Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетический анализ явления нестабильности в системе мутаторной линии DRОSОРHILА MELANOGASTER.

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетический анализ явления нестабильности в системе мутаторной линии DRОSОРHILА MELANOGASTER."

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ' ИМ. М.В.ЛОМОНОСОВА

На правах рукописи

ХЩЙБЕРГЕНОВА БЕРМЕТ МЕРЛКСОВНА

УДК 575-24:595.773.4

t

- ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ¿КШЗ ЯВЛЕНИЯ НЕСТАБИЛЬНОСТИ В СИСШЕ МУТАГСРНОИ ЛИНИИ EROSOPEQIA КЕШЮОASTER.

(03.00.15 - гепзтика)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени . кандидата биолопгсгскга: наук

МОСКВА - 1993

Работа выполнена на кафедре генетики л селекции Биологачесхс факультета Московского Государственного Университета лые М-В.Ломоносова

Научный руководитель: доктор Сяологических наук, профессор

' Ы.М.АСЛШН доктор биологических наук А.И.КДО

Офицкальше сшсеентн: доктор медицинских наук, профессор

л.к.корочаш

кандидат биологических наук Г.М.ГРИШ4ЕВА

У

Ведущая организация: Санкт-Петербургский Государственный Университет.

Защита диссертации состоится "/У" 993 г, в час!

на заседании специализированного совета Д.002.85.01 при Инсткту биологии развития РАН им. Н.К.Кольцоза по адресу: 117334, Москв ул. Вавилова, д.26. С диссертацией ыонно ознакомиться в библиотеке МГУ.

Автореферат разослан 11_"_ 1993 г.

Ученый секретарь специализированного созета, кандидат биологических нэук-

Е.М.Протопопа

БВЩЩЖЕ.

Мобильные елекенты составляют подвижную часть генома еукарзот и представлены многочисленными копиями различного типа. Вставхи мобильны? элементов могут оказывать существенное влияние на работу генов, так как внедрение мобильных вленентов возмогшо в интроннуг, экзонную, регулятсрнух последовательность различим генов. В настоящее время известно, что большая часть спонтанны! иутаций обусловлена .тасерциями мобильна элементов. Так при исследовании 13 стабильных, спонтанно возникших мутаций по локусу иШе у дрозофилы установлено, что семь из них являются вставками (гаоЬаг а1., 1932). Для некоторых генетических лэкусов возмокен переход к нестабильному состояеизо. Явление нестабильности исследовалось в работах Демерека (Бешегес, 1937), Ткнякоза (Тпняков, 1938), Гериензсна (Гершензон, 1941), Дусеезэй (Дусеева, 1948). Детальный анализ, проведенный в 70-е годы на локусах «Ше и зц^ес! выяеш1 связь этого явления с мобилькши алиментами (вгееп, 1977; Голубовсгай и др., 1977). К настоящему времэни у дрозофилы известно несколько систем генетической нестабильности. Такие системы как Р-М (Ште11, 1979; Ег^е15, 1979), 1-й ( ВгегПапо et а1., 1987).- Н-Е (Гвпш>рои1ов е4 в1., 1987) известны как системы гибридного дасгекэза. спецефэтеские сзойства которых эбуслсвлены перемещениями Р-, 1-, ЬоЬо-слемеятоз, соответственно. Лзвесиш и другае системы, з которых происходят транспозиции нескольких семейств мобильных элементов. Это системы 15стабильности КБ (Кии и др., 1983, 1506), (Герасимова, 1981,

1988), лие;я №., характеризующаяся нпзког головой етстивностьв [Беляева и др., 1981; Пэсгкоза и др., 1984), ис-снстемэ (Ыш, е1; 11-, 1939), линия КС, характеризующаяся часпаш реверсиями гсо-локуез ({£е?е1-ЯЬ.?.о е! а!., 1539).' Изучение подобных систем рибяяает исследователей к вопросам рэтулящи процессов ргнепозицЕИ шбильвкх алемгзтоз.

Целью данной работы было дальнейгег исследование явления

- г -

генетической нестабильности в мутаторной линии (MS) Crcsophil melanogaster.

Мутаторная линия проявляет свойства, известные как явлена генетической нестабильности. .Пиния ЫБ характеризуется иоЕызпенно частотой споетанаого мутирования мутанты появляются

виде крупных пучков (Ким и др., 1989). На фоне имеющихся мутгци часто возникали новые в других локусзх. Появление и нестабильност мутаций имели янсерционнуп природу.

Первая часть налей работы посвящена изучения роли подвизнк элементов в процессе спонтанного мутагенеза, происходящем ыутазорной лш. Были поставлены следуп$ие задгчн: 1 исследование роли мобильного элемента УДГ4 в яадукцпи спонтанны мутаций; 2) исследование распределения ьтого элемента при обратно, (мутировании шсерционннх .мутаций; 3) изучение возможной роли ЦЦГ в издугадя* спонтанных хромосомных перестроек; 4) изучение взаимодействия мобшгьвых элементов разшх семейств в условия: мутаторной линии.

Вторая часть работы состоялз в изучении зозмсянол взаимодействия двух семейств мобильных элементов 1ЩЧ и hobo транспозиции которых наблэда&тся в системе нестабильности.

