Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетическое изучение двойной супернестабильной системы в локусах Yellow и Scute Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетическое изучение двойной супернестабильной системы в локусах Yellow и Scute Drosophila melanogaster"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМ1Я НАУК ' ИНСТИТУТ ОБЩЕ!! ГЕНЕТИКИ им. Н.И.ЗавилсБа

на празах рукописи УДК: 575.24 : 595 .ПХЛ

Оклаянова Ольга ЕладишроБна

TE'rIET!!4FC"CE ИЗУЧЕНИЕ ДЕОЯНОЛ СУПЕРНЕСТАБИЛЬНОЙ СИСТЕМЫ В ЛО КУСАХ YELLOW И SCUTE DROSOPHILA MELAN0GA5TEH.

(03.00.15 - генетика)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации кг соискание ученой степени . кандидата биологических наук

МОСКВА, 1992

. Работа выполнена в- лаборатории биосинтеза нуклеиновых кислот Института молекулярной биологии' им. В. А, Энгетгьгардта Российской Акадеш'л: Наук, а также в лаборатории генетики • мобильных элементов Института биология гена Российской Академии ■ Наук.

Л

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:.H.A. Чуриков - доктор биологических

наук, П.Г. Георгиез.- кандидат биологических наук

/

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор биологических наук, чл.-кор. Российской АН Корочкин Л.И.

кандидат биологических наук Пасюкова Е.Т.

\

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Московский Государственный Университет им. М.Е. Ломоносова.

Зашита состоится 'тяп^ г. в " ^"'"частов

на заседании специализированного совета (Д ,002.49.01 I б Институте общей генетики РАН им. H.H.Вавилова по адресу: 11ТЕ09, Москза, В-ЗоЗ, ул. Губкина, д. 3.

С диссертацией 'можно ознакомиться в библиотеке Института обшея генетики им. Н.И.Вавилова РАН

Автореферат разослан "Ур "^¿'ОО...¿уиА.__ 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного соЕета

доктор биологических наук Г.Н.Полунина

г Ч

roSV. ■ ••■

£>'la. ВВЕДЕНИЕ

Нестабильность у D. aelancgaster определяется мобильными

генетическими элементами, которые, переиеиаясь по геному, могут

вызывать появление новых мутаций. Частота таких пеоемещений

—4 -■)

очень невелика и составляет 10 -1С на поколение (Ананьев и др., "1953). Известно, что значительная часть всех мутаций у D.nelanogaster зависит от инсерцип ыобильнах элементов. В определенных условиях перемещения мобильных элементов могут активироваться. Было установлено, что s результате скреамеания между отдельными линиями D.Eelaragaster происходит индукция транспозиций мобильных элементов. Хорошо изучена система гибридного дисгекеза типа Р-М (Kiciwell et .si. ,1937). Также были описаны случаи, когда при скрещивании окределнных линий активировались перемещения других мобильных злеаентоз:"I, hobo, МДГ4, Сталкера (BregLiano et.ai.,1981; Jannopoulos et.al.,1987; Герасимова и др., 1990; Georgiev et.ai.,1990Ь

Иногда пси инсерциоиком мутагенезе возникгят супернестабильные мутации, при которых с частотой до нескольких десятков процентов либо возникают нсвие мутация, либо происходят реверсии к дикому типу. See изученные супернестабильные ¡¡плгации .оказались связанными со вставками мобильных элементов, прежде всего с внедрением двух копия F-злеизнта, как, напркаер мутация snw (Eoiha et.al.,1935).

Ранее бия опясал ковш тип суг.ериестабяяъяах мутаций s

згзлич.чах локусал, расположенных на X-xpowccoise D.a^latiogaster.

X ? + aG

Эти мутации возникали после скрешзания я;*нал у sc • , в

которой наблэдадись перемещение мобильного генетического элемента

Станкерз., с дияиея . Лапные иутации характеризуется вксскоя

частотой мутйцион^ы;: переходов и большим разнообразием получаемых

% производных аллелей. Для индукции мутагенеза в супернестабилькых

хлиниях необходима транспозаза Р-элемеита. (Гесргкее и др., 15Э0).

При изучения мутагенеза сунернестабильной иутантной линии,

поз-гнлстсЯ з яокусе yellow, до получили линии с двумя

супернестабилькими ¡.г/тациямч s л о кусах yellow и scute. .Пиния,

содертаиая эти мутации была обозначена у sc .

Как установлено в предварительных мэлекуаярно-генетических

исследованиях, мутации в двойной супернестаоилькоя системе линии

y2nsscEe вкзваны вставками элемента X неизвестной природы.

расположенными б регуляторких областях локусоБ yellow и scute. На

конце каждой вставки р^полозшна неавтономна копия Р-злемента

(Самарина О.П. и др. личное сообщение!. Линия ^sc518 является

линией К*-типа, гаскольку не содержит активных~копий Р-элемента.

'Данные о молекулярной структуре района, содержа- щего локусы

2ns Ш2

yellow я scute в яянии у sc приведено на рис. i..

Рис.1. Условное представление молекулярной 'структуры локусов yellow-асhaste-scute в двойной гупернестабильноя системе. X и X' -гомологичные вставки неизвестном природы.

