Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетическое разнообразие Francisella tularensis из природных очагов России

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Генетическое разнообразие Francisella tularensis из природных очагов России"

На правах рукописи

ТИМОФЕЕВ Виталий Сергеевич

Теистическое разнообразие ГгапсЫчйа 1и1агеп.и^ из природных очагов России

03.02.03 - микробиология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

13 МАЯ 2015

0боленск-2015

005568603

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государстветшй научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Научный руководитель:

Мокриевич Александр Николаевич, кандидат медицинских наук.

Научный консультант:

Павлов Виталий Михайлович, доктор биологических наук.

Официальные оппоненты:

Мещерякова Ирина Сергеевна, доктор биологических наук, Федеральное государственной бюджетное учреждение «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н. Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующая лабораторией туляремии отдела природно-очаговых инфекций.

Афанасьев Сташслав Степанович, заслуженный деятель науки, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное бюджетное учреждение науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им Г. Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, заместитель директора по биотехнологии.

Ведущая организация: Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Защита состоится « (9 » 2015 г. в И часов на заседании

диссертационного совета Д 350.002.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации по адресу: 142279, Московская обл., Серпуховский р-н, п. Оболенск.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии».

Автореферат разослан « ~Ь-Ч » 2015 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук

Фурсова Надежда Константиновна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Туляремия - зоонозная природно-очаговая особо опасная инфекция, возбудитель которой - Francisella tularensis - инфицирует более 250 видов животных и передается человеку множеством способов - прямым контактом с зараженным животным, приёмом внутрь контаминированной воды и пищи, аэрогенным путем, а также через укусы клещей, мух и комаров. Возбудитель туляремии принадлежит семейству Francisellaceae, роду Francisella [Bergey, 2005]. Согласно принятой в настоящее время международной классификации, в пределах вида F. tularensis выделяют четыре подвида туляремийного микроба: tularensis (то же, что и nearctica) - тип A, holarctica (то же, что и palaearctica) — тип В, mediasiatica и novicida. Подвид holarctica включает в себя три биологических варианта: japónica - японский биовар, биовар I Ery(S) (эритромицинчувствительный) и биовар II Ery(R) (эритроми-цинрезистентный).

Степень патогенности туляремийного микроба различна у разных подвидов F. tularensis [Champion, 2009]. Наибольшей вирулентностью для человека обладает F. tularensis подвид tularensis (nearctica) - уровень смертности зараженных этим штаммом людей без лечения достигает 60 % [Dienst, 1963]. Генетические основы для высокой степени вирулентности этого подвида до сих пор неизвестны. Этот подвид распространен в Северной Америке, однако есть данные о выделении штаммов этого подвида на территории Европы [Gurycova, 1998, Johansson, 2000]. Европейские изоляты F. tularensis в основном относятся к подвиду holarctica, и, хотя инфекция, вызванная штаммами F. tularensis этого подвида, очень контагиозна и вызывает тяжелую патологию, болезнь редко заканчивается смертельным для человека исходом [Champion, 2009]. На территории России встречается F. tularensis подвида holarctica представленный двумя биоварами - I Ery(S) и II Ery(R), который циркулирует главным образом среди грызунов и зайцеобразных. По поводу вирулентности среднеазиатского подвида F. tularensis - subsp. mediasiatica -опубликованы немногочисленные данные, свидетельствующие о способности этих бактерий вызывать инфекцию у человека и кроликов [Olsufjev and Meshcheryakova, 1983]. Возбудитель F. tularensis подвида novicida считается невирулентным для человека, единичные случаи выделения туляремийного микроба этого подвида от людей описаны только у лиц со сниженным иммунным статусом [Leelaporn, 2008].

С учетом вышеизложенного, подвидовая идентификация культур F. tularensis, выделенных из клинических изолятов или объектов среды, является важнейшим этапом диагностики, так как обеспечивает предварительную оценку степени вирулентности и эпидемиологической опасности выделенной культуры.

Степень разработанности темы исследования

До настоящего времени внутривидовая дифференциация возбудителя туляремии традиционно основывается на различиях подвидов по ряду фенотипических признаков: -способности к сбраживанию сахарозы, активности цитруллинуреидазы, ß-лактамазной активности, чувствительности к эритромицину.

Подвидовые особенности метаболизма F. tularensis могут быть связаны с множеством

причин - с утратой гена, обуславливающего признак, с его инактивацией, с нарушением его регуляции, однако подобных данных опубликовано очень мало.

В частности, известно, что резистентность бактерий к антибиотикам группы |3-лактамов обеспечивает фермент Р-лактамаза, активность которой (гидролиз лактамного кольца) диагностируют по цветной реакции в присутствии субстрата и хромогена [O'Callaghan, 1972, Montgomery, 1979]. Показано наличие у F. tularensis двух Р-лактамаз, при этом среднеазиатский подвид F. tularensis не имеет лактамазной активности, однако резистентен к р-лактамным антибиотикам [Олсуфьев, 1975, Цимбалистова, 2014]. В научной литературе мы не нашли упоминаний о причинах этого противоречия и молекулярных механизмах редуцированной р-лактамазной активности F. tularensis subsp. mediasiatica.

Точно также в доступной научной литературе отсутствуют данные о генетических механизмах и причинах внутривидовой вариабельности других биохимических свойств F. tularensis, которые используют в качестве признаков, определяющих подвидовую принадлежность F. tularensis — таких как устойчивость к эритромицину, способность к сбраживанию сахарозы и гидролизу цитруллина.

Современный уровень науки обозначает новые требования к диагностике инфекций, которые включают в себя знание молекулярно-генетических детерминант, обуславливающих видовые и внутривидовые различия возбудителей опасных инфекций

В настоящее время для подвидовой дифференциации туляремийного микроба стали широко применять методы молекулярного типирования: определение межгенных повторяющихся (ERIC-PCR) и внегенных палиндромных последовательностей (REP-PCR), применение универсальных (случайных) праймеров в системе RAPD-PCR [Puente-Redondo, 2000], анализ полиморфизма единичных нуклеотидов - SNP-типирование [Pandya, 2009], ML VA- титрование [Johansson, 2004].

Результаты генотипирования являются базой для эпидемиологического расследования эпизоотий и вспышек туляремии среди населения, а также основой для совершенствования эффективных средств инфекционной диагностики и выбора оптимальных молекулярных мишеней для нового поколения диагностических методов. Каждый из методов имеет свои достоинства и недостатки, практическое использование многих ограничено сложностями методики, проблемами с воспроизводимостью и оценкой результатов.

Одним из наиболее успешных методов, применимых для внутривидового типирования микроорганизмов, в т.ч. и F. tularensis, является метод MLVA (Multiple-Locus Variable number tandem repeat Analysis) - определение кратности вариабельных тандемных повторов того или иного локуса, позволяющий не только отнести исследуемый штамм к тому или иному подвиду, но и определить географический регион его происхождения. Так, в 2004 году A. Johansson с соавторами предложил схему MLVA-типирования штаммов туляремийного микроба на основе анализа 25 локусов, содержащих тандемные повторы, по которой им были оттипированы 192 изолята преимущественно Североамериканского и Северо-Европейского происхождения. В Российской Федерации А.С. Водопьянов [2009] применил ML VA — типирование по четырем локусам для коллекции из 352 штаммов туляремийного микроба. Следует отметить, что качество подвидовой и штаммовой

идентификации F. tularensis напрямую зависит от количества использованных для типирования локусов. Так, при MLVA25- типировании [Johansson, 2004] 192 изолятов F. tularensis было выделено 120 индивидуальных генотипов, а МЬУА4-анализ 352 штаммов позволил выделить всего 61 индивидуальный генотип.

Учитывая все вышесказанное, на настоящий момент изучение генетического разнообразия штаммов F. tularensis, встречающихся на территории России, по методике, предложенной А. Johansson, а также изучение генетических детерминант, определяющих подвидовую дифференциацию F. tularensis является актуальной задачей совершенствования диагностики туляремии.

