мозга на 50% по сравнению с группой интактных животных. Эти результаты свидетельствует о способности ДЖРБ сохранять свой окислительный потенциал и при переваривании пищи [Карп и др., 2010]. При потреблении творога через 24 ч после его облучения, когда, по нашим данным, происходит полный распад ДЖРБ, не выявлено достоверных отличий в количестве МЯ по сравнению с группой контрольных животных. Так как увеличение количества

микроядер в клетках красного костного мозга линейно зависит от дозы рентгеновского излучения (рис.5), то потребление мышами облученного в дозе 100 Гр творога вызывает такое же количество цитогенетических повреждений, как тотальное разовое облучение в дозе около 0.1 Гр.

Таблица 3. Влияние скармливания обезжиренного и обезвоженного творога, облученного в дозе 100 Гр, на образование микроядер (МЯ) в полихроматофильных эритроцитах (ПХЭ) костного мозга мышей

№ Воздействие N Число ПХЭ Число ПХЭ с МЯ ПХЭ с МЯ, %

1 ОГр 7 12373 54 0,49 ± 0,03

2 белок 0 Гр 7 15342 73 0,50 ±0,01

3 белок 100 Гр 11 26126 177 0,69 ±0,04*

4 белок 100 Гр 24 ч 4 8231 43 0,51 ±0,01

1 - контрольная группа - необлученные животные; 2 - контрольная группа -необлученные животные, в качестве корма использовали необлученный творог; 3 - в качестве корма использовали творог, облученный в дозе 100 Гр; 4 - использовали творог', облученный в дозе 100 Гр и выдержанный в течение 24 ч для распада ДЖРБ. * - статистически достоверное отличие от группы 2 (р < 0,05)

При одновременном приеме с питьевой водой природных антиоксидантов - 5 мМ растворов инозина, L-триптофана и L-метионина -наблюдалось снижение количества микроядер в красном костном мозге мышей до исходных значений, статистически не отличающихся от группы интактных животных. При приеме раствора витамина С наблюдалось уменьшение прироста количества микроядер на 30% (рис. 6).

Рис.6. Влияние

некоторых антиоксидантов при их совместном введении с облученным обезжиренным творогом {per os) на -х_ выход ПХЭ с МЯ в

красном костном мозге 0,4 мышей

0,8

0,6 •

контрольная группа, качестве корма

0,2 -1 is-*" использовали

необлученный творог; 2 - в качестве корма использовали творог,

1 "—г-"1 т т . | облученный в дозе 100

1 2 3 4 5 6 Гр; 3-6 - в качестве

корма использовали

творог, облученный в дозе 100 Гр, и дополнительно в качестве питья - 5 мМ растворы антиоксидантов - Met L (3), Trp L; (4), Ino (5), витамин С (6).

* - статистически достоверное отличие от группы 1, (р < 0,05)

Основным белком, входящим в состав обезжиренною творога, является казеин, который в процессе пищеварения расщепляется до отдельных аминокислот. Результаты, полученные для облученного творога, позволили предполагать, что механизмом повреждающего действия ДЖРБ при перорапьном введении может являться генотоксическое действие долгоживущих радикалов аминокислот.

В связи с этим было исследовано генотоксическое действие раствора гидролизата казеина, облученного в дозе 100 Гр, при введении его внутрибрюшинно аутбредным мышам Ку^НК. Установлено, что при внутрибрюшинном введении мышам этого раствора происходит увеличение числа полихроматофильных эритроцитов, содержащих микроядра, в 1,3 раза по сравнению с контролем (таблица 4).

Таблица 4. Влияние гидролизата казеина, облученного в дозе 100 Гр, при внутрибрюшинном введении на образование микроядер в полихроматофильных эритроцитах красного костного мозга мышей

№ Воздействие N Число ПХЭ Число ПХЭсМЯ ПХЭ с МЯ, %

1 Контроль (0 Гр) 5 11051 52 0,47 ±0,01

2 Гидролизат казеина (0 Гр) 5 10139 36 0,35 ± 0,03*

3 Гидролизат казеина (100 Гр) 5 10665 62 0,58 ± 0,08*

4 Гидролизат казеина (100 Гр) (сухой) 5 9437 60 0,67 ±0,12*

1 - контроль, введение 0,9% NaCl без облучения; 2 - введение раствора гидролизата казеина (в 0,9 % NaCl, 0,2 мкг/г) без облучения; 3 - введение раствора гидролизата казеина, облученного в дозе 100 Гр; 4 - введение гидролизата казеина, облученного в сухом виде в дозе 100 Гр и затем растворенного для инъекции * - статистически достоверное отличие от контроля (0 Гр) (р < 0,05)

Таким образом, установлено, что облученные белки и аминокислоты способны приводить к повреждению структуры ДНК in vivo, а также показана возможность нейтрализации гснотоксичсских повреждений ДНК с помощью некоторых природных антиоксидантов.

выводы

1. Показано образование долгоживущих радикалов бычьего сывороточного альбумина, овальбумина и гидролизата казеина при воздействии рентгеновского излучения в диапазоне доз от 5 до 50 Гр. Время полужизни этих радикалов составляет 3,5,5 и 2,5 часов соответственно.

2. Показана способность индуцированных рентгеновским излучением долгоживущих радикалов белков вызывать окислительные повреждения ДНК in vitro с образованием в ней 8-оксогуанина.

3. Установлен физико-химический механизм повреждающего воздействия долгоживущих радикалов белков, заключающийся в их способности длительное время генерировать активные формы кислорода - перекись водорода и гидроксильныс радикалы в водной среде.

4. Установлено, что долгоживущие радикалы белков и аминокислот, индуцированные рентгеновским излучением, способны вызывать образование цитогенетических повреждений в ДНК полихроматофильных эритроцитов красного костного мозга грызунов с образованием микроядер.

5. Использование природных антиоксидантов - Ino, Met L, Trp L - позволяет нейтрализовать последствия окислительного стресса, обусловленного долгоживущими радикалами белков, индуцированными воздействием ионизирующего излучения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах

1. Карп О.Э. , Гудков C.B., Гармаш С.А., Штаркман И.Н., Черников A.B., Брусков В.И. Генотоксическое действие in vivo долгоживущих радикалов белка, индуцируемых рентгеновским облучением. // ДАН. 2010. Т. 434, № 3, с. 412-415

2. Гудков C.B., Гармаш С.А., Штаркман И.Н., Черников A.B., Карп О.Э., Брусков В.И. Долгоживущие радикалы белка, индуцируемые рентгеновским облучением, являются источником активных форм кислорода в водной среде // ДАН. 2010. Т. 430, №1, с. 123-126

3. Гудков C.B., Гармаш С.А., Карп О.Э., Смирнова B.C., Черников A.B., Брусков В.И. Долгоживущие радикалы аминокислот, индуцируемые рентгеновским излучением, являются источником образования перекиси водорода в водной среде. // Биофизика. 2010а. Т. 55, № 4, с. 588-593

4. Гудков C.B., Карп О.Э., Гармаш С.А., Иванов В.Е., Черников A.B., Манохин A.A., Асташев М.Е., Ягужинский JI.C., Брусков В.И. Образование активных форм кислорода в воде под воздействием видимого и инфракрасного излучения в полосах поглощения молекулярного кислорода. // Биофизика. 2012. Т. 57, № 1, с. 5-13

5. Bruskov V.l., Кагр O.E., Garmash S.A., Shtarkman I.N., Chernikov A.V., Gudkov S.V. Prolongation of oxidative stress by long-lived reactive protein species induced by X-ray radiation and their gcnotoxic action. // Free Radical Research. doi:10.3109/10715762.2012.709316

6. Гудков C.B., Штаркман И.Н., Карп О.Э., Ассадулина Н.Р., Гармаш С.А., Черников A.B., Брусков В.И. Использование рибоксина (инозина) после рентгеновского облучения для защиты клеток крови мышей. // Нижегородский медицинский журнал. 2008. №4., с. 18-24.

