Генетические процессы в культуре соматических клеток хлебных злаков - ячменя (Hordeum vulgare L.), твердой (Triticum durum Desf.) и мягкой (Triticum aestivum L.) пшениц

Гапоненко, Александр Константинович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Генетические процессы в культуре соматических клеток хлебных злаков - ячменя (Hordeum vulgare L.), твердой (Triticum durum Desf.) и мягкой (Triticum aestivum L.) пшениц
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетические процессы в культуре соматических клеток хлебных злаков - ячменя (Hordeum vulgare L.), твердой (Triticum durum Desf.) и мягкой (Triticum aestivum L.) пшениц"

г 7и / ч V

РОССИйСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ РАСТЕНИЕВОДСТВА имени Н. И; ВАВИЛОВА

На правах рукописи УДК 575:576.535:633.1

ГАПОНЕНКО Александр Константинович

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В КУЛЬТУРЕ СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК ХЛЕБНЫХ ЗЛАКОВ — ЯЧМЕНЯ (HORDEUM VULGARE L.), ТВЕРДОЙ (TRITICUM DURUM DESF.) И МЯГКОЙ (TRITICUM AESTIVUM L.) ПШЕНИЦ

Специальность: 03.00.15 — Генетика

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

1992

Работа выполнена в институте общей генетики им. Н. И. Вавилова Российской Академии Наук и в Центре «Биоинженерия» Российской Академии Наук.

Официальные оппоненты: член-корреспондент АН Республики Беларусь, доктор биологических наук Н. А. Картель; доктор биологических наук, профессор С. А. Гостимский; доктор биологических наук, профессор Ь. В. Ригии.

Ведущее учреждение — Институт Цитологии и Генетики Сибирского Отделения Российской Академии Наук.

Защита состоится 1992 г. в час.

па заседании Специализированного совета, шифр Д 020.18.02 при Всероссийском научно-исследовательском институте растениеводства имени Н. И. Вавилова по адресу: 190000, Санкт-Петербург, центр, ул. Герцена, ' 44, ВИР.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института растениеводства им. Н. И. Вавило-

ва.

у г

Автореферат разослан »

Ученый секретарь Специализированного совета

Э. А. Гончарова

1992 г.

поесч^тк-л- .

"fit bCTCÍH'1 fl>i I

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

Зерновце злаки являются важнейшими сельскохозяйственными культурам;! и составляют основной продукт питания для населения всего. земного шара. Она относятся к однодольным растениям семейства

Gramínea, бИОЛОГИЧССКИе ОСОбеННОСТИ КОТОрЫХ СуЩОСТВвШЮ ОТЛИЧАЮТ

их от моделышх объектов культуры клеток растений, которыми явля-ютявляются представители двудольных растений семейства Solanacea - табак, петуния, картофель, томаты. Закономерности морфогенеза и изменчивости генома in vitro, выявленные для видов семейства Solanacea, не могут быть приемлем для ячменя, и пшениц.

Поэтому необходимо фундаментальное изучение генетики соматических клеток и растений, регенерированных в культуре клеток, для понимания основ функционирования генома злаков в условиях in vitro и для создания теоретической базы биотехнологии этих важнейших сельскохозяйственных культур.

Фенотипическое отличие растений, регенерированных in vitro, от исходных растений было впервые показано в 1967 Р.Г.Бутенко с соавторами на табаке. Начиная с начала восьмидесятых годов, когда появились первые работы, показавшие возможность культивирования соматических клеток мягкой пшеницы (Shimada and Yamada, 1979; Ah-lowalia, 1982; Ozlas-Akino, Vasil,1982; ГаПОНеНКО И Др., 1984), ячменя (Cheng and Smith, 1975; Картель и Манешина 1977), твердой пшеницы (Bennici, D'Amato,197S; I и регеперации из культивируемых клеток растений, происходит интенсивное накопление фактов о наличии такой изменчивости у злаков. Феномен генотипической вариабельности регенерантов получил название сомаклональной изменчивости ти (Larkin and' Scowcroft 1981). Известен ряд работ, посвещенных изучению данного феномена на мягкой пшенице (Larkin et ai.,1984; Maddock et al., 1985; Cooper et al., 1986; Ryan et al.,1987; Га-поненкоидр., 1986, 1988; Омельянчук и др., 1990). Сомаклональ-ная изменчивость ячменя и твердой пшеницы практически не исследована из-за трудности регенерации этих видов растений in vitro.

Изучение механизмов вызывающих сомаклональную изменчивость у однодольных растений представляется фундаментальной проблемой генетики, решепие которой имеет также важное прикладное значение для разработки основ биотехнологии хлебных злаков. Назрела необходимость решения проблемы управления стабильностью и изменчивостью генома злаков m vitro, поскольку для селекции важно получе-

нив наибольшего разнообразия регенератных растений, как источника исходного материала, а при создании трансгешшх растений необходимо сохранение константности исходного генотипа, которая также важна для сохранении ценных генотипов в условиях клеточных банков и при мякроклональном размножении.

Изучение генетических процессов в культуре клеток, влияющих на стабильность генома возможно различными путями: выделением биохимических и других мутаций, возникающих в соматических клетках, и выяснением природы этих мутаций; исследованием цитогенетических процессов в культивируемых in vitro клетках; изучением генетики растений-регенерантов, так как их генотип в сравнении с генотипом исходного растения должен отражать процессы, протекающие в клетках при культивировании и регенерации из них растений. Необходимы молекулярно-генетическио исследования клеточных клонов и растений -регенерантов для определения роли молекулярно-генетических процессов в возникновении сомаклональной изменчивости злаков.

Определение частоты возникновения и спектра сомаклональной изменчивости, возникающей в соматических клетках злаков, , на разных уровнях организации генетического материала, которая реализуется в растениях-регенераитах, может выявить главные- причины возникновения сомаклональной изменчивости у зерновых злаков.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было изучение причин возникновения сомаклональной изменчивости у хлебных злаков, выяснение факторов, влияющих на стабильность генома в условиях in vitro, и определения возможности создания на ее основе ценного селекционного материала. Конкретными задачами были:

1.Разработать высокоэффективные системы регенерации растений ячмоня, твердой и мягкой пшениц in vitro. Для этого определить факторы, влияющие на частоту индукциию морфогенного каллуса и регенерации растений. Исследовать соматический органо и эмбриогенез

ЗЛаКОВ in vitro.

2.Выявить сомаклональные варианты по количественным признакам и маркерным признакам, используя в качестве биохимических маркеров проламины и изоферменты. Определить зависимость величины сомаклональной изменчивости от генотипа и времени культивирования.

3.Провести генетический анализ некоторых сомаклонов для оп-"редодения характера наследования возникших изменений.

4.Исследовать цитогенетические и некоторые молекулярные про-

цессн, протекающие в клетках каллусных культур, для определении роли этих процессов в возникновении сомаклональной изменчивости у злаков.

.5.Разработать рекомендации по получению сомаклонов зерновых злаков для селекции и использовании культуры соматических клеток хлебных злаков для создания трансгешшх растений.

Научная новизна и практическая ценность. При выполнении поставленных 'задач нами были разработаны методы получения и ведения культуры соматических клеток ячменя, твердой и мягкой пщениц и регенерации из них растений. Впервые в нашей стране разработаны способы массовой регенерации злаков in vitro.

Показано стимулирующее влияние пара-аминобензойной кислоты (ПАБК) и рентгеновского излучения на индукцию морфогенного каллуса и регенераций растений твердой и мягкой пшениц. Определены оптимальные дозы для обработки донорных растений.

. Показано, что процесс регенерации растений злаков in vitro происходит как путем соматического эмбриогенеза, так и органогенеза.

Впервые на обширном материале исследована сомаклональная изменчивость ячменя и твердой пшеницы. Показана зависмость частоты сомаклональной изменчивости в зависимости от генотипа и.времени культивирования. Установлена изменчивость растений-регенерантов ячменя и Мягкой пшеницы по хозяйственно Ценным признакам, изофер-ментному-составу эстераз, по компонентному составу глиадинов мягкой и твердой пшеницы. Установлено, что частота сомаклональной изменчивости у мягкой пшеницы на порядок выше, чем у твердой.

При анализе наследования изменчивости по изоферментному составу составу эстераз у сомаклонов ячменя и компонентному составу глиадинов у твердой и мягкой пшениц в sc3 впервые обнаружено наличие нестабильно наследуемых изменений.

Впервые-исследованы цитогенетические процессы, протекающие в каллусных культурах, методом дифференциальной окраски хромосом. Показана изменчивость распределения гетерохроматина по длине ме-тафазных хромосом в клетках НМК твердой пшеницы которая заключалась в увеличении, уменьшении и слиянии теломерных, а также инте-ркалярных сегментов.

Впервые показано изменение характера метилирования рибосома-льной ДНК в длительно культивируемых каллусах ячменя. Показано, что внутри повторов рДНК, во время культивирования, происходит

сайт-специфичное деметилование рДНК.

Получены сомаклоны ячменя и мягкой пшеницы с хозяйственно-ценными признаками, использованные в селекции этих культур Казахским научно-исследовательским институтом земледелия им И.Р.Випья-мса. Так, у сорта Московский 3 выделены сомаклоны, отличающиеся крупным колосом, высокой озерненностью, короткой соломиной, высокой продуктивной кустистостью (Искаков и др. 1988). Созданные на базе сорта Заря сомаклокальные варианты оценивались в четырех экологических пунктах юга Казахстана и на искусственнм инфекционном поле. По результатам кластерного анализа по 15 элементам продуктивности выделен ряд генетически различаемых кластеров,которые прошли испытания в контрольном питомнике. По результатам экологической оценки 549 сомаклональных линий, полученных от сорта Родина, и 492 от линии АД20/47 и кластерного анализа по 13 количественным признакам выделены 43 мастера для селекционного использования (Шегебаев.Воронкова, 1988).

Апробация работы.

Основные результаты, работы обсувдались и были представлены на различных Мевдународных и Всесозных конференциях, симпозиумах и семинарах в том числе на: международном симпозиума "Культура кле-ток и тканей - применение в улучшении растений."( Оломоуц, Чехословакия, 1984 г.), на Всесоюзных конференциях "Новые направления биотехнологии" (Пущино,1984 и 1986 г.), на Всесоюзном семинаре "Научно-производственная интеграция в селекции.", (Москва, 1986г.), на VI мекдународом конгрессе по культуре клеток и тканей (Миннеаполис,США,1986 г.), на Всесоюзной конференции ло генетике соматических клеток в культуре (Звенигород, 1986 г.), на семинарах в лаборатории др. Нам Хай Чуа (Рокфеллеровский университет, Нью-Йорке, 1987 г.), в лаборатории др.Т.Марби (университет штата Техас, Остин, США, 1987 г.), на Республиканской конференции "Га-метная и зиготная селекция растений" (Кишинев, 1987 г.), на XIV международном ботаническом конгрессе (Берлин, 1987 г.), на V съезде Всесоюзного общества генетиков и селекционеров (Москва, 193?г.), на семинарах Института общей генетики им Н.И.Вавилова АН СССР (Москва, 1984-1988 г.), на Всесоюзной конференции по биотехнологии злаковых культур ( Алма-Ата, 1988 г.), на 6-ом конгрессе федерации Европейского общества физиологов растений (Сплит, Югос-оАавмя) в 1988 г., на семинарах и заседаниях Центра Биоинженерия РАН (Москва, 1989 - 1992 г.). 6

Структура работы. Диссертация изложена в настоящей работе в форме научного доклада, список опубликованных по теме диссертации работ включает 27 наименований. Основная часть результатов получена, в соавторстве с А.Р.Искаковнм, Г.Н.Охрименко, С.А.Бабаевой, IT.Ф.Петровой.I Выявление характера метилирования рДНК у гормон-независимых клеточных линий ячменя выполнена совместно с Ц.Хвыр-левой в лаборатории Е.В.Ананьва. Вклад других соавторов отражен в публикациях по теме диссертации. Всем коллегам автор приносит глубокую благодарность за участие в совместных работах.

На защиту вынесены следующие основные положения!

1.У злаков, система индукции морфогешюго каллуса и регенерации растений, основанная на использовании незрелых зародышей на определенной стадии развития, является наиболее эффективной. Регенерация растений в кульуре in vitro происходит как путем соматического эмбриогенеза так и органогенеза.

. 2.Сомаклональной изменчивость является эффективным способом получения генетической изменчивости хлебных злаков.

3.Вывод об отсутствии значимого вклада геномных (полиплоидия и анеуплоидия) и хромосомных мутаций в возникновение сомаклональ-ной изменчивости у злаков.

4.Рабочая гипотеза о роли метилирования в возникновении нестабильно наследуемых сомаклональных вариантах.