•Выбор данной линии в качестве объекта исследования основывался на том, что согласно упсыянутым данным вставки в

локусах yellow и scute гомологичны, хотя и - не идентичны. При

2 ns иа " ^

введении з линиэ у sc копии Р-элэмента, продуцирующего

активнуо транспозазу, можно ожидать возникновения двухцзпочечных

разрывов" по концам вставок. Таккы образом, в двойной

супернестабильной системе существует предпосылки для инициации

процессов рекоьйинации между последовательностями двух

гомологичных вставок, поскольку известно, что механизм

рекомбинации предполагает наличие двух гомологичных

последовательностей, расположенных недалеко друг от друга.

Актуальность псоДлеш.

Процессы рекоКОяйацяи играот важную роль в биологии. Изучение мехаиизаэв уеконОикационных процессов уделяется больше внимание,- поскольку рекомбинация является одним из • основных механизмов создания генетического разнообразия. Несмотря на

иирокомосштабность научных исследования, проводимых в данной области, многие вопросы, касавшиеся механизмов рекомбинации у эукариот ;*. ее контроля, остаются открытыми. 3 связи с этим, получение удобных для изучения рекомбинации систем з геноме Б.Eclanofaster. изучение механизмов рекомбинация и: исследование роли генов, участвующих в этих процессах, является на сегодпятккй день валноя задачей.

Цель и задачи исследования.

' Целью данной работы являлось: 1) выяснение роли генетической • рекомбинации в явлении супернестабильно ста; 2) разработка модельных систем для изучения процессов рекоибянации и генноя конверсии; 3) выяснение роли мейотических мутация б мейотичеекой и митотическоя рекомбинации, г таие ро*н гомологичной Х-хромосома у самок в кодификации супернестабильяости.'

В конкретные задачи работы вкодило: 1) создание коллекции производных аллелей супернестаСилькоя лкикк j?nss cF® D. Eelanogaster; 2) установление закономерностей мутагенеза супернестабильиоя линии y^^sc1*® и se производянх аллелей: 3) изучение влияния мейотических кутация Drosopfiiia ка мутагенез двойной супернестабилъноя системы у самцов и сьавк; 4) изучение влчяния' гомологичной хромосомы у самок, траислокации на Y-хрзкосоме, гомологичной яистальноя части х-хромосомы у самцов и ионкзирушЕЕй радиации на мутагенез в двойной суперкестабильнся системе.

Научная новизна и практическая ценность работ«.

В результате проведенных гнссперикгятов генетически изучена • природа супериестабилыюетк •в локусах yellow и scute у D.nelamg?.ster и показана саязь суп"рнестаЗильвссти с процессами рекомбинации. Таким образом, в работе создана новая оригинальная система' для изучения механизмов и генетического контроля рекомбинации. Установлено, что данная система даух суперкестабкльтаг. мутачия значительно отличается от известных супериастибкльиих кутлцкя., вызванных естгзлгми Р-элемертоз. Показано, что кеяоткческне мутации влияют на мутагенез, мндуцкрозанния в двойной суперкестабилькой системе у самцов

дрозофилы. Однако, значительно более сильное воздействие ие1-ыутации оказывают на мутагенез, происходящий на предмейотмческих стадиях у самок, чего не было показано ранее. Таким образом, настоящая система двух супернестабильных мутаций может широко использоваться • в исследованиях генетических механизмов рековЗилаыии.

Аппобдция ca<iom. Материалы диссертации были представлены на научном коллоквиуме лаборатории биосинтеза нуклеиновых кислот Института молекуюгрнзй биологии им. В.А. Зкгельгардта РАН (1992) и на Межлаборатерном научном семинаре б Институте-общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН 11992).

Публикации. Яа материалам диссертации опубликовано 3 статьи.

Объем диссертации. Диссертация иэложна на 180 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, эксприментальноя части, обсуждения полученных результатов и выводов и включает в себя 4 рисунка и 12 таблиц.1 Список' цитируемой литературы насчитывает 222 наименования.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. На персом этапе работы была проведена обшая 'характеристика мутагенеза в даоиной супернестабильной системе и получена

^ТТч TTS3

коллекция производных аллелей линии г sc , Второй этап

состоял е пояске и изучении влияния различных факторов

генетической и кггенетическоя природы на мутагенез исследуемой

линии. Третьим этапом работы било исследование влияния

2ns тпр

мевотических аутгама ка мутагенез в линии у sc.

Линия, б которой наблюдалась супернестабильиость, несла мутации в локусах'уе!1лу и scute. •

Ген yellow находится на дистальном конце Х-хромосомы. Это ген экспрессируется на стадии личинки и куколки и отвечает га пигментацию ротогсго аппарата и шкрохет личинки и кутикулы имаго. Генный кояллекс ac>.aete-scute отвечает за дифференцмровку цетинок и волосков взрослого насекомого, которые явдяптсм иннервированныыи чувствительными органами.

Б табл. 1 н 2 приведена классификация у- и sc-аллелея.

возникающих в дзояноя супернестаблльноя системе. Каждая индекс в обозначении- производных аллелей соответствует определенным у- и sc-мутациям, возникши б исходной линии и отличавшимся фенотипически друг от друга: для yellow - степень окраски тела, крыльев и vsstxkok, которые могут изменяться независимо друг от друга; для scute - исчезновение определенных групп петчнок.

Тайлица 1.

Классификация аллелей scute для двоявоя „ „ суперпестабильтюя системы мутация линия у£ sc '.

Обозначение sc-аллелея

Отсутствие щетинки вида:

Ни ASA AOR РРА PS ANP ОС РУ MOB РОН PVT

cXmb

sc

mp

90 50 50 90 10 10 10 10 10 10 10

90 50 50 90 50 10 10 10 10 10 10

90 30 90 SO 50 10 10 10 10 10 10

90 90 '90 90 90 10 10 10 50 50 10

90 90 90 90 . 90 50 50 50 50 50 50

90 90 SO 90 50 90 50 50 50 50 50

90 SO 90 90 90 90 90 SO • 50 50 90

50 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10

90 10 10 10 10 •1С 10 10 10 10 10

10 50 50 90 10 10 10 10 10 10 10

¡0 30 SO- 90 50 10' 10 10 10 10 10

50' 50 SO- 90 . 50 50 50 50 .50 50 50

50 90 90 90 50 50 50 50 50 50 50

50 90 90 90 90 50 50 50 50 50 50

50 90 90 90 90 90 90 SO 50 50 50

90 SO 90 90 SO 90 90 90 30 90 90

К50

seit

srria 1сНЪ

IcHm

sc!*-sc sc

Ho Ну

;Fea ;haa

10 90 50 90

90 90 90 90

90 90 90 90 90 SO

90 90

93 30 90 90 90 90

sc.

-n2 sc

90 10 50 10 10 10 '10 10 10 10 10

90 .10 50 10 50 50 Í0 10 50 50 10

SO 10 50 10 50 50 50 50 50 50 50

SO 50 50 50 90 50 50 50 50 50 50

90 50 50 90 90 50 50 50 50 50 50

ч-% Обозначения л*атинок: ОС: оцелярные, FY: пост-вертикальние; A VT и "PYT: передние и задние вертикальные: ADC и PDC: передние » задние дорсоцентральные: PS: пресыотурольиые; НУ: 'гуморальные; АИР и PN?: передние и задние котоплевральные; ASA и PSA: передние и заднее супгл^рные; АРА и РРА:' пеездкке и падике пост-гларнне; АЗС и РЕ С: передние к задние скутеляярные. 90 -практически полное отсутствие щетинки (более, чему 90% особен); 50 - в средней тетинка присутствует у 502 особей; 10 - нрксутстчу.е щетинки (она отсутствует иенеа, чем у IOS особей).

Таблица 2.

Классификация у- аллелей.

. Степень пигментации

Телз Бротаые Грудные щетинки

и щетинки

крыямг 5 О .

5" 5 +S У y+ns

+ihs „-►mns

5 У У

3 5 у*15 /Ins

2 , • 5 . .. ydris

1 5 y2s y2ns

0 0 - yls

Примечание: 5 - степень пигментации соответствует дикому ' типу; О - тело, крылья, ветинки и волоски имеют- желтую окраску (т.е. тип у1); 4, 3, 2, 1, - промежуточные оттенки мевду серым (5) и желтым (0) Обозначения у+3 и др. были впервые использованы в работе по исследованию супернестабильной мутации в локусе уеПоу/.

Для индукции сулериестабилъности использовали линии с самками со сцепленными ^-хромосомами, гомозиготными по конструкции, продуцирушаей актину» транспозазу Р-элемента. Б качестве таковой была выбрана конструкция ?(гу+, (Л2-3 I К99Е). У особей, имеющих эту конструкцию, яа третьей хромосоме ь районе 9SB расположен маркерный гея rosy и неавтономная копия Р-злеыента.. Эта копия не имеет инвертировззных кочцое и потому не ыожгт перемещаться по геному. Кроме того, из последовательности, кодарувшея транспозазу, удааги третий интрон. поэтому транспозаза мохгт активно работать как в половых, так и в соматических клетках дрозофилы. Схемы основных генетических скрещивания по анализу мутагенеза у саицов и самок дрозофилы приведены низа.

Схемы генетических скрещивания, использованных в работе: АНАЛИЗ МУТАГЕНЕЗА У САМЦОВ ЛИНИЯ y2nsscme

F1: 2 С( 1 )Г!М, у f; (гу+, (Д2-3 ) I/[ry+ , 1Л2-3 >! х o'y^sc^/Y; гу/гу

F2: 2 C(1)RM, у f; ry/ry х о'y2nssclIE/Y; try*, U2-3 > J/ry Анализ мутагенеза и скрещивание самцов с измененными у- и (или) зс-фэкстипа«и (y*sc*> с самками Ct 1 JEM, у Г; гу/гу F3: ^ СП !КМ, у f х o*y*sc'I/Y; гу/гу Анализ фенотипа мутантных производных аллелей