7. Гудков C.B., Тихомиров A.A., Андриевский Г.В., Штаркман И.Н., Асадуллина Н.Р., Гармаш С.А., Карп О.Э., Недзвецкий B.C. ДНК-защитные и радиопротекторные эффекты гидратированного фуллерена Сю. // Физика живого. 2009. №. 17, с.82-88

Участие в научных конференциях и симпозиумах

8. «Биология наука XXI века». 11-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. Пущино. 29 октября - 2 ноября 2007 г. с. 8 Асадуллина Н.Р., Карп О.Э., Гудков C.B., Штаркман И.Н., Брусков В.И. Антиоксидантные свойства некоторых пуриновых соединений

9. Медицинская биоинженерия - 2007. Пущино. 10-12 декабря 2007 г. с. 1415. Гудков C.B., Штаркман И.Н., Гармаш С.А., Карп О.Э., Брусков В.И. Метод определения долгоживущих белковых радикалов, образующихся при воздействии рентгеновского излучения

Ю.Медицинская биоинженерия - 2007. Пущино. 10-12 декабря 2007 г. с. 2426. Карп О.Э., Штаркман И.Н., Гудков C.B., Гармаш С.А., Брусков В.И.

Опрделение 8-оксогуанина в ДНК с помощью иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител

11.VIII международный симпозиум «Биологические механизмы старения». Харьков. Украина. 21-24 мая 2008 г. с. 23 Гудков C.B., Штаркман И.Н., Кари О.Э., Гармаш С.А., Брусков В.И. Долгоживущис радикалы белка как посредники окислительного стресса с генотоксическими последствиями

12.VIII международный симпозиум «Биологические механизмы старения». Харьков. Украина. 21-24 мая 2008 г. с. 58 Гудков C.B., Штаркман И.Н., Карн О.Э., Черников A.B., Брусков В.И. Влияние аминокислот на образование активных форм кислорода при воздействии рентгеновского облучения и тепла

13.Медико-биологические проблемы токсикологии и радиологии. Санкт-Петербург. 29-30 мая 2008 г. с. 211. Гудков C.B., Асадуллина Н.Р., Карп О.Э., Гармаш С.А., Штаркман И.Н., В.И. Брусков. Антиоксидантные и радиозащитные свойства некоторых природных пуриновых соединений

14.Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем. Белоруссия. Минск. 25-27 июня 2008 г. с. 147-149. Штаркман И.Н., Гудков C.B., Гармаш С.А., Карп О.Э., Черников A.B., Брусков В.И. Долгоживущис радикалы белков, индуцированные рентгеновским излучением, как источники образования активных форм кислорода

15.«Биология наука XXI века». 12-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. Пущино. 10 - 14 ноября 2008 г. с. 170. Гармаш С.А., Гудков C.B., Штаркман И.Н., Карп О.Э., Брускоп В.И. Образующиеся при воздействии рентгеновского излучения долгоживущис радикалы белков способны генерировать перекись водорода и гидроксильные радикалы

16.«Биология наука XXI века». 12-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. Пущино. 10 - 14 ноября 2008 г. с. 190. Гудков C.B., Штаркман И.Н., Карп О.Э., Гармаш С.А., Брусков В.И. Образование долгоживущих радикалов белка и аминокислот под воздействием рентгеновского излучения и их генотоксическое действие

17.VIII Конференция молодых ученых специалистов и студентов посвященная дню космонавтики. Москва. 14 апреля 2009. с. 21-22 Карп О.Э., Штаркман И.Н., Гудков C.B., Брусков В.И. Долгоживущие радикалы белка способны повреждать ДНК in vitro и in vivo

18.«Биология наука XXI века» 14 Международная Пущинская школа конференция молодых ученых. Пущино. 19-23 апреля 2010. с. 135 Карп О.Э., Гудков C.B., Брусков В.И. Генотоксическое действие долгоживущих радикалов белка in vivo

19.IX международный симпозиум «Биологические механизмы старения». Харьков. Украина. 26-29 мая 2010 г. с. 19. Гармаш С.А., Карп О.Э., Гудков C.B., Брусков В.И. Долгоживущие радикалы 1-аминокислот как посредники в развитии окислительного стресса

20.111 Всероссийский конгресс «Симбиоз-Россия 2010». Нижний Новгород. 24-29 мая 2010 г. с. 173. Карп О.Э., Смирнова B.C., Асадуллина Н.Р.,

Иванов В.Е., Гармаш СЛ., Гудков C.B., Брусков В.И. Образование цитогенетических повреждений под действием долгоживущих радикалов белка

21.VIII Международная конференция «Биоантиоксидант» Москва. Россия. 46 октября 2010 г., с.111-112. Гармаш СЛ., Карп О.Э., Гудков C.B., Брусков В.И. Долгоживущие радикалы аминокислот как источник образования перекиси водорода в водной среде

22.VIII Международная конференция «Биоантиоксидант» Москва. Россия. 46 октября 2010 г., с.196-197. Карп О.Э., Гудков C.B., Брусков В.И. Повреждения днк in vivo под воздействием долгоживущих радикалов белка и их нейтрализация природными биоантиоксидантами

23.VI съезд по радиационным исследованиям. Москва. 25-28 октября 2010 г. т.1, с. 20. Гармаш СЛ., Карп О.Э., Гудков C.B., Брусков В.И. Прооксидантные свойства долгоживущих радикалов L-аминокислот

24.VI съезд по радиационным исследованиям. Москва. 25-28 октября 2010 г. т.1, с. 31. Карп О.Э., Гудков C.B., Черников A.B., Смирнова B.C., Брусков В.И. Генотоксические свойства долгоживущих радикалов бежа, индуцированных рентгеновским излучением

25.«Биология наука XXI века» 15 Международная Пущинская школа конференция молодых ученых. Пущино. 18-22 апреля 2011. с. 124-125. Карп О.Э., Гудков C.B., Брусков В.И. Роль долгоживущих радикалов белка в продлении окислительного стресса in vivo при действии рентгеновского излучения

26.Медико-биологические проблемы токсикологии и радиологии. Санкт-Петербург. 19-20 мая 2011 г. с. 134. Карп О.Э., Гудков C.B., Черников A.B., Брусков В.И. Прооксидантные и генотоксические свойства долгоживущих радикалов белков, индуцированных неионизиругощими и ионизирующими излучениями

27.VII Международная Крымская конференция «Окислительный стресс и свободнорадикальныс патологии». Украина. Судак. 22-30 сентября 2011 г. с.15. Брусков В.И., Гудков C.B., Карп О.Э., Черников A.B., Штаркман И.Н. Продление окислительного стресса долгоживущими активными формами белка, индуцированными рентгеновским излучением, и их гснотоксическое действие

28.Радиация и Чернобыль: Наука и практика. Беларусь. Гомель. 13-14 октября 2011 г. с.38-40. Гудков C.B., Гапеев А.Б., Бережнов A.B., Карп О.Э., Гармаш СЛ., Брусков В.И. Сочетанное действие рентгеновского излучения и видимого/инфракрасного излучения в полосах поглощения молекулярного кислорода

29.«Биология наука XXI века» 16 Международная Пущинская школа конференция молодых ученых. Пущино. 16-21 апреля 2012. с. 315-316. Карп О.Э., Гудков СВ., Брусков В.И. Продление окислительного стресса долгоживущими активными формами белка, индуцированными рентгеновским излучением, и их генотоксическое действие.

Подписано в печать:

06.09.2012

Заказ № 7553 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Карп, Ольга Эдвиновна

ВВЕДЕНИЕ

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Активные формы кислорода и окислительный стресс

1.1. Активные формы кислорода

1.1.1. Синглетный кислород

1.1.2. Супероксид-анион радикал

1.1.3. Перекись водорода

1.1.4. Гидроксильный радикал

1.2. Окислительный стресс

Глава 2. Окисление белков

2.1. Реакции окислителей с биологическими мишенями

2.2. Повреждения основной цепи белка. Образование белковых радикалов

2.3. Повреждение боковых остатков аминокислот

2.3.1. Алифатические аминокислотные остатки и остатки с положительным и отрицательным зарядом

2.3.2. Ароматические остатки

2.3.3. Цистеин и цистин

2.4. Окисление остатков метионина в белках

2.5. Передача повреждения в пределах белковой молекулы и на другие мишени

2.6. Последствия окисления белков

2.6.1. Фрагментация и димеризация

2.6.2. Образование окисленных активных соединений и цепная реакция

2.6.3. Конформационные изменения

2.7. Окисление белков и нарушение энергетического метаболизма

2.8. Деградация окисленных белков

Глава 3. Антиоксидантные свойства некоторых аминокислот и пептидов

3.1. Аминокислоты как природные низкомолекулярные антиоксиданты

3.2. Пептиды как природные внутриклеточные антиоксиданты 36 ЧАСТЬ II. МЕТОДИЧЕСКАЯ