Материал и методы исследований.

Ячмень. Использовали районированные сорта и линии ярового ячменя: Московский 121, Московский 3, Нутапс 518, Носовский 9, Одесский 100, Илийский, линию к-19275, несущую мутацию "вакси". Реципрокные гибриды Московского 121 и Московского 3 с к-19275. Для обеспечения чистоты исходного материала семена проверялись на линейную типичность по компонетному составу гордеинов, выявляемому методом электрофореза.

Твердая пшеница. Были использованы 2 сорта твердой пшеницы: Джафари и Кызыл бугда, районированные в Азербайджане. Для использования в работе однородного генетического материала биотипы каждого сорта были отобраны по компонентному составу глиадинов. Для этого зерновки разрезали на 2 половинки. Зародышевая часть использовалась для репродукции.семян, другая часть для электрофорети-ческого анализа глиадинов.

Мягкая пшеница. Использовали следующие линии и сорта мягких пшениц: чистую линию (дигаплоид) АД 20/47, полученную В.М.Суха-

новым из культуры пыльников Саратовской 52 и сорта, созданные дуц различных зон СССР - Родина, Белорусская 80, , Таежная, Шираки, Камышинская. Озимые пшеницы представлены сортами Заря, Мироновская 808, гибридом Мироновская 808 х Безостая, пшенично-пырейными гибридами, радиомутантом 32566, полученным из Мироновской 808. Линейная чистота материала проверялась по компонентному составу глиадинов, определяемому методом электрофореза в ПААГ.

Полевые исследования.

Донорные растения и потомство регенерантов выращивали на полях НПО "Подмосковье а первичные растения-регенеранты в теплице. При анализе сомаклонов использовали номенклатуру, предложенную Ларкиным и Скоукрофгом - первичные регенеранты обозначили как sCj, а их самоопыленное потомство sc2, sc3 и т.д. (Larkm, Scowcroft, 1981). Для получения второго поколения семена каждого -колоса SCj высевали в поле по семьям на рядки длиной 1 м. при междурядье 15 см., из расчета 20 семян на рядок. При выращивании второго поколения в теплице из каждого колоса высевали по 10 зерен в вегетационный сосуд. Семьей считали потомство одного колоса SCj. Все растения, отобранные во втором поколении, высевали в sc3 на делянках длиной 1 и., при междурядье 15 см. по 30 -семян на рядок. В каждом поколении через 10 рядков регенерантов высевали один ряд исходного генотипа - контроль.

Для предотвращения переопыления исходные растения и регенеранты изолировали перед цветением и во время 'цветения, надевая пергаментные изолятор!. Во втором и третьем поколениях изолировали по 3 колоса кавдой семьи. Изоляторы надевали на 1 колос растения. Отбор морфологически измененных форм вели, начиная с первого поколения. Все растения с отклонениями высевали в полевых условиях для проверки наследования полученных изменений.

Методика цитогенетических и цитологических исследований.

Анализ цитогенетических процессов, происходящих в культивируемых m vitro клетках, проводили на каллусах разного срока культивирования, начиная со дня посадки зародышей на среду. Для цитологического анализа регенерантов использовали меристемы корешков. Таким образом, цитогенетический анализ состоял, в основном, из следущих разделов исследования: 1) незрелые зародыши со щитком в момент посадки на среду; 2) каллусы ячменя и твердой пшеница' различных сроков культивирования; 3)корешки регенерантов при внсадко их из пробирок в перлит; 4)корешки проростков первой се~ 6

менной репродукции регенерантов sc2. Объекты перечисленных-вариантов исследования фисировали в ацетат-алкоголе по Карнуа 3:1 в течение 24 часов. Во избежания артефактов зародыши и каллусы не подвергали предфиксационной обработке, воздействующей на митоз.

Корешки растений-регенерантов, перед фиксацией обрабатывали 1,5 часа 0,2% раствором колхицина и 1,5 часа холодной водой .при Т°+2°С. Для каллусов предфиксационную обработку не применяли. Окраску хромосом проводили по Гимза <Iordansky et all, 1976 1 и Фе-льгену, ядрышки красили серебрением ПО Хизум (Hizuma et al., 1980). Измерение длин хромосом проводили па микрофотографиях при помощи измерительной линейки wild с ценой деления 0¿1 мм.

Зародыши в момент посадки на среду и каллусы с зонами морфо-геза фиксировали в ФСУ (формалин-этиловый спирт-уксусная кислота), обезвоживали и заливали в гистопласт. Срезы толщиной 7-10 микрон окрашивали гематоксилином Эршиха и по Фельгену. Для исследования процесов морфогенеза и регенерации растений на сканирующем электронном микроскопе ткани фиксировали 4 часа в 2.5s глюта-ровом альдегиде при pH 7,2 на фосфатном буфере и далее в is тет-роокиси осьмия. После обезвоживания проводкой по серии спиртов до абсолютного алькоголя ткани высушивали методом перехода критической точки, напыляли золотом и исследовали на сканирующем электронном микроскопе Филлипс 501 при 20, 40, 80и 160 кратном увеличении.

Электорофоретический анализ пролаиинов и изоферментов эсте-

разы, алкогольдегидрогеназы (АДГ), глутаматдегидрогеназы

(ГДГ).глутамат-оксалоацетат трансаминазы (ГОТ).

Электрофорез ГЛИЭДИНОВ ПРОВОДИЛИ ПО Бушуку (Bushuk, Zillm-

ап,1Э79). Электрофорез зоферментов эстеразы, АДГ, ГДГ и ГОТ проводили ПО Харту (Hart, 1974).

Методы статистического анализа.

Все дашше проведенных исследований обработаны математико-статистическими методами по Плохинскому (1970). Достоверность разности частот индукции морфогешшх каллусов между разными генотипами, а также между вариантами обработки ПАБК и контролем определяли по критерию Стьюдента. Достоверность характера расщеплете при генетическом анализе определяли методом "хи-квадрат" (х2 ). Достоверность различия между распределениями регенерантов по количе-твенным признакам использовали критерий лявда (\) Колмогорова.Данные структурного анализа Обрабатывали на ЭВМ Mera Coman 125/Sm 4

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ . 1 .РАЗРАБОТКА СИСТЕМЫ РЕГЕНЕРАЦИИ РАСТЕНИИ ЗЛАКОВ IN VITRO.

1.1.Влияние типа экспланта и состава культуральной среды.

У двудольных образование каллусной культуры ивдуцируется из дифференцированных клеток паренхимы, колленхимы, эндодермы и пе-рицикла, (Дмитриева 1981). Управление морфогенезом возможно изменением соотношения ауксинов и цитокининов в культуральной среде (Skoog and Miller 1957 1. Для злаков эта система оказалась непригодной, поскольку злаки in vitro практически независимы от экзогенных цитокининов. Для индукции каллуса необходимо наличие в культуральной среде синтетического ауксина - 2,4 дихлорофеноксиук-сусной кислоты (2,4 Д). Регенерация растений происходит при удалении 2.4 Д ИЗ среды (Shimada, 197В). Кроме ТОГО ОКаЗЭЛОСЬ, ЧТО клетки злаков, по мере прохождения растением онтогенеза, теряют СВОЙСТВО тотипотентности (Wernike, Brettell,19S0 1. 1

Нами изучено влияние различных факторов, влияющих на частоту индукции морфогенного каллуса (МК) и регенерацию растений у разных генотипов ячменя и пшениц: сред - Грина и Филлипеа; Гамборга; Линсмайер и СкуГ! возраста незрелых зародышей! различных комбинаций цитокининов и ауксинов.

Показано, что частота каллусогенеза выше у зародышей старшего возраста, но частота индукции МК и регенерации растений выше при использовании зародышей на более ранних сроках развития. Для пшениц оптимальной средой для каллусогенеза и регенерации растений является среда линсмайер и Скуг, для ячменя среды Гамборга и модифицированная среда Мурасиге и Скуг (Гапоненко и др.,1985s Ле-сова и Гапоненко 1988).

1.2. Индукция каллусообразования и регенерации растений в . зависимости от генотипа.

Межвидовой и внутривидовой полиморфизм злаков по способности. к органогенезу in vitro прослеживается при сравнении результатов регенерации растений различных сортов и линий (Табл.1- 3). Частота индукции морфогенного каллуса и регенерации растений достоверно отличается между сортами внутри вида и между видами. Наши данные (Гапоненко и др. 1984, 1985, 1986) хорошо согласуются с работами зарубежных И отечественных авторов (Sears, Deckard 1982; La-t&t et al. , 1933; Maddock et al.,1983; ДжерДбМалиеВ И Др., 1985, Банникова и др. 1985).

Наиболее трудными объектами культуры клеток хлебных йлаков являются ячмень и твердая пшеница. Для многих генотипов ячменя не удается получить даже индукцию каллуса (Hanzel et al.,1985I. При индукции каллуса твердой пшеницы из мезокотиля удавалось получить регенерацию растений ТОЛЬКО ИЗ первичного каллуса (Bennlci, D"Amato, 1978). Наиболее отзывчивой культурой in vitro является мягкая пшеница.

Таблица 1.

Зависимость частоты индукции морфогенного каллуса и регенерации растений ячменя от генотипа (1-8 пассажи).

Кол-во Получено каллусов Из них морфо- ПолуГенотип эксп- всего Частота кал- генетитических чено

лантов лусогенеза.ж всего частота растен,

Московский 3 190 111 58,5±4,7 27 24,3-4,i 118

Одесский 100 674 429 63,6-2,3 .70 16,3-1,2 110

Московский 121 565 490 86,7±1,5 50 10,2-1,4 74

Носовский 9 247 139 56,5-4,2 6 4,3-1,6 8

Нутанс 518 203 ' 104 51,5-4,9 7 6,7±2,3 14

Илийский 362 190 52,5-2,6 3 1,5±0,8 4

К-19275 200 81 40,3±3,5 4 4,9-2,3 7

К-19275ХМ-121 64 46 72,1-6,6 ■ 3 6,5-3,7 1°

К-19275ХМ-3 140 120 85,7-2,9 4 3,3-2,6

М-121ХК-19275 47 . 40 89,1-5,2 2 5,0±3,1 -

М-ЗхК-19275 ' 47 34 72,3-6,5 2 •5,8-4,0 -

Таблица 2.

Зависимость частоты индукции морфогенного каллуса и регера-ции растений мягкой пщеницы от генотипа (1-3 пассажи).

Кол-во Получено каллусов Из них морфо- Получено

Генотип эксп- всего Частота кал- генных растений

лантов лусогенеза.г всего частота

Родина 204 195 95,5-1,5 100 51,3-3,6 159

АД20/47 207 177 85,5-2,5 . 67 37,9±3,6 591

Белорусская 80 206 189 91,7-1,9 • 61 32,3-3,4 88

Эритроспермум 180 150 83,3-2,8 72 48,0±4,1 67

Камышинская 208 202 97,1±1,2 101 50,0±3,5 378

Шираки 165 145 87,9-2,5 31 21,4-3,2 8

Таежная 224 206 91,9^1,9 75 31,5-3,2 479

Заря 115 98 85,2-3,3 33 33,7-4,7 165

1.3.Стимулирующие действие параашшобензойной кислоты и рен-■ тгеновского излучения на индукцию ыорфогенатических процессов In vitro.

Определив наиболее оптимальный тип и возраст акспланта и состав сред для культивирования и регенерации растений, мы, тем не менее, столкнулись с проблемой получения морфогенного каллуса и регенерантов для некоторых генотипов ячменя, мягкой и особенно твердой пшениц. Поскольку в нашем распоряжении оставался только один управляемый фактор, влшгаций на частоту индукции морфогенного каллуса - состояние клеток акспланта в момент посадки на среду, мы провели поиск факторов, влияющих на генетико-физиологачес-кое состояние акспланта.

Известно, что ПАБК является биологически активным соединением, не вызывающим мутагенного действия (Шангин-Березовский, 1983). ПАБК участвует в синтезе фолиевой кислоты и действует как витамин. Также известно, что рентгеновское излучение в малых дозах может вызывать стимулирующий аффект на ряд биологических процессов.

Нами было показано, что при обработки колосьев донорных растений на 2 - 6 дни после начала цветения 0,1% раствром ПАБК или рентгеновским излучением в дозе 3 - 6 Гй частота индукции морфо-нного каллуса и регенерации растений увеличивается (Охрименко, Гапоненко и др.,1986, 1988).

. 1,3. Изучение иорфогенетических процессов при индукции каллуса ц регенерации растений.