АНАЛИЗ МУТАГЕНЕЗА У САКЯС Fl: 2 У2"^®3^2"^^; ry/ry х oV/Y; Iry*, (Л2-ЗП/ТМЗ, St F2: 2 y2nS£CCe/X*; try+, (Д2-3) 1/гу x o'ac3/Y IX* - любая Х-хромосома)

Анализ мутагенеза у самок, и скрещивание саицоЕ с измененными у- и (или) sc- фенотипами !y*sc*) с самками Cd'RK, у f; ry/ry F3: 2 С(1)НМ, у f; ry/ry х o'y*scVY

Анализ делеция района между супернестабильным! вставками у самок

* *, 3 у sc /ас

В опытах по изучению мутагенеза в лкяии сс^ было

проанализировано 77966 Х-хромосом. Б табл.3 представлены сводные результате всех опитов по изучению иутагенеза у самцов в двойной сулернестабильноя системе. Частота мутагеяеза составляла в средней 3,4». Могяю выделить четыре основкя типа производных аллелей, частота возникновения которых псезанает Ю-^ . Таковыми классами является y+nssc+, y+nsScnc," y^sc136 и y^sc®. Относительно общего количества всех производашх аллелей аллели четырех основных фекотипических классов состагляст 232, 3S, 6Z и ■40%, соотцетственно. Одиночные изменения происходят в среднем у 505 всех аллелей, в то время как одиночные изменения sc-фгнотипа происходят редко. Итересно, что более 402 от общего числа всех производных составляст аллели, у которых произошли изменения и у-, и sc-фенотипа. Более того, дзояные изменения в большинстве случаев ичевт скоординированная характер, т.е. в локусах yelloi'.'.ti scute обычна происходят одни и те же изменения y2ns -> у+пз и sc^'^sc'.

Скоординированные изменения в двух локусах, не язлявтея

результате* того, что изменение, например, в локусе yellow, одновременно влияет на гс-фенотип. Действительно, иутациоккыя

2rs ^ +j1s

переход у у , хотя и сопровождается чаще всего

возникновением £с+ аллеля, но может сочетаться, хотя и

значительно реже-. практически с любой другой зс-мутаиией. Кроне' +ns

того, не только у , но и все остальные сскозние у-аллели сочетается с различными sc-фзнотипаш, образуя минорные классы. Иныыи словами, промеходят одновременные, но ке зависящие друг от друга изменения и в локусе yellow, и в локусе scute, которые в большинстве случаев имеет скоординированный

характер.__:__;___

Таблица 3.

Основные классы мутация, которые возникли при^анализе мутагенеза в линии yZnsscEe (просмотрено 77S66 Х-хромосом и найдено 2413 ыутаятов).

Обозначение фенотапа "yellow Обозначения фенотипа scute'

EC ' 5СШ-1ЛС scea __Dd-mo sc

y+ns y+st3) 679 16 22 5 19 0 lie 0

♦таз pdns 4 1 0 0 0 2 2 0 3 19 15 6

y- 19, 23 i 25 30 3 0 28 39 9 173,

У T!5 J 0 2 0 0 0 2 0 0 11 13 69 25 5 8 Э о -

19 6- 33 1125

* - y2ssc+ = y2sHww - есть слабый Hw- эффект.

В скобках приведена степень пигментации оснований антенн.

* * ? r.s me

- исходный аллель у sc

Наиболе? простаы объяснением одновременных и однотипных изменений в двух локусах мо;гт являться реиипрокная рекомбинация.

Поскольку мутации б локусах yellow и scute вызвали гомологичными, но не идентичными вставками, то такие структуры могут являться субстратами для рекомбинации, которая инициируются двухиепочечными разрывами на концах делегированных копий Р-элемента при участии транспозаза, как это предполагается в модели рекомбинации.

Среди.минорных классов выявляются все остальные- изменения в локусе yellow (по крайней мере 7 различных фенотипов), которые, сочетаются с разнообразными изменениями г локусе scute.

Остается открытым вопрос о причине почти полного (если не считать аллеляг. y^nsscea) отсутстзия аллелей с одиночными изменениями sc-фенотипа. Возможно, что многие события, происходящее в локусе scute, не фиксируются в изменениях sc-фенотипа. .

Необходимо отметить, что большинство полученных в опытах производных аллелей оказались также супернестабильными.

Следовательно, копии Р-злекечтов, пас положенные so вставках,

* %

остались интактными, и болышнстзо изменения фенотипа было связано с изменениям;! во внутренних областях Еставок.

Кроме приведенных в габл.З фенотипических классов аллелея, 5 двоч«оя суперкестабиль-ion системе в условиях мутагенеза очень редко возникали аллели, у которых прип;ектаиив тела можно условно обозначить как суперзкспресси» гена yellow. Ка основании этого, а такт; бслыаого разнообразия фенотипов yellow и scute мохю предположить, что экспрессия генетических локусов yellow v. scute s. двойной супернестабилькоя системе, кроме исходных регулятерных элементов этих ло'куссь, а такзе знхансера МДГ4, контролируется такж ригуляторными элементами, расположенными е суперкестэбилькых вставках.

Необходимо добавить, что результаты различных однотипных экспериментов характеризуется хоровея повторяемость». Было сделано «есть независимых экспериментов и од*я опйт с пятьи двухдневным брудааи..-Аллели различных к л ас со г- з разных опытах в'о?кикавтГ-.'-прита'жй-ельно с одинаковыми частотами. При этом, распределение'частот'в различных опытах совпадает с нормальный вероятностные распределением, т.е. колебания частот является случайными. В табл. 4' приведена частота и спектр мутаций,

возникгоиих в тре/. однотипных опытах, а также усредненные значения для сести однотипных экспериментов и пяти Орудов.

Далее мы изучили зависимость частоты и

спектра индуцированного мутагенеза от концентрации активной транспозазы. Б'табл. 4 приведены данные'для нескольких 1болывеп частью основных! фенотипических классов производных аллелея, которые возникают в лини-/, '/^гс1® при использовании линии в качестве источника активной транспсзаза. Линия п, действительно содержит менее активную траиспозазу, чем линия

РСгу*,( ¿2-31 К99£1. Как. известно при ск-решваияи линии епы с линией I¡2 прзясходят около 202 мутационных ищыенекия в локусе БХпзес!, а при .использовании линии Р1'гу+, (&2-3)Н99Б) - до

В нашей случае оказалось, что обшая частота возникновения производных аллелея остается той же, что и при использовании (А2-3 1(93В> элемента. Однако, изменяется соотношение между основными фенотипическиыи классами. Уменьшается частота возникновения аялелей класса у+Пь5с+, а частоты появления

^пс ТëР? с пр

у и ук, напротив, увеличивается приблизительно в 2

разг. Таким образом, увеличивается количество аллелей, у которых изменениям подвергается один локус уе!1оад.

Таблица ^

Аналич мутагенеза у самцов (частота мутация х 10 1.

+ПЗ + у БС у'^вс"® у^зс1® ,.1а„_Н1е у БС Обшая частота ыута:шй(-«';'

[Д2-3 ] три опыта 6,3 6,5 Б,7 0,2 1,6 2,2 4,7 3,1 1,9 10,4 11,1 13,6 24,6 35,4 32,0

2 среднее 6,6 1.2 3,3 15,1 . 33,5

я2 4.1 3,6 7,2 13,1 35,7

ионмзирусиая радиация (2,3 бруды} 3,0 9,8 ' 1,3 0,9 2.6 1,8 12,0 10,2 28,4 30,0

Б таблице дирныи прифтои выделены частота мутация в тех случаях когда обиаружЕ:га отличие от контрольных значения.

Следовательно, замена линии Pfг/*, <Л2-3)К99В) на лини» л2 при индукции мутагенеза в двойной супернестаоильной системе меняет специфичность, но не частоту мутационных переходов, в отличие от стандартного Р-М гибридного дисгенеза. Возможно, наличие дефектных молекул фермента в -линии л2 приводит ■ к изменениям в процессах гекетичеекких обменов, которые лежат в основе аллельннх переходов в двойной суперкестабильноя системе.

Из данных, приведенных в табл.Л следует, что ионизирувшдя радиация не оказала никакого достоверного воздействия на частоту ч спектр мутаций, возникающих- в двойкой супернестабилькоя системе. Это, Еэзмсхно, связано, го-лервых, с непродолжительным временем возникновения производных аплелеч присперматогенезе и, во-вторых, с низкой частотой индукции радиацией двухцепочечных разрывов в супернестабильнах вставках, по-сравненио с индукцией дзухцелочечных разрывов тсанспогазоя Р-элемента.

Наконец^ было выяснено еца одно обстоятельство, которое подтверждает сделанный ранее вывод об отличии данной двойной супернгстабильиоя система от стандартных систем Р-М гибридного дисгенеза. Поскольку для индукции мутагенеза использовали [Д2-33199В) элемент, который продуцирует активную транспозазу и в соматических клетках, то полно • было отадать возникновение мутация в соматических клетках, что фенотипически проявляется в появлении мозаиков. Однако ни в потомстве исследуемой линии

tna

у se ', ни в потомстве ее супернестабильных производных после индукции мутагенеза не было обнаружено появления мозаиков. Следовательно,' для возникновения. мутация в двойной супернестабильной система, кроме транспозазы Р-элемента, нужны и другие факторы, зависящие очевидно от элемента X, только в совокупности с который шжт осудзствлять свои функции Р-злемент.

Еысе были описаны основные закокомеркост:4. мутагенеза, V происходящего в двойной супернестабильноя системе у самцов дрозофилы. Далее мы провели сравнение мутагенеза у самок и самцов. Мл изучили вяи.игниз гомологичной хромосома на частоту и спектр мутации, возникает« в двойной супернестабильной системе у самок.

Из зкоприментов, результаты которых суммированы s табл. 5 и б следует, что и частота, и спектр мутаций, возникавших вследствие

индуцированного транспозазой Р-элемента мутагенеза у самцов ■ и самок линии ест® значительно отличаются. В опытах на самках

1 <7 +

появляется новый основной класс производных аллелей у бс . Аллели этого класса возникают наиболее часто в виде пучков. Таким образом, ■ их • возникновение можно соотнести с белее ранними стадиями гаыетогенеза, чем у самцов. Аллели класса у+пг5с+ также в "некоторых случаях возникает с гораздо более высокой, чем у самцов частотой и в сидз больших пучков. Кроме того, у самок'значительно снижена частота возникновения аллелей классов у^БС®5, у+ПЕБС1пе, у2я5С"'е.