Цели и задачи исследования

Цель исследования - изучение генетического разнообразия туляремийного микроба методом MLVA-типирования и генетический анализ биохимических особенностей подвидов F. tularensis.

Задачи исследования:

1. Проведение MLVA-типирования штаммов туляремийного микроба из "ГКПМ-Оболенск"

2. Определение минимального набора локусов, позволяющего с высокой разрешающей способностью проводить MLVA-типирование.

3. Изучение генетических детерминант ß-лактамазной активности F. tularensis, способности к гидролизу цитруллина и сахарозы и устойчивости к эритромицину.

4. Конструирование и апробация праймеров и зондов для определения подвидовой принадлежности штаммов F. tularensis на основе выявленных генетических особенностей.

Научная новизна исследования

По результатам MLVA-типирования по 25 локусам установлены филогенетические связи 159 штаммов F. tularensis из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур "ГКПМ-Оболенск", среди которых выявлено 127 индивидуальных МЦУА25-генотипов. Определен минимальный набор из 17 VNTR-локусов, позволяющий в полном объеме сохранить достоверность получаемых данных о внутривидовой кластеризации штаммов F. tularensis. Выявлен кластер штаммов, объединяющих в своих MLVA-профилях признаки, присущие как подвиду tularensis, так и подвиду holarctica.

Впервые показано, что на территории Российской Федерации циркулирует F. tularensis subsp. mediasiatica. Предложена эволюционная модель возникновения и распространения подвида F. tularensis subsp. mediasiatica.

Показано, что F. tularensis subsp. mediasiatica обладает ß-лактамазной активностью.

Определены генетические детерминанты устойчивости к эритромицину у штаммов туляремийного микроба, относящихся к II типу голарктического подвида.

Выявлены генетические основы таких биохимических особенностей подвидов F. tularensis, как способность к гидролизу цитруллина и сбраживанию сахарозы.

Теоретическая и практическая значимость исследования

Установлена распространенность F. tularensis subsp. mediasiatica на территории Южной Сибири и на основании анализа данных о географическом распространении штаммови их генетических особенностей предложена эволюционная модель возникновения и распространения среднеазиатского подвида F. tularensis.

Сконструирована плазмида pGM6 для целевой инактивации генов F. tularensis методом гомологичной рекомбинации с повышенной эффективностью.

В Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур ФБУН ГНЦ ПМБ («ГКПМ-Оболенск») депонированы авторские штаммы - F. tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ АЫа2 с делетированным геном Ыа2, кодирующим функционально активную ß-лактамазу, и F. tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ АЫа123 с делетированными генами blal, Ыа2 и ЫаЗ. Штаммы необходимы для изучения роли ß-лактамаз в устойчивости возбудителя туляремии к ß-лактамным антибиотикам, а также как модельные штаммы для генно-инженерных экспериментов с использованием плазмид, несущих в качестве маркера детерминанты устойчивости к ß-лактамным антибиотикам.

Создана система праймеров и зондов для дифференциации F. tularensis от других франциссел и определения подвидовой принадлежности (за исключением подвида mediasiatica) штаммов F. tularensis методом ПЦР-РВ.

Результаты исследований использованы для получения патента на изобретение: «Способ дифференцирования подвидов туляремийного микроба» № 2478717 от 23.09.2011 (Оболенск, 2011), а также для составления методических рекомендаций «Проведение работ по характеризации изолятов Francisella tularensis» (Оболенск, 2013) и «Определение минимальной бактерицидной концентрации (МБК) антибиотиков для F. tularensis колориметрическим методом» (Оболенск, 2015) учрежденческого уровня внедрения.

Методология и методы исследования

Методология исследований соответствовала поставленным задачам. Предметом исследования явилось изучение генетического разнообразия штаммов F. tularensis из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур ФБУН ГНЦ ПМБ («ГКПМ-Оболенск»), а также молекулярно-генетическая характеристика подвидовых особенностей F. tularensis. Анализ научных источников по упомянутым проблемам проводился на основе формально-логических методов исследования. Планирование и проведение экспериментов проводилось на основе общенаучных и специфических методов.

В работе использовали 165 штаммов F. tularensis, которые выращивали при температуре 37 "С на плотной питательной среде FT-arap (ФБУН ГНЦ ПМБ) и на жидкой питательной среде [Лапин А.А, 2009] с добавлением полимиксина В до концентрации 100 мг/л.

Выделение и очистку ДНК, а также выделение РНК и обратную транскрипцию проводили с помощью наборов реагентов производства "Sigma-AIdrich" и "Bio-Rad", США, "Fermentas", Литва, "ИнтерЛабСервис" и "Синтол", Россия, согласно инструкциям

производителей. Очистку ПЦР-продуктов и их секвенирование проводили в компании «Синтол» (г. Москва, Россия).

Трансформацию клеток Е. coli осуществляли "кальциевым" методом [Маниатис Т., 1984]., F. tularensis - методом электропорации.

Для дифференциации подвидов туляремийного микроба и анализа транскрипционной активности генов Р-лактамаз применяли метод ПЦР в реальном времени с использованием амплификатора с оптическим ПЦР-модулем CFX96 (Bio-Rad Laboratories, Inc, USA). Детекцию продуктов амплификации проводили с использованием оптического ПЦР-модуля по каналам FAM/SYBR, HEX, ROX, Су5.

Для инактивации генов р-лактамаз применяли метод гомологичной рекомбинации с использованием плазмиды pGM5 и полученной на ее основе в данной работе плазмиды pGM6. Биоинформационный анализ проводили с использованием базы данных NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). Поиск аналогов целевых генов и белков проводился с помощью алгоритма BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.goY/Blast.cgi и пакета программ Vector NTI 10.0.1. (Invitrogen Corporation). Построение филогенетических деревьев по аминокислотным последовательностям белков проводили с помощью программы MEGA 6.0 (http://www.megasoftware.net). Построение филогенетических деревьев по результатам MLVA-типирования проводили с помощью программы Bionumerics 5.1 (Applied Math NV, Бельгия).

Устойчивость к антибиотикам определяли диско-диффузионным методом, а также методом серийных разведений антибиотика. Цитруллинуреидазную активность F. tularensis определяли в цветной реакции с нингидрином по методу, предложенному Родионовой [Родионова, 1970].

Положения, выносимые на защиту

1. МЬУА25-типиропанис 160 штаммов F. tularensis выявило 127 индивидуальных генотипов. Разрешающая способность данного метода сохраняется при использовании минимального набора из 17 локусов (Ft-M2 - Ft-M8, Ft-M10, Ft-M12, Ft-M13, Ft-M17, Ft-M18, Ft-M20, Ft-M21, Ft-M22, Ft-M24, Ft-M25). Штаммы F. tularensis группы Невада обладают генетическими признаками двух подвидов - tularensis и holarctica.

2. На территории Российской Федерации (Южная Сибирь) впервые обнаружена эндемичная генетически обособленная популяция F. tularensis subsp. mediasiatica

3. Лактамазная активность и резистентность туляремийного микроба к Р-лактамным антибиотикам группы пенициллинов обеспечивается сериновой р-лактамазой В1а2; лактамазы Blal и В1аЗ являются функционально неактивными по отношению ко всем группам Р-лактамов.

4. F. tularensis subsp. mediasiatica обладает р-лактамазной активностью, однако скорость гидролиза антибиотиков у штаммов этого подвида значительно снижена по сравнению со штаммами других подвидов.

5. Отсутствие активности цитруллинуреидазы у штаммов F. tularensis subsp. holarctica I и II биоваров является следствием 6 аминокислотных замен и появления двух

стоп-кодонов в гене ctu. У штаммов F. tularensis subsp. holarctica bv. japónica вероятной причиной утери цитруллинуреидазной активности являются 7 аминокислотных замен.

6. Причиной устойчивости II биовара F. tularensis subsp. holarctica к эритромицину является нуклеотидная замена А —» С в 2052 положении гена 23S-PHK.