Третья часть работы была отведена на выявление факторов участвуЕцих в регуляции транспозиций мобильных элементов ] мутаторной линии. В в то? раздел входили следущие задачи: 1 исследование способности мута торной линии к генетической трансформации; 2} изучение поведения двух структурных подсеыэйси МДГ4 в геноме стабильной ляши SS.

Научная новизна psCoiri. В работе деталззарованг характеристика генеетчзсхи нестабильной мутаторной линии, Показано, что в мутаторной линии может происходить гранспозшдо лишь одного семейства ВДГ 0W4) при неизменной локализации друга: семейств, в данном случае - Щ[Г2. Установлено, что Еознкс-ювенк! мутаций в мутаторной линии имеет ' инсерционный характер, Ревертирование в мутаторной линии происходит за счет вырезаши

- з -

ЛДГ4 из мутировавшего локуса. Во ииожественно-марккрованких пиниях, несущих "пепочш" одиночных мутаций разной молекулярной трирода, также ноЗлкдавтся транспозищк лишь МДГ4. Цитогенетическн заявлено, что мутаторная линия характеризуется высокой частотой :рсмосси5Н1 аберраций. Показано, что транспозиции МДГ4 осуществляются независимо от перемещений МДГ2 и не взаимодействуют системой транспозиций ЬоЬо-элемэнта, перемещения которого 1айиксирован; з данной системе. Впервые установлено, что данная 'енеткческая система нестабильности обладает повышенной 4фектишостьэ трансформации, причем эти характеристики являются ¡обственно свойством мутаторной линии, с транспозиции МДГ4 сзязаны ! механизмами дерепрессии в сатой мутаторной линии, проведен •енеткческий аналуз трансформактоз, полученных при введении в 'езом молекулярных конструкций на основе вектора СаЭреЕ, эдеркзвлт ргзлччдае внутренние вставки, и имеющих различную кспрессшэ гена шши 7?hite. Таким образом, в данной работе изучены охарактеризованы свойства новой генетической систеш е стабильности. Получен материал для дальнейшего изучения естабильности, а также молекулярно-геветическет исследований ешой зкспрэссш:.

Практическая Ц2ЕПОС?ь работы. Рез7.,йтатн генетического и ктэгснетаческсго анализа явления нестсбл.шюж в мутаторной 1ШЕ5 предстзьллют как 'гВоре:вдес1сй, так н прзжческЕЙ интерес. ;'таторпзя линяя, характеризушаяся сгойстсзш гене~г:эс;:ой ;стабильности, мо-йт быть использована в кс-чсстве тест-систем при галззе иутзггшсй • активности лекарственных препаратов, гготзгче ;к*пс оффэктоь слабых воздействий (на уровне генеративных а'пцгй. хрохосэ1£Ш. гбсррацгй). В^еогссаутг&иьЕая линия дрозсфшк :е была гопэлъзовсль в качестве тест-слстещ при оценке шетиуеской опасности загря&яеагс окртза^ей сред::, в том числс анализе еффектов долговременного хронячс ского облучения (гачизка (Мзгсмедоза, 1993). Весьма зфЬзктивнш является пользование КБ линии для изученк.ч ь;зг?зпзков гс-нной бкснрессия.

Апробация работы. ОсноЕше научные результаты диссертаци докладывались на 1-й Всесоюзной конференции го генетике насекомы: (Москва, 1991), на конференции молодых ученых МГУ (1988), н, лабораторных семинарах лаборатории генетики животных кафедр; генетики и селекции МГУ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на/^?стр. включая таблиц, рисунков, и состоит из введения, обзор; литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения заключения, выводов и списка литературы.

Выражав глубокую признательность научному руководите^ доктору биологических наук Киму А.И. за постоянный интерес i помощь, оказанную б выполнении вгой работы. Приношу искрении; благодарность научному рухзводдгелю доктору биологических наук профессору Аслгняау U.U. за участие в ойсущании результатов, < также Любомпрской К.Е., Романовой Н.И., Шостак Н.Г. за помощь i проведении некоторых экспериментов.

Результаты. . '

I. Наследование закономерностей перемещения мобильны: элементов б производеых мутаторной линии, несуддах одиночные .'/утацш. С целью выяснения поведения ВДЧ при феЕОТшическш реверсиях видимых мутаций, возникших в потомстве MS, а такке поведения других ретротранспозонов при мутационных переходах, проведен анализ изменений распределения МГЭ в процессе реверткрования изсервдонных по №4- ыутзций, выделенных из MS, и i новых мутационных переходах. Анализ локализации мобильньи элементов - МДГ4 и МДГ2 - методом гибридизации in situ проводило; в следующих производных мутаторной лпгш:

Распределение мобильных элементов в Х-хромосомах исследованныз линий представлено в табл.1. Во всех исследованных случаях сайта

- с, -

✓

локализации ВДГ2 в процессе обратного мутирования не изменились.

Однако, распределение МДГ4 б Х-громосомах ревертгнтов оказалось

сильно измененнкм. Показано, что мутирование и нестабильность

1 ¿к

мутации f связаны с вырезанием и перемещением ВДГ4- В линии Г ' наличие сайта гибридизации КДГ4 в районе 15 EF свидетельствует о том, что внедрение НДГ4 вызывает мутацию. Вероятно, при инсерции МДГ4 в рзйон 15ЕР, где локализован локус t, происходит инактивация гена I. Вырезание МДГ4 из этого локуса приводит к восстановлении функционирования гена i. Такие хе закономерное» выявлены при изучении мутации ot. Таким образом, анализ подтверди шсерционнув природу нестабильных мутаций I и ot. Они вызваны внедрением ВДГ4 в мутирущие лохусы. При ревертаровании наблюдается транспозиция лишь элемента ВДГ4 (табл.1), но не ЩГ2. Эксцизия элемента ЩГ4 из локуса приводит к восстановлению исходного нормашюго фенотипа. Перемещаются одновременно несколько копий ХДГ4. В случае et и 1 мы наблюдаем не только изменения локализации сайтов згебрадизации, но и уменьшение числа кошй ЭДДГ4 в I хромосоме. Вероятно, жешо транспозиции ВДГ4 ответственны за мутирование в данной системе, так как изменение локализации ВДГ4 наблюдается только в липиях-ревертантах. А в ыугантных линиях, заложенных от братьев-ревертантов, локализация ВДГ4 не отлечзэтсп от исходанх чутаций.

II. Анализ законоизрностей Щ'тстюьания во ынояеетвенно-царкироваишЕ линиях. Так как в геноме мутаторззй линии и ее ¡¿утр торных производных присутствует ¡.¿осиль his генетические элементы рззпых семейств, определенный интерес представляло ^следование закономерностей ■ их взаимодейетЕИ в необычных гсловвж: - в условиях иутаторзой лашзи. С втой целью m гсследсвадн закономерно ми воззшюЕенУя нутаций (как

гршыI, так и обратных) во ¡гаогестеешо-мартароЕгннкх лиеиях на ?знс гзпетйлеекого о;фуеэннк ^татаркой лика. Изучение гэдвергзлксь сочетания мутаций, полученных из Iß -

11с. 13к 145c

и у V ct í , поддерживавшихся в гетерозиготе с хромосома FM4, У31 ^sc^áa В, которая нгеэт множественные инверсии. Ранее

i

помощью гибридизации. 1п si tu было показано, что мутация у вызвана инсерцней ВДГ2 в сайт 1А, мутация иасерцкей ВДГ4

7С-8С, мутации ct1?k - в 7В и f14k - в 15EF (Ким, Беляева, 1986) Частота мутирования одиночных маркеров составляла Ю-4. Анали характера мущхззшшя в лигаих у3'd se8 dm В ■

оt1 1 , у*^1 d бсВ dm В прогадали у самцов потомства полученного от скрещивания самок исследуемнх линяй с самцам цутаторчой жшаи. Последнее скрещивание проводили с целы насыщенет-гевоиов потомства мобильными генетическими элементам мутаторной лыазп. Ври проверке 8.300 саздов потомства линии у1^ ct1 d б с8 dm Б бнло выявлено G случ зев "мутирования

затронувших разные локусы Х-хромосош. Самца, мутировавшие п< локусу se, оказались стерильными и неигзнеспособнши. При анализ! 8779 саицов вотоымва осшпи y1kp ct13l£í14k/PM4, у314 se8 dm ] выявлены случаи одиночных мутаций, затрагивающих АБС-комплекс. ¡ такзе двойных мутаций, когда происходит одновременное мутирозашк лсяуса В к реверсам к дакоау тану мутации В условиях дашлг экспс-рклоЕТсз обе месш сt¿oено-иаркиров знные лиши мутируют i частотой Ю-4. В то ез время, при анализе 15718 особей линия у в< я ot sri í/sm,piü se® da В, взятой в качестве контроля и несуще! мутации в тех та jíckv caí, не выявлено ни одного случа: мутирования. Таким образом, как и з случае мутирования одиночны: маркеров при совмещении з одном геноме 4 мутаций сохраняете! высокий темп мутирования (10 'Ь, согоо^'эви.мй в обоих случаях. Интересно, что при еовагещзннг з одноу геноме мутаций, шещиз разную молекулярную природу, частота мутирования нэ претерпел; существенна! изменений. Характер возникновения мутаций в обои: проанализированных случаю пучкоЕнй. В потомстве одного саыщ появлялось от 1 до 22 мутантных особей. Размер пучка изменялся о' 3,1358 до 50Í и в 2 случаях анализируемых линий, размер нута достигал 100$. Вероятно, sto является следствием возникнэвеюи

л мг.и)лс1лив11н1)-маргскрОВаШШХ ксслвдовенных линиях.

М Д Г 2 М Д Г <

Л и Н т! и

1 * 1 Л. 113 40 6? 7В 19? 20 1Р ?В 9А 10А 10Б 11А 12А 12С1) 12? 15Е? 1бВ

4К с С П и а □ п

г; Н а гз и п а

п Г] а .13 - -

1+2 а п. а п С - -

а □ а с а а е а а □

□ а а а Г! с □ а а а

сЛ е з о а п - - - - 1 а 1 п

5Л4к/?й4 Л; о*1-'* еп*4 з П а я а ® а а а а, я □ а ш а с о

-о

Примечание. Темные квадраты - сайты гибридизации;

гфочерки - исчезновение соответствующих сайтов

гибридизации; стрелки - появление новых сайтов.

мутапий ЕЗ разных стадиях развития гаиет. Пучковый хара:<?( мутирования объясняется появлением мутации на премейотическс стадии гаыетогенеза. Таким образом, как и в случае саыс мутаторной лиши, одиночных мутантов, гак и в случае множественнь мутантов, свойство пучкового мутирования сохраняется.

III. Аяализ распределения мобильных генетических элементе при мутациоша; переходах во меожественно-маркированшн: линиях at13l:sE4i7m,y31d sc8 eta В и y1kw ct13ksn4k В. В этом случа проведено изучение локализации двух семейств мобильных влеиентоа МЦГ2 I! ВДГ4. Исследовались с амин-потомки от скредавани ицдиаидуальныг самцов линии y1lsW ct1^ken4lc/Plf4, sc8 dm В линии y1kw В с самками, имеющиш сцепленные Х-хромосода

лишш 3/С (1 )M,ji/Y. С использованием метода гибридизации in sit показано, что у мутанта y1iS? ct1^ksa4ic В, полученного в потомстн линии y1kw ct'3ksn4k/?Ji4,(im В МДГ2 не меняет своей локализации как к в самой родительской лишш. Однако для исследованных лини зафиксировано ш 2 сайта гибридизации МДГ4 s Х-хромосоме, цриче) только один аз низ оказался общи». Слэдопательно, для смей локализации ssoporo сайта гибридизации необходимо прохекденк! одновременно даух событий. Эксцизия ВДГ4 в старом сайге : интеграция копта ВДГ4 в новое место на Х-хро«осоме (табл.1). Tai как мутации, входящие в состав множественно- маркированных лишй вызваны разными мобильными элементами (МДГ2 и ВДЧ)» а мутациенны? перехода в них связаны с изменениями локализации ВДЧ, но не ЩГ2, мокво предположить, что мобильные элемента тала ретро гранено зоно! не взаимодействует друг с другом в процессе перемещения щя мутационных переходах. Полученные данные согласуются с данными не распределена) других семейств мобильных элементов в MS, которые такзе не меняет своих позиций в хромосомах, за исключением МДГ4 и hobo элементов (Ким, Беляева, 1990).

IV. Хромосомные перестройки в генетически нестабильной системе MS. Анализ хромосомных перестроек был прозе лен у особей гетерозигот по хромосомам MS и хромосомам линии дигого типа D32. Б качестве контроля использовалась линия SS, поскольку мутзторная линял ведет сЕое начало от этой линга. Бнло лроанаетзировано 143 клетки MS линии и 153 - SS. Установлено, что MS обладает поваленным уровнем хромосошшх аберраций в сравнение с контролем. Наиболее часто в перестройки вовлекаются 2-хромо«ш, 2L и 3L-плечи аутосоы. Самым распространенным типом аберраций являются делеции. Поскольку частота их встречаемости в MS гораздо Еыше, чем в SS, можно предположить, что они вызван» перемещением ЦЦГ4. Скорее всего ЩГ4 вырезаются полностью, захватывая при этом i соседние участки геЕов, в результате чего образуются делеиш. Следует отметить, что только в MS зарегистрированы транслокации и инверсии. Д.Лкмом (Lim, 1988) описано появление лвверсий в линии Uc, при этом в точках разрывов сохранились противоположно ориентированные hobo-влемэЕты, А.И.Кимом и Е.С.Ейляевой (ч590) показано, что в MS происходят перемещения двух секэйстз мобильшх элементов - ВДГ4 и hobo. Не исключено, что последний монет участвовать в появлении инверсий в MS. ?зкш образом, повышенный уровень хромосомных перестроек б MS связан с транспозициями мобильных элементов в 8той линии, а именно ВДГ4 и hoto.

Y. Генетический ааалпз поведения МДГ4 в отсутствии активного hobo-блеиента з ливкях, искусственно моделируздих MS. А.И.Кимсм и Е.С.Велягво$ (1991) при анализе хрсюсом индивидуальпнх особей мутаторноК линии (J3S) обнаружена гетерогенность распределения сайтов гибридизации элемента hobo. Наблюдались случаи сксцизии и транспозиции котай элементов двух семейств - ВДГ4 и hobo. Перекгдезгя копий елеиентов дауг семейств заблзод-элись как в половых, та;; и в соматических клетках. С цель» знявления возможного взаимодействия элементов, относяпцгхся к двум различным классам, были кеследозгш дзе линии, искусственно

Табп. N Раопрвдвпспп« различных типов аверрация по хромосомам МЭ линии и линчи ЭБ.

1 п ! «1 П Р1 Ч С1 п Рр Ч Ср п Т Ч т Число 1п Частота 1п

с они 1 1 1

мв Мб бэ НЭ гг ИЯ нэ БЭ Ив ЦБ ма МЭ бв! 1 ИЗ НЙ

X 6 1613 ш П, 3 13 1.961 9 09+ э 3 1 92± г, и - - 1 1 _ »

3 1 р .2 4 72 4 72 г а г,4 (

21 13 19 к 65 + 13, 381. 10 14 6 54* 9 79± 3 3 1 2.1± 1 0, 7± 1 1 1 0.71

4 45 5, 6 3 93 4 83 2 о 2,А 1, 53 * 1 1 7 ,53

211 Й 15 б 26+ ю. 8 в 5 2В + 5 59± _ б - 4 12± _ 1 0, 7 + 1 ( „

3 55 5. 04 3 5Б 3 78 3,3 V, 53 1 1 1

зь 10 17 в 11. 89 + 6 5 3 92± г 5+ 4 7 2,621 4,9+ 4 г, 8 + 1 1 1 0.7 +

3 93 5, зг 3 08 3 ог 2 54 3,65 г, 71 1 1 1 7,53

ЗЙ я го 3 26+ 13 991: 5 5 3 2б± 6, 29£ _ 9 6,29+. 2 1 41 1 1 _

г ,82 5 71 2 82 3 ,99 3,99 1 9 1 1 1

Примечание: п - число аберрация; ц - частота аберраций (%); Р1 - делеции;

Юр - дупликации; Т - транелокасии; Хп - инверсии.

моделирующие MS (125Í и 1451). Эти линии были заложены от индивидуальных трансформантов с мутацией 1, полученных при введении клонированной из MS копии №4 в реципиентную линию SS. Введение элемента осуществляли методом трансформации посредством МЕкроинъецирования в полярную плазму ранних эмбрионов молекулярных доноршх конетрукцзй, несущих полкоразмерный МДГ4 в составе вектора CaSpeR (Еектор на основе Р элемента) и плазмида-помоцника, обеспечиванцего активной трааспозазой. Установлено, что частота мутирования как в лшее 125Í, так и в линии 145Í выше, чем

в стабильной линии SS (10~°). Установленный уровень мутирования мог быть результатом нестабильности лишь МДГ4, тах как полноразмерный hobo-элемент в линии SS отсутствует. Полученные данные генетического анализа совпадают с результатами молекулярно-хитогенетических исследований. С использование«! метода гибридизации ln situ было показано, что в линиях 125Í и 145Í изменяется как тесло копий ВДГ4, так и их распределение в хромосомах, т.е. происходят активные трйеспоэзщеи этого элемента. Таким образом, транспозиции ВДГ4- происходят в клетках особей линий, не содеркалзос в своем геноме активных копий hobo-элемента, но и.'зщах условия для перемещения ЩЧ.

71. Изучение поведения ЦЩ'4 при взедении экзогенного активного fcobc-елененга. С цель» юзможеой мобилизации МДГ4 в присутствии hcbo-глемэнтг было проведено скре!цгшанис самок лабораторной линии 112Í, мутгция Í в которой обуслсзлзна янсерцией „'одноразмерной каши МДГ4, с самцами линии 23.5*HRF, содержащей кмшоцегшке копии hoto елекеата, но лишенного АЩР4 копий в сво»м геноме. Надо ответить, что в геноме линии 112? отсутствовали копии уставного ЬоЬс-элемепта. /Е&лгзировгли гибридах самцов на яюсобвость к реверсиям мутации ' Г. Данвнй показатель ;в1'детельствовал с ыобизшззцви VJW4- В качестве контроля на 'йототу реверпгрозавяя мутации Í были прозерены самцы исходной инк 1?2í. Установлено, что частота реЕертирования у гибридных

самцов и самцов линии 112Í бнла одинаковой - 10~4. Следовательно введение активного hobo элемента в геном линии, содержаще полноценные копии ВДГ4 не приводит к мобилизации етого МДГ4. Така образом, на основе полученных данных о способности МДГ4 самостоятельным перемещениям в отсутствии hobo влемента

Таблица 3. Частота ревертирования самцов двух типов.

Тип анализируемых самцов Число проанализированных самцов Число , реверсий Í Частота ревертирования

гибридные самцы 21054 2 0.9x10"4

самцы линия 1121 23167 3 1.3x10-4

неспособности hobo мобилизовать ВДЧ, можно утверждать, чтс транспозиции элементов двух классов МДГ4 к hobo осуществляются независимо друг от друга- Таким образом, вся совокупность свойст! MS и ее производных, по-видимому, монет быть объяснен; дестабилизацией ВДГ4-

Ш. Генетический анализ способности мутаторной линии к репарации натеска индуцированных повреждений генетического материала. Мутаторная линия связана по происхождению с линией,

' ¡м

неполноценной по репарации mus(1 )121 , полученной в результате обработки нитрозоаталмочевшой самцов линии SS. Эта линиí проявляла сверхвысокую чувствительность соматических клето? личинок 1 возраста к летальному действию МЫС (Асланян, Ким, 1981), что свидетельствует о неспособности .мутантов к репарацш

VI

повревдений ДНК. Свойство линии мутанта nus(1)121 по дефектно ста репарации могло иметь остаточные эффекты в мутаторной линии (WS).

С целью проверки возможной чувствительности к экзогенным мутагенным факторам MS был проведен эксперимент на чувствительность к ММС.

VII.1. Проверка на ММС-чувствительность Х-хромосоьа мутаторной линии. Мутагеном МЫС (0.1? водный раствор) обрабатывали кладки яиц, полученных при скрепдаании самцов мутаторной линии с самками B/C(1)RIi,y ifY, несущими сцепленные Х-хромосомы. В контроле использовали дистилированную воду. Данные опыта и контроля не отличались. Соотношение полов в обработанных кладках при использовании 0,концентрации ffflC соответствовало о кидаемому по Х-хромосоме распределению 1:1.

VII.2. Проверка на ММС-чувстзктедьность аутосом мутаторной линии. Для выявления ШС-чувствительноста аутосоы Ж использовали линию Si«5f0y/Pm; Tií2,Ubx/Sb. Эта лабораторная линия несет инверсии во всех аутосомах, использующихся как запирагеж кроссинговера. Из потомства. скрещивания самок егсй линии с самцами мутаторной линии проводили индивидуальные скрещивания самок и самцов с одинаковым фенотипом. В потомстве, полученном от каждой пары и обработанном 0.1% растаором ?А'С, учитывали соотношение фенотипов, указанных в таблице 5. Соотношение в F2 маркированных особей к немаркированным, в опыте и контроле не различалось, т.е. и в аутосомах MS не зарегистрированы детерминанты чувствительности к ШС. Из полученных результатов следует, что мутаторная линия не является чувствительной к ШС мутагену и, значит, имеет нормальные репарационные системы.

VIII. Изучение причин генетической нестабильности MS. Кимом и Беляевой (1989) было установлено, что линии SS и KS отличаются различным числом .копий ЩЦЧ. В линии SS не наблюдается транспозиций МДГ4 и зафиксировано лишь две аухроиатиновые копии, тогда как в IS регистрируется 30-40 активно перемещавдихся копий

Таблица 4. Влияние 0,1Jt раствора ШС на соотношение полов в линиях MS ж SS.

и о Эксперимент ?? 0я 0" Р%2 (1:1)

i* л р Опыт £025 2007 >0,05

Контроль 3721 3794 >0.05

Эксперименты проведены в 2 повторносгях,статистически не

Р

отличавдихся друг от друга (Р^ >0,05).

Таблица 5. Влияние 0,1? раствора ММС на соотношение

фенотшов в линиях MS и vs.

и о ¡i 0 й Эксперимент . Г е н'о т и п

Су БЪ; Су Ubz Су БЬ; Ubr + + РХ2(8:1)

0шт 12еб 768 712 353 >0,05

Контроль 1072 794 . 564 265 >0,05

Эксперименты проведены в 2 повторяостях, статистически не

о

отличающихся друг от друга ^ >0,05).

ВДЧ за гевоы. При изучении структурной организации клонирована:! копий ВДГ4 из SS и ЫЗ выявлены существенные различия линий нг уровне рестрикеннх карт. Копиц ЭДГ4 в ЫЗ (активные ксшш) несут внутренний Hind III - cafcr и Xba I и Pst I - сайты в длинных концевых повторах, отсутствунщйх у »<ДГ4 в SS (неактивные коша). С цель» выявления функциональных различий из MS и SS: выяскеккл ьозмсзны! причал «стабильности в Ш, лиж, а такие злияния

генетического окружения на мобильность подвижных элементов был прсзеден ряд экспериментов по генетической трансформации различных . линий.

ШГ.1. Повышенная эффективность трансформации мутаторной линии Drosophila melanogaster. В качестве рецшшентных линий были использованы следущие лабораторные линии, различающиеся по количеству копий ЦДГ4: SS - стабильная линия, являющаяся исходной для мутаторной линии и содержащая две неактивные копии ВДГ4; vg -стабильная линяя, не имеющая эухрсматиновнх копий ЩГ4; нестабильная мутаторная линия, содерхащая 30-40 активных копий МДГ4. Все использовапнне линии несут маркерную мутацию w в Х-хромосоме. В экспериментах использовали конструкции на основе: вектора CsSpeR, содержащего ген ;,ccr¡í-v?h.ite, ограниченного кокцевыми повтораш Р-алэмента, содержащего внутренние вставки ЦЦГ4, ВДГ1 или без втавки. В качестве вектора-помощника был использован вектор рЯ25.7те. Трансформацию проводили методом микрозшьэцировгния дэкорннх конструкций в полярную плазму дехорионизироваяннх эмбрионов, отобранных из синхронизированных 30-минутных кладок. В один эмбрион вводили „100 пкл раствора для инъекции, содержащего 500 мкг/мл донорной ДНК и 125 мгсг/мл р1С25.7»с. Отбор траясфэрмантов осуществляли по появлении цветной окраски глаз, что обусловлено экспрессией гена мшш-white. Частоту (эффективность) трансформации определяли как процентное соотношение числа трансфэрмантов (пучков трансформантов) к общему числу фертильшх мух Ро. Результаты экспериментов по микроиньецированив различных конструкций, приведенные в таблице 6, свидетельствуют о разной эффективности трансформации в исследованных линиях. Эффективность трансформации конструкциями CaSpeR и CaSpeR: :МДГ4 в линии SS имеют один порядок. В то же время этот показатель выше на порядок для линии MS. Частота трансформации линии vg сопоставима с эффективностью трзнсформзции линии w. В наших экспериментах показано, .что эффективность

Таблица 6. Эффективность трансформации линий дрозо$иж с разным числом копий НДГ4 конструкциями на основе вектора CaSpei..

Конструкции • Линии

w vg MS

CaSpeR без втавки 1.82 (1/55) 2.50 (1/40) 12.83 (5/39)

CaSpeE со вставкой МДГ4 3.57 (2/57) 6.45 (2/31)

CaSpeE со вставкой МДГ1 15.00 (9/60)

Примечание. В скобках: в числителе указано число трансфор-мангов (пучков грансфордантоЕ), в знэменателе-число фертилышх ¡¿ух io.

трансформации не определяется особенностями донорного фрагмента ДНК - трансформация примерно с одинаковой частотой осуществляется как CaSpeE, несущим встгвочную последовательность ДНК в виде мобильного элемента, так и без нее. Содержание вставк? такие не играет существенную роль: в одном случае (линия SS) в качестве вставки использован элемент ВДГ4, а в другом (Iß) - ЩГ1, однако Быяьленн8н закономерность сохраняется. Следовательно, эффективность трансформации определяется а данном исследовании молекулярно-генетическими особенностями рецигкентной линии. Как лравзло, эффективность трансформации зазисит от условий и техники проведения мккроннъехций, состава и концентрации вводимой ДНК, размера ДНК, а также соотношения ДНК транспозона и вектора-помощника (Spradling etal., 1S82; Rubin et al., 1983). 3 Haazz оксперзментах эффективность трансформации зависит от природа реципиентных линей. Высокая эффективность трансформации мутгторной линии свидетельствует, что последняя ьгагсет быть использована для

выяснения молекулярных и генетических механизмов генетической нестабильности.

VIII.2. Анализ доведения двух структурных подсемейств ЗДДГ4 в лабораторной линии SS. Для выяснения влияния хромосомного окружения, наличия малого числа копий ВДГ4 в геноме SS использовали две конструкция вектора CaSpeR: одна из которых содержит копию элемента gypsy из линии MS (CaSpeR 6i), другая содержит ксшш из стабильной линии SS (CaSpeR 7i). Молярное соотношение конструкций, содзржащкх 1ЩГ4 и pi25.7wc составляло 5:1, соответственно, йз результатов, приведенных в табл.7 следует, что эффективность трансформации при инъецировании вектора CaSpeR с двумя разягааю'лжсл вставками МДГ4 в стабильной линии SS не изменяется. Следовательно, введение активной копии МДГ4 из MS не приводит к ühsj'iBííz '¡-рансгазиций ?.ЩГ4, находящихся в геноме стабильней линии SS. Таким образом, причины генетической нестабильности, проявляемые мутаторной линией, вероятно, заложены в геноме самой линии. Возможно транспозиции МДГ4 з КБ линии происходят из-за нарушений генетического контроля, осуществляемого

Таблица 7. Эффективность трансформации линии SS конструкциями двух подсемейств ЩЦ74-

Конструкции Количество проанализщюв. иньецир. мух Число , случаев трансформации Эффективность трансформации

CaSpeRGi 77 1 1.30

СэйреШ 58 2 3-45

геномом мутаторной линик. Генетический анализ факторов, контролирующих процесс перемещений МКГ4, также показал

необходимость наличия ютя бы одной из хромосом МБ б геноме другой линии (Ким у. др., 1991). Предполагается, что транспозиции МДГ4 могли быть обусловлены мутацией (мутациями) б генах, контролирующих мобильность этого элемента, и находящихся в хромосомах МБ линии. Полученные в работе трансформанты могут бить использованы для исследований механизмов генной ехспрессии, а такие свойств генетической нестабильности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Таким образом, s данной работе прсведено генетическое изучение явления нестабильности, проявляемой мутаторной линией MS. В первой части работа изучено поведение мобильных элементов, принадлежащих к разхзш семейств^/: ВДГ2 и ЩЧ в мутат-орной линии и ее производных, несущи одиночное мутации, a Taies реЕертантов таких мутаций. Характер перемещений бтих мобильшх элементов изучался и во мьоаесгвеянс-мгрктровашгп. линиях, несущих мутации различной янезрцаозной природа, но бозьжеех в системе мутаторной линии. В результате исследований установлено, что непосредственную роль в образовании спонтанных мутаций, а такие ревзртировшш спонтанных мутацкй играют транспозиции мобильного влсмента ВДР^ (gypsy). При перемещении МДГ4 локализация ВДГ2 езтаетоя неизменной, что свидетельствует об отсутствии взапмодействяя этих двух семейете при транспозициях, кто согласуется с данными А.И.Кима и Е.С.Беляевой (1986), показавши., что локализация таких элементов как ЦДЛ, МДГЗ, 297, 17-6, copia, Beagle, ES, Doc, FB, Spinger и I сохраняет стабильность к aie в хроютссуах MS, так з ее мутацзонных производных.

Цитогенеитческий анализ политенаых хромосом елкнных. ьелез MS линии выявил поваленное содерагиие хроиссгкдщ перестроек ко сравнению с исходной лгшкей SS. Преооладаадр« тнпоа яашгэгея делэции. Наиболее чувствительной к хромосомные перестройкам

оказалась Х-хромссома. Такой повышенный уровень хромосомных аберраций монет быть обуслозлен транспозициями мобильных элементов. Известно, что хромосомные перестройки характерны для систем генетической нестабильности в условиях Р-М, I-R, Н-Е дссгенеза (Engels, 1938, Blactanan ex al., 1958).

Д.Лиыом (lim, 1988) на границах хромосолаых перестроек, возникающих в Uc-лиши, выгзлено наличие hobo-елеыентов.

После вяявлепил А.И.Кимом перемещений hobo-элемента в MS jiwh было нзучгно возможное взаимодействие двух семейств мобильных элементов ЦДГ4 и hobo из иутаторной линяи. Генетический анализ поведения двух елемептов в одного генетическом окружении выявил отсутствие какого-либо гзагмодэйствия двух изучаемых сенсяств hobo и МДГ4 з 2S. Таким образом, MS-системэ отличается от известных ранее наличием автоношшс транспозиций элементов отдельных семейств - МДГ4 л hobo (Кзш, Беляева, 1991; lim, Belyaeva, 1991).

В третьей части работн было исследовано три ' линии, различающихся по яатачип активкнх г.ошй ВДГ4. Оказалось, что 1® линия, содержащая в своем геноме 30-40 актявшх копий МДГ4 обладает поз&иенной вфЗйктгвнос'гью трансформации. При введении дау? различающихся подсемейств МДГ4 в гекси стабильной ленки w еффективностъ трансформация не превышала 3%- Следовательно, мутатсрная линия обладает особыми свойствами (механизмами), которые продают данной системе свойство нестао'ильшсти. Полученные трансформация в ходе экспериментов с использованием метода ■ микронЕьекща могут быть использовагы в молекулярно-биологических исследованиях г энной" ексцрессии, а raxse изучения двух подсемейств Щ[Г4, различающихся по структуре (Лвбс:.?ирскал и др., 1991).

- 20 -вывода.

1. При анализе перемещений МГЭ б системе генетической нестабильности MS установлено:

1.1. Б мутаторной линии происходят транспозиции лишь одного семейства ЩГ - ЩГ4 при неизменной локализации МДГ2. Перемещение МДГ4 мокко объяснить наличием' собственной системы транспозиции, не участвующей в транспозиции-элемента МДГ2.

1.2. Возникновение мутаций в мутаторной линии имеет иасерционкую природу, так как в исследованных мутантннх линиях мутации вызваны внедрением МДГ4 в соответствующие локусы.

! .3. Процесс ревертирования инсерционных мутаций, полученных в системе MS, происходит за счет вырезания ВДГ4 из мутировавшего локуса.

2. Бри анализе закономерностей поведения ВДГ4 во множественно-маркированных линиях, несущих несколько мутаций разной молекулярной природы и находящихся в генетическом окружении MS показано:

2.1. Мутирование во. многвственно-чаркированных линиях происходит на лремеЗотических стадиях сперматогенеза, о чем свидетельствует пучковый характер возникновения мутантов. Таким образом МДГ4 претерпевает массовые переведения на ргнних стадиях сперматогенеза.

2.2. При всех мутационных переходах, (от дикого аллеля к мутантному и наоборот), наблюдаемых в линиях, маркированных мутациями разной молекулярной природа, наблюдаются транспозиции лишь 1.ЩГ4-. Локализация УДГ2 остается посто'шной.

3. " Пс-рекешеш'л двух мобильЕпх анеиентов, относящихся к разным классам - М.ЩМ (ретроараЕсподсн) и hobo (трзнспозон) в мутаторной лтгши осуществляются незазкжо ,друт от друга. Вероятно, М£Г4 обладает автономной системой тракслоггщйи к ь:е зависит от сзстзм гибридного дкегенезэ. Причины генетической нестабильности KS линек пс-звдимсау, связан« .с регуляторзггда

механизмами, присутсТЕухцими 3 самой линии, а не наличием одного из структурных подсемейств МДГ4 в геноме MS.

4. Мутаторяая линяя характеризуется высокой частотой образовала хромосогжых перестроек, выявленных на уровне иолитещнх хромосом сланных келез личинок дрозофилы. Наиболее часто встрсчаицетгя тшом перестроек пзляатся делешш. Перестройки возникают во teex хромосомах, однако чаще других в них участвует Х-хромооома.

5. ¡/утаторнзя линия обладает повышенной эффективностью трансформации. При сравните льном анализе 3-х линий - не несущей эухромаишовых копий ?ЩГ4 (vg), несущей неактивные еухроматановпе копта НДГ4 (SS) п нестабильной мзогокошйной uo ЭДГ4 линии (MS) показано, чте независимо от типа молекулярной конструкции и типа заутренней вставки донорной ДНК, максимальная эффективность трансформации, отлгчгщэяся на порядок, характерна для нестабильной системы (MS).

Список, работ, опубликованвых по теме диссертации.

1. Ким А.И., Любоютрсхая Н.В., ИЬстак Н.Г., Худайбергенова Б.М., Барский В.Е., Ильян Ю.В. Нестабильная линия дрозофилы, характеризуадаяся транспозициями элемента МЦГ4. обладает повышенной способностью к генетической трансформации //ДАН СССР. 1991. T.317.Ä 1. С.215-218.

2. Ким А.И., Худайбергенова Б.М., Беляева Е.С., Асланян М.М. Транспозиции мобильного элемента МДГ4 при мутационных переходах в произзодннх мутаторной линпз дрозофилы // Вестник МГУ. Сер.16.Биология. 1991. № 4. С.66-69.

3. Худайбергенова Б.М., Кии А.И., Асланян U.M. Реверсии ин-серцаонных мутаций и транспозиции мобильного элемента МДГ4 в системе мутаторной линии дрозофилы // 1-ая Всесоюзная конференция по генетике насекомых. Тезисы докл. Москва, 1991. с.115.

Список работ, сданных в печать.

4. Kim A.I., Lyubomirskaya U.V., Shostak К.У., Arkhipova I.R., Khudaybergenova Б.М., Barsfcy "Y.E., Ilyin Y.V. High efficiency of genetic transformation of the Mutator Strain of D. melanogaBter characterized by genetic instability // Drosophila Information Service.

5. Как A.I., Khudaybergenova B.M., Belyaeva E.S., Aslanian М.Ы. ¡Transposition of mobile element gypsy and mutational charges in genetically unstable Mutator Strain of D. melanogaster // Drosophila Information Service.