Таблица 5.

Анализ мутагенеза у йс у саыок, содержащих в гомологичной хромосоме стабильный производный аллель (частота мутаций х 10 )

Гомологичная хромосома 2П£ ЕЕ , у 8 с / Предиейотическая стадия Стадии меяоза Частота мутации Б кейозе (-Ю"3}

+пз + 15 + у бс у Б С у йс у бс у . ес у ес

шв еа >вз ше Г илв5~3* • ; Г. 2 5 73,0 142,0 24,0 0.3 0,1 0,1 - 1,4 0,5 - 0,5 0,4 4,2 -- „ 0,9 1,4 1,6 43,0* 2,7 • 0,3 С,'2 0,3 0,8 2,2 1,7 6,0 6,1 4,2

* - данкие производный мутации возникает на предмейотческнх стадиях пучками*.

Таблица б.

Анализ мутагенеза у самок (частота мутацик х 10 3)

Гомологи ч~. ная хромо- у-Шз'с- Предмейотичес кая стадия Стадии меяоза Частота иутацмя в мейозе

у зс у1 зс у"м2с+у+П5зсюэу25Вс2у153ске

1п11 )£с \ 15'. 1| ас" у 5с «ОЕ) 17,0 13,0 42,0 0,5 - 0,9 3,0 4,6 1,8 • 3,5 1.0 2,8 0,5 1,2 0,5 1Л 0,4 4,4 16,5 9,0 1.2

В гастоятер работе мсг.пльповались lavcrs другие гомологичнее

хромоспмч. Из полученных результатов следует, что гомологичная

хромосома оказывает значительное воздействие на частоту и спектр

мутация, возникавших, при мутагенезе, индуцируеыом тракспозазои

Г¿2—3 Н9ЭВI злеиента в двойной супернестабильноя системе линии

y2nssc'c. Наличие гомологичной хромосомы в опытах на самках

приводит к тому, что некоторые производные аллели возникают

пучгсаьи, и, таким образом, их появление можно соотнести с

предмейотическими стадиями созрёзаиия пологих клеток. При индукции

мутагенеза в системе двух мутация jrrß sc3-'3 различные гомологичные

хромосома могут либо способствовать, как например нейтральная

xpoMoccva y+sc+, либо супрессировать, как напримео хромосомы с 14

инверсиями ±n( 1 )ас , InilJsc , возникновение этих аллелеп. Необходимо отметить, что специфичность аллелыщх переходов, которые приводят к образованию пучков аллелея в двойной еупернесгабияьноя системе, определяется видом мутаций, расположенных з локусах yellow и acute, расположенных на гомологичной хромосоме (см. табл.5 J.

Однако, многие производные аллели в опытах на самках возникает как отдельное события, поэтому их поягдемие, по зеей вероятности, происходят в мейозе. Из результатов экспериментов, приведенных в табл.5 и 6, следует, что гомологичная хромосома не оказывает влияния на специфичность и соотношение между производными аллелями различных • .фенотипкческих классов, возникающих на стадии меяоза, а уменьшает частоту возникновения этих аллелей.

В пользу предположения о роли гомологичной хромосомы в уменьшение о бив я частоты мутация у санок свидетельствуют результаты опита, в котором мутагенез индуцировался у самцов линии

»рр СПЬ

y"-°sc ' в присутствие транслокации у ас sc , расположенной на Y- хромосоме. Результаты этого опыта представлены в табл.7. Известно, что х- и Y-хрокоссмы взаимодействуют друг с другом в митозе и в первом делении мейо^а. ■ При наличии на У-::ромосоме участка, гомологичного дистальной части Х-хромосомя, эти две хрсмоссыы будут спаризаться с использованием данной области гомологии. Это спаривание отличается от случая, когда взгнмодеястЕиуйт обичныг Х- v. y-xdomocomu.

Таблица Т.

Частота мутация основных фенотипических классов, возникающих в двойной супернестабильноп системе y2nsscme у самцов в контроле и б

присутствие . транслокации Х-хромосоме.

ас

se

расположенной на

Частота возникновения аллеля 110 3) Общая частота мутаций (-10-3 ) Число проанализированных Х-хромосом

y+nssc+' . , - ■ y+nsscve y2sscrae ,.ls„„na i se

контроль 6,5 1,2 3,3 15,1 33,5' 77966

транслокация 4,0 3,1 1,1. 6,6 1S,5 3505

Видно, что транслокация уменьшает оОщй частоту мутаций в линии

Орс- тпа

у se. При этом относительная доля производных аллелей основных

y^sc*5,

фенотипических классов у+П5£с', у'-бс"*", с"*" в обшем

количестве всех производных практически созпадает с контрольными значениями: 212, 365, 62 против 235, 40£, 6Х, соответственно.