7. Причиной отсутствия сахаразной активности у F. tularensis subsps. holarctica, tularensis, и mediasiatica является делеция 5'- области кодирующего данный фермент гена размером 237-292 п.о.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность и обоснованность результатов и выводов подтверждается применением комплекса методов биологических исследований, адекватных целям и задачам исследования, проведением экспериментов на сертифицированном оборудовании, репрезетативностью выборки объектов исследования, использованием статистических методов анализа с помощью сертифицированного программного обеспечения.

Результаты диссертационной работы были представлены, доложены и обсуждены на IV ежегодном всероссийски конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 26-28 марта 2012 г.), международной конференции «Молекулярная эпидемиология актуальных инфекций» (Санкт-Петербург, 5-7 июня 2013) и VI Всероссийской научно-практической конфнренции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора «Актуальные проблемы эпидемиологии и профилактической медицины.» (Ставрополь, 22-24 октября 2014).

Апробация диссертации состоялась на заседании межлабораторного семинара ФБУН ГНЦПМБ 23 декабря 2014 г.

Личный вклад соискателя

Работа выполнена в лаборатории микробиологии туляремии ФБУН ГНЦПМБ в рамках государственных контрактов №№34-Д (2012 г.), №33-Д ( 2013 г.), №16-Д (2014г.), а также в рамках темы НИР 035 (2011, 2012, 2013 гг.). Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены и проанализированы лично автором. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль автора была определяющей. Основное содержание работы отражено в 6 научных публикациях, в том числе в двух статьях журналов из списка изданий, рекомендованного ВАК, а также в одном патенте Российской Федерации.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 174 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 36 работ отечественных и 167 работ зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 29 рисунками и 33 таблицами и включает два приложения.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Результаты исследования Генотипическая гетерогенность и географическое разнообразие штаммов F. tularensis из коллекции ГНЦ ПМБ по данным MLVA—типнрования

В ходе филогенетического анализа по 25 VNTR-локусам выборки из 159 штаммов F. tularensis и одного штамма F. philomiragia из "ГКПМ-Оболенск" нам удалось идентифицировать 127 индивидуальных генотипов. Подвидовые различия MLVA25-профилей F. tularensis соответствовали описанным ранее [Johansson А. 2004], но диапазон значений кратности повторов во многих локусах в нашей работе был несколько шире, в основном благодаря отдельным штаммам с аномальным размером локусов.

На рисунке 1 представлена схема дендрограммы исследуемых штаммов. Внутри дендрограммы все штаммы распределились согласно их подвидовой принадлежности, а внутри подвида holarctica (наиболее многочисленной выборки) - по более мелким кластерам и группам кластеров.

F. tularensis mbsp. ttovicida и noricida-like — Р- Nevada

Южна-Сибирскии кластер

\

Ханты-Мансийский кластер

Ставропольски-Краснодарский кластер

F. tularensis ssp. holarctica

Московский кластер J bw japónica

F. lula ren sis subsp. mediasiatica

F. tularensis subsp. tularensis

Рисунок 1 - Схематическое изображение МЬУА25-дендро граммы исследуемых штаммов

Из 140 штаммов F. tularensis голарктического подвида было выделено 108 индивидуальных генотипов. Внутри данного подвида четко обособлены в отдельный кластер пять штаммов японского биовара, причем два из них обладали идентичным генотипом.

Отдельный кластер (названный Невада) сформировали три штамма - Japonski Downs, 0/284, и Nevada 14, МЬУА25-профили которых имели сходство как со штаммами

голарктического (локусы Ft-M 7, Ft-M 9, Ft-M 13, Ft-M 16, Ft-M 17, Ft-M 18 Ft-M 22), так и неарктического подвидов (локусы Ft-M 2, Ft-M 10 и Ft-M 25).

По филогенетическим связям на дендрограмме этот кластер занял промежуточное положение между японским биоваром и остальными штаммами голарктического подвида. Полученные нами данные согласуются с результатами A.J. Vogler [2009], который также отмечал наличие сходно расположенного кластера штаммов на основании SNP-анализа. Следует отметить, что один из трех штаммов в кластере Невада - F. tularensis Nevada 14 -принадлежит не к подвиду holarctica, а к подвиду tularensis. Если исключить крайне малую вероятность того, что штаммы разных подвидов могли независимо приобрести сходные ML VA-профили, а также учитывать теорию о сравнительно позднем происхождении подвида holarctica от подвида tularensis либо их общего предка [Johansson А. 2004; Vogler A.J. 2009], то можно предположить, что входящие в группу Nevada штаммы действительно филогенетически родственны и представляют собой переходную между этими подвидами группу.

Большинство штаммов с территории Южной Сибири вошли в состав одного кластера - благодаря распространенности у них делеций в локусах Ft-M5 и Ft-M12 и снижению кратности повторов в локусе Ft-M17 до 1. Исключением явились лишь четыре южносибирских штамма, ML VA-профили которых более схожи с усредненным профилем для подвида holarctica. Интересно, что формирующие южно-сибирский кластер и имеющие сходный генотип штаммы географически представлены двумя достаточно далеко друг от друга отстоящими ареалами - Иркутским и Барнаульским. Такое филогенетическое родство географически отдаленных штаммов, на наш взгляд, говорит о "белых пятнах" на огромной территории Южной Сибири вследствие ее незаселенности и, как результат, недостаточной представленности штаммов туляремийного микроба из областей между Иркутским и Барнаульским ареалами. По данным настоящего исследования мы считаем, что есть основания отдельно выделить южно-сибирскую популяцию возбудителя туляремии подвида holarctica.

Основная часть оставшихся штаммов голарктического подвида, была выделена на южных территориях России (Ставропольский, Ростовский и Краснодарский регионы), частично на территориях Казахстана и Украины. Небольшую группу составили штаммы из других регионов, включая Центральный и Северный регионы России и некоторые страны Европы. Большинство этих штаммов в дендрограмме, хоть и разделены на определенные группы, однако проявляют значительно меньшее генетическое разнообразие и по большей части кластеризуются вне зависимости от географии места выделения. Это можно объяснить, во-первых, недостаточным для формирования отдельных кластеров количеством штаммов, выделенных не в южных регионах, и, во-вторых, невысокой степенью вариабельности ML VA-профилей в пределах подвида holarctica. Внутриподвидовые различия обуславливаются, в основном, вариабельностью 9 локусов из 25 (гипервариабельного Ft-МЗ, и локусов Ft-M-6, Ft-M-8, Ft-M-17, Ft-M-19 - Ft-M-24), поэтому случайные мутации могут приводить к тому, что штаммы, эволюционно отстоящие далеко друг от друга, приобретают одинаковое количество повторов в одном из этих локусов и на основании этого кластеризуются в одну группу.

Тем не менее, в соответствие с тезисом о клональной структуре популяции возбудителя туляремии, штаммы из Западной Сибири, выделенные при эпидемиологическом расследовании вспышки туляремии в Ханты-Мансийске в 2013г, сформировали отдельный кластер. В этот кластер вошли изоляты от заболевших людей, от грызунов из предполагаемых очагов заражения и из объектов внешней среды. Ханты-Мансийские штаммы являются генетически идентичными по 24 УШИ локусам, различаясь лишь по гипервариабельному локусу Б^МЗ. Различия в длине этого локуса позволили разделить Ханты-Мансийские штаммы на 4 индивидуальных генотипа, содержащие 9, 10, 15 и 17 повторов. Следует отметить, что все изоляты от больных людей (штаммы Х-4, Х-7, Х-7-2, Х-8К, Х-8М) и один образец от грызуна бурозубки (штамм Х-2/26) обладали идентичными МЬУА25-профилями и содержали 15 повторов в локусе Е1-МЗ, что указывает на общий источник их заражения. Таким образом, данные МЬУА вносят существенный вклад в эпид/расследование, верифицируя выявление источников и путей распространения инфекции.