При посадки на среду 10-14 дневный зародыш состоит из щитка и собственно проамбрио, включающего апикальную меристему проростка и точки роста корней. Анализ митотической активности в различных зонах зародыша показал, что в момент посадки, клетки собственно проамбрио активно делятся, имея митотический индекс 4* В атот же момент митотическая активность клеток щитка составила 0,011, т.е. клетки щитка практически не делятся. Уже на рторой день культивирования происходит резкое изменение распределения митотической активности в различных зонах зародыша. В собственно проамбрио отмечается снижение митотической активности до 2,5%, в то время как митотический индекс клеток щитка увеличивается до 5,5%, т.е. возрастает в 50 раз. Митотическая активность сосредоточена в Ъйитвлиальном и субагштолиальном слоях клеток,-где на третий день культивирования хорошо просматриваются зоны активной пролифера-12

Таблица 3. Влияние ПАБК на индукшго каллусогекеза, а также ва процесс морфогенеза твердой гпгенида.

¡Вреуя ¡обоа-¡Йотки

¡ТЭ-OOV

gjn^EK °s vac.

Кол-

-BO

пкс-

план-

TOE

Получено каллусов

Кол-во

Частота t

Из них морг{юген-шх каллусов

Кол-во

Частота <

д-с-то-верность

Ыорфогекные каллусше линии с регекерационной способность!)

.1 пассгж

II пассаж

Кол-

-Е0

Часто-:Дос- ¡Кол-та ¡то- ¡-во а ¡вер- ¡ ¡кость¡

Чacтo-¡Дoc- Jiiojr— та ¡то- ¡во <г ¡вер- ¡ ¡ность!

: Ч г

¡III пассаж^!

пасся*

Час-^Кол^Час-то- ¡-во ¡то-та ¡ ¡та

< : : <

sr 0 sJIkoh.

В 3 ■§5 is

> 24

149 144 99,3

90 90 100,0

62 62 100,0

56 56 100,0

136 80

88,9

93,5 1,19

58 80,4 1,44 45 90,4 0,29

36 38 22

43.4

45,0 0,15

65.5 2,18' 43,9 0,43

1.5

3 3,7 0,12 7 12,1 3,28' 2 4,4 0,51

1.2

8,6

0 5 0

8,6

1.1? 16

гаю;

32 44 24

32 100,0 44 100,0 24 100,0

29 90,6 44 100,0 1,62 21 87,5 0,33

29 42 16

100,0 95,4 76,2

1.41 2,17*

6 10 3

20,7 22,7 14,3

0,09 0,21

0 10 I

22,7 4,8

0 9 0

20,4

* — достоверно соответственно на уровна значимости 0,0Ь.

а»

ции. В дальнейшем визуально легко прослеживается, что образование меристематических центров каллусной ткани происходит за счет эпителиальных слоев щитка, а клетки слоев,контактирующих с прозмбрио увеличиваются в раачерах и теряют характерные черты, присущи клеткам мористем.

Те меристематические центры, которые возникли из клеток апи-дермального и субэпидермального слоев формируют морфогашый каллус, способный к регенерации растений. Митотическая активность сохраняется в поверхностных слоях такого каллуса. Сами клетки имеют характерные особенности. Они все связаны между собой общими ■ клеточными стешшми образуя единую ткань.

Совершенно другую структуру имеет неморфогенная меристема. Прожде всего она расположена глубоко внутри каллуса, будучи покрытой вакуолизировэнными клетками. При выходе из неморфогенной меристемы клетки формируют паренхимную часть каллуса. Клетки паренхимы имеют характерные особенности: сильно вакуолизированы; полностью теряют способность делиться; клетки изолированы друг от друга, т.е. не имеют общей клеточной стенки; легко отделяются друг от друга.

Изучению процесса регенерации растений хлебных злаков посве-щено ряд работ (Ог1аз-Ак1пз, УазИ, 1962; Мапеиззоп, Богптап, 1985), в которых показано, что для злаков характерно возникновение двух типов каллусов - морфогенного (МК) и неморфогенного (КМК). Эти типы каллусов легко различимы визуалЬно. Для МК характерны признаками являются твердая консистенция, бело-желтоватый цвет, глобулярная структура. НМК прозрачный, водянистый, легко рассыпается на отдельные клетки.

Регенерация растений злаков происходит только из МК, путем соматического эмбриогенеза. Формальными критериями которого является образование в каллусе под воздействием 2,4 Д биполярных структур - соматических эмбриоидов, имеющих апекальные меристемы побега и корня. _

При проведении собственных исследований мы обнаружили, что несмотря на преобладание соматического эмбриогенеза при регенерации растений мягкой пшеницы имеет место и процесс органогенеза -образование листовых структур, способных к развитию в побег и образованию корня при воздействии ауксина (ивдолилуксусной кислоты) ЧГапсдаенко, Голубева, 1986).

Развитие листовой пластины начинается с закладки приморди-

I ч' ' Л .«С». V4 V I

Л. '; , •

.....л\ .::•'■

I-

л к^..

г;

г . 4

. -Ч _ V V

Ч " л «

■ . рлу

.к^лг ■ ' \ г

...........:: •••""Т-

•■' 1

'V г-,.: .....Л ' ■ *

£ I.

/ I. - ......

4 ' I \ V ' ■ ! •• '•:■<

^ • ■ V, '"У '

► V ■ . .' ' V "" Д- 5 У' -''Г"/'.' ' ...-...*

, 'У."-'- 1

Ь -••_—а2-

Рис.2. СканируюииЯ электрошшЯ микроскоп. Микрофотографии ироцоссов регснорации растош1й. а и б - различные типы морфоген-ных каллусоп с зонами морфогенеза; в - закладка примордиальных валиков (ПВ); г - соматические эмбриоиды (СЭ); Д - соматический эмбриоид; е - развитие листовой структуры. Масштаб дан внизу мик-крофэтогрфий - один штрих - 1 микрон.

ального валика, образуемого мористематическими клетками на поверхности ШС. По море пролиферации клоток и перехода к росту растяжением валик превращается в листовую структуру, имеющую проводящие пучки. При основавании листа часто возникают соматические зм-бриоиды. Соматический эмбриогенез, имеет как правило, множественный характер, который заключается в возникновении не одного, а ряда соматических эмбриоидов в определенных зонах МК (рис.1 - 3)

Рис.1, а - поперечный; б - продольный срезы зародыша на 7 день 1п VI¿го; в - поперечный срез зародыша В области корешка на 14 день культивирования; г - 30 дневный каллус. Стрелками обозначены МК с поверхностной меристемой и НМК с меристемой в глубине каллуса; внешний вид:д - неморфогенного каллуса; е - морфогениого каллуса.

i ' ■ г.'

Рис.3.Развитие листовой структуры: а - внешний вид! б -

продольный срез.

2. СОМАКЛОНАЛЬНАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ХЛЕБНЫХ ЗЛАКОВ.

Сомаклональная изменчивость изучалась на растениях-регенера-нтах, получешшх без применения воздействия рентгеновского облучения на донорнне растения.

2.1. Соиаклональная изменчивость ячменя.

2.1.1.Изучение иорфолргических и количественных признаков в , ЗС2 И ЭС^ .

Среди растений-регенерантов, получепных из каллусных культур с высокой частотой встречаются летальные хлорофильные мутанты. Это явление наблюдалось различными авторами на ячмене, пшенице и тритикале (Па1е',ПеатЬгог1о,1979; Со1с^в 1п, Кгопз1ас1,1 966; Ананьев и др.1986). Авторами было показано, что причиной появления.хлорофильных мутантов является делеция хлоропластов ДНК.

Таблица 4.

Частота хлорофильных мутаций у растений-регенерантов ячменя.

Генотип Московский 3 Московский 121 Одесский 100 Носовский 9 Ну тане 518

Получено регенерантов 118 71 110 8 14

Из них хлорофильных мутантов Всего Частота,!

9 7,6±2,4

18 24,3-4,9

10 9,1±2,7

2 гб.О^б.в

3 21,4±10,9

В SCt среди растений достигших полной зрелости, отмечена высокая стерильность, изменчивость по морфологическим признакам: супротивное расположение листьев, появление антоциановых полоо на зерновках, ветвление колоса и стебля. Регенеранты первого поколения показывали большой полиморфизм по высоте растений, размеру и плотности колоса, количеству междоузлий. В зс2 морфологиченские изменения, отмеченые в SCj не наследовались (супротивное расположение листьев, ветвистость колоса и стебля). Однако были обнаружены изменения, не наблвдавшиеся в sct. Были обнаружены голозерные и полуголозерные формы. Как в SCj так и в sc2 среди сомакло-нальных линий сорта Московский 3 с частотой 0,67-и 1,09* соответственно встречались морфозы колосьев, которые можно разделить на следующие типы: 1) поворот оси колоса; 2) мутовка - формирование на одном уступе колосового стержня большего по сравнению с нормальным количеством колосков; 3) "выпад" - отсутствие или недоразвитость нескольких колосков на колосковом стержне, 4) ветвисто-колосость - ветвление колосового стержня.

Наряду с морфологическими признаками, но с гораздо большей частотой возникают изменения по количественным признакам.Отбор таких форм затруднен и требует применение специальных биометрических методов. С целью выявления таких изменений был проведен структурный анализ регенератных растений сортов Московский 3, Московский 121, и Одесский 100 в se,,. . Определяли статистические параметры признаков, определяющих продуктивность и устойчивость растений к полеганию. Сравнение растений опытного и контрольного вариантов проводили по размаху варьирования значений признаков, средним арифметическим значениям признаков и по коэффициенту вариации (Табл.6).

Для оценки генетической структуры популяций и выявлению со-маклональных линий в sc2 провели расчленяющий отбор. Для етого во втором поколении сомаклоны разделили на две группы, отличапциеся, от средней арифметической контроля на за ••+" группа и "-" груша. В sc3 данные этих групп учитывали отдельно. Как ввдно из гистограмм (рис. 4 ), проведение расчленяющего отбора внутри сомакпона-льных линий оказалось эффективным и разделило их на две, значительно различающиеся по среднему значению, характеру распределения, а также по амплитуде варьирования выборки, что свидетельствует о ганотической гетерогенности данных популяций. При сравнении средних арифметических данных групп со средней арифмеметической конт-10

; 1 о. Результата анализа регенератов' $С_, (Р) и растений истовой фсрии (К) ао количественна!! признакам

¡Стагасти-чес кио

¡ри

ысота ! дгагаа растений ! глягаого' ! колоса

Длина верхнего междоузлия

1 Чисд>колос- ¡Число зерен Продуктивная ; ков с глав- ¡с главного

кустистость

ного коло- , са ;

Одесский 100

К 77,2+0,64 10,7+0,13 25,4+0,44 6,8+0,36 27,3+0,36 24,4+0,35

3,341,60 12,14), 90 17,3+1,20 51,343,70 12.74),90 14,4+1,00

лимит 61 I 100 8,5^14,5 15~- 36 2-15 .' 22~- 36 аз 1 зз

75,6+0,391 10,3+0,09* 26,3+0,23 7,6+0,42 26.2jp.191 23,6+0,19*

+ 9,4+0,40 15,7^0,60х 20,3^0,70 56,6+2,20 15,24), 50 17, ЕМ), 60

ЛШС1Т 50 I 95 2,5+14 11-40 2-20 9-35 3 I 33

Московский 3

к I ¿«5 32,6+0,70 11,6+0,14 27,0+0,43 ■ 6,9+0,35 29,0+0,29 26,441,27

^ "с* 9,34),60 13,5^0,87 17,Л,П 46,442,90 10,441,61 11,2+0,69

лиинт 63~- 100 8,5-15,5 13-37 2 -~1д 21-36 19-34

р 81,2+0,40 11,6+0,79 24,3+0,22* . 6,3+0,15 29.94), 16х 26,4+0,19

(V + ы- — о ✓ 12,1+0,35х 16,85),49х 22,04).64х 58,8+1,70х 13,5+1,70х 17,у),50

лзэсгг 46 1 ИХ) 5,5 - 16,0 11-40 1-23 16 - 39 7 I 36 _

Московский 121.

к * X и2 84,1+0,87 11,5+0,24 23,8+0,55 7,5+0,50 30,7+0,45. 27,9+0,42

I2.lTo.351 15,6^1,5 17,2+1,80 49,7+4,7 10,1+1,0 10,7+1,0

ламит 71 I 97 7,0116,5 13 - 32 2 Г 16 20 I 38 17-35

р х + ы^ 82,7+0,72 12,2+0,20х 24,3+0,44 6,9+0,32 32,1+0,33х 28,7+0,35

± "о* 10,6«),60 16,1+1,20 20,2+1,20 51,743,30. 12,341,70 14,643,90

лимит '57-98 6,5 -"16,5 II - 37 21 20 19 I 40 17 - 37

рольного варианта установлены достоверные различия для большинства изучешых признаков.

и » а и «

I ы ао к за

. Рисунок 4.