+Г1С яр

Увеличивается относительная частота аллелея у ее до 162 против ЗТ- в контроле. Следовательно, общее уменьшение частоты мутация под влиянием гомологичной транслокации, расположенной на У-хромосоме, достигается, в основном, за счет упорядоченного уменьшения частоты возникновения практически всех аллелей основных и минорных фенотипических классов. Таким образом, изменяется частота, а ке специфичность аллельшх перехедов. •

.Далее ыы исследовали влияние те1-иутация на мутагенез, индуцированный в -двойной супернестабильной системе у самцов. Эти мутации в различной степени нарушит прохождение мейоза у самок и, как принято считать, практически не влияет на процесса генетического обмена у самцов дрозофилы, Б табл.4 приведены результаты этих экспериментов.

Наибольшее влияние на частоту к спектр нутация, возникавших в двойной супернестабильной системе у самцов, оказывает мутация те1-218, которая, как известно, не влияет ни яа одну из известна?:

систем репарации, по нарушает поиск гомологичного сайта в процессе

рекомбинации. В спектре мутагенеза почти в 2 раза уменьшено

количество аллелей y+nssc+ и y^sc"16. П*5

Мутация те1-41 также влияет на частоту и спектр мутаций.

возникавших в двойной супернестабильноп системе у самцов, хотя и в

меньшей степени, чем mel-218. Мутация mei-41^ приводит к

1 s ins

уменьшению количества аллелея у sc . Частоты возникновения

аллелей ¡Л^ес®5 и y^sscne несколько увеличивается. Мутация

пк

тэ1-41 ■ таю®, как и mel-213 ухудиает условия для поиска гомологичного саята в процессе рекомбинации. Эта мутация, кроме того, влияет на пострепликативнув репарацию.

Таблица в.

Влияние мейотаческих мутация на спектр и частоту мутации в двойной супернестабилькой системе у самцов дрозофилы.

y+nssc+ y+nsscEe y^sc®8 ylsscM Обшая

частота ^

мутация f/£>;

контроль 8,6 1,2 3,3 15,1 33,5

y2nsseme rael-9a 3,0 " 1.6 2,3 14,3 30,2

y2nsscme гсеШ35 7,2 5,4 4,4 7,2 36,0

y2nsscme nie 1-218 5,5 '1,0 2,5 4,9 17,0

В таблице жирным шрифтом отмечены частоты мутаций, которые отличаются от контрольных значений.

Из опытов по изучения мутагенеза у самцов в системе с двойней супернестабилькостыо стало известно, что мутантные производные аллели здесь практически не возникают пучками. Следовательно, при мутагенезе у самцов линии у^'^бс"13 производные аллели в основном 44 возникают на стадии меяоза. Таким образом, в работе показано влияние. пк1-мутация на мутагенез, происходящий в двойной супернестаСильноя системе у самцов О.ше1апойаз1ег е меяозе. Более того, из предположения о роли процессов генетической рекомбинации в мутагенезе двойной супернестабильной системы следует .""что мейотические мутации влияпт на процессы генетического обмена,

происходящие у самцов на стадии мейоза. Поэтому очевидно, что система с двойной супернестабильностьо в локусах yellow и scute y2mScm открывает новые возможности для исследования молекулярных механизмов воздействия мейотических мутация на все процессы, контролируемые ssi-локусами, у самцов дрозофилы в мейозе.

д 2riS iTiP

.Мутация msi-3- us влияет на мутагенез у самцов линии у sc . Недавно было показано, что мутанты mei-S дефектны по апуряновоя эндонуклеазе. Очевидно, что фермент апуриновая зндонуклеаза по-сразиенио с транспозазой Р-злеиента играет незкачительнув роль в двойной сулериестабильной системе, и частота двухцепочечных разрывов, возникаоцих во. вставках вследствие активности этого фермента во много раз меньие частоты двухцепочечных разрывов, . возникавших под действием транслозазы Р-элемента.-

Мейотические мутации не увеличивает количество летальных

производных аллелей, возникавших при индукции мутагенеза в

*

двойной .супернестабилъной системе у sc mel у самцов.

Далее изучили влияние ше1-411)5 и ше1-?.1в на частоту и спектр мутаций, возникающее при мутагенезе в двойной супернестабильнои системе 'f113 sc™ у самок. Результаты этих опытов суммированы в табл. 9. Видно,' что происходит увеличение частоты мутаций, возникающих в ыеяезе (т.е. не появлявшихся в виде пучков!, по-сравнению с аналогичным контрольным опытом ка самках (первая строчка в таОл.Э). При этом мейотичеекг.е мутации супрессируют возникновение производных аллелей на предмезотических стадиях. С другой стороны, на стадии меяоза под воздействием мейст-лческих мутаций происходит увеличение частоты мутаций, зачительное в случае нутации ие1-21В. Известно, что продукты генов bei-41' и гае 1-218

участвуот в меяхромосомном спаривании в процессе рекомбинации.