Обнаружение К Магетк $иЬ$р. те&аыайса на территории Российской Федерации

Среднеазиатский подвид в коллекции представлен 10 штаммами (и 9 индивидуальными генотипами), которые сформировали отдельный кластер. Три из них - А-554, А-678 и А-823 - были выделены на территории Алтайского края России в 2011 году. До сих пор в научной литературе не было данных о распространении этого подвида на территории Российской Федерации, и считали, что он существует только в Средней Азии, что и обусловило подвидовое название. Принадлежность этих трех штаммов к среднеазиатскому подвиду была подтверждена с помощью однопраймерного типирования [Вахрамеева и др., 2011] и отсутствием лактамазной активности в отношении пенициллина и нитроцефина (Рисунок 2). По длине локусов Б^МЗ и РЬМ7 эти штаммы отличаются от остальных штаммов подвида тесИаз1аиса большим количеством повторов - 47 и 63 в локусе К-МЗ и 5 и б в локусе Р1-М7. Различия в длине УМТЛ-локусов между штаммами А-554, А-678 и А-823 в целом меньше, чем с другими представленными в коллекции штаммами Р. ¡иЬгеюгя среднеазиатского подвида, что может говорить о генетической обособленности алтайской популяции К (и/аге/им виЬБр. тесНав 'юИса.

Учитывая, что: генетическое родство между подвидами тесИах'шИса и Ш1агепз1$ значительно выше, чем между остальными подвидами Ы1агет1$\ разделение ¡и1агеп$1$ на подвиды 1и!агеп$1$ и Ио1агсИса произошло на территории Северной Америки; среднеазиатский подвид отсутствует в Америке, а подвид /м/аге/ш'5 в Евразии, можно предположить, что К Ш1агеп$1$ БиЬэр. тесИск'шЧса возник в результате случайного проникновения Р. ийагегкгЕ виЬБр. ¡икггепзи из Америки в Евразию, и затем, мигрируя через Сибирь на юго-запад, приобрел ряд генетических и фенотипических признаков, по которым сейчас его и выделяют в подвид тесИся'шНса.

fvreMC*"

fc { )@L Ьчштт* Российская Федерация

^ ОКймвро«» Л

i ш

У Л > / / "Г 4 Ш

' У -< у " йи<

■ %

С*1

Казахстан

ÖL

Монголия . Китай

Í *УЛ2НБ;ло{> ' .

i ' ' ' \

Китай >

Рисунок 2 - Карта распространения штаммов F. tularensis в Южной Сибири 1-1346,1-347; 2 -1-382; 3 -1-365; 4 -1-329; 5 - 1-349; 6 -1-282,1-305,1-373; 7 - 1-388; 8-1387; 9-А-823; 10-А-678; 11 -А-1045; 12-А-554; 13 -1-367.

С учетом привязанности F. tularensis к водным биотопам, можно предположить, что распространение F. tularensis subsp. mediasiatica происходило вдоль цепи водоемов, в настоящее время представленных цепью крупных озер, тянущихся от Байкала через северную Монголию, КНР и Казахстан. Наиболее вероятно, что проникновение микроорганизмов из Америки в Евразию происходило в связи с миграцией теплокровных животных, и сопровождающих их кровососущих насекомых через Берингов перешеек, исчезнувший 10-11 тысяч лет назад. Именно с этого времени гидрография предполагаемого пути распространения F. tularensis subsp. mediasiatica начинает напоминать современную -озера этого региона формируются в процессе усыхания и дробления на изолированные водоемы более крупных озер. Наблюдаемое в современности разделение водоемов аридными регионами могло изолировать популяции друг от друга, препятствуя свободному обмену штаммами, и некоторые из популяций туляремийного микроба могли погибнуть.

Определение минимального числа VNTR-локусов, позволяющего сохранить разрешающую способность MLVA25

Нами было отмечено, что информативность и значимость использованных для филогенетического анализа локусов не одинакова. Этот факт был отмечен в литературе и ранее, и наводил на мысль о возможности уменьшения количества используемых для анализа VNTR-локусов [Vogler A.J. 2009]. В указанной работе отмечено, что анализ сохраняет достаточную разрешающую силу при использовании лишь 11 VNTR-локусов. Однако применение этого подхода к исследуемой в данной работе выборке штаммов привело к нарушению кластеризации. В ходе собственных исследований нами было

показано, что для сохранения в полном объеме данных о внутривидовой кластеризации нашего набора штаммов F. tularensis необходимо использовать как минимум 17 VNTR-локусов: Ft-M2- Ft-M8, Ft-M10, Ft-M12, Ft-M13, Ft-M17, Ft-M18, Ft-M20, Ft-M21, Ft-M22, Ft-M24, Ft-M25. При этом не меняется число индивидуальных генотипов (G=127) и сохраняется разделение штаммов по основным филогенетическим группам, хоть несколько изменяется состав более мелких групп и их взаимное расположение. Дальнейшее снижение числа локусов приводило к нарушению кластеризации и снижению разрешающей способности метода.

Изучение генетических основ биохимических различий подвидов туляремийного микроба

Следующим этапом нашей работы было изучение генетических основ подвидовых биохимических различий F. tularensis. Нами была поставлена задача проанализировать возможность выявления генетических мишеней для подвидовой дифференциации среди генов, потенциально кодирующих ферменты, определяющие биохимические различия подвидов туляремийного микроба (способность к сбраживанию сахарозы, цитруллинуреидазная и ß-лактамазная активность).

Изучение генетических детерминант р-лактамазной активности F. tularensis

Отсутствие р-лактамазной активности является основным признаком для дискриминации F. tularensis subsp mediasiatica. При этом, как отмечают в научной литературе, подвидовые различия по признаку устойчивости к р-лактамным антибиотикам у F. tularensis отсутствуют. Анализ in silico позволил выявить у всех изученных штаммов три гена, кодирующих: металло-Р-лакгамазу Blal, две сериновые р-лактамазы В1а2, и В1аЗ. Лишь у штаммов, относящихся к голарктическому подвиду, ген blal распался на два перекрывающихся гена - собственно blal и ars, кодирующий арилсульфатазу Ars, содержащую домен, характерный для металло-р-лактамаз. За исключением этой особенности, последовательности генов р-лактамаз практически идентичны у всех подвидов F. tularensis. Так, при трансляции их in silico, подвидо-специфические отличия subsp. mediasiatica составляют от одной (для В1а2) до трех (для Blal) аминокислот. Для лактамазы В1а2 - фермента с доказанной ß-лактамазной активностью у штаммов других подвидов [Bina X. R., 2006; LoVullo Е. D., 2006] это отличие состоит в замене в 97 положении глицина на аргинин. Учитывая отсутствие лактамазной активности у штаммов среднеазиатского подвида, следует отметить, что именно эта замена может быть ответственной за данный фенотипический признак. В целом, выявленные различия были слишком незначительными для проведения подвидовой дифференциации молекулярно-генетическими методами.

Филогенетический анализ р-лактамаз F. tularensis и гетерологичных микроорганизмов показал, что Р-лактамазы возбудителя туляремии формируют обособленный кластер и являются уникальными белками, сходство которых с аналогичными ферментами других микроорганизмов не превышает 55% для металло-р-лактамаз, и 38% для сериновых р-лактамаз.

Получение вариантов штамма 15 НИИЭГ с инактивированными генами 0-лактамаз и оценка их чувствительности к р-лактамам

Для определения роли отдельных р-лактамаз в лактамазной активности туляремийного микроба и его устойчивости к р-лактамным антибиотикам была проведена работа по инактивации генов р-лактамаз К ¿и/агеи.5« методом гомологичной рекомбинации. Первоначально для этого была использована плазмида рОМ5, однако в связи с низкой эффективностью целевой рекомбинации, мы провели работу по ее модификации, и получили плазмиду рвМб, с использованием которой были получены ЫаГ, Ыа2~ и ЫаЗ' мутанты на основе вакцинного штамма Р. Ш1агепз1з 15 НИИЭГ - как по отдельным генам, так и полностью безлактамазный вариант.

Анализ экспрессии генов р-лактамаз у вариантов штамма 15 НИИЭГ с инактивированными генами р-лактамаз показал, что инактивация одного или нескольких из этих генов не приводила к изменению уровней экспрессии остальных генов, кодирующих Р-лактамазы. У клонов с делетированным геном Ыа1 продолжала экспрессироваться арилсульфатаза.