Глава 4. Материалы и методы исследования 39 4.1. Материалы

4.2. Методы

4.2.1. Получение крысиного сывороточного альбумина

4.2.2. Обезвоживание творога

4.2.3. Облучение

4.2.4. Животные

4.2.5. Долгоживущие радикалы белка

4.2.6. Иммуноферментный анализ (ИФА)

4.2.7. Микроядерный тест

4.2.8. Тест на выживаемость

4.2.9. Определение перекиси водорода

4.2.10. Определение концентрации гидроксильных радикалов

4.2.11. Определение концентрации растворенного кислорода 43 4.2.12. Статистический анализ

ЧАСТЬ III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 5. Влияние долгоживущих радикалов белка и аминокислот на образование АФК в водных растворах in vitro при воздействии рентгеновского излучения

5.1. Образование долгоживущих радикалов белка

5.2. Образование АФК в водной среде под влиянием долгоживущих радикалов бычьего сывороточного альбумина

5.3. Образование перекиси водорода в водной среде под влиянием долгоживущих радикалов аминокислот

Глава 6. Генотоксическое действие долгоживущих радикалов белка, индуцированных рентгеновским излучением

6.1. Образование 8-оксогуанина в ДНК in vitro под действием долгоживущих радикалов бычьего сывороточного альбумина

6.2. Образование полихроматофильных эритроцитов с микроядрами в клетках красного костного мозга животных под влиянием долгоживущих радикалов белка 61 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 71 ВЫВОДЫ 75 СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 76 СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генотоксическое действие долгоживущих радикалов белка, индуцированных рентгеновским излучением"

Воздействие ионизирующего излучения на живые организмы может происходить как за счет прямого действия - возбуждения и ионизации макромолекул, так и путем косвенного действия - образующихся в результате радиолиза воды высокореакционных свободных радикалов [Кудряшов, 2004]. Преобладающая часть повреждений биополимеров в клетке, индуцированных ионизирующей радиацией, образуется в результате окислительного стресса. Окислительный стресс - это нарушение в биологической системе баланса между прооксидантами и возможностью их нейтрализации в системе антиоксидантной защиты [Halliwell, Gutteridge, 1982]. При воздействии ионизирующего излучения окислительный стресс обусловлен образованием активных форм кислорода (АФК) в результате радиолиза воды [Ward, 1988]. Поскольку АФК, за исключением перекиси водорода, являются короткоживущими продуктами, то этот процесс происходит непосредственно во время облучения.

В настоящее время установлено, что при воздействии высоких доз ионизирующей радиации на биологические объекты мишенями являются вода и белки. Белки являются более чувствительной мишенью, чем ДНК и липиды для реакции с гидроксильным радикалом (ОН') - наиболее реакционноспособной АФК [Du, Gebicki, 2004]. Это обусловлено тем, что среди биополимеров содержание белкового компонента в клетке является наибольшим и составляет около 15% ее общей массы и 70% сухой массы [Gracanin et al., 2011] и они содержат ряд высокореакционных групп [Shtarkman et al., 2008].

При повреждении белков ионизирующей радиацией в присутствии кислорода возникает ряд окисленных продуктов, время полужизни которых может составлять несколько часов и более [Stadtman, 1993]. Среди них важную роль занимают гидропероксиды белков и аминокислот [Rahmanto et al., 2010]. Первичное окисление белков и свободных аминокислот с образованием их пероксидов может вызывать ряд цепных реакций, что в конечном итоге приводит к повреждению других биомолекул, включая ДНК и белки [Rahmanto et al., 2010]. Предполагается, что окисление белков свободными радикалами участвует в процессе клеточного старения и инициирует ряд болезней человека [Hawkins, Davies, 2001].

Было показано, что аминокислоты, так же, как и белки, способны к образованию долгоживущих радикалов в результате воздействия ионизирующего излучения [Блюменфельд, Калмансон, 1958].

В связи с этим актуальным является исследование возможности индукции пролонгированного окислительного стресса долгоживущими радикалами белка (ДЖРБ) после облучения, их роли в окислительном повреждении ДНК и генотоксического действия в клетках млекопитающих. Цель данной работы заключалась в исследовании генотоксического потенциала ДЖРБ, индуцированных рентгеновским излучением. В соответствии с целью были поставлены основные задачи:

3. Определить способность ДЖРБ вызывать окислительные повреждения ДНК in vitro и in vivo.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Карп, Ольга Эдвиновна

выводы

1. Показано образование долгоживущих радикалов бычьего сывороточного альбумина, овальбумина и гидролизата казеина при воздействии рентгеновского излучения в диапазоне доз от 5 до 50 Гр. Время полужизни этих радикалов составляет 3, 5,5 и 2,5 часов соответственно.

3. Физико-химический механизм повреждающего действия долгоживущих радикалов белков обусловлен их способностью длительное время продуцировать перекись водорода и гидроксильные радикалы в водной среде.

4. При разных способах введения в организм крыс и мышей долгоживущие радикалы белков и гидролизата казеина вызывают образование цитогенетических повреждений в полихроматофильных эритроцитах красного костного мозга.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе представлены результаты исследования генотоксического действия долгоживущих радикалов белка, индуцированных рентгеновским излучением, и их способности к продлению окислительного стресса в системах in vitro и in vivo.

В Главе 5 работы была исследована способность индуцированных рентгеновским излучением ДЖРБ БСА генерировать активные формы кислорода в водном растворе. Методом усиленной хемилюминесценции в системе люминол-р-йодофенол-пероксидаза было показано, что долгоживущие активные формы белка имеют два периода полужизни (15 мин и несколько часов). Время полужизни радикалов овальбумина и казеина при дозе 10 Гр составляет около 5,5 ч и 2,5 ч соответственно. Установлена зависимость образования перекиси водорода под влиянием облученного бычьего сывороточного альбумина при различных временах после облучения отражает экспоненциальный характер уменьшения способности облученного белка к генерации перекиси водорода в течение трех часов после облучения. С помощью специфичного флуоресцентного зонда, кумарин-3-карбоновой кислоты была изучена зависимость образования гидроксильных радикалов молекулами бычьего сывороточного альбумина от дозы рентгеновского излучения во времени. Было показано, что концентрация гидроксильных радикалов, образующихся под влиянием облученного бычьего сывороточного альбумина, так же как и перекиси водорода, линейно зависит от дозы излучения. В течение пострадиационного периода наблюдается экспоненциальный характер затухания способности облученного бычьего сывороточного альбумина к генерации гидроксильных радикалов так же, как и к генерации перекиси водорода. Таким образом, наши экспериментальные данные свидетельствуют о том, что долгоживущие активные формы белка бычьего сывороточного альбумина имеют двухфазный характер пострадиационной элиминации с общим полупериодом жизни в растворе порядка пяти часов и способны самопроизвольно генерировать активные формы кислорода. Образующиеся при этом перекись водорода и гидроксильные радикалы могут являться причиной длительного протекания окислительного стресса и повреждений ДНК в клетке и модельных системах in vitro.

Методом хемилюминесценции была исследована возможность образования долгоживущих радикалов в растворе отдельных облученных аминокислот. Для всех исследованных аминокислот наблюдалась линейная зависимость люминесценции от поглощенной дозы ионизирующего излучения. Чтобы выяснить возможную роль отдельных аминокислот в составе облученного белка в образовании активных форм кислорода, методом усиленной хемилюминесценции была исследована способность различных облученных рентгеновскими лучами аминокислот генерировать перекись водорода. По способности к генерации перекиси водорода аминокислоты можно разделить на три группы: аминокислоты, не способные к генерации перекиси водорода (Cys); аминокислоты, вызывающие генерацию умеренных количеств перекиси водорода (Arg, Met, Pro, Gly, Phe) и аминокислоты, приводящие к наибольшей продукции перекиси водорода (Leu, lie, Val, Ser,Thr).

В Главе 6 работы методом иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител исследовано образование 8-оксогуанина - биомаркера окислительных повреждений ДНК - в растворе ДНК под действием облученного БСА Инкубация ДНК с облученным раствором бычьего сывороточного альбумина приводит к образованию в ДНК 8-оксогуанина. Доля повреждений, опосредованная облученным белком, по сравнению с тотальным облучением ДНК в той же дозе, является значительной, и составляет 35 %. Полученный результат показывает высокую эффективность повреждения ДНК, опосредованную облученным белком. Было показано, что с помощью некоторых антиоксидантов можно существенно снизить повреждающий эффект долгоживущих радикалов бычьего сывороточного альбумина.