« *

Таким образом, ыутактныз продукта локусоз те 1-41 и тг1-216 при мутагенезе в двойкой супернестбильной системе у. самок нарушает' ыежхромосомные взаимодействия на предмейотических стадиях, и в процессе рекомбинации не возникают алаельные переходы, которые фенотипически фиксируется в виде пучков. Однако, на стадии мейоза нарушение межхромосомного спаривания приводит к увеличении частоты нутация, по-сравнеиию с контрольным-; экспериментами; спектр мутаций у самок под воздействием мейотических мутации становится похожим на спектр у самцов. Следовательно, меяотичзские мутации создают у

самок на стадии меиэза состояние, при котором гомологичная

хромосома практически не влияет на возникновение мутация в локусах /

ye lloví и scute в двойной супернестаСильной системе.

Таким образом, из приведенных выше результатов, следует, что тэ1-41^ и'гое1-213 влияют на генетическую рекомбинацию в' двойной s-упернестабильной системе у самок и самцов дрозофилы на всех стадиях, когда происходит генетическая рекомбинация.

Таблица 9.

Влияние мейотических мутация на частоту и спектр мутация,

2ns roe

возникающих в двойной супернестабильной системе мутация у se у самок y2nsscme/y+ sc+(0H>.

¡Гомологичная хромо-

сома y2nsscffi3

контроль mei-218

Предмеяотичес кая стадия

+71s + 1 s + у sc yl°sc

13,0

42,0

Стадии мейоза

У+Чс+у+ПЗзстау2з5сУ5£сте

1,1

4,8

0,9 1,0

1,1 3,4 1,8 2,8 2,8 1,1

Частота мутаций в -меяозе

(-10-3)

1,6 8,0 21,9

На основании вышеизложенного можно сделать вывод о том, что в основе аллелъных переходов в двоякой. супернестабильной системе у sc у самцов лежат процессу генетической рекомбинации, происходящие между последовательностями гомологичных вставок, расположенных на одной хромосоме. Возникновение пучков фекотипически однотипных мутаций у самок на предмейотических стадиях происходит с участием з рекомбинационном событии двух хромосом. Мейотические мутации нарушают межхромосомног спаривание у самок, у" sc /у sc (ОН), и производные аллели возникают за счет /рекомбикационных процессов, происходящих в локусах yellow и scute на однея хромосоме.

ч

I. Показано, что в

вывода

результате

мутагенеза, индуцированного

тралепозазоя Р-элеглента, кодируемой элементом (гу , < Д2-3 ))(99В>, з линии •/- го у саыцов с частотой около 3,4 х10 происходит возникновение производных аллелей с разнообразными сочетаниями у-и зс-мутаций. При этом более 40£ всех мутационных изменений приходится на дола скоординированных двойных мутационных

аллельных переходов в локусах yellow и гсиге.

2. Мутагенез в линии y'^sc^ у самок значительно отлнче.ется от мутагенеза у самцов. Возникают новые основные фенотипические классы аллелей, изменяется частота мутаций. Основное различие б спектре и частоте производных аллелей 'достигается у самок за счет возникновения определенных аллелей на предмейотических стадиях, в отличие от -мутагенеза у самцов.

3. Показано, что характер мутагенеза. в двойной супернестабильной- системе мутаций y'^sc1119 у самок зависит от гомологичной хромосомы: инверсии супрессируют возникновение мутаций на предмейотических стадиях; другие суперкестабилькые мутации, расположенные в аналогичных генетических сайтах на гомологичной хромосоме, могут либо суг.рессировать, либо не супрессировать возникновение производных аллелей на ранних предмейотических стадиях, в зависимости от конкретного зида зтих мутаций.

4. Показано, что данная супернестабильная система по сбоим свойства« отличается ст известных супернестабильиых мутация, вызвынных инсерциями Р-элементов: элемент try , (¿2-3 1М&9В) в двойной суперкестабильной системе не ■ индуцирует появления соматических мозаиков; уменьшение. ..концентрации активной транспоаазы не изменяет частоты кутаиия.

5. Мутации is-el—, msl-218 оказывают незначительное влияние на характер мутагенеза линии > s scP6 у самцов. У самок эти мутации, как и расположенная на гомологичной хромосоме инверсия, супрессируст возникновение производных аллелей на предмейотических стадиях.' Во время мейоза данные меотические «утации приводят'ic увеличению частота-мутация.

Мутация ве1-9^..и воздействие ионизирующей рариг.ции не влияет на частоту и спектр мутаций в двойной супернестаби.пьной системе.

Список раба г, опубликованных по. теме диссертации.

1. Окладкова O.S., Георгиев П.Г. Двойная система супернестабильности у Drcsopîiila nslanogaster как модель для изучения механизмов рекомбинации."Докл. АН, ÏS92, Т. 325, Г!о 2. С.2Б4-2В8 .

2. Окладнова O.E., , Георгиев П.Г. Двойная система супернестзбильиостм в локусах yellow и ¿cute. Brosopftila eslancgaster. Генетика. 1Э92. T.23. No 10. с.100-113.

3. Оклаисва O.S., Георгиев П.Г. Влиляме мейотических мутаций на процессы, происходя®« б двоякой суперкестабиль.чой системе з локусах yellow и scute Drcsopftlla œelanogaster. Генетика. 1992. Т.26. Но 11. С. .

чх