Последующее изучение устойчивости мутантных штаммов к антибиотикам группы Р-лактамов показало, что чувствительность к р-лактамам различных групп появлялась только у штаммов Р. 1и!агет15 с инактивированной лактамазой В1а2 - Р. 1и1агеп$1$ 15ДЫа2 и 15ДЫа123. Инактивация гена Ыа2 приводила к появлению чувствительности к антибиотикам группы пенициллинов, но не цефалоспоринов и карбапенемов (таблица 1, рисунок 3,). Одновременно лишь штаммы с инактивированным геном Ыа2 теряли Р-лактамазную активность, определяемую в нитроцефиновом тесте.

Таблица 1 - Чувствительность штамма Р. Ыагегягь 15 НИИЭГ и его вариантов с инактивированными генами р -лактамаз к антибиотикам группы р-лактамов

антибиотик 15 НИИЭГ 15Д Ыа[ 15Д Ыа2 15Д ЫаЗ 15Д Ыа123

МИК МБК МИК МБК МИК МБК МИК МБК МИК МБК

ампициллин 128-256 2561024 128256 256512 8 16 64-256 256512 2 8

амоксициллин 128-256 512 128 512 8 8 128 256 4-8 4-8

пенициллин 16-32 32-64 16 32-64 2 4 16-32 64 2 4

карбоксициллин 32-64 64-128 32 64 4 8 16 64 4 4

имипенем 4-8 32 8 16-32 8-16 16 4-8 8 4-8 16

меропенем 4 4 8-32 2-4 32 4-16 4-16 2-16 2 2

цетриаксон 2 4 2-32 4-64 2 2-4 4-8 2 4

цефазолин 64-128 512 16-32 128 32-64 128 32-64 256 32 32-64

цефтазидин 4-16 16-32 8 32 4-8 8-32 4-16 32 8 32

цефалотин 8 16-32 8 16-32 4 16 8 16 4-8 8-16

А - Р. Шки-ел^ 15 НИИЭГ; В - Р. Ш1агепз!з15ДЫа2; 1- меропенем, 2- ампициллин, 3 — амоксицштлин/клавуланат Рисунок 3 - Появление чувствительности Р. Щ1агеп5{5 к р-лактамам после инактивации

гена Ыа2.

Инактивация двух других р-лактамаз - Ыа1 и ЫаЗ - не приводила к изменению чувствительности клеток К Ш1агепз1з ко всем использованным в опыте антибиотикам лактамного ряда (таблица 2).

Таблица 2 - Рост штамма Р. иЛагепйХй 15 НИИЭГ, его В1а2 - вариантов и их же, трансформированных плазмидой рйтб, на среде с ампициллином

Штамм Lg КОЕ/чашку.

среда без антибиотика среда с ампициллином (1000 мг/л)

15 НИИЭГ 3,1±0,6 3,0±0,09

15Д Ыа2 3,0±0,3 1,3±0,09

15 ШаПЗ 3,1*0,3 1,5±0,2

15ДЫо2-рОМ6 3,1±0,4 3,1±0,3

15AWa/23-pGM6 3,0±0,1 3,1±0,4

Таким образом, наши результаты согласуются с результатами X. R. Bina [2006] об отсутствии роли белка В1аЗ в обеспечении устойчивости к лактамам, а также получены аналогичные результаты для метало-р-лактамазы Blal.

Приобретение чувствительности к пенициллинам у штаммов К иАагет'к 15Дй/а2 и 15Д6/а123 позволяет использовать их в генетических манипуляциях с плазмидами, несущими маркер ампициллинустойчивости, что может значительно расширить доступный арсенал генно-инженерных инструментов, пригодных для изучения туляремийного микроба. Для проверки этой возможности мы трансформировали штаммы 15ДЫа2 и 15ДЫа123 плазмидой рОМб, которая содержит маркер ампициллинустойчивости, и показали, что введение данной плазмиды восстанавливает устойчивость к ампициллину мутантных штаммов до уровня родительского (таблица 2). Штаммы Г. Шагепям 15ДЫа2 и \5АЫа123 депонированы в ГКПМ «Оболенск» как перспективные модели для генно-инженерных экспериментов.

Сравнение чувствительности к р-лактамам штаммов F. tularensis subsps. holarctica и mediasiaíica Для сравнения использовали штаммы F. tularensis 15 НИИЭГ subsp. holarctica и 120Дшг subsp. mediasiatica. Секвенирование генов Р-лактамаз обоих штаммов подтвердило, что последовательности этих генов у штамма 15 НИИЭГ не отличаются от штамма LVS (subsp. holarctica), а у штамма ПОДриг - от штамма FSC 147 (subsp. mediasiatica). Изучение транскрипционной активности генов р-лактамаз на уровне мРНК показало, что уровень экспрессии у обоих штаммов генов А/а/, Ыа2, ЫаЗ и ars одинаков у обоих штаммов. Индукция ампициллином приводила к значительному увеличению синтеза мРНК гена Ыа2 как в клетках F. tularensis 15 НИИЭГ, так и в клетках штамма 120Дриг. Гены ars, blal и ЫаЗ реагировали на индукцию ампициллином незначительно.

Определение устойчивости штаммов 15 НИИЭГ и ПОДриг к антибиотикам диско-диффузионным методом, а также методом серийных разведений при плотности бактериальной суспензии 108 КОЕ/мл, показало одинаковую резистентность этих штаммов к препаратам группы группы Р-лактамов.

Однако мы обнаружили, что снижение концентрации туляремийного микроба до 106105 КОЕ/мл приводило к проявлению чувствительности штамма F. tularensis ПОДриг к ампициллину (таблица 3).

Таблица 3 - Минимальные бактерицидные концентрации ампициллина для штаммов F. tularensis subsp. holarctica{\S НИИЭГ) и mediasiatica (ПОДриг) при различных концентрациях микробной взвеси

Штамм F. tularensis Концентрация микробной взвеси, м.к./мл

Чо» ЙГ Í0i 10®

15 НИИЭГ ssp. holarctica 4096 4096 4096 1024

ПОДриг ssp. mediasiatica 4096 4096 8 2

Дальнейшие исследования показали, что чувствительность штамма F. tularensis ПОДриг проявляется к препаратам пенициллинового ряда, но не цефалоспоринам и карбапенемам. (таблица 4).

Таблица 4 - Чувствительность штаммов F. tularensis 15 НИИЭГ и 120Ариг к антибиотикам группы р-лактамов*

антибиотик 15 НИИЭГ subsp. holarctica 120Дриг subsp. mediasiatica

МИК МБК МИК МБК

ампициллин 128-256 256-1024 2 2

амоксициллин 128-256 512 4 4-8

пенициллин 16-32 32-64 4 4

имипенем 4-8 32 4-8 16

меропенем 4 4 8-16 8-64

цетриаксон 2 4 2 2

цефазолин 64-128 512 256 256

* - Представлены пограничные данные полученного диапазона значений МИК и МБК в трех независимых экспериментах. Концентрация микроорганизмов составляла 105 КОЕ/мл.

Изучение ß-лактамазной активности F. tularensis subsp mediasiatica и hotarctica

В предыдущих разделах было показано, что спектр генов ß-лактамаз у штаммов подвидов mediasiatica и holarctica идентичен и эти гены активно экспрессируются, в том числе ген Ыа2, кодирующий единственный белок с выявленной функциональной активностью. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей белка В1а2 выявило единственную аминокислотную замену специфичную для подвида mediasiatica: 97Gly-»Arg. При этом у штамма ПОДриг чувствительность к пенициллинам появлялась лишь при снижении концентрации микробных клеток в среде с антибиотиком (то есть при увеличении количества молекул антибиотика, приходящихся на одну микробную клетку). Это позволило нам предположить, что наблюдаемое у штаммов среднеазиатского подвида отличие последовательности белка В1а2 на одну аминокислоту приводит к снижению эффективности реакции расщепления лактамного кольца.

Поэтому следующим этапом исследований было изучение динамики расщепления ß-лактамов на примере нитроцефина штаммами F. tularensis 15 НИИЭГ и 120Дриг.

Было установлено, что, вопреки распространенному мнению, штамм F. tularensis 120Д pur среднеазиатского подвида обладает лактамазной активностью, однако скорость расщепления нитроцефина у него значительно снижена (рисунок 4).

Если в культуре F. tularensis 15 НИИЭГ максимальную скорость расщепления субстрата регистрировали в течении первого часа, а полное расщепление проходило в течение 2-4 часов, то пик скорости гидролиза у клеток F. tularensis 120Д pur приходился на 4 часа, а полное расщепление нитроцефина занимало около 20-24 часов (рисунок 4). Кроме этого, было установлено, что ß-лактамазная активность была значительно выше в осветленных ультразвуковых лизатах клеток по сравнению с суспензией живых клеток F. tularensis, что говорит о внутриклеточной, скорее всего периплазматической локализации ß-лактамаз F. tularensis.

Последним этапом исследований было проведение экспериментов по истощению пула бензилпенициллина в ростовой среде (200 мг/л), в результате которых было установлено, что время полного расщепления антибиотика клетками F. tularensis 15 НИИЭГ и 120Д риг составляет 4 и 24 часа, соответственно.

Таким образом, было установлено, что штаммы туляремийного микроба среднеазиатского подвида обладают ß-лактамазной активностью, хотя скорость гидролиза антибиотиков при этом снижена. Причиной снижения эффективности гидролиза ß-лактамов является, видимо, замена Gly->Arg.B 97 положении белка В1а2.

OS

7Г

0 <t>

1

Я

г>

1.1 I

0.9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0.1 0

■15Н1ШЭГ..

=П2оариг

•контр оль среды

16 20

Время, ч

Рисунок 4 - Динамика расщепления нитроцефина штаммами 15 НИИЭГ subsp. holarctica и 120Дpur subsp. mediasiatica

Изучение генетических основ цитруллинуреидазной активности F. tularensis

Активность фермента цитруллинуреидазы присуща представителям неарктической и среднеазиатской расы F. tularensis и отсутствует у штаммов голарктического подвида [Marchette N.J., 1961, Родионова И.В., 1968, 1970]. Цитруллинуреидаза (СТО), кодируемая у штамма F. tularensis subsp. tularensis Schu S4 геном размером 861 n.o. (FTT0435) принадлежит к семейству C-N гидролаз и разлагает цитруллин на орнитин, двуокись углерода и аммиак [Fleming D.E., 1955].

Мы показали, что цитруллинуреидазы F. tularensis относятся к отдельной группе CN-гидролаз, и выявили ряд подвидоспецифических нуклеотидных замен в гене ctu по сравнению с F. tularensis subsp tularensis - 9 замен у штаммов голарктического подвида, 3 замены у штамма F. tularensis subsp. mediasiatica FSC147 и 48 замен у штамма F. tularensis subsp. novicida 3523. У всех представителей F. tularensis голарктического подвида, кроме штаммов японского биовара, две нуклеотидных замены в гене цитруллинуреидазы привели к возникновению стоп-кодонов (рисунок 5). Однако не обладающие стоп-кодонами в гене ctu штаммы F. tularensis японского биовара, тем не менее, не обладали цитруллинуреидазной активностью. В цитруллинуреидазе штамма F. tularensis Miura японского биовара было выявлено семь аминокислотных замен, три из которых могут влиять на заряд и конформацию белка (151Gly—>Asp, 183Pro—> Leu, 222Asp—* Asn,) и, таким образом, могут нести отвественность за редукцию цитруллинуреидазной активности F. tularensis голарктического подвида.

Ьо1аго£е» ГШ5СС2-00 (1511

Ьо1агсг1са ОБУ 16 (151)

halarcti.ee 1,У5 (151)

Ме<Иаз1аПса Г5С147 (151)

Ги1агепз1з гсЬи 34 (151)

ги1агепз±з Е£С 198 (151)

г и! агег.зх 3 «¥9б-341в (151;

ТССАААЫЦСА Т13САААШСА ТССААА*ААГА ТСОЛ* ЬАА^А

ТССЙАА!ААрА

(ААТТС1АААТАТТ ЛАТТС£АААТАТТ 1ДАТ1 1Л1АААЗАТГ ЬААТХ{ЛААА1АТГ кААТТСТАААТАТГ ЬААТГСЗАААТАТТ ЬААТХСТАААТАТТ

Ьэ1агсс1са БТНЗГйС2-00 Ьо1вгсг±са СЕН 18 1ю1агсь1са 1Л*3 Мэс1±аз1аъ1са 55С147 Еи1аЕепз±з БсНи 24 Си1агепз1з Ё5С 195

(401) ашстаттостттгА (401) ЗЯЕЛЫТОСГПТП&С (401) ОШЗТСТТОСТТТГААС (401) СЙАСТССГСЕТГТТААС (401) еААСТС^ТОСЛТТТА (401) ОШПСЙТСС-ГТТГААО

Еи1агепз1з Н?9о-3418 (401) еАДепфГоепТГААОе ГГТ^ Д

ТлС а

тай а

ГААСС птЬ а

В рамках отмечены стоп-кодоны, появившиеся вследствие замены 160-го нуклеотида с

С на Т, и 422-го нуклеотида с в на А Рисунок 5 - Нуклеотидные замены, приведшие к инактивации гена цитруллинуреидазы у К гм/агегш',! зиЬзр. Ио1агсИса В аннотированных геномах штаммов К подвида поУ1с!с/а, обладающих, по

литературным данным, цитруллинуреидазной активностью, мы не выявили гена сш (за исключением штамма 3523), однако выявили ген, кодирующий белок УР_898469Л., принадлежащий к группе С-Ы гидролаз и присутствующий у представителей всех подвидов Р. /и/алешта, кроме подвида Ио1агсИса и, возможно, обеспечивающий цитруллинуреидазную активность Р. Ш1агеп$\$ эиЬвр. по^ю1йа

Выявление генетических особенностей, потенцнально ответственных за устойчивость К /и/агам« яиЬяр. ко1агсйса Ьу. И к эритромицину

В пределах Р. (и/а/'е/юм ¡иЬьр. 1ю1агсИса, кроме японского биовара, выделяют еще два, различающихся по устойчивости к эритромицину - I - чувствительный к макролидам, и, в том числе к эритромицину и II (нечувствительный). Проведенное нами исследование показало, что у всех исследованных штаммов с природной устойчивостью к эритромицину наблюдается замена 2048саАСАОА2055 на 2048ОаАААОА2055 (рисунок 7).

2029 2078

зсни (2010)

ГСЕ 147 (2010) СЙСГСТАС<Х6<^ТТАСМА£31ЖЮА<ГСШТ0гЛС€ТТГАСХАТАССГ

ии2 (2010) САСТстсшса^тгАеАсвбгфазАсссште&АостггАсхАТАвст

1ЛН5 (2023! САСТеГАС(Х:е<ЖСТТАС^|сАСАеАСССШТС^ССТТГАС1АХАвС1

зея (2029) САСТвтСССааЗСТТАШс|<асЖАССССШ'<Ш^ССГТГАСТАТАвСГ зед 2 (2029) САетСТАСаГ<КХЮТТАвАС§(а§АСАШССЕТ{Ш1аГГТТАСГАТАест

Штаммы Р. (и/агегсш эиЬзр. ш1агепз1з (БЬси 84), зиЬэр. те£Йа?/а//са(Р8С147), эиЬзр. по\>ю1с1а (1Л12), Р. ы1агет\з зиЬэр. Ио1агсНса (ЬУ8), а также резистентные (эец) и чувствительные (вец 2) к эритромицину штаммов Р. Ш1агепз15 из коллекции «ГКПМ-Оболенск»

Рисунок 7 - Нуклеотидные замены в генах 23-8 РНК, выявленные при множественном выравнивании нуклеотидных последовательностей

Таким образом, нами подтверждено предположение о замене А на С в положении, соответствующему 2052 нуклеотиду штамма F. tularensis subsp. holarctica LVS, как причины устойчивости II биовара голарктического подвида туляремийного микроба к действию эритромицина.

Выявление генетических основ различной способности подвидов F. tularensis к сбраживанию сахарозы

Как было сказано выше, способность к сбраживанию сахарозы является одним из признаков, используемым для внутривидовой дифференциации у F. tularensis. Способность к сбраживанию сахарозы с образованием кислоты была описана только у F. tularensis subsp. novicida, и не выявлена у остальных подвидов возбудителя туляремии [Eigelsbach, Н. Т., and V. G. McGann. 1984]. Также было обнаружено, что сахарозу способны сбраживать представители вида Francisella philomiragia и некоторые штаммы, относящиеся к роду Francisella, систематическое положение которых не уточнено.

Нами показано, что не инактивированные гены катаболизма сахарозы присутствуют в геноме лишь у F. tularensis subsp. novicida и F. philomiragia. У всех других исследованных нами представителей видов F. tularensis и F. noatenuensis ген ключевого фермента сахарозного обмена - p-фруктофуранозидгидролазы инактивирован вследствие транспозиционного переноса его 5'-области, результатом чего оказалось нарушение его транскрипции. Гены, кодирующие белки, предположительно участвующие в транспорте сахарозы также отсустсвуют у F. tularensis subsp. mediasiatica, subsp. tularensis, subsp. holarctica. Выявленные подвидовые различия позволили сконструировать праймеры для идентификации в анализируемом образце ДНК F. tularensis subsp. novicida и F. tularensis subsp. holarctica.

В процессе изучения расположения на хромосоме гена сахаразы у штаммов F. tularensis разных подвидов нами был обнаружен ген i/vD, предположительно кодирующий дегидратазу дикарбоксикислот. Аналоги данного гена выявлены у штаммов всех подвидов F. tularensis, но у subsp. holarctica в данном гене выявлена делеция размером 344 п. о., позволяющая использовать этот ген как генетическую мишень для дифференциации подвида holarctica (рисунок 8).

2EQ 299 JSOQ «49

sore sí (2S9) rciAxt5GCTidSG»<»ATast«Tícr<3>xibc»Tq ib:kiu-.ví!»i •**ге»еегки<аао(Щй>бф10В1

FSC147 (259] rcXAlK3GI3-A«GaitóAIGiS:Tj®tí^lS^IÍ-l\ RSIRTJCISaMTKXATO^IGTGCIAlASiAGCtSrAGGfATGAGI

0112 (259) rCIAIGGGrACStarGStAIGAGCTiCICSgriJlCaiilCr,'

osms (250) rcTATGGGTñTftGñXGÍj!fAXGAS¿TA------------f /------------AIGGIATCTK3ATAGAAGC»AGS»TGAST

LVS (250) rdATGGGIATfGAIGÍgATGAGlra---------- '--------------ArGGTATGAGCT»AS»AGCÍ¡ÍriGGÍíJ'GASI

Штаммы F. tularensis subsp. novicida (U112), subsp. mediasiatica{FSC147) subsp. tularensis (Shcu S4) F. tularensis subsp. holarctica (LVS, OSU18)

Рисунок 8 - Делеция в гене j/vD, выявленная при множественном выравнивании нуклеотидных последовательностей гена ilvD F. tularensis

Применение ПЦР для идентификации F. tularensis и ее подвидовон дифференциации в смеси культур и клиническом материале

Основываясь на выявленных нами генетических особенностях, обуславливающих биохимические различия подвидов туляремийного микроба, мы сконструировали несколько пар праймеров для проведения подвидовой дифференциации F. tularensis, используя в качестве генов-мишеней гена цигруллинуреидазы ctu, ген сахаразы sac и ген дегидратазы дикарбоксикислот ilvD.

Принимая во внимание, что первым этапом диагностики является идентификация возбудителя на видовом уровне, мы сконструировали праймеры для обнаружения ДНК F. tularensis в исследуемом образце, используя в качестве генетической мишени уникальный для рода Francisella и отсутствующий у гетерологичных микроорганизмов ген z'g/C. Учитывая распространенность в природе непатогенных и условно-патогенных франциселл, при конструировании праймеров необходимо было свести к минимуму возможную гомологию последовательности оперона iglABCD у F. tularensis и родственных микроорганизмов. Мы провели BLAST-анализ гена iglC и множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей данного гена у различных представителей рода Francisella. Основываясь на результатах, были сконструированы праймеры для дифференциации вида F. tularensis как от гетерологичных микроорганизмов, так и от других (непатогенных) представителей рода Francisella.

Таким образом, были разработаны следующие пары праймеров и Taq-man зонды к ним (последовательности приведены в направлении 5'—>3'):

1) Для идентификации вида F. tularensis (включая дифференциацию от родственных микроорганизмов F. phylomiragia, F. noatunensis на основе различий в последовательности гена iglC):

iglCF - ctgtgctagctgcgcaacatac; iglCR - ctacagctgctgctagtgtaatacg; iglC-RT -(Cy5)cttattgttggatttatagagcctggcgt (BHQ1).

2) Для дифференциации F. tularensis subsp. holarctica (сигнал отсутствует благодаря делеции в гене-мишени ilvD):

ilvDF - ctatagcacatgccatagtatttgca; ilvDR -aatgtctgcacactggtatgatgg; ilv-RT (FAM) tcatacatcctggcatattcttatcacaac (BHQ1).

3) Для дифференциации F. tularensis subsp. novicida по признаку наличия в геноме 5'-области гена сахаразы sac:

SacPF - attttagatttgtcggtattatcgcgac; SacPR - atgctttcttattcatttggcttagtaac, sacP-RT - (HEX) tgatagcacttgcaatggcttctg-(BHQ 1)

4) Для дифференциации F. tularensis подвидов holarctica, tularensis, и mediasiatica no наличию гена цитруллинуреидазы ctu: CtuF - gctaaaaccattgatgaatcaccaat; CtuR -gccattactctagcagcttctgg, Ctu-RT - (ROX) ccatattccagacggtattggttaccaag (BHQ1)

Данная тест система позволяет идентифицировать F. tularensis и отнести исследуемый штамм к подвидам holarctica, и novicida

Для испытания предлагаемых нами праймеров и зондов мы проанализировали с их помощью очищенные препараты ДНК всех штаммов из нашей коллекции. Праймеры

испытывались в мультиплексной ПЦР-РВ - то есть в реакционной смеси присутствовали все предложенные праймеры и зонды, и детекция амплификации велась по четырем каналам одновременно. При этом было показано, что практически во всех случаях определяемая нами подвидовая принадлежность совпадала с указанной в паспорте штамма. Исключениями являлись лишь штаммы среднеазиатского подвида, которые не дифференцировались от F. tularensis subsp. tularensis, и 2 штамма из филогенетической группы Nevada - Nevada 14 и 0/284. Первый из них по паспорту относится к подвиду tularensis, а второй - к подвиду holarctica. Однако праймеры ilvDF/ilvDR не отжигаются на ДНК штамма Nevada 14, что характерно для подвида holarctica, и отжигаются на ДНК штамма 0/248, что для штамма голарктического подвида нетипично. Данный факт является дополнительным аргументом в пользу предположения о промежуточном положении этой филогенетической группы между подвидами holarctica и tularensis, выдвинутого по результатам MLVA-типирования.

Указанные праймеры были успешно испытаны для идентификации F. tularensis в смеси с культурами гетерологичных микроорганизмов - Bacillus anthracis СТИ-1, Yersinia pestis subsp. pestis bv. orientalis EV, Yersinia pseudotuberculosis серотип 0:3 83, Escherichia coli JM83, а также из секционного материала от разлагающихся трупов мышей, погибших от экспериментальной туляремии, то есть содержащего постороннюю кишечную микрофлору. При этом, несмотря на то, что выделить F. tularensis из образца в виде чистой культуры было крайне затруднительно, или же вовсе невозможно в связи со значительной обсемененностью посторонней микрофлорой, наличие в образце туляремийного микроба стабильно детектировали и определяли его подвидовую принадлежность, за исключением невозможности дифференцирования штаммов неарктического и среднеазиатского подвидов. Высокая степень генетического родства подвидов tularensis и mediasiatica [Broekhuysen М. 2003] была причиной высокого процента ложноположительных и ложноотрицательных сигналов при испытаниях разработанных праймеров.