Распределение регенерантов ячменя сорта Московский 3 по числу зерен с главного колоса в гс2 и зс3.

Таблица 6.

Частота наследуемых изменений количественных признаков у сомаклональных линий ячменя, по данным гс2 и зс3>

Признак Число изученных растений Московский регенерат 595 3 контроль 120 Одесский 100 регенерант контроль 333 100

Высота растений 2,4-0,6 0 2,4-0,8 0

Длина колоса 1,7-0,5 0 2,7-0,9 0

Длина 2-го верхнего междоузлия 1,1-0,4 '• 0 0 0 '

Длина верхнего междоузлия 1,0-0,4 0 0,9±0,5 0

Общая кустистость 1,0±0,4 0 2,4-0,8 0

Продуктивная кустистость 1,6±0,5 0 2,4-0,8 0

Число колосков с главного колоса 1,8-0,6 0 2.1*0,8 0

Число зерен с главного колоса 3,6-0,8 0 1,8*0,7 0

«В результате проведенного анализа установлено, что сомакло-вальные линии имеют больший размах изменчивости по всем изученным

го

признакам, чем растения исходной формы.

Уровень генетического разнообразия изучаемых вариантов сравнивали по коэффициентам вариации. При проведении такого анализа у сорта Московский 3 по всем изученным признакам установлено наличие достоверных различий от контроля (табл. 5). У сорта Одесский 100 сомаклональные линии достоверно отличались от растений исходной формы только по длине главного колоса. Не обнаружено достоверных отличий между исходными растениями и растениями регеперан-тами сорта Московский 121.

Необходимо отметить, что коэффициенты вариации у сомакло-налышх линий всех изученных генотипов были выше по всем изученным признакам, чем у растений исходных форм.

2.1.2. Зависимость величины соыаклональной изменчивости от продолжительности культивирования in vitro.

При регенерации растений ячменя с увеличением времени культивирования наблюдается увеличение частоты хлорофильных мутантов-(Табл. 71. Известно, что хлорофилыше мутации используют как модельный тост для выявления мутагенного действия каких-либо химических соединений или ионизирующих излучений. В данном случае увеличение времени культивирования является увеличением Дозы мутагенного фактора.

Таблица 7

Зависимость частоты регенерации хлорофильных мутантов ячменя

от продолжительности культивирования каллусов.

# Кол-во Получено В том числе

пас- каллу- регоиеоан- хлорофильных мутантов

сажа сннх тних про- к частота %

линий ростков к в° частота,*

Московский 3

1 14 29 0 0

г 5 19 1 6,2

3 10 39 2 5.3

4 Ч 2-1 2 0,3

5 ■ 2 5 2 40,0

Одесский 100

1 27 41 2 4,9

о 21 3G О 5.5

3 16 33 6 18,1

Московский 121

[ 3 7 0 0

23 33 9 27,3

3 16 33 9 27,3

Для изучения зависимости величины изменчивости количественных признаков от продолжительности культивирования были использованы результаты структурного анализа сомаклональных линий сорта Московский 3, у которого было получено наибольшее количество регенератов в течение 1-4 пассажей. Из полученных гистограмм видно,. что растения-регенера-нты разных пассажей имеют разный характер распределения (рис.5). Это наиболеечетко прослеживается при изучении признака "число зерен главного колоса". С увеличением времени культивирования размах варьрования признака увеличивается.

РАСпшыниг риття-ри-егу лотов'отоия сот юошвошя з по фот

33® В ПАБНОК КОЛОСЕ В ЗШМОСШ 01 ДОШОЮТШЛОСП! ЦШ1

Рисунок 5.

Распределение регенератов ячменя сорта Московский 3 по числу "ЗАрен главного колоса в зависимости от срока культивирования.

2.1.3.Изучение изменчивости по маркерным признакам (гордеины, эстеразы.

В качестве маркерных признаков использовали компопентный состав гордешюв, эстераз, восковидность крахмала.

Электрофоретическому анализу гордеинов в ПААГ подвергли все полученные регенеранты, давшие семена. Сомаклонов с изменегашм спектром гордеина обнаружено не было.

При анализе изоферментов эстеразы у регенорантов сортов Московский 3, Носовский 9, Нутанс 513, к-19275 такжо не обнаружено изменений У регенорантов сортов Одесский 100 и Московский 121 были обнаружены изменешш в компонентном составе эстераз с частотой 1,06 и 0,72* соответственно. Эти изменения заключались в исчезновении или появлении дополнительных зон активности как в Est l, так И в Eat 2.

Однако при анализе семенного материала потомства измепенпнх регенерантов отмеченные изменения не били обнаружены. Зимограммы эстераз всех изученных сомаклоналыгах линий не отличались от контроля.

2.2.Соиаклональная изменчивость пшениц.

2.2.1.Соиаклональная изменчивость пяткой пшеницы по количественным и морфологическим признакам.

Структурный анализ вели по 5 морфологическим признакам: высота растений, продуктивная кустистость, длина колоса, число колосков, форма колоса. Представлены результаты анализа трех генотипов: дигаплоидной линии АД 20/47, сортов Родина и Белорусская 80.. Данные по первому покологгаю приведены по всем изученным сортам .

2.2.2. Первое поколение. Растения-регеперанты sCj отличались от растений исходных сортов по различным морфологическим признакам. Среди регенертов с изменением стебля отмечены следующие формы: короткостебелыше, карлики, длилостебелыше, растения с толстым стеблем, ветвистые формы. Среди изменений колоса наблюдали: безостые формы, спельтоиды, скверхеды, плотноколосые, крупную колосковую чешую, острую колосковую чешую, отсутствие плеча у колосковой чешуи.

2.2.3. Второе поколение. Болышшстзо изменений, отмеченных в sc1 не наследовалось в sc2. В тоже время, данные структурного анализа показали, что в sc2 средние показатели высоты, длины колоса и числа колосков мало отличалась от этих показателей у исходных

генотипов,'но у потомства регенераптов значительно увеличился размах изменчивости по всем исследованным признакам (Рис.6). Коэффициент вариации по изученным количественным признакам, был достоверно выше чем у контрольных растений зс2 .

!-раст«ми-раг*трасты, г-к'окгроль.

Рисунок 6.

2.2,4. Зависимость частоты возникновения сЬмахлональной нз-' ыенчивости от генотша.

Таблица 8.

Частота и спектр сомаклональной изменчивости у мягкой пшеницы, А-

по данным &2

Типы мутаций

Частота семей с мутациями,х АД20/47 Родина Белорусская 80

1 , •. 2 з • 4

1.Короткостебельные 3,9 1,5 26,7

2.Карлики - 3,3

3,Карлики безостые 0,2 - -

.4, .Безостые 0,3 - • -

2 3 4

5.Короткостсбелыше с плотшм 0,5 колосом

6. Цилиндрический колос 0,8

7.Цилиндрический плот!Шй колос 0,3 О.Скнорход

Э.СуСкомппктоид Ю.Компактоид

П.Слольтоид 1,7

12.Острая колосковая чешуя 0,3

13.Изменено расположение колосьов 0,3

14.продуктив1шо

15.Широкий лист ' -0,2

16.Сверхчувствительность к мучни-

стой росе.

4,0 1.5 1.5

0,5

Л,5_

1Л 3,3

5.5

Изучено семой sc„

59)

201

Кик видно жз полученных данных сомаклоналлая изменчивость у мягких пшениц зависит от генотипа и составляет 1,6* У линии АД 20/47 и сорта Годила и у сорта Белорусская 80. При этом частота клеточных линий давших мутантные растения на порядок выше -57 и вда соотнтствено.

I? продолах одного генотипа морфогенотическио каллусные линии при наличии достаточного количества регенерантов достоверно отличились по частоте возникновения мутантннх растений. В каллусгах линиях АД 20/47, где преобладал эмбриогейетический путь регенерации растений, «57 и 142 получено 32 и 22 регенерата, у которых не обнаружено изменчивости, а у линии 19 из 4 получешшх регоне-рантов 2 были мутант!п;ми. Такая но картина наблюдалась у регена-рлнтов сорта Родина: из линии 148 получено 4 регенеранта 2 из которых с мутация?.«; из 20 рогенерантов, получешшх из линии 27 ни один не нес мутаций.

Таблица 9.

Частота сомаклональной изменчивости по морфологическим и количественным признакам по данным зс2 и бс^ и частота возникновения клеточных линий, давших сомаклональные варианты.

Проанализировано растений . Частота Ё ® <о и § Й сц (М # из м со я из м с-$ иг

£ о ь й 1 Е< £ СП 1Л я ф из

о ё о СЦ СО и » 1Л м СО со о м

Частота ыугантнюс семей м »—1 +г из со" ы •Ч1 01 о* . $ м м

го 0 СО д ш 01 О I ■ м" ю 0> м со

о & о (Ч а 1Л м о г^ в

1 о ■ е< ш § со а д 0 § 1 а.« см я м ю с-- о % о ю из N (-1 +1 о 8

1 из м м ч со

3 . & о а о ГА со см о м 1

о « ф 1 о- & СЧ1 ьеяорус-ская 80

2.2.4.- Изменчивости растений-регенерантов твердой и мягкой пшеницы по маркерным признакам.

2.2.4.1. По компонентному составу глиадинов.

.Для изучения изменчивости растений-регенерантов твердой и мягкой пшеницы по компонентному составу глиадинов использовали регенеранты зс2 мягких пшениц Белорусская 80, Родила и линии .АД 20/47, а также ЗС3 линии АД 20/47, и гс2 и бс3 твердой пшеницы сортов Кызыл бугда и Джафари.

Изменения электрофоретического спектра глиадинов изученных сомаклонов характеризовались исчезновением и изменением злектро-1юретичвской подвижности (качественные различия), изменением интенсивности (количественные различия) как единичных, так и группы компонентов, при неизменности остальной части спектров. Появление новых компонентов глиадинов не наблюдалось (рис.7,8).

. ... . " н

> .—< к—I м <—•

Ьа* ММ

{ЯКЗЙЗ ""¡¡-^И^ 6=6325-

«м •— кн.

Ецезвэ »в«*

•«■+ м-*«

(Г* ВД

I К 2 3 К 4 5 К 6

>ис.7. Электрофореграммы глиадинов растений-регенерантов мягкой сценицы линии АД20/47. К - контроль; 1-е - сомаклоны семей »3, ;3, 48, 40, 8, 37, соответствешо.

НнЫ-

ь ; .»«1

-И 'МЫ-к—ил

к.. и '

1 К 2

с:;

К 3

'¡Л

¿" Г 1

4 К

Рис.В.Электрофореграммы глиадинов растений-регенерантов твердой пшеницы сорта кызыл бугда. К - контроль, 1 -4 - растения-регено-ранты семай - 14, 30, 18, и 22,соответственно.

Таблица 10.

Характер изме!иивости компонентов глиадинов линии АД 20/47 в ЗС2.

Характер изменчивости

* Проанализировано

семьи колосьев зерен

всего измен, всего измен

1 2. 1 • 16 8

2 2 2 16 16

3 4 2 . 32 17

4 3 2 21 7

6 4 4 32 . 13

7 4 3 32 19

8 4 3 32 20

10 6 1 41 И

13 4 1 32 2

37 4 '1 ' 32 8

40 4 1 24 6

48 4 1 32 1

Отсут.ь>ч ,Р3 0тсут.и4,Р9

Отсут.и^,Р4Ослаб. р6 •

0тсут.и4,Ра

Ослаб.Отсут.ь>4,рв

Отсут.

Отсут.<■>.. ,Р, Ослаб, ы ц

117 в • о

0тсут.ы4-рз . Отсут.Г3,Р3

Отсут.ы4 7 яг4 Усилен.аа 6

отсут.«4;9;7вг3,Р9

Отсут •и9 § 6, „ (!, .г,'. г4. Р7. Ослаб.

1.2.4

гг

2.2.4.2. Частота соиаклонпльной изменчивости твердой и мягкой гжедацы в яс? по компонентному составу глиа-динов.

Частота сомлклонплыюй изменчивости определилась по % измененных семей, колосьев и зерен от об.'вдго числа всех изучешшх со-мей, колосьев и зерен, соответственно, в зс2.

Кол-по измененных семей (колосьоп.оорон)

Суммарное число проанализированных семей (колосьев, зерен)

Семью считали мутпптной или измененной, осли срюди зорок, получешшх от всех колосьев имелось хотя бы одно зерно с измсшен-1шм ялектрофоретическим спектром глиадинов .

Как видно из нолучшшх данных, частота сомлклопалыюй изменчивости зависит от генотипа и составляет от 0,54 до Г),7*, по числу зарои в сс2.

2.2,5. Характер наследования сомяклоналыюй изменчивости у растений-регенррантов твердой и мягкой пшеницу в зс3.

В 2С3 оило исследовано потомство 0-и обнаруженных в из-монешшх семей мягкой пшеницы, так как данные изменения легко идентифицировались и были множественными. При анализе было.'устанои-лено, что сомаклонн сомей » а, а, 13, 37, которые п ?>С? имели из-монешшй спектр глиадинов, в зс,, показали но отличимый от контроля спектр. Изменения спектра глиадинов сомаклонои сом. » 40 наследовались, так как 1 из 5 проанализированных колосьов оказался измененным. Из 6-и зерен колоса 3 зорна имели измененный спектр глиадинов. При. анализе потомства сем.« 40 било обнаружено, что все проанализированные зорна сохраняли измененный спектр.

В 2С3 было исследовано потомство 4-х, обнаруженных в зе,,, семей регенератов твердой пшеницы сорта Кызыл бугда. Было установлено, что олектрофо^тические спектры глиадшюв .сомаклонои со-мей # 14, 18, 22 но отличаются от контроля. Анализ потомства ре-генорантов сом. « 30 показал, что данная изменчивость стабильно наследуется .

Таким образом, нами было установлено, наличие стабильно и нестабильно наследуемых изменений компонентного■состава глиадинов, как у твердой, так и у мягкой пшеницы.

Таблица !.

Частота сс;.2;слсналы!01: гз:.:й;гчгесст1: по ко:.гзоксктнс:.у слстазу

у растена^-регснераетов твер~о;; 2 кягкои паенсаг в Й О^

1 П р о а к а л с з к р о Б а н 0

«• Б< :рек , Семе.: Колосьев оереи

а контсол: зККХ р2.С— эастенл^-регекераы- с ас? с1сг. -рог он ера:-:- састен; рег с;:есс::- 1

>> 1 £-• 1'и орт ,т тоа т ов тов

1 1 1 них , 1 12 -Л1Х 1 шкх » Т0Рг 1 кних , та,;» ,

__1

| Тверд. I Ккзьу: бут Ы 100 - 122 3,28-1,0 233 4 1,72±С,СС1099 6

1 ' 100 - 19 - - 22 - ■ ПО -

1¿0/47 1 100 - 50 15 30,0±6,5 193 39 20,2±2,9 1530 149 9,7±0,Ь I

г;а 1Рсддна 1 100 1 - 169 33 19,¿¿3,1 268 36 14,¡¿±2,1 2116 94 4,4±0,4 1

Белорус- 1 100 _ '76 7 9,2±3,3 146 7- 4,8±1,8 1084 37 3,4±0,5 1

ская оО _ 1 _ • _

2.2.6. Анализ изоферыентного состава эстераз, АДГ, ГДГ и ГОТ сомаклонов твердой и мягкой пшеницы.

Были проанализированы 112 растений-регенерантов (26Я зерен) твердой пшеницы и 16 регенерантов (92 зорен) мягкой пшеницы.

Донорные растения АД 20/47 оказались гомогенными по изоферментному составу зстераз, споктр которых включал в себя 12 компонентов (Рис.93). При изучении изофермоитного состава эстераз из зерновок регенерантов АД 20/47 в SC2 было установлено явление со-маклоналыгай изменчивости, возникащее с частотой 62,503, 31,25« и 30,43*, вычисленной по сомьям, колосьям и зернам, соответствен--но (см.Табл.12).

При анализе зерновок контрольных растений твердой пшеницы, сорт Джафаря оказался гомогенным по изоферментному составу эстераз, а сорт Кызыл бугда - гетерогенным. Спектры данных вариантов зимограмм включали в себя от 6 до 11 изоформентов эстеразы.

При анализа потомства растений-регенерантов твердой пшеницы сорта Джафари в sc2 било установлено, что зимограммы зстераз регенерантов не отличаются от контроля. Среди сомаклонов Кызыл бугда в sc2 было обнаружено изменение изоферментного состава эстераз с частотой.2,бз*, о,94* и 0,65*, вычисленная по семьям, колосьям и зернам, соответственно (см.Табл.12). Все изученные контрольные растения как мягкой, так и твердой пшеницы оказались гомогенными по изоферментному составу АДГ, ГДГ и ГОТ. При анализе зерновок сомаклонов sc2 изменения по изоферментномусоставу данных фермен- . тов не были обнаружены. Спектры АДГ и ГДГ включали 3 компонента, а ГОТ - 4.

При анализе растений-регенерантов твердой и мягкой пшеницы в SC_2 по изоферментйЗМУ составу АДГ, ГДГ, ГОТ и эстеразы из зрелых семян,, нами была обнаружена изменчивость по встеразным локусам. Данные изоферменты были использованы в качсСТЗЭ генетичесгеге маркеров сомаклональной изменчивости, так как генетический контроль этих ферментов хорошо изучен.

Система эстеразы, по которой нами была обнаружена изменчивость, является одной из наиболее полиморфных систем, известных у пшеницы. Гены, контролирующие изоферменты эстеразы локализованы в хромосомах 3-Й П 6-Й гомвологических групп (Bozzini et al.,19731. Данные локусы проявляют высокую тканевую специфичность. Локусы, кодирующие изоферменты эстеразы зрелых семян гексашюидной пшени- . цы (Eat-5i локализованы в длинном плеча ЗА, ЗВ, ЗД хромосом

, 31

Таблица :. Частота ссягакхснагькой изуекодгоетн по кэ^ер^ггиоиу

составу зстсрао у ргстекия-р'сгеиерантов тгердоП к гягкоЯ псеккцы в БС^.

Кол-в 0 п р о а н а л и з и р о в а н н ы х

Сорт Зеопн коетоо.-ъ-»-кос растегая. | рас Сс.иЯ те н;!Я-реге1:с рантов к07.0сь«э растенкй-регенгран- тов раст Зерен енка-мгекергиь 70в*

I 1г:к • Зсег о:'/зум!ен-: кд -;Час?о-: та Всего |Из1'е!>ек-:Чзсто-; тле : та Всего ; их к-;Чзсто-: та

: : • < : : « 1 «

20/47 243 0 5 62.50 16 5 31,25 92 2.-3 30,43

Кьоул бугдр. 150 И I 2.63 106 I 0,94 236 2 0,65

Д*а£чрк 100 с - - Гб - 32 - -

(Ainaworth et ai., 1984 1. Каждый из 3-х, возможно, гомеоаллелышх локусов, кодирует, по крайней мере, 7 изоферментоп и состоит из тесно сцепленных генов.

Наблвдаемая нами изменчивость по изоферментному составу ос-теразн характеризовалась как отсутствием, так и появлением, а также изменением интенсивности и. электрофоретической подвижности отдельных изофврмептных зон на зимограмме. Нами было установлено, что изменчивость по изоферментному составу астораз не связана с геномными и крупными хромосомными мутациями, которые можно определить методом окраски по Фельгену, т.к. все проанализированные сомаклоны имели эуплоидный набор, без видимых изменений морфологии хромосом. Подробности цитогенетического анализа растений-регенерантов описаны ниже.

Частота изменчивости у мягкой пшеницы линии АД 20/47 была на порядок больше, чем у твердой пшеницы сорта Кызыл бугда. Можно предположить, что более высокая частота изменчивости мягкой пшеницы связана, во-первых, с разницей в уровне плоидности, во-вторых, с тем, что АД 20/47 является чистой линией (дигаплоид), полученной из культуры пыльников.

Из 3-х проанализированных нами изоферментов в качестве генетических маркеров сомаклональной изменчивости у пшеницы-, в литературе нам известна только одна работа, выполненная Девисом с совет. в 1986 г. (Davis et ai.,1986). Авторами было установлена изменчивость по локусу АДГ-1, которая характеризовалась отсутствием и изменением интенсивности изоферментных зон на зимограмме. В результате цитогенетического анализа были обнаружены изменения числа хромосом, а■также•хромосомные перестройки.

: Ji ~

'ькл f Ф -I j е. t. „ —

« vi »4

-Pi;

2 К 3

4 К 5

Рисунок 9.

Зимограммы изоферментов астеразы сомаклонов мягкой пшеницы линии АД 20/47. К - контроль! 1-5 - сомаклоны сем. #3,8,1.3,14,37, соответственно. Схема показывает изоферментный состав астеразы контрольных растений.

3. ЦИТОГЕКЕТШи КУЛЬТИВИРУЕМЫХ IN VITRO СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК.

3.1.Цитогенетический анализ каллусных культур ячменя.

В щитке в момднт посадки на с;>эду все клетки являются диплоидными (2n-i4 I без каких-либо изменений (табл.13 ). На 5-й день появляются тетрашюидные метафазы с 28 хромосомами (рис.Ю ). На 8-й день культивирования также отмечено наличие полиплоидных клеток. При атом наряду с мотафазами с 28 хромосомами били обнаружены мотафаны с 5G хромосомами. Обращает внимание тот факт, что ка-ллусные линии одного срока культивирования, различаются между собой по характеру проходящих в !шх нитогонетических процесов. На восьмой донь культивирования било исследовано 5 различных каллусных линий. В линии 8 частота полиплоилних клеток составляет 4,8*, И не обнаружено других типов изменений. В тоже время, в каллусных линиях 10 и 11, содержащих диплоидные мотаДазы обнаружены клетки с политешшми хромосомами. В етих линиях обнаружено явление слипания хромосом, частота которого достигает 16,G и 12,5t. В линии 7 с частотой 29,0« обнаружены анеушюидные клетки. Частота слипания хромосом при этом достигает 37%. В этой линии но обнаружено полиплоидных метатез.

В нашем эксперименте каллусы к -1 месяцу культивирования п значительной степени снижают или торчит способность к регенерации растений. Различия п протекании нитогонетических процессов между различными каллусными линиями к этому времени становятся более заметными. Наряду с каллусами, кмо'х;ими только диплоидные метафайл, имеются каллусы, в которых полиплоидные клетки встречаются с. частотой 3S и 82Х. 240-дневный каллус имел неморфогешую структуру. Частота диплоидных мота^аз в нем составила 77*. Отмочены также анаунлоидные и полинлошшо клетки. В годичном каллусе частота диплоидных клеток уменьшается до 26а возрастает чистота аноупло-идных и полиплоидных клеток.

Таким образом, показано, что в меристемах мэрфогешшх каллусов преобладают диплоидные метки.

'. Наряду с изменением чиг.'-i хромосом и клотках каллусов обнаружено явление слипания хромосом. Это пиление заключается в появлении ДНК-ковых связей между хромосомами в виде тяжей, пятой или более близких контактов как между гомологичными, так и негомологичными хромосомами. Слипание хромосом отмечается уже в двухдневном каллусе и возрастает с увеличением возраста культуры, дости-34

Рисунок 10.

Патогенетические процессы: в культуре соматических клеток ячменя. а - различная степень конденсации, хроматина в ядрах: ь -метафаза тетраплоидной клетки; о - метафаза с единичными мок -плечевыми мостами слипания хромосом; <1 - метафаза с множественными . мостами слипания хромосом; е - метафаза со сверхспирализо-ванными хромосомами и теломерными мостами слипания; г - раняя анафаза с повышенной липкостью хроматид, имитирующая мейоз; в ~ те-лофаза с отставшей хромосомой и множественными микроядрами! ь -14 политенных хромосом.

■a

a i-i

O'S II

h «3

OH.

CU © c

n) neo

E-i OTCJ oxgi || E-< a y H c

ce COvji' t-, tdn o>4< || H ra

S a S ¿r> yo!

I I

HÜ1X

o w iá m d x ni o H>«<

o o o 0>

w w na

US :! B

¡J (ü

I I I I I I I I I g

Ti 3 .1 a

i i

a 3 %

o o o

C| R< o.

X M K

a> a> a>

P ' 1 B 1 ' §

s ffi §

li ti a

<ü tví "1

11 "."1 I

O OI '»lOrjCOUJ HuJO'ÍOlt'OOOOO

I r- I O j\'0--«D01'í'}OIOQQOQOg o . > -r-KOH'M • i*-.T'i>íortooooo

I ^HHI—II—t

I I I I I 1(7) I I I I I I I I I • I I I II I WOT

Oí MCSJ

lililí -1 I I I I I I I I I I I I I I I I

lili

¡>C\J

M -H

oooonu) »".-! ^o-'foino-iíjüo^omoíio

QO0O<ípO.nQ ;'OinOCOQJOCVC>OffíQOaO!>tD 00 000)ÍJ)L'-i3>vi6oJ)00>OaiC)íJOO)OiriHM*l HHWH '-"-I I—I M MM n

OlOCJlOCO —I • vf w ta H10 'Xi cvl en.:: M CJ

CM IT3 co

M-H

-\¡

o o rio

HNíTíiin'j);

i H.N'O'J'I.iv,': I •!1—í f—11 -O H >- H1 -

JOOHN.1)'?. O

гая в 120-дневном каллусе 100*. Контакты хромосом отмочены как одиночные, так и множественные. Следует отметить, что множественные контакты не специфичны и затрагивают как теломерные концы хромосом, так и шггеркалярные участки плеч хромосом.

Необходимо подчеркнуть, что при анализе как матафазных, так и анафазных пластинок не выявлено наличие мостов, фрагментов, ди-центриков и другого типа хромосомных перестроек. Это свидетельствует о том, что в нашем эксперименте отсутствует мутационный процесс, вызывающий структурную перестройку хромосом. Частота хромосомных аберраций в анафазах и метафазах каллусной культуры составляет величину меньшую, чем частоты перестроек в корешках контрольных семян.

3.2. Цитогенетический анализ каллускых культур твердой

В меристемах МК были исследованы метафазы с целью оценки стабильности и вариабельности кариотипа in vitro в течение 3-х месяцев культивирования (см.Табл.14). В щитке в день посадки на среду все метафазы были эуплоидные с 2п=4х=28 хромосом. На 3-й день культуры с частотой 1,6 - 4,3% появляются полиплоидные метафазы с 4п=8х=5б хромосом, а на '6-й день анеуплоидные метафазы с частотой 4,1 - 11,5*. В нашем эксперименте, каллусы.к 4-му месяцу культивирования значительно теряли способность к регенерации растений. Цитологический анализ показал, что параллельно со снижением регенерационной способности каллусных линий возрастала частота появления как полиплоидных, так и анеуплоидных клеток. При этом наблюдались значительные различия между каллусными линиями одного и того же возраста. Отмечено, что в одной и той же каллусной линии не встречается одновременно высокая частота полиплоидных и . анеупловдных клеток. Так, в линии # 19 частота полиплоидных клеток составляла 67*, а анеуплоидные клетки отсутствовали. И, наоборот, в линиях #14, 15, 16 анеупловды встречались с частотой 20*, 30*, 40* соответственно, а полиплоидные клетки отсутствовали. Все полиплоидные клетки имели хромосомный набор 4п=0х=56.

В возникновении полиплоидных клеток хорошо прослеживается роль нарушения веретена деления с образованием реституционного ядра. Кроме полиплоидных клеток отмечен широкий спектр анеуплоидных вариаций хромосомного набора от 8 до 55 хромосом. Среди этих анеупловдов 58* составляли анеуллоидч с 27 хромосомами. В популяции клеток таких каллусов часто прослеживаются микроядра, об

пшеницы.

Таблица 14

Изионызостъ структура кариотипа соматических клеток твердой пиеницы сорта Кызыл Оугда в зависимости от времени культивирования.

1 Но:.:ес Вреул Исследо- Мот агази с л!етас .азы с Анеуилокдные Частота ме- Другие1 |

1 КЕЛЛ„- кулътн- вано _ 4х=28 4П 3 1х-56 иета^азы та^аз со явления ,

1 с ной зг.соз-?.- слинангями

, .ипсти шя, число % число % число г хромосом,% 1 1

I о 37 37 100,0

НО .46 100,0 5? ¿Те _ _ — — |

' 'л 3 190 1С У 98,-: 3 _ — — — 1

1 <г 70 67 55,7 4,3 — — 1.0 — .

1 5 ЬВ 1СО.О _ _ — 2,5 —

С 2Ь о7,5 I зТо 3 9,1 12,0 "

7 з.-с 43 3 5,8 6 11,5 17,0 - 1

о - 'У: 187 ¿4,3 2 I 0 8 4,1 21,0 — |

1 ^ х -X 89 £0,1.' I 0,9 21 18,9 19,0 мелкие хромосомы,

1 ю ОС ¿О 44,8 7 12 I 25 43,1 29,0 _гс_ 1

, 11 42 67, ? 14 22,6 6 9,7 25,0 п 1

30 «.I '(¿, 4 3 10,3 5 17,2 27,0 я» 1

13 С/ ~ 46 77,9 8 13,6 5 8,5 30,0 — 1

| го 60,0 _ — 5 20,0 '23,0 мелкие хромое о:.!!,

1 10 60 гз СО ,7 — _ 10 30,3 42,0

I 10 и 60,0 _ _ 4 40,0 40,0

1 33 к 4Ь,а 3 5.1 14 42,4 67,0 мелкие хромосомы'

16 64,0 2 8,0 7 28,0 78,0 1

» г с. % 30 10 33,3 20 66,7 — — 31,7 мелкие хромосомы»

* „7 хь 59,3 8 29,6 3 И,1 40,0 — |

1 26 57,3 3 6,7 16 35,5 75,0 — .

вавшиеся в результата потери хромосом из Змгур долений. Анализ метафазных хромосом показал, что уме па 3-й день культивирования между хромосомами обнаруживаются ДНК-овце тяжи и чити (Рис. 11). Они могут присутствовать как между гомологичными, так и ногомологичными хромосомами, быть единичными и множественными, затрагивать как инторкалярные участки хромосом, так и толомиры. Эти тяжи и нити свидетельствуют о наличии поверхностной липкости хромосом. В процессе культивирования число метафаз со слипаниями хромосом постепенно увеличивалось и к 3-му месяцу достигло 75 - 7ЕЯ. Мосты слипания были непрочными и но препятствовали анафазному расхождению хромосом, поскольку нарушений в анафазах отмочено не было.

3.2.1.Исследование структуры хромосом методом дифференциального окрашиваия.

Был проведен анализ распределения С-окрашивагмя по длине ме-тафазных хромосом в клетках МК и НМК 30-дневной каллусной линии. Идентификацию хромосом проводили по номенклатуре, предложенной Джилом и Кимбером (0111,К1тЪег,1974I. В качестве контроля использовали рисунок С-окрашииания на хромосомах клеток щитка в день посадки на среду. В НМК были отмечены значительные отклонения от контроля, которые заключаются в следующем: в сверхспирализации хромосом, уравнивании длин плочей в направлении мотацентричности хромосом. Спирализация хромосом, происходящая за счет аухромати-ческих районов, что видно на интерфазных ядрах, ведет к сближению и слиянию гетерохроматиновых блоков, как теломорных, так и интер-каляркых. Эти отклонения от контроля делают практически невозможной достоверную идентификацию всех таких сверхслирализовашшх хромосом в меристемах НМК.

Таким образом, изменчивость рисунка С-окрашивания в хромосомах зависит от типа меристемы и от времени культивирования, т.е. наблюдаются различия в функциональной морфологии хромосом в условиях культуры соматических клеток.

З.з. Цитогенетический анализ растений регенерантов.

3.3.1. Ячменя.

Нами было исследовано число хромосом у регенерантов сорта Московский 121 в момент высадки из пробирок в перлит. Для выяснения числа хромосом у растений-регенерантов после прохождения мей-оза был проведен цитогенетический анализ проростков из семян первой репродукции регенерантов. Из 163 проанализированных регенерантов только один, получеппый в третьем пассаже из каллусов сор-

■ 39

та Одесского 100 имол 29 хромосом.

Таким образом, практически все регенераты имели нормальное число хромосм 2п=14.

3.3.2. Твердой и мягких пщениц.

Нами было исслодовано число хромосом у первичных растений-регенорантов, получошшх в 1-м и во 2-м пассажах твердой пшеницы сортов Джафари и Кызыл бугда, а также мягкой пшоницы линии АД 20/47 н момент высадки из культуры в перлит. Для выяснения числа хромосом у растений-регенерантов после прохождения мейоза был' проведон цитогонотический анализ проростков из семян второй репродукции зрелых рогенорантоп (бс., ). При анализе числа хромосом у первичных растений-рогенерантов Джафари и Кызыл бугда, при вусад-ко их в перлит, сроди 60 растений был обнаружен один полиплоид с 4п=8х-56 хромосом и один внеуплоид с 2п=4х-1=27 хромосом, а также среди 30 растений-рогенерантов АД 20/47 был обнаружен 1 анеуплоид с 2п=Сх-Ь-41 хромосом (см.Табл.15). Анеуплоиды после прохождения мейоза оказались стерилышми, а полиплоид дал потомство. Все изу-чопгае нами порвичныо растения-рогонерантн сорта Джпфари имели эуплоидноо число хромосом - (2п=4х--20). При исследовании числа хромосом у проростков из семян растониЯ-регенерантов зс-2 всех

Таблица 15.

Число хромосом у первичных рогонерантов, пересаживаемых из

культуры в перлит, и проростков 50 твердой и мягкой шисниц.

Культура

Число расто ниЯ

Норма

Анеуплоид Полиплоид

Чис Часто Чис Часто

ло та ло та

X г

Первичные регенераты Твердая пшеница (2п-4х=28) Млп«я СО оП ;>л 1 1,7 29 1 3,3 1 1.7

пшеница (2п=6х=42)

Тв.пше- 100 ИХ) -

зс^ 1шца Мягкая ■ пшеница 70 70 -

изученных сортов (в том числе, с.омлклоноп, измененных по компонентному составу глиадинов и эстераз твердой и мягкой пшеницы) был установлен эуплоидный набор хромосом, без видимых структурных пе-40

рестроек.

Алолиз кариотипа у растений-регенерантов может бить связан о невозможностью использовать по разним причинам корневые меристемы. Нами была разработана методика использования конской генеративной сфоры, в частности, делящихся клеток интогументов для пшеницы после ее цветения, для установления цитогенотичоских причин стерильности. Эта методика позволила определить анеуплоидную природу сторильного регонеранта твордой пшеницы .

Цитогонотический анализ получешшх в нашом опыте каллусных линий твердой пшеницы в течение 4-х месяцев культивирования показал, что в каллусах, обладающих рогонорациошгой способностью, преобладающее число клеток являются эуплоидными. В МК по мер« культивирования происходит накопление полиплоидных и аноуплоидных клеток и в некоторых линиях на 2-м и 3-м мосяце культивирования их частота достигет 66,7* и 42,4* от числа исследованных метафаз. Начиная с 6-го дня культивирования псе 15 линий имели анеуплоид-ные метафазы с частотой от 4,1* до 4 3,1%. Цитогонетику твордой пшеницы в культуре in vitro можно считать вопросом мало изученным, В связи с малым ЧИСЛОМ имеющихся публикаций (Bennlcl,1986I. Данные, полученные разными авторами трудно сопоставимы и значительно различаются. Наибольшее число работ по цитогенетике твердой пшеницы в культуре in vitro выполнено Бешшци и Д'Амато с соавт. (Bennlc1,D'Amato, 1978: Bannlcl et al.,1979; D'Amato et al.,1980; Lupi,Bennici et al.,1981). В качестве экспланта вти авторы использовали мезокотиль и получали регенерацию растений из первичного каллуса.

Причины возникновения полиплоидных клеток кроются в нарушении веретена деления и образовании реституционного ядра. Видимо, этот же процесс более слабой выраженности ведет как к неравному расхождению хромосом, так и к потере хромосом из фигур делений, т.е. возникновению анеуплоидов и микроядер. Это нарушение работы веретена наблюдается в участках каллуса с повышенной конденсацией хроматина и уменьшением синтеза рибосомальных РНК. Можно считать, что как полиплоидия, так и анеуплоидия представляет собой явления, сопровождающие процесс старения каллуса.

МК твердой пшеницы довольно быстро, уже к 4-му месяцу, стареет и теряет способность к регенерации растений, что согласуется с данными Эапен и Pao (Eapen,Rao,1985I. Процесс старения каллуса, по нашим данным, цитологически проявляется в усилении степеци ко-

нденсации Х]юм,т]'и:т и ядрах, инходнмих из меристемы, и постепенном сокращении об)ома самой меристемы.

Одной из главных причин, побудивших нас исследовать цитоге-чет-ику культивируемых клеток твердой цшоницы и растиний-рзгенера-HTOij твердой и мягкой пшеницы, была необходимость установить наличие коррзллцио.шпЯ связи патогенетических изменений, и частности, геномных и хромосомных мутаций с сочаклональной измотиво-стью, найденной нами у твердой, а такие у мягкой пшеницы.

В нашем эксперименте геномные мутации, выражающиеся в нали-' чип полиплоидных и анеунлоиднпх клеток, имели в ряде линий твердой пшеницы высокий процент, и чем сказано выше. Однако их роали-:злция в ¡^стения-регенеранты наблюдалась с частотой 1,7«, .т.е. было получено всого два растения. При анализе числа хромосом у первичных рлстений-рчзгенераптов, до прохождения мейоза, мягкой пшеницы линии ЛД 20/47, среди 30 проанализированных растений был обнаружен 1 аноунлоид наолюдаемая распространегаюсть анеуплоидных клеток в каллусах, и выживаемость анеуплоидных растений-р.згенершпчж у гнпатцн обеспечивается наличием у тпордой 2-х геномов (А и И), а у мягкой 3-х (Л, В и Д). Однако все изученные нами рмстония-регеноранты sc2 имели зуплоидний набор хромосом.

При анализе мета!лип:;х хромосом в каллуспоЯ культу]«, хромосомные мутации или перестройки не были обнаружены и они но составляют основополагающего мутационного процесса в культур») клеток пшеницы, Наряду с этим, нами была обнаружена нг.четшзос/ь рисунка С-окрагаипания саерхспирализов!шш;х хромосом в клетках НМЛ 30-дневногп каллуса. Спиралилацил. ведет к сближении и слиянии гетерохроматиновых сегментов. При визуальной оценке было установлено уменьшение количества го Гчухзхр« ватина в целом, т.е. наблюдаемая изменчивость связана, по-видимому, с процессами диминуции, возможно и амплификации высокопоиторяющнхся последовательностей Д!1К. К настоящему времени уже накоплен материал, позволяющий говорить о наличии этих процессов в культур« in vitro. Ламтан с соавт. в 1988 г. покатали. что увеличение размера С-бенда в некоторых хромосомах гибридных растений T.aoativum х Л.¡-octale, регенерирова-шшх из культуры клеток, является результатом амплификации повторяющихся последовательностей ДНК(1арИап et al..1906).

TaiaM образом, из полученных нами дашшх, а также анализа данных других авторов, следует, что геномные и хромосомные перестройки не могут быть основопологакпей причиной сомаклоналыюЯ из-42

менчивости у пшеницы. Наиболее вероятной причиной сомаклоналыгоЯ изменчивости служат качественные и количественные изменения в структуре ДНК, т.е. точкоине мутации, амплификация структурш/х генов и т.д.

З.з .з. Патогенетический анализ 1В хроиосош соиаклона ш1Гкой

пшеницы, измененного по компонентному составу глиадинов.

Дли изучения корреляции между изметивостьа по компонентному составу белков зорновки - глиаданов и структурой хромосом, нами были отобрат; сомаклони зс2 гексаплоидной пшеницы, линии ЛД 20/47 сем. » 40. Зорновки были поделеш; на 2 части, из которых одну использовали для електрофореза, а другую проращивали, один корешок использовали для цитогенетического анализа, оставшуюся часть для получения регенерантов эс^. В спектре глиадинов данных сомаклоноп отсутствовали р,, г \. г,, " , „ ,, и наблюдалось сни-

7 1 1 э , о , о , 1 I

женив интенсивности ы „ 4 компонентов (Рис.12 ). В качестве контроля был использован спектр перцовок исходных растений линии ЛД 20/47. Для установления локализации генов, кодируют« вышеуказанные компоненты, был использован каталог аллельных вариантов блоков глиадинов мягкой пшеницы при электрофорезе в ПААГ-е (Созинов, 1985). Выло установлено, что гея, кодирующий у компонент, который легко можно идентифицировать, локализован в коротком плече 1В хромосомы, т.е. в локусе Ы.П1В. Для установления возможной изменчивости структуры 1В хромосомы, несущей данный глиадинкоди-рувдий ген, были получены метафазные пластинки из корешка той же зорновки, имеющей измененный спектр глиадинов, где отсутствовал компонент у и были исследованы методом дифференциальной окраски хромосом по Гимза. В качестве контроля использовали рисунок С-окрапивэния на 1В хромосоме клеток меристем зародышевых корешков зерновок имевдие неизмененный спектр глиадинов.

1В хромосома, как и другие хромосомы В генома, содержит большое количество гетерохроматяна по длине плеч, что дает возможность визуально определить крупные хромосомные перестройки. Короткое плечо 1В хромосомы, где локализован локус сглив, содержит крупный блок гетерохроматина в районе ядрышкового организатора, центромерном и интеркаляряом районах. При визуальном наблюдении изменение С-окрашивания 1В хромосомы сомаклона не было обнаружено, что свидетельствует об отсутствии хромосомных мутаций. При этом все проанализированные метафазные пластинки имели эушкжщшй набор хромосом без видимых морфологических изменений.

■чй

"к. .Л^л .

А- - — >"

V •

4 V-

« ' "Г **

£ Л?

'«г • г•'»'** «

V*.

■

« I • • Е)Э

1 . «й О

г;,:";' « * : I

да ш г V

Ь ® V . ,ч

4 .. - .1 ..."Л $ . .

В. '

... . :< .•»•;««>'.. • .'аг

• V». I *■

-■ ■ V .1« »>- л *

Рисунок 11 .

Изменчивость структуры ядер и хромосом в соматических клетках твердой ншеншщ сорта Кизил Оугда в течение 3-х месяцев культивирования .

ЬЧ

а - метафаза из меристемы 30-дневного морфогенного каллуса и ядра с различной степенью конденсации хроматина; б - матафаза из меристемы 30-дневного неморфогешюго каллуса со сверхспирализованными хромосомами; в - вариации в степени конденсации хроматина ядер, размере и числе ядрышек, определенные серебрением; г - полиплоидная метафаза с 4л=8х=56 хромосом; д - реституционное ядро, образовавшееся в ранней анафазе от нарушзния работы веретена деления; е - метафаза со сверхспирализованными хромосомами и мостами ели-' пания; ж - градиент в конденсации хроматина и размере ядрышка при переходе меристематических клеток в паренхимные.

К} Я

<М М*

| — Л

** 1П

Рисунок 12.

Электрофореграмма глиадинов и' окрашенная пр Гимза 1В хромосома мягкой пшеницы линии АД 20/47 сем. #48. К - контролы 1 -со-маклон.

Таким образом, показано, что изменчивость по компонентному составу глиадинов не вызвана изменением структуры 1В хромосомы .

4.ГЕНЕТИЧЕСКИИ АНАЛИЗ ИЗМЕНЕННЫХ ПО КОМПОНЕНТНОМУ СОСТАВУ

ГЛИАДИНОВ СОМАКЛОНОВ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ ЛИНИИ АД 20147.

Для генетического анализа растений-регенерантов мягкой пшеницы линии АД 20/47, потомства измепешшх по компонентному составу сомаклонов сем.- # 48 и сем. # 40 в sc3 скрещивали с исходной линией: se AD 20/47 х ad 20/47 и ad 20/47 х SC ad 20/47. Из-за небольшого количества проанализированных ad 20/47 х se ad 20/ 47 растений, данные обратного скрещивания не приводятся.

При анализе эндосперма зерен F( (т.е. зерновок, полученных на материнском растении в результате опыления - se AD 20/47 х AD 20/47) было установлено, что все зерна имели идентичный с контролем спектр глиадинов. Однако интенсивность компонентов, отсутствующих у мутантных сомаклонов была слабее, так как активные аллели присутствовали в одной дозе. Для упрощения генетического анализа снижение интенсивности дашшх компонентов в спектре зерновок, в которых активные аллели присутствовали в '1-й и 2-х дозах не учитывалось, поскольку степень изменения интенсивности при визуальной оценке является суб]ективной. В f2 частота появления му-тантного фенотипа для растений сем. # 40 АД 20/47 х АД 20/47 составляла 27,3% и ii.es, вычисленная по колосьям и зернам, соот-ветственйо; а для растений сем. # 48 АД 20/47 х АД 20/47 -2,2* и 0,2%. Таким образом, из 46-и проанализированных колосьев растений сем. # 48 АД 20/47 х АД 20/47, только один колос . содержал из 7-и, ' 1 зерно с измененным спектром глиадинов (табл.' 16). Анализ растений сем. # 40 АД 20/47 х АД 20/47 в F2 показал, что из 33-х колосьев, S содержали зерновки спектр глиадинов, которых соответствовал спектру мутантных сомаклонов.

Таким образом, в F2 в колосьях; где были обнаружены зерновки с измененным спектром глиадинов, наблюдалось расщепление по принципу присутс-тв./отсутств., в соотношении - 3:1 (табл. 17).

5.ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ДВУХ СЕМЕЙСТВ ПОВТОРЯЮЩИХСЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ДНК В КАЛЛУСНЫХ ЛИНИЯХ ЯЧМЕНЯ

Исследовали структуру двух типов повторяющихся последовательностей ДНК: основного повтора 18s и. 28s генов рРНК (клон H.V.014 ) и Н-семейства повторящихся последовательностей ДНК (клон 006, Ананьев и др.,1986) в геноме нормальных растений ячменя (ко-46 --.■-■

нтроль), каллусной линии, культивируемой в течение 1,5 года и ра

Таблица 16.

Характер наследования изменчивости по компонентному составу глиадинов в Р И Р у растений ЙС АБ 20/47 х АЭ 20/47.

# генера ции Культура П р о а н а л и з и р о в а н о

Колосьев Зерен

Все го Изменен ных Частота X Все го Изменен ных Частота %

Сем.#40 х х АД 20/47 6 - - 95 - -

Сем.#48 х X АД 20/47 5 . - - 84 - -

Сем.#40 х X АД 20/47 33 9 27,3 255 30 11,8

р2- Сем.#48 X X АД 20/47 46 1 2,2 419 1 0,2

Таблица 17.

Характер расщепления по фенотипу спектра глиадинов >у растений БС АБ 20/47 х АБ 20/47, в Р .

Культура # колоса Проанализиров ано зерен х2 Вероятность (Р)

Всего Изменен • ных

Сем.#48 .1 • 7 1 0,427 0,20

X АД 20/47

Сем.#40 1 7 2 0,048 0,80

х АД 20/47

2 26 6 0,051 0,80

3 10 3 , 0,133 0,50

4 18 ' 4 0,073 0,50

5 14 4 0,095 0,50

6 10 2 0,133 0,50

7 8 2 0 0,99

8 15 4 0,022 0,95

9 11 3 0,030 0,80

стущей без экзогенных ауксинов в культуральной среде, и растениях регенерантах. С помощью блотгибридизации по Саузерну определяли размер и состав рестриктных фрагментов этих двух семейств повторяющихся последовательностей ДНК. В ДНК каллусной ткани по сравнению с ДНК из нормальных растений обнаружено изменение набора рестриктных фрагментов ДНК, гомологичных рДНК при использовании рестриктаз, чувствительных к метилировании цитозина - Ват нх и Нра11. При ЭТОМ В случав Нра11-гидролиза ДНК только часть Нра сайтов оказалась.деметилирована в каллусной ДНК, тогда как практически все сайты для Ваш Н1 оказались деметилированы в ДНК гормо-независмой каллусной линии, утратившей способность-к регенерации. Для Н-семейства диспергированных последовательностей ДНК генома ячменя не было обнаружено различий.в спектрах фрагментов гибридизации в ДНК проростков и-каллусов (Рис.13).

'"Г" :/

Х-

Я» Л» ;

û С Ь г а S i a. 'S '

i ir m

Рис.13.

I .Гибридизация клона H.v.ou с ДНК'каллусов лшшй: М121-8 (а), M12Î-217 (б), М121-218 (В), и ДНК проростков сорта Московс- • КИЙ 121(Г), обработанных реСТрИКТЭЗОЙ Ваш нх. II. Гибридизация геномной ДНК ячменя из проростков (а), каллусной линии М121-218 (б), и ДНК вставки клона H-V.014 (в) с Р32 меченным клоном H.V.014 и Р мечешшм клоном н.у.ооь (lin.

В последние годы накоплено значительное количество данных в пользу ведущей роли метилирования - деметилирования в регуляции процессов активности генов, активации мобильных элементов и их перемещения по геному (Fedoroff,1989). Наблюдаемые картины дают

основание считать, что при культивировании клеток растений in vitro происходит изменение характера метилирования ДНК. Причем наблюдается как локус-специфичность, так и сайт-специфичность деме-тшшрования ДНК в клетках каллусной ткани. Можно предположить, что изменение характера метилирования ДНК, во время культивирования, может быть причиной активации, мобильных элементов, возникновения сомаклонаяьных вариантов и их нестабильного наследования.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Хлебные злаки существено отличаются от традиционных обьектов культуры клеток - табака, петунии, картофеля трудностью культиви-вирования и регенерации растений. Долгие годы значительные усилия многих лабораторий были направлены на разработку способов получения регенерации растений из каллусных культур. Попрекнему единичны сообщения о регенерации растений злаков из протопластов. Этим объясняется отставание в разработке клеточных технологий, применительно к нуждам селекции хлебных злаков. Однако в процессе проведения' наших исследований ситуация в значительной степени изменилась. Прежде всего сто произошло от осознания факта, что главным для получения культуры злаков, способной к регенерации растений, является тип и состояние экспланта. В настоящее время для большинства генотипов мягких пшениц регенерация растений в культуре не представляет особых трудностей. Возможно получения большой выборки регенератов для поиска ценных для селекции сомаклональных вариантов. При сочетании клеточной селекции на устойчивость с эффективными системами регенерации возможен существенный вклад клеточных технологий в селекционный процесс. Особый интерес может представлять селекция на ;устойчивость, если механизм устойчивостй определяется на клеточном уровне.

Успехи в разработке методов прямого введения генов в клетки любых таксонов растительного царства сделали возможным генетическую трансформацию пшеницы баллистическим способом (Vasil et al., 1992), основанным на использовании морфогенных каллусов.

Однако для практической селекции в настоящее время необходимо сочетание классических методов селекции с методами клеточной инженерии, которая стремительно развивается.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ.

1.Разработана высокоэффективная система индукции культуры соматических клеток хлебных злаков и регенерации растений, осно-

ванная на концепции морфогенеза злаков, заключающейся в том, что главным фактором получения способной к морфогенезу культуры клеток является генетически детерминированная компетенция клеток эк-спланта на определенной стадии онтогенеза растения.

2.Показано, что регенерация растений злаков в культуре соматических клеток in vitro происходит, как путем соматического эмбриогенеза, так и органогенеза.

3.Показано стимулирующее влияние Г1АБК и рентгеновского излучения на регенерацию растений твердой и мягкой пшеницы, и определены оптимальные дозы и условия обработки для получения максимальной часототы индукции морфогенного каллуса и регенерации растений.'

4.Установлено наличие сомаююналыюй изменчивости у всех изученных видов хлебных злаков. Показано, что частота возникновения сомаклональной изменчивости хлебных злаков зависит от гонотипа и продолжительности срока культивирования. Наибольшая частота сомаклональной измененчивости показана у мягкой пшеницы.

5.Анализ наследования изменчивости по компонентному составу глиадина твердой и мягкой пшеницы в sc3 и эстераз у регенератов ячменя выявил стабильно и нестабильно наследуемые изменения.

6. В морфогенетических каллусах ячменя и твердой пшеницы обнаружены различные цитогенетические аномалии, частота которых по-вышалась'с увеличением времени культивирования. Эти аномалии заключались в появлении полиплоидных и анеуплоидных клеток, сверхс-гофализации хромосом, повышении конденсации хроматина, которое сопровождалось снижением синтеза рибосомалышх РНК, т.е. уменьшением количества и размеров ядрышек вплоть до полного их исчезновения. Обнаружено явление "липкости" (stickiness) хромосом, которое сопровождалось появлением ДНК-овых тяжей между хромосомами. Выявлены значительные различия в характере протекания цитогенети-ческих' процессов между различными каллусными линиями одного срока культивирования.

7.Показана изменчивость распределения гетерохроматина по длине метафазных хромосом клеток неморфогонного каллуса твердой пшеницы, которая заключалась в увеличении, уменьшении и слиянии теломерных, а также интеркалярных сегментов. Предполагается, что наблюдаемая изменчивость связана с процессами амплификации и редукции высокоповторяпцихся последовательностей ДНК.

в.Цитогенетический анализ растений-регенерантов до прохожде-

ния мейоза показал наличие анеуплоидных и полиплоидных растений у всех изученных видов. Несмотря на наличие значительных дитогене-тических изменений в каллусе, все полученные регенеранты sc2 были без видимых структурных перестроек хромосом. Было установлено, что изменчивость по компонентному .составу глиадинов сомаклона линии АД 20/47 но связана с изменением рисунка дифференциальной окраски хромосомы 1В, в которой локализован локус, кодирующий измененный компонент.

9.Обнаружено явлешш деметилирования определенных сайтов в рибосомалышх ДНК длительно культивируемых гормононезависимых ка-ллусной линии ячменя

10.Полученные данные позволяют заключить, что геномные и хромосомные мутации не могут быть основной причиной сомаклональной изменчивости у исследованных видов злаков. Наиболее вероятной причиной возникновения сомаклональной изменчивости у злаков могут быть процессы, происходящие на молекулярном уровне и приводящие- к возникновению точковых мутаций, а также процессы затрагивающие регуляцию экспрессии генов. Такими процессами может быть изменение характера метилирования ДНК, активация мобильных элементов.

11.Высокая частота сомаклональной изменчивости, показанная по морфологическим и биохимическим признакам для всех исследованных злаков позволяет заключить, что культура соматических клеток злаков in vitro является мощным источником генетической изменчивости и может быть использовано для получения ценного исходного материала для селекции хлебных злаков.

РЕКОМЕНДАЦИИ.

1.В селекционные программы, направленные на сортоулучшекие хлебных злаков целесообразно включать методы культуры клеток для получения сомаклонов по отдельным признакам.

2.Для получения большой выборки сомаклоналных вариантов необходимо использовать регенеранты из 3 - 5 пассажей, в которых наблюдаются интенсивные процессы регенерации, а-регенеранты показывают наибольший размах изменчивости.

3.При получении трансгенных растений злаков баллистическим способом необходимо использовать тблько первичные каллусы в точе-чение первого месяца культивирования, для предотвращения возник- ' новения сомаклональной изменчивости.

список,

работ опубликованных по теме диссертации

1.Gaponenko A.K.,Muntyan V.А.,Mallkova N.I.,Sozlnov A.A. In vitro plant regeneration of different variétés In winter wheat(Tritl-сш aestlvum L. (//International Symposlum^lant tissue and cell culture - Application to crop improvoment" Czechoslovakia, Olo-niouc, 1964, p.69.

г.Гапоненко А.К.,Мунтян M.А.,Маликова H.И..Созинов А.А. Регенерация растений различных генотипов озимой пшеницы in vitro.//Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии!', Пущино, 1984, стр.82.

3.Гапоненко А.К.,Мунтян М.А..Маликова Н.И..Созинов А.А. Регенерация растений различных генотипов пшеницы Trltlcum aestlvum L.in Vitro//floiui. АН СССР, 1984.T.278. »5, с. 1231-1235.

¿.Гапоненко А.К.,Мунтян M.А..Маликова H.И..Созинов А.А. Регенерация растений пшеницы Trltlcum aestlvum L.In vitro.// ЦИТОЛОГИЯ и генетика. 1985, т.19, »s, с. 331-342.

5.Гапоненко А.К..Маликова Н.И..Охрименко Г.Н..Созинов А.А. Получение сомакпональных ЛИНИЙ у злаков (Trltlcum aestlvum L., Hor-deum vulgare L.).// ДОКЛ. АН СССР, 1985, T.283, »6, c.1471-

1475:

6.Хвырлева Ц.Д..Рыжик M.В.,Ананьев Е.В..Гапоненко А.К.,Искаков А.Р.,Созинов А.А.Деметилирование рДНК в каллусной ткани ячменя, культивируемой in vitro.// Докл. АН СССР. 1986, «5, с.1249- • 1252.

- 7.Gaponenko А.К..Okhrlmenko G.N.,Iskakov A.R.,Sozinov А.А. Genetic analysis of somaclonal variation in cereals (Trltlcum aestlvum L. and Hordeum vulgare L. I//In Abstracts of 6th interna-international congress of plant Tissue and Cell Culture, Minne-apolié, USA,1986,p.217.

8.Охрименко Г.H.,Гапоненко А.К.,Журавлев Г.В.,Демкин В.П.,Созинов А.А. Влияние рентгеновского излучения на морфогенз Trltlcum aestivum L. in vitro. Радиационная генетика - селекции. Материалы 1 Всесоюзного координационного совещания, Москва, 1986, стр.73.

Э.Искаков Д.Р..Гапоненко А.К. Сомаклональная изменчивость растений ячменя Hordeum vulgare L.//II Всесоюзная конференция молодых ученых по физиологии растительной клетки, Тез. докл.Москва,

1986, стр.9.

10.Гапоненко А.К.,Созинов А.А.Генетический анализ сомаклональной ИЗМвНЧИВОСТИ У Tritlcum aestlvum L. Я Hordeum vulgare L.//Всесоюзная конференция по генетике соматических клеток в культуре, Тез. докл.Звешгород, 1986, стр.99.

П.Хвырлева Ц.Д., Рыжик М.В., Ананьев Е.В., Гапонепко А.К.., Иска-коз А.Р..Созинов A.A. Сравнение структурной организации двух семейств повторяю:цихся последовательностей ДКК в каллусной ткани ячменя и у регенерантов.//Всесоюзная конференция по го-нетике соматических клеток в культуре. Тез. докл. Звенигород,

1986, стр.130.

12.Гапоненко А.К. Перспективы использования культуры клеток в селекции.//Успехи современной генетики, 1987, #14, Москва,Наука, стр.64-74.

13.Созинов A.A., Искаков А.Р., Гапоненко А.К. Культура соматических клеток - новый источник изменчивости для селекции ячменя. //Доклады ВАСХНИЛ, 1987, # 11, стр. 3-5.

14.Гапоненко А.К., Голубева О.Н. Морфогецетические процессы в культуре соматических клеток пшеницы.//Гаметная и зиготная селекция растений. Кишинев, "Штишща", 1987, стр 133-135.

15.0хрименко Г.Н., Гапоненко А.К., Созинов A.A. Способ культивирования ткани пшеницы.// Авторское свидетельство СССР #1458386 от 15.10.1988.

16.Gaponenko F.K.,petrova T.F.,Sozinov F.F. Cytogenetics of in vitro cultured somatic cells of cereals!HORDEUM VULGARE L. , TRITICUM AESTIVUV L. and TRITICUM DURUM )//Abstracts of XIV International Botanical congress, Berlin, 1987, p.485.

17-Гапоненко A.K. Механизмы сомаклональной изменчивости у злаков. //Тезисы симпозиальных докладов v сьезда ВОГИС, 1987, т.vi, стр.130.

18.Гапоненко А.Л..Петрова Т.Ф..Искаков А;А.,Созинов A.A. Цитоге-нетика культивируемых in vitro соматических клеток и растений-генерантов злаков. Сообщение i.Hordeum vulgare L.//Генетика,

1987, Т. XXIII,#11,стр.2036 - 2046.

19.Искаков А.Р..Гапоненко А.К. Селекционное изучение сомаклональ-ных линий ячменя Hordeum vulgare L.//Тезисы докладов Всесоюзной конференции по биотехнологии злаковых культур, Алма-Ата,

1988, стр.64.

20.0хримонко Г.Н..Гапоненко А.К. Сомаклональная измоньчивость

5о

яровой пшеницы.//Тезисы докладов Всесоюзной конференции по биотехнологии злаковых культур, Алма-Ата,1988, стр.65.

21.Лесова ¡К.Т. .Гапоненко А.К. Оптимизация среды для культивирования соматических клеток ячменя Hordeum vulgare L.//ТеЗИСЫ ДОкладов Всесоюзной конференция по биотехнологии злаковых культур, Алма-Ата, 1988, стр.66.

22.Бабаева С.А., Петрова Т.Ф., Гапоненко А.К. Цитогенетика культивируемых in vitro соматических клеток и растений регенеран-. тов.//Тезисы докладов всесоюзной конференции по биотехнологии злаковых культур, Алма-Ата, 1988, стр.67.

23.Gaponenko A.K.,Petrova T.F.,Iskakov А. P. jCozinoV A. A. Cytogenetics of in vitro cultured somatic cell and regenerated plants of barley (Hordem vulgare L.).//Theoretical and applied genecs, 1966, 75 :905r911.

24.Gaponenko A.K. The nature of somaclonal variation in cereals (T.aestivum, T. Durum, H.vulgare)// Abstracts of the 6th Congress of the; Federation of European Societies of Plant Physiology, Yugoslavia, Split,14-10.

25.Искаков A.P.,Сариев B.C., Гапоненко A.K. Селекционное изучение растений-регенерантов ячменя."Селекция и урожай",Алма-Ата,1988, стр.104-117.

26.Бабаева С.А..Гапоненко А.К.,Петрова Т.Ф. Цитогенетический анализ IB-хромосомы сомаклона мягкой пшеницы, измененного по компонентному составу глиадинов.//Доклады Академии Наук СССР, '1991,. т.320 , #5, 1251-1253.

27.Анализ изоферментного состава эстеразы, АДГ, ГДГ и ГОТ у со-маклонов твердой и мягкой пшеницы.//Генетика, 1992, т., «12.

PTII.Тгш.ВгС?.Зак.77о.Тяр.100. 20.11.ЭЗ.Беспютпо.

Информация о работе

Гапоненко, Александр Константинович
доктора биологических наук
Санкт-Петербург, 1992
ВАК 03.00.15

Автореферат

Генетические процессы в культуре соматических клеток хлебных злаков - ячменя (Hordeum vulgare L.), твердой (Triticum durum Desf.) и мягкой (Triticum aestivum L.) пшениц - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы