Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетические основы и методы биохимической диагностики наследственных болезней обмена веществ

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Краснопольская, Ксения Дмитриевна

1.1. Характеристика класса наследственных болезней обмена

1.2. Этиология и патогенез

1.3. Генетическая гетерогенность и клинический полиморфизм

Глава 2. Методические и организационные принципы биохимической диагностики наследственных болезней обмена

2.1. Программы массового просеивания

2.2. Программы селективного просеивания

2.3. Подтверждение диагноза

Глава 3. Характеристика некоторых классов наследственных болезней обмена - объектов данного исследования

3.1. Боленни накопления гликозаминогликанов

3.1.1. Этиология и патогенез

3.1.2. Генетическая гетерогенность и клинический полиморфизм

3.2. Недостаточность эритроцитарной глюкозо-6-фо-сюатдегидрогеназы

3.2.1. Этиология и патогенез

3.2.2. Генетическая гетерогенность и клинический полилорфизм

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Глава 4. Материалы и методы.

4.1. Обследованные контингента

4.2. Материал ,цля исследования.

4.3. Программы селективного просеивания на наследственные болезни обмена

4.3.1. Тест Гетри для селективного просеивания на фенилкетонуршо контингента умственно отсталых

4.3.2. Программа селективного просеивания на наследственные болезни обмена для детей с отставанием в умственном и физическом развитии.

4.3.3. Программа селективного просеивания на эри-троцитарные энзимопатии .для больных с нес-фероцитарными гемолитическими анемиями

4.4. Подтверждение результатов просеивания

4.4.1. Методы подтверждения диагноза фенилкето-нурии.

4.4.2. Методы подтверждения диагноза болезней накоплен: гя гликозаминогликанов

4.4.3. Методы подтверждения диагноза эритроцитар-ных энзимопатии.

4.5. Методы типироЕания аллелей Grd

4.6. Количественная обработка данных

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУдаШЕ.

Глаьа 5. Диагностика наследственных болезней обмена в контингентах повышенного риска

5.1. Характеристика программ селективного просеивания и подтверждения диагноза .для контингента детей с отставанием в умственном и физическом развитии

5.1.1. Диагностика фенилкетонурии у интернированных умственно отсталых . ЗШ

5.1.2. Диагностика наследственных болезней обмена у интернированных умственно отсталых и при медико-генетическом консультировании.

5.1.3. Диагностика болезней накопления гликозами-ногликс.ное при медико-генетическом консультировании . Г7£

5.2. Характеристика программ селективного про-сеиванкя и подтверждения диагноза для контингента гематологических больных

Глава 6. Диагностика наследственных болезней обмена при популяционных обследованиях.

6.1. Частота недостаточности эритроцитарной глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы в выборках из различных популяций СССР.

6.2. Исследование генетической гетерогенности недостэточности глюяозо-б-фосфатдегидро-геназы.

6.2.1. Характеристика препаратов нормального фермента.

6.2.2. Характеристика мутантных форм глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы у гематологических больных из разных этнических групп

6.2.3. Характеристика мутантных форм глюкозо-5-фос-сгатдегидрогеназы в Еыборках из различных популяций.

6.2.4. Закономерности распространения аллелей (5сГ е разных этнических группах

6.3. Спектр 31 частоты наследственных болезней обмена при популяционных исследованиях в Туркмении и Узбекистане

6.4. Геногеография наследственны:: болезней обмена в СССР.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генетические основы и методы биохимической диагностики наследственных болезней обмена веществ"

Наследственные болезни обмена веществ (НБ0) - обширная группа моногенно наследующихся болезней человека. Практическое значение их исследования определяется чисто медицинскими аспектами, т.е. необходимостью разработки методов диагностики, лечения, профилактики этих заболеваний, представляющих серьезную проблему для современного здравоохранения. С другой стороны, НБО - типичные "биохимические" мутации человеческого генома - являются мощным инструментом исследования нормального метаболизма человека, характеризующегося большой сложностью и большим числом "белых пятен" на своей карте. Являясь одной из наиболее бурно развивающихся ветвей современной медицинской биохимической генетики, исследования НБО способствуют решению важных медицинских проблем (снижение детской заболеваемости и смертности) и развитию генетики, в частности, генетики человека (исследование структурной организации генома, молекулярного механизма мутаций, биохимического полиморфизма популяций, картирование генов на хромосомах и т.д.).

Актуальность теш.

Снижение детсксй заболеваемости и смертности является одной из кардинальных проблем советского здравоохранения. Благодаря разработке и внедрению в практику успешных мер борьбы с инфекционными и алиментарными болезнями наследственная патология становится одним из важных этиологических факторов детской заболеваемости и смертности, причиняя также тяжелый моральный ущерб отягощенным семьям /4,8,10,22/. Из -2500 моногенных наследственных болезней каталогизированных Маккьюсиком /264/ на 1978 г., более 600 нозологических единиц составляют НБО. Доминирующая часть последних представлена летальными и сублетальными формами и манифестирует в детском возрасте. На НБО приходится 11-17% госпитализаций и 8,5% смертности в крупных педиатрических клиниках экономически развитых стран /164,347/. Характерные особенности этой группы заболеваний - выраженная генетическая гетерогенность, клинический полиморфизм, наличие гено-и фенокопий - создают большие трудности для их диагностики. Тем не менее, решение всех практических и теоретических задач, связанных с НБО, требует их точной диагностики, т.е. локусной и, во многих случаях, аялельной идентификации, основанной на применении биохимических методов. В течение 20-летнего периода (начиная с 1964 г.) интенсивных исследований НБО была выработана специфическая стратегии их биохимической диагностики. Она включает использование программ массового и селективного просеивания для предположительного выявления НБО с последующей подтверждающей диагностикой. Последняя использует самые современные методы биохимии и смежных с нею дисциплин и нередко представляет самостоятельное научное исследование /4,11,22,33,87,179/.

По приказу M3 СССР В 813 от 1939 г. в стране была создана сеть кабинетов по медико-генетическому консультированию, а по приказу tè 1120 от 1979 г. эта сеть была принципиально расширена. Поскольку в обязанности кабинетов входит выявление больных с НБО, это ставит задг.чу создания программ селективного просеивания на НБО с максимальной адаптацией ее к реальным возможностям организации медико-генетической службы на базе областных и республиканских больниц.

НБО характеризуется выраженной неравномерностью их этнического распространения, что проявляется и на локусном и на аллель-ном уровне. В связи с разработкой эффективных методов лечения и профилактики все возрастающей группы НБО изучение их геногеог-рафии в Советском Союзе с разнообразным этническим и национальным составом является очень актуальным. Существование географических, языковых, родовых, национальных и др. барьеров способствовало многочисленной подразделенности населения страны и формированию региональных особенностей груза наследственной патологии, сказавшихся на частоте и спектре НЕО /8,19/.

Из Есего вышеизложенного делается очевидным, что перед здравоохранением каждой страны стоит задача самостоятельной разработки и применения, программ выявления и подтверждающей диагностики НБО. Необходимость разработки таких программ вытекает из потребностей медгко-генетического консультирования отягощенных семей, включая ,дородовую диагностику, и актуально для планирования органами здравоохранения мер первичной