Методом микроядерного теста была исследована способность долгоживущих радикалов белка, индуцированных рентгеновским излучением, продлевать окислительный стресс и вызывать окислительные повреждения в ДНК in vivo. Изучено влияние облученного крысиного сывороточного альбумина при внутривенном введении его самцам крыс на образование микроядер в полихроматофильных эритроцитах красного костного мозга. Процент полихроматофильных эритроцитов, содержащих микроядра, в группе животных, которым внутривенно вводили крысиный сывороточный альбумин, облученный в дозе 100 Гр, был в 2,7 раза больше, чем у контрольных животных. Была показана линейная дозовая зависимость образования микроядер при их тотальном рентгеновском облучении, и таким образом было установлено, что внутривенное введение раствора альбумина, облученного в дозе 100 Гр, вызывает такое же количество цитогенетических повреждений, как тотальное разовое облучение в дозе около 0,3 Гр.

Было исследовано влияние скармливания облученного обезжиренного и обезвоженного творога самцам мышей на формирование микроядер в полихроматофильных эритроцитах их красного костного мозга. При употреблении мышами облученного в дозе 100 Гр творога в течение суток происходит относительное увеличение на 50% содержания микроядер в полихроматофильных эритроцитах их костного мозга по сравнению с группой интактных животных. Эти результаты свидетельствует о способности долгоживущих радикалов белка сохранять свой окислительный потенциал при переваривании пищи. Поскольку увеличение количества микроядер в клетках красного костного мозга линейно зависит от дозы рентгеновского излучения, то можно установить, что употребление мышами облученного в дозе 100 Гр творога соответствует тотальному облучению мышей в дозе около 0.1 Гр. При одновременном приеме с питьевой водой природных антиоксидантов наблюдалось снижение величины содержания микроядер в красном костном мозге мышей до исходных значений, статистически не отличающихся от группы интактных животных. Основным белком, входящим в состав обезжиренного творога, является казеин, который в процессе пищеварения расщепляется до отдельных аминокислот.

Результаты, полученные для облученного творога, позволили предполагать, что механизмом повреждающего действия долгоживущих радикалов белка при пероральном введении может являться генотоксическое действие долгоживущих радикалов аминокислот. В связи с этим было исследовано генотоксическое действие раствора гидролизата казеина, облученного в дозе 100 Гр, при внутрибрюшинном введении его в организм мышей. Установлено, что при внутрибрюшинном введении мышам этого раствора происходит увеличение числа полихроматофильных эритроцитов, содержащих микроядра, в 1,3 раза по сравнению с контролем.

Результаты, полученные для казеина и его гидролизата свидетельствуют о том, что способностью образовывать долгоживущие радикалы обладают сами аминокислоты, входящие в состав белка, а пространственная структура белка, по-видимому, не сказывается существенным образом на их времени жизни. Также не исключено, что пространственная структура белка защищает значительную часть аминокислот от воздействия рентгеновского излучения, при этом окисляются преимущественно аминокислоты, находящиеся на поверхности белка. Это предположение подтверждается полученными еще в 1958 г отечественными учеными данными о том, что интенсивность

73 люминесценции гидролизата казеина в несколько раз превышает интенсивность люминесценции нативного белка. Об этом могут также свидетельствовать и полученные методом ЭПР данные о значительном увеличении количества свободных радикалов при гамма-облучении денатурированного белка [Блюменфельд, Калмансон, 1958]. Данный результат частично может быть обусловлен большей доступностью аминокислот для образования радикалов при нарушении глобулярной структуры в результате денатурации белка. Полученные нами данные показывают, что собственная антиоксидантная система организма полностью не справляется с нейтрализацией окислительного стресса, обусловленного образованием дополнительных активных форм кислорода за счет долгоживущих окисленных продуктов индуцированных рентгеновским облучением белков и аминокислот. Однако дополнительное введение некоторых природных антиоксидантов инозина, метионина, триптофана и в меньшей степени витамина С способствовало нейтрализации генотоксического действия долгоживущих радикалов белка [Коуаша еХ а1., 1998; Гудков и др., 2007].

Таким образом, полученные в данной работе результаты показывают возможность существования долгоживущих радикалов белка и аминокислот, которые при облучении животных могут продлять окислительный стресс в течение нескольких часов после воздействия ионизирующей радиации путем генерации активных форм кислорода. При этом активные формы кислорода способны осуществлять генотоксическое действие, повреждая ДНК костного мозга мышей и крыс. При этом, как показано в данной работе, некоторые природные антиоксиданты могут в значительной степени нейтрализовать этот процесс при введении их в организм мышей после облучения.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Карп, Ольга Эдвиновна, Пущино

1. Анискина А.И., Чалисова Н.И., Закуцкий А.Н., Комашня A.B., Филиппов C.B., Зезюлии П.Н. Влияние аминокислот на клеточную пролиферацию и апоптоз в органотипской культуре тканей молодых и старых крыс. // Усп. Геронтол. 2006. Вып. 19. С. 55-59

2. Белокрылов Г.А., Деревнина О.Н., Попова О.Я. Различия в иммунном ответе, фагоцитозе и детоксицирующих свойствах под влиянием пептидных и аминокислотных препаратов. //Бюл. Экспер. Биол. Мед. 1995. Т. 118(2). С. 509-512

3. Блюменфельд Л. А. Калмансон Э.А. Спектры электронного парамагнитного резонанса биологических объектов. // Биофизика. 1958. Т. 111(1). С. 87-91

4. Болдырев A.A. Карнозин. Биологическое значение и возможности применения в медицине. М.: Издательство МГУ. 1998. 320 с.

5. Ванг A., Ma Ч., Кси Ж., Шен Ф. Карнозин- природное лекарственное средство, замедляющее старение человека. // Биохимия. 2000. Т. 65(7). С. 869-871

6. Владимиров Ю.А., Азизова O.A., Деев А.И. и др. Свободные радикалы в живых системах. // Итоги науки и техники. Сер. Биофизика. М. 1991. С. 1-249

7. Гудков C.B., Штаркман И.Н., Черников A.B., Усачева A.M., Брусков В.И. Гуанозин и инозин рибоксин элиминируют долгоживущие белковые радикалы, образующиеся при воздействии рентгеновского излучения. // Доклады Академии Наук. 2007. Т. 413 2 .С. 264-267

8. Деккер И.А., Лайвси С.А., Чжоу С. Переоценка антиоксидантного действия очищенного карнозина. // Биохимия. 2000. Т. 65(7). С. 766-770

9. Журавлев А.И. Развитие идей Б.Н. Тарусова о роли цепных процессов в биологии. // Биоантиокислители в регуляции метаболизма в норме и патологии. // М.: Наука, 1982. С. 3-37.

10. Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меныцикова Е.Б. Окислительный стресс: биохимический и патофизиологический аспекты. М.: МАИК «Наука/Интерпериодика». 2001. 343 с.

11. Кудряшов Ю.Б. Радиационная биофизика (ионизирующие излучения). // М.: Физматлит. 2004. 443 с.

12. Лейнсоо Т.А., Абе X., Болдырев A.A. Карнозин и родственные соединения защищают двухцепочечную ДНК от окислительного повреждения. // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 2006. Т. 42. № 5. С. 453-457

13. Маянский А.Н., МаянскийД.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. // Новосибирск: Наука. 1989. 123 с.

14. Меныцикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К., Бондарь И.А., Круговых Н.Ф., Труфакин В.А. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. // М.: Слово. 2006. 553 с.

15. Новоселов В.И., Амелина С.Е., Кравченко И.Н., Новоселов C.B., Янин В.А., Садовников В.Б., Фесенко Е.Е. Роль пероксиредоксина в антиоксидантной системе органов дыхания. // Докл. РАН. 2000. Т. 375(6). С. 831-833

16. Осипов А.Н., Азизова O.A., Владимиров Ю.А. Активированные формы кислорода и их роль в организме // Успехи биол. Химии. 1990. Т. 31. С. 180-208.

17. Пескин A.B. Взаимодействие активного кислорода с ДНК. // Биохимия. 1997. Т.62(2). С.1571-1578

18. Разумовский С.Д. Кислород элементарные формы и свойства. // М.: Химия. 1979

19. Синицкая Н.С., Хавинсон В.Х. Роль пептидов в свободнорадикальном окислении и старении организма. // Успехи современной биологии. 2002. Т. 122(6). С. 557-568

20. Трофимов A.B., Князькин И.В., Кветной И.М. Молекулярная биология нейроэндокринных клеток желудочно-кишечного тракта в моделях преждевременного старения. С.П.: Система. 2004. 158с

21. Хавинсон В.Х., Анисимов С.В., Малинин В.В., Анисимов В.Н. Пептидная регуляция генома и старение.М.: Издательсьво РАМН. 2005. 208с

22. Хавинсон В.Х., Морозов В.Г. Геропротекторная активность тималина и эпиталамина. // Успехи геронтол. 2002. Вып. 10. С. 74-84

23. Чалисова Н.И., Пеннияйнен В.А., Ноздрачев А.Д. Регуляторные воздействия незаменимых и заменимых аминокислот на ткани селезенки и печени в органотипической культуре. // ДАН. 2003. Т. 393(2). С. 276-280

24. Черников А.В., Брусков В.И. Образование активных форм кислорода в воде под действием тепла. // Доклады Академии Наук. 2002. Т. 384. С. 181-184

25. Чистяков В.А., Корниенко И.В., Клецкий М.Е. Корниенко И.Е., Лисицын А.С., Новиков В.В. Супероксиддисмутирующая активность некоторых аминокислот в водных растворах. // Биофизика. 2005. Т. 50. вып. 4. С. 601-605

26. Штаркман И.Н., Гудков С.В., Черников А.В., Брусков В.И. Образование перекиси водорода и гидроксильных радикалов в водных растворах L-аминокислот при воздействии рентгеновского излучения и тепла. // Биофизика. 2008. Т. 53, вып. 1, С. 5-13

27. Штаркман И.Н., Гудков С.В., Черников А.В., Брусков В.И. Влияние аминокислот на образование перекиси водорода и гидроксильных радикалов в воде и 8-оксогуанина в ДНК при воздействии рентгеновского излучения. // Биохимия. 2008а.Т. 73. С. 576586

28. Alia, Mohanty P., Matysik J. Effect of proline on the production of singlet oxygen. // Amino Acids. 2001. Vol. 21. P. 195-200

29. Alia, Saradhi P.P., Mohanty P. Proline in relation to free radical production in seedlings of Brassica juncea raised under sodium chloride stress. // Plant Soil. 1993. Vol. 155. P. 497500.

30. Armstrong D.A., Yu D., Rauk A. Oxidative damage to the glycyl alpha-carbon site in proteins: an ab initio study of the C-H bond dissociation energy and the reduction potential of the C-centered radical. // Can. J. Chem. 1996. Vol. 74. P. 1192-1199

31. Arutyunova E.I., Danshina P.V., Domnina L.V., Pleten A.P., Muronetz V.I. Oxidation of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase enhances its binding to nucleic acids. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. Vol. 307. P. 547-552

32. Asadullina N. R., Usacheva A. M., Smirnova V. S., Gudkov S. V. Antioxidative and radiation modulating properties of guanosine-5'-monophosphate. // Nucleot. Nucleos. and Nucl. Acids. 2010. Vol. 29. P. 786-799

33. Biaglow J.E., Varnes M.E., Epp E.R., Clark E.P., Tuttle S.W., Held K.D. Role of glutathione in the aerobic radiation response. // Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 1989. Vol. 16. P. 1311-1314

34. Block D.A., Yu D., Armstrong D.A., Rauk A. On the influences of secondary structure on the alpha-C-H bond dissocation energy of proline residues in proteins: a theoretical study. // Can. J. Chem. 1998. Vol. 76. P. 1042-1049

35. Boldyrev A.A., Dupin A.M., Pindel E.V., Antioxidative properties of histidine-containing di peptides from skeletal muscles of vertebrates. // Comp. Biochem. Physiol. 1988. V. 89B. P. 245-250

36. Bolton J.L., Trush M.A., Penning T.M., Dryhurst G., Monks T.J. Role of quinones in toxicology. // Chem. Res. Toxicol. 2000. Vol. 13. P. 135-160

37. Bruskov V. I., Malakhova V., Masalimov Z. K., Chernikov A. V. Heat-indused formation of reactive oxygen species and 8-oxoguanine, a biomarker of damage to DNA. // Nucleic Acids Research. 2002. Vol. 30. P. 1354-1363

38. Bump E.A., Brown J.M. Role of glutathione in the radiation response of mammalian cells in vitro and in vivo. // Pharmacol. Ther. 1990. Vol. 47. P. 117-136

39. Buxton G.V., Greeenstock C.L., Helman W.P., Ross A.B. Critical review of rate constants for reactions of hydrated electrons, hydrogen atoms and hydroxyl radicals in aqueous solution. //J.Phys. Chem. Ref. 1988. Data 17. P. 513-886

40. Cecarini V., Gee J., Fioretti E., Amici M., Angeletti M., Eleuteri A.M., Keller J.N. Protein oxidation and cellular homeostasis: emphasis on metabolism. // Biochimica et Biophysica acta. 2007. Vol. 1773. P. 93-104

41. Chao C., Ma Y., Stadman E.R. Modification of protein surface hydrophobicity and methionine oxidation by oxidative systems. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1997. Vol. 94. P.2969-2974

42. Chen C., Dickman M.B. Proline suppresses apoptosis in the fungal pathogen Colletotrichum trifolii. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. Vol. 102(9). P. 3459-3464

43. Dakin H.D. The oxidation of amido acids with the production of substances of biological importance. //J. Biol. Chem. 1906. Vol. 1. P. 171-176

44. Daly M.J. Death by protein damage in irradiated cells. // DNA Repair. 2012. Vol. 11. P. 12 -21

45. Dastoor Z., Dreyer J.L. Potential role of nuclear translocation of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in apoptosis and oxidative stress. // J. Cell. Sci. 2001. Vol. 114. P. 1643-1653

46. Davies M.J. Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen. // Photochem. Photobiol. Sci. 2004. Vol. 3. P. 17-25

47. Davies M.J. The oxidative environment and protein damage. // Biochimica et Biophysica acta. 2005. Vol. 1703. P. 93-109

48. Davies M.J., Fu S., Dean R.T. Protein hydroperoxides can give rise to reactive free radicals. // Biochem J. 1995. Vol. 305(2). P. 643-649

49. Dean R.T., Fu S., Stacker R., Davies M.J. Biochemistry and pathology of radical-mediated protein oxidation. // Biochem. J. 1997. Vol. 324. P. 1-18

50. Du J., Gebicki J.M. Proteins are major initial cell targets of hydroxyl free radicals. // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2004. Vol. 36 11 . P. 2334-2343

51. Dubbelman T.M., de Goeij A.F., van Steveninck J. Photodynamic effects of protoporphyrin on human erythrocytes. Nature of the cross-linking of membrane proteins. //Biochim. Biophys. Acta. 19785. Vol. 11. P. 141-151

52. Easton C.J. Free-radical reactions in the synthesis of alpha-amino acids and derivatives. // Chem. Rev. 1997. Vol. 97. P. 53-82

53. Eisenberg WC, Taylor K, Guerrero RR. Cytogenetic effects of singlet oxygen. // J Photochem. Photobiol. B. 1992. Vol. 16(3-4). P. 381-384

54. Forman H.J., Maiorino M., Ursini F. Signaling functions of reactive oxygen species. // Biochemistry. 2010. Vol. 49. P. 835-842

55. Fu S., Hick L.A., Sheil M.M., Dean R.T. Structural identification of valine hydroperoxides and hydroxides on radical-damaged amino acid, peptide, and protein molecules. // Free Radic. Biol. Med. 1995. Vol. 19. P. 281-292

56. Fu S.L., Dean R.T. Structural characterization of the products of hydroxyl-radical damage to leucine and their detection on proteins. // Biochem. J. 1997. Vol. 324. P. 41-48

57. Furukawa A., Hiraku Y., Oikawa S., Luxford C., Davies M. J., Kawanishi S. Guanine-specific DNA damage induced by gamma-irradiated histone. // Biochem. J. 2005. Vol. 388 3 .P. 813-818

58. Gao J., Yin D.H., Yao Y., Sun H., Qin Z., Schoneich C., Williams T.D., Squier T.C. Loss of conformational stability in calmodulin upon methionine oxidation. // Biophys. J. 1998. Vol. 74. P. 1115-1134

59. Gebicki J.M. Protein hydroperoxides as new reactive oxygen species. // Redox Rep. 1997. Vol. 3.P. 99-110

60. Gebicki S., Gebicki J.M. Crosslinking of DNA and proteins induced by protein hydroperoxides. // Biochem. J. 1999. Vol. 338. P. 629-636

61. Gebicki S., Gebicki J.M. Formation of peroxides in amino acids and proteins exposed to oxygen free radicals. // Biochem. J. 1993. Vol. 289. P. 743-749

62. Gebicki S., Gill K.H., Dean R.T., Gebicki J.M. Action of peroxidases on protein hydroperoxides. // Redox Rep. 2002. Vol. 7. P. 235-242

63. Genet S., Kale R.K., Baquer N.Z. Effects of free radicals on cytosolic creatine kinase activities and protection by antioxidant enzymes and sulfhydryl compounds. // Mol. Cell. Biochem. 2000. Vol. 210. P. 23-28

64. Gracanin M., Lam M.A., Morgan P.E., Rogers K.J., Hawkins C.L, Davies M.J. Amino acid, peptide, and protein hydroperoxides and their decomposition products modify the activity of the 26S proteasome // Free Radic Biol Med 2011. Vol. 50. P. 389 399

65. Gudkov S. V., Gudkova 0.,Y., Chernikov A. V., Bruskov V. I. Protection of mice against X-ray injuries by the post-irradiation administration of guanosine and inosine. // Int. J. Radiat. Biol. 2009. Vol. 85 2 . P. 116-125

66. Halliwell B., Gutteridge J.M. Oxygen toxicity, oxygen radicals, transition metals and disease. // Biochem. J. 1984. Vol. 219. P. 1-14

67. Halliwell B., Gutteridge J.M.C. Caeruloplasmin and the superoxide radical. // Lancet. 1982. Vol. 2. P. 556-559

68. Hamman B.L., Bittl J.A., Jacobus W.E., Allen P.D., Spencer R.S., Tian R., Ingwall J.S. Inhibition of the creatine kinase reaction decreases the contractile reserve of isolated rat hearts. // Am. J. Physiol. 1995. Vol. 269. P. 1030-1036

69. Hampton M.B., Morgan P.E., Davies M.J. Inactivation of cellular caspases by peptide-derived tryptophan and tyrosine peroxides. // FEBS Lett. 2002. Vol. 527. P. 289-292

70. Hassel B., Sonnewald U. Selective inhibition of the tricarboxylic acid cycle of GABAergic neurons with 3-nitropropionic acid in vivo. // J. Neurochem. 1995. Vol. 65. P. 1184-1191

71. Hawkins C.L., Davies M.J. Generation and propagation of radical reactions on proteins. // Biochim. Biophys. Acta. 2001. Vol. 504. P. 196-219

72. Hawkins C.L., Pattison D.I., Davies M.J. Hypochlorite-induced oxidation of amino acids, peptides and proteins. // Amino Acids. 2003. Vol. 25. P. 259-274

73. Hawkins C.L., Rees M.D., Davies M.J. Superoxide radicals can act synergistically with hypochlorite to induce damage to proteins. // FEBS Lett. 2002. Vol. 510. P. 41^14

74. Hirayama H., Tamaoka J., Horikoshi K. Improved immobilization of DNA to microwell plates for DNA-DNA hybridization. // Nucl. Acids Res. 1996. Vol. 24. P. 4098-4099

75. Hogg P.J. Disulfide bonds as switches for protein function. // Trends Biochem. Sci. 2003. Vol. 28. P. 210-214

76. Holmgren A. Antioxidant function of thioredoxin and glutaredoxin systems. // Antioxid. Redox Signal. 2000. Vol. 2. P. 811-820

77. Holtzman D., Meyers R., Khait I., Jensen F. Brain creatine kinase reaction rates and reactant concentrations during seizures in developing rats. // Epilepsy Res. 1997. Vol. 27. P. 7-11

78. Hoppe G., O'Neil J., Hoff H.F. Inactivation of lysosomal proteases by oxidized low density lipoprotein is partially responsible for its poor degradation by mouse peritoneal macrophages. // J. Clin. Invest. 1994. Vol. 94. P. 1506-1512

79. Kanofsky J.R., Sima P. Singlet oxygen production from the reactions of ozone with biological molecules. //J. Biol. Chem. 1991. Vol. 266. P. 9039-9042

80. Keck R.G. The use of t-butyl hydroperoxide as a probe for methionine oxidation in proteins. // Anal. Biochem. 1996. Vol. 236. P. 56-62

81. Kriegenburg F, Ellgaard L, Hartmann-Petersen R. Molecular chaperones in targeting misfolded proteins for ubiquitin-dependent degradation. // FEBS J. 2012. Vol. 279(4). P. 532-42

82. Kiffin R., Bandyopadhyay U., Cuervo A.M. Oxidative stress and autophagy. // Antioxid. Redox Signal. 2006. Vol. 8. P. 152-162

83. Kiffin R., Christian C., Knecht E., Cuervo A.M. Activation of chaperone-mediated autophagy during oxidative stress. // Mol. Biol. Cell. 2004. Vol. 15. P. 4829^1840

84. Kindig C.A., Howlett R.A., Stary C.M., Walsh B., Hogan M.C. Effects of acute creatine kinase inhibition on metabolism and tension development in isolated single myocytes. // J. Appl. Physiol. 2005. Vol. 98. P. 541-549

85. Kohen R., Yamamoto Y., Kundy K.S. Antioxidant activity of carnosine, homocarnosine, and anserine present in muscle and brain. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. Vol. 85. P. 3175-3179

86. Kotiaho T., Eberlin M.N., Vainiotalo P., Kostiainen R. Electrospray mass and tandem mass spectrometry identification of ozone oxidation products of amino acids and small peptides. // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2000. Vol. 11. P. 526-535

87. Koyama S., Kodama S., Suzuki K., Matsumoto T., Miyazaki T., Watanabe M. Radiation-induced long-lived radicals which cause mutation and transformation. // Mutat. Res. 1998. Vol. 421(1). P. 45-54

88. Kuhn D.M., Arthur R.E. 1-DOPA-quinone inactivates tryptophan hydroxylase and converts the enzyme to a redox-cycling quinoprotein. // Brain Res. Mol. 1999. Vol. 73. P. 78-84

89. Kukreja R.S., Jesse R.L., Hess M.L. Singlet oxygen: A potential culprit in myocardial injuri? // Mol. Cell. Biochem. 1992. Vol. 111. P. 17-24

90. Lass A., Suessenbacher A., Woolkart G., Mayer B. and Friedovich B. Functional and analytical evidence for scavenging of oxygen radicals by L-Arginine. // Mol. Pharmacol. 2002. Vol. 61. P. 1081-1088

91. Levine R.L., Moskovitz J., Stadtman E.R. Oxidation of methionine in proteins: roles in antioxidant defense and cellular regulation. // IUBMB Life. 2000. Vol. 50. P. 301-307

92. Levine R.L., Mosoni L., Berlett B.S., Stadtman E. Methionine residues as endogenous antioxidants in proteins. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1996. Vol. 93. P. 15036-15040

93. Levine R.L., Wehr N., Williams J.A., Stadtman E.R., Shacter E. Determination of carbonyl groups in oxidized proteins. // Methods Mol. Biol. 2000a. Vol. 99. P. 15-24

94. Lieber M.R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end joining pathway. // Annu. Rev. Biochem. 2010. Vol. 79. P. 181 211

95. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent. // J Biol Chem 1951;193:265-275

96. Luo S., Levine R.L. Methionine in proteins defends against oxidative stress. // FASEB J. 2009. Vol. 23(2). P. 464-472

97. Luxford C., Dean R.T., Davies M.J. Induction of DNA damage by oxidised amino acids and proteins. // Biogerentology. 2002. Vol. 3. P. 95-102

98. Luxford C., Dean R.T., Davies M.J. Radicals derived from histone hydroperoxides damage nucleobases in RNA and DNA. // Chem. Res. Toxicol. 2000. Vol. 13. P. 665-672

99. Luxford C., Morin B., Dean R.T., Davies M.J. Histone HI- and other protein- and amino acid-hydroperoxides can give rise to free radicals which oxidize DNA. // Biochem. J. 1999. Vol. 344. P. 125-134

100. Luxford C., Roger T.D., Davies M.J. Radicals derived from histone hydroperoxides damage nucleobases in RNA and DNA. // Chem. Res. 2000. Vol. 13. P. 665-672

101. Ly A., Tran N.Q., Ward J.F., Milligan J.R. Repair of oxidative Guanine Damage in Plasmid DNA by indoles involves proton transfer between complementary bases. // Biochem. 2006. Vol. 43. P. 9098-9104

102. Lynch R.E., Fridovich I. Effects of superoxide on the erythrocyte membrane. // J. Biol. Chem. 1978. Vol. 253(6). P. 1838-1845

103. Mallet R.T., Squires J.E., Bhatia S., Sun J. Pyruvate restores contractile function and antioxidant defenses of hydrogen peroxide-challenged myocardium. // J. Mol. Cell. Cardiol. 2002. Vol. 34. P. 1173-1184

104. Manevich Y., Held K.D., Biaglow J.E. Coumarin-3-carboxylic acid as a detector for hydroxyl radicals generated chemically and by gamma radiation. // Radiation Research. 1997. Vol. 148. P. 580-591

105. Mashima R., Yoshimura S., Yamamoto Y. Reduction of lipid hydroperoxides by apolipoprotein B-100. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. Vol. 259. P. 185-189

106. McFarland G.A., Holliday R. Retardation of the senescence of cultured human diploid fibroblasts by carnosine. // Exp. Cell. Res. 1994. Vol. 212. P 167-175

107. Meyer H, Bug M, Bremer S. Emerging functions of the VCP/p97 AAA-ATPase in the ubiquitin system. //Nat Cell Biol. 2012. Vol. 14(2). P. 117-23

108. McCord J.M., Russell W.J. Inactivation of creatine phosphokinase by superoxide during reperfusion injury. // Basic Life Sci. 1988. Vol. 49. P. 869-873

109. Midden W.R., Dahl T.A. // Biological inactivation by singlet oxygen: distinguishing 02 (Hg) // Biochim. et Biophys. Acta. 1992. Vol. 1117. P. 216-222

110. Midorikawa K, M urata M , K awanichi S . H istone peptide AKRHRK enhances H202-induced DNA damage and alters its site specifi city. // Biochim. Biophys. Res. Commun. 2005. Vol. 333. P. 1073- 1077

111. Milligan J.R., Aguilera J.A., Ly A., Tran Q., Hoang 0.,Ward J.F. Repair of oxidative DNA damage by amino acids. // NAR. 2003. Vol. 31. № 21. P. 6258-6263

112. Milligan J.R., Tran Q., Ly A., Ward J.F. Peptide repair of oxidative DNA damage. // Biochemistry. 2004. Vol. 43. P. 5102-5108

113. Mohsenin V., Gee J.L. Oxidation of alpha 1-protease inhibitor: role of lipid peroxidation products. // J. Appl. Physiol. 1989. Vol. 66. P. 2211-2215

114. Morgan P.E., Dean R.T., Davies M.J. Inhibition of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase by peptide and protein peroxides generated by singlet oxygen attack. // Eur. J. Biochem. 2002. Vol. 269. P. 1916-1925

115. Morgan P.E., Dean R.T., Davies M.J. Protective mechanisms against peptide and protein peroxides generated by singlet oxygen. // Free Radic. Biol. Med. 2004. Vol. 36. P. 484496

116. Morin B., Davies M.J., Dean R.T. The protein oxidation product 3,4-dihydroxyphenylalanine DOPA mediates oxidative DNA damage. // Biochem. J. 1998. Vol. 330. P. 1059-1067

117. Murrell G., Bromley F.N. Modulation of fibroblast proliferation by oxygen free radicals. Biochem. J. 1990. Vol. 265. P. 659-665

118. Nauser T., Schoneich C. Thiyl radicals abstract hydrogen atoms from the alpha C-H bonds in model peptides: absolute rate constants and effect of amino acid structure. // J. Am. Chem. Soc. 2003. Vol. 125. P. 2042-2043

119. Neta P., Grodkowski J., Ross A.B. Rate constants for reactions of aliphatic carbon-centered radicals in aqueous solution. // J. Phys. Chem. Ref. 1966. Data 25 P. 709-1066

120. Neta P., Huie R.E., Ross A.B. Rate constants for reactions of peroxyl radicals in fluid solutions. // J. Phys. Chem. Ref. 1990. Data 19. P. 413-513

121. Neuzil J., Gebicki J.M., Stacker R. Radical-induced chain oxidation of proteins and its inhibition by antioxidants. // Biochem. J. 1993. Vol. 293. P. 601-606

122. Nielsen H.K., Loliger J., Hurrell R.F. Reactions of proteins with oxidizing lipids: Analytical measurements of lipid oxidation and of amino acid losses in a whey proteinmethyl linolenate model system. // Br. J. Nutr. 1985. Vol. 53. P. 61-73

123. Nulton-Persson A.C., Szweda L.I. Modulation of mitochondrial function by hydrogen peroxide. Hi. Biol. Chem. 2001. Vol. 276. P. 23357-23361

124. Olsen C., Rustad A., Fonnum F., Paulsen R.E., Hassel B. 3-Nitropropionic acid: an astrocyte-sparing neurotoxin in vitro. // Brain Res. 1999. Vol. 850. P. 144-149

125. Orlowski M., Wilk S. Catalytic activities of the 20 S proteasome, a multicatalytic proteinase complex. // Arch. Biochem. Biophys. 2000. Vol. 383. P. 1-16

126. Ostdal H., Davies M. J., Andersen H. J. Reaction between protein radicals and other biomolecules. // Free Rad. Biol. Med. 2002. Vol. 33. P. 201-209

127. Pacifici R.E., Salo D.C., Davies K.J. Macroxyproteinase M.O.P.: a 670 kDa proteinase complex that degrades oxidatively denatured proteins in red blood cells. // Free Radic. Biol. Med. 1989. Vol. 7. P. 521-536

128. Padmaja S., Squadrito G.L., Lemercier J.N., Cueto R., Pryor W.A. Rapid oxidation of dl-selenomethionine by peroxynitrite. // Free Radic. Biol. Med. 1996. Vol. 21. P. 317-322

129. Park E.M., Thomas J.A. S-thiolation of creatine kinase and glycogen phosphorylase b initiated by partially reduced oxygen species. // Biochim. Biophys. Acta. 1988. Vol. 964. P. 151-160

130. Pietraforte D., Minetti M. Direct ESR detection of peroxynitriteinduced tyrosine-centered protein radicals in human blood plasma. // Biochem. J. 1997. Vol. 325. P. 675 684

131. Pryor W.A., Jin X., Squadrito G.L. One- and two-electron oxidations of methionine by peroxynitrite. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1994. Vol. 91. P. 11173-11177

132. Rahmanto A.S., Morgan P.E., Hawkins C.L., Davies M.J. Cellular effects of photogenerated oxidants and long-lived, reactive, hydroperoxide photoproducts. // Free Radic. Biol. Med. 2010. Vol. 49 10 . P. 1505-1515

133. Rahmanto A.S., Morgan P.E., Hawkins C.L., Davies M.J. Cellular effects of peptide and protein hydroperoxides. // Free Radic. Biol. Med. 2010. Vol. 48 8 . P. 1071-1078

134. Reid D.L., Armstrong D.A., Rauk A., Sonntag C. H-atom abstraction by thiyl radicals from peptides and cyclic dipeptides. A theoretical study of reaction rates. // Phys. Chem. 2003. Vol. 5. P. 3994-3999

135. Roche M., Rondeau P., Singh N. R., Tarnus E., Bourdon E. The antioxidant properties of serum albumin. // FEBS Letters. 2008. Vol. 582. P. 1783-1787

136. Rodriguez H., Valentine M.R., Holmquist G.P., Akman S.P., Termini J. Mapping of peroxyl radical induced damage on genomicDNA. // Biochemistry. 1999. Vol. 38. P. 16578 16588

137. Ross S.M., Sabri M.I., Spencer P.S. Action of acrylamide on selected enzymes of energy metabolism in denervated cat peripheral nerves. // Brain Res. 1985. Vol. 340. P. 189-191

138. Lee S.M., Huh T.L., Park J.W., Inactivation of NADP + -dependent isocitrate dehydrogenase by reactive oxygen species, Biochimie 83 2001 1057-1065.

139. Schmalhausen E.V., Pleten A.P., Muronetz V.I. Ascorbate-induced oxidation of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. Vol. 308. P. 492^196

140. Schoneich C., Bonifacic M., Asmus K.D. Reversible H-atom abstraction from alcohols by thiyl radicals: determination of absolute rate constants by pulse radiolysis. // Free Radic. Res. Commun. 1989. Vol. 6. P. 393^105

141. Schoneich C., Pogocki D., Hug G.L., Bobrowski K. Free radical reactions of methionine in peptides: mechanisms relevant to beta-amyloid oxidation and Alzheimer's disease. // J. Am. Chem. Soc. 2003. Vol. 125. P. 13700-13713

142. Schoneich C., Yang J. Oxidation of methionine peptides by Fenton systems: the importance of peptide sequence, neighbouring groups and EDTA. // J. Chem. Soc. 1996. Vol. 2. P. 915- 924

143. Schoneich C. Cysteine residues as catalysts for covalent peptide and protein modification: a role for thiyl radicals? // Biochem Soc Trans. 2011 Vol. 39(5). P. 1254-1259

144. Sharov V.S., Ferrington D.A., Squier T.C., Schoneich C. Diastereoselective reduction of protein-bound methionine sulfoxide by methionine sulfoxide reductase. // FEBS Lett. 1999. Vol. 455. P. 247-250

145. Sharov V.S., Schoneich C. Diastereoselective protein methionine oxidation by reactive oxygen species and diastereoselective repair by methionine sulfoxide reductase. // Free Radic. Biol. Med. 2000. Vol. 29. P. 986-994

146. Shen H.R., Spikes J.D., Kopecekova P., Kopecek J. Photodynamic crosslinking of proteins: I. Model studies using histidine- and lysinecontaining N-2-hydroxypropyl methacrylamide copolymers. // J. Photochem. Photobiol. 1996. Vol. 34. P. 203-210

147. Shen H.R., Spikes J.D., Kopeckova P., Kopecek J. Photodynamic crosslinking of proteins: photocrosslinking of a model proteinribonuclease A. // J. Photochem. Photobiol. 1996. Vol. 35. P. 213-219

148. Shen H.R., Spikes J.D., Smith C.J., Kopecek J. Photodynamic cross-linking of proteins: IV. Nature of the His-His bond's formed in the rose bengal-photosensitized cross-linking of N-benzoyl-lhistidine. // J. Photochem. Photobiol. 2000. Vol. 130. P. 1-6

149. Shtarkman I.N., Gudkov S.V., Chernikov A.V., Bruskov V.I. Effect of amino acids on X-ray-induced hydrogen peroxide and hydroxyl radical formation in water and 8-oxoguanine in DNA // Biochemistry (Moscow) 2008. Vol. 73. P. 470 478

150. Simpson J.A., Narita S., Gieseg S., Gebicki S., Gebicki J.M., Dean R.T. Long-lived reactive species on free-radical-damaged proteins. // Biochem. J. 1992. Vol. 282. P. 621— 624

151. Sirove r M.A. Role of the glycolytic protein, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, in normal cell function and in cell pathology. // J. Cell. Biochem. 1997. Vol. 66. P. 133— 140

152. Sohal R.S., Svenson I., Brunk U.T. Hydrogen peroxide production by liver mitochondria in different species. // Mech. Ageing and Develop. 1990. Vol. 53. P. 209-215

153. Spector D., Etienne F., Brot N., Weissbach H. New membraneassociated and soluble peptide methionine sulfoxide reductases in Escherichia coli. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. Vol. 302. P. 284-289

154. Stachowiak O., Dolder M., Wallimann T., Richter C. Mitochondrial creatine kinase is a prime target of peroxynitrite-induced modification and inactivation. // J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273. P. 16694-16699

155. Stadtman E.R. Oxidation of free amino acids and amino acid residues in proteins by radiolysis and by metal-catalyzed reactions. // Annu. Rev. Biochem. 1993. Vol. 62. P. 797821

156. Stadtman E.R., Berlett B.S. Reactive oxygen-mediated protein oxidation in aging and disease. // Chem. Res. Toxicol. 1997. Vol. 10. P. 485-494

157. Stone J.R., Yang S. Hydrogen peroxide: a signaling messenger // Antioxid Redox Signal. 2006. Vol. 8. P. 243 270

158. Sundqvist T. Bovine aortic endothelial cells release hydrogen peroxide. // J. Cell Physiol. 1991. Vol. 148. P. 152-156

159. Suzuki Y.J., Edmondson J.D., Ford G.D. Inactivation of rabbit muscle creatine kinase by hydrogen peroxide. // Free Radic. Res. Commun. 1992. Vol. 16. P. 131-136

160. Takenaka A., Annaka H., Kimura Y., Aoki H., Igarashi K. Reduction of paraquat-induced oxidative stress in rats by dietary soy peptide. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2003. Vol. 67(2). P. 278-283

161. Terman A., Brunk U.T. Lipofuscin. // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2004. Vol. 36. P. 14001404

162. Terman A., Brunk U.T. Lipofuscin: mechanisms of formation and increase with age. // Apmis. 1998. Vol. 106. P. 265-276

163. Torrielli M.V., Dianzani M.U. Free radicals in inflammatory disease. // Free Radicals in Molecular Biology, Aging and Disease. N.Y.: Raven Press. 1984. P. 355-379

164. Tretter L., Adam-Vizi V. Inhibition of Krebs cycle enzymes by hydrogen peroxide: a key role of alpha.-ketoglutarate dehydrogenase in limiting NADH production under oxidative stress. // J. Neurosci. 2000. Vol. 20. P. 8972-8979

165. Ueno A., Vannais D., Lenarczyk M., Waldren C. A. Ascorbate, added after irradiation, reduces the mutant yield and alters the spectrum of CD59- mutations in A L cells irradiated with high LET carbon ions. // J. Radiat. Res. 2002. Vol. 43. P. 245-249

166. Walsh M., Stevens F.C., Oikawa K., Kay C.M. Circular dichroism studies on Ca2+-dependent protein modulator oxidized with N-chlorosuccinimide. // Biochemistry. 1978. Vol. 17. P. 3928-3930

167. Ward J.F. DNA damage produced by ionizing radiation in mammalian cells: identities, mechanisms of formation and reparability. // Progr. Nucl. Acid Res. Mol. Biol. 1988. Vol. 35. P.95-125

168. Watts Z.I., Easton C.J. Peculiar stability of amino acids and peptides from a radical perspective. //J. Am. Chem. Soc. 2009. Vol. 131. P. 11323 11325

169. Wendel A. Enzymes acting against reactive oxygen. // Enzymes: Tools and Targets. 1988. P. 161-167

170. Wentworth P. (Jr.), Jones L.H., Wentworth A.D., Zhu X., Larsen N.A., Wilson I.A., Xu X., Goddard W.A., III, Janda K.D., Es moser A., Leruer R.A. Antibody catalysis of the oxidation of water. Science. 2001. Vol. 293. P. 1806-1811

171. Wilkinson F., Helman W.P., Ross A.B. Rate constants for the decay and reactions of the lowest electronically excited state of molecular oxygen in solution. An expanded and revised compilation. // J. Phys. Chem. Ref. 1995. Data 24. P. 663-1021

172. Winterbourn C.C., Buss H. Protein carbonyl measurement by enzyme-linked immunosorbent assay. // Methods Enzymol. 1999. Vol. 300. P. 106-111

173. Winterbourn C.C., Kettle A.J. Biomarkers of myeloperoxidasederived hypochlorous acid. // Free Radic. Biol. Med. 2000. Vol. 29. P. 403-409

174. Witting P.K., Mauk A.G. Reaction of human myoglobin and H202. Electron transfer between tyrosine 103 phenoxyl radical and cysteine 110 yields a protein-thiyl radical. // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276. P. 16540-16547

175. Wolosker H., Panizzutti R., Engelender S. Inhibition of creatine kinase by S-nitrosoglutathione. // FEBS Lett. 1996. Vol. 392. P. 274-276

176. Yuan G., Kaneko M., Masuda H., Hon R.B., Kobayashi A., Yamazaki N. Decrease in heart mitochondrial creatine kinase activity due to oxygen free radicals. // Biochim. Biophys. Acta. 1992. Vol. 1140. P. 78-84

177. СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

178. АФК активные формы кислорода ДЖРБ - долгоживущие радикалы белка ПОЛ - перекисное окисление липидов ОН~ - гидроксильный ион ОН* - гидроксильный радикал 02*" - супероксид-анион радикал 102 - синглетный кислород

179. ABTS 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenz-thiazoline-6-sulfonic acid) ИФА - иммуноферментный анализ Guo - гуанозин Ino - инозин

180. ККК- кумарин-3-карбоновая кислота

181. ОН-ККК 7-гидроксикумарин-З-карбоновая кислота

182. ПХЭ полихроматофильные эритроциты1. МЯ микроядра

183. ЭПР электронный парамагнитный резонанс

184. DOPA дигидроксифенилаланин1. ХЛ хемилюминесценция

185. БСА бычий сывороточный альбумин

186. КСА крысиный сывороточный альбумин

Информация о работе