Также нами были сконструирована и испытана пара праймеров iglC340F (cctaacttaattttcatatctgtagcacctgc) и iglC340R (aacaggtaacaagtggcgagacc) для использования их совместно с праймером chij1 в разработанной ранее в нашей лаборатории [Вахрамеева Г.М. 2011] системе однопраймерного типирования, позволяющей определить подвидовую принадлежность исследуемого штамма F. tularensis по распределению на электрофореграмме полученных ПЦР-ампликонов. Праймеры iglC340F/iglC340R позволяют наработать ампликон размером 340 п.о, который, отличается по размеру от ампликонов, полученных при ПЦР с использованием праймера chifl, и, не перекрываясь с ними на электрофореграмме, сигнализирует о наличие в образце ДНК F. tularensis.

При использовании вместе с chifl праймеров iglC340F/iglC340R с зондом iglC-RT заключение наличии в анализируемом образце ДНК F. tularensis делают лишь при наличии сигнала в ПЦР-РВ, затем подвидоспецифические ампликоны разделяются электрофоретически в агарозном геле, и после окраски геля детектируются визуально. Такой подход позволяет пренебречь вероятностью ложно-положительного заключения о наличие в образце ДНК F. tularensis, так как даже при неспецифической наработке ампликона размером 340 п.о. вследствие загрязнения образца ДНК гетерологичных

микроорганизмов, не будет фиксироваться превышения уровня светимости образца при детекции по соответствующему каналу прибора.

Выводы

1. Проведение MLVA-типирования с использованием 25 VNTR-локусов 159 штаммов F. tularensis из коллекции ГНЦ ПМБ «ГКПМ-Оболенск» позволило выявить 127 индивидуальных генотипов. Разрешающая способность данного метода практически полностью сохраняется при использовании минимального набора из 17 локусов (Ft-M2 -Ft-M8, Ft-M10, Ft-M12, Ft-M13, Ft-M17, Ft-M18, Ft-M20, Ft-M21, Ft-M22, Ft-M24, Ft-M25). Анализируемые штаммы кластеризуются в соответствии с их подвидовой принадлежностью, а также разделяются на более мелкие группы внутри подвидов.

2. Штаммы, выделенные при эпидемиологическом расследовании вспышки туляремии в Ханты-Мансийске в 2013 году, обладают практически идентичными MLVA-профилями и проявляют ограниченную вариабельность в единственном гипервариабелыюм локусе Ft-МЗ. Различия по данному локусу способствовали установлению источника заражения.

3. В пределах голарктического подвида выявлен обособленный кластер из трех штаммов, обладающих рядом генетических признаков, присущих как подвиду tularensis, так и подвиду holarctica, и представляющих собой, предположительно, промежуточное звено между этими двумя подвидами.

4. На территории РФ циркулирует генетически обособленная популяция F. tularensis subsp. mediasiatica. Анализ полученных данных позволяет выдвинуть гипотезу о возникновении и возможных путях миграции штаммов среднеазиатского подвида.

5. Единственным функционально активным ферментом в отношении Р-лактамаз пенициллинового ряда является сериновая р-лактамаза В1а2. Она активна в том числе и у F. tularensis subsp. mediasiatica, однако скорость гидролиза р-лактамов у штаммов этого подвида значительно снижена. Предположительной причиной сниженной активности фермента является замена G—»R в 97 положении белка В1а2.

6. Разработанная методика целевой инактивации генов у F. tularensis методом гомологичной рекомбинации с помощью плазмиды pGM6 позволяет осуществлять этот процесс с повышенной эффективностью.

7. Отсутствие активности цитруллинуреидазы у штаммов F. tularensis subsp. holarctica I и II биоваров является следствием 6 аминокислотных замен и появления двух стоп-кодонов в гене ctu. У штаммов F. tularensis subsp. holarctica bv. japónica вероятной причиной утери цитруллинуреидазной активности являются 7 аминокислотных замен. У F. philomiragia и F. tularensis subsp. novicida гидролиз цитруллина вероятно осуществляется белком, гетерологичным цитруллинуреидазе остальных подвидов F. tularensis, предположительно аналогом C-N-гидролазы YP_898469.1. F. tularensis subsp. novicida U112.

8. Причиной отсутствия сахаразной активности у F. tularensis subsps. holarctica, tularensis, и mediasiatica является делеция 5'- области кодирующего данный фермент гена.

9. Причиной устойчивости биовара II F. tularensis subsp. holarctica к эритромицину является нуклеотидная замена А —► С в 2052 положении гена 23S-PHK.

10. Созданная на основе выявленных генетических основ биохимических различий подвидов туляремийного микроба система праймеров и зондов позволяет как проводить дифференциацию F. tularensis от других франциссел, в объектах внешней среды, или в клиническом материале методом ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ), так и определять при этом принадлежность штамма F. tularensis к подвидам holarctica и novicida, провести с ее помощью дифференциацию подвидов tularensis и mediasiatica не представляется возможным. Модификация системы однопраймерного типирования добавлением праймеров iglC340F/iglC340R и зонда iglC-RT-(Cy5) позволяет избежать ложных результатов при загрязнении исследуемого образца, и позволяет с высокой надежностью проводить одновременную индикацию F. tularensis и определение подвидовой принадлежности исследуемого штамма.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Публикации в журналах ВАК

1. Тимофеев, B.C. Молекулярное типирование штаммов Francisella tularensis методом мультилокусного анализа вариабельности числа тандемных повторов / B.C. Тимофеев, Т.Ю. Кудрявцева, А.Н. Мокриевич, В.М. Павлов., И.А. Дятлов // Мол. генет., микробиол. и вирусол.. - 2014. - N 1.-С. 8-15

2. Мокриевич, А.Н. Выделение среднеазиатского подвида туляремийного микроба на территории Алтайского края./ А.Н. Мокриевич, B.C. Тимофеев, Т.Ю. Кудрявцева, Г.И. Уланова, С.Б. Карбышева, Р.И.Миронова, Г.М.Вахрамеева, Т.ИГубарева, В.М. Павлов, И.А. Дятлов // Пробл. особо опасн. инф. 2013; 115(1):66-9.

Патенты

3. Вахрамеева, Г.М., Лапин A.A., Тимофеев B.C., Мокриевич А.Н., Кудрявцева Т.Ю., Павлов В.М. Патент на изобретение «Способ дифференцирования подвидов туляремийного микроба» под № 2478717 10.04.2013 МПК С12Q1/04 (2006.01 )

Тезисы в материалах конференций

4. Тимофеев B.C. Однопраймерное ПЦР-типирование подвидов туляремийного микроба / B.C. Тимофеев, A.A. Лапин, Г.М. Вахрамеева, Р.И. Миронова, А.Н .Мокриевич, В.М. Павлов, И.А. Дятлов // Инфекционные болезни. - 2012. - Т. 10, прил. 1. - С. 376

5. Мокриевич, А.Н. Обнаружение среднеазиатского подвида туляремийного микроба на территории Алтайского края / А.Н. Мокриевич, B.C. Тимофеев, Т.Ю. Кудрявцева, Г.И. Уланова, С.Б. Карбышева, Р.И. Миронова, Г.М. Вахрамеева Т.И. Губарева, В.М. Павлов, И.А. Дятлов//Инфекция и иммунитет: 2013, Т.3,№2, с. 155

6. Тимофеев, B.C. Роль нуклеотидных замен в V домене 23S-PHK Francisella tularensis в формировании резистентности туляремийного микроба к эритромицину / B.C. Тимофеев, А.Н. Мокриевич, В.М. Павлов. Актуальные проблемы эпидемиологии и профилактической медицины. 2014. с. 112

Подписано в печать:

14.04.2015

Заказ № 10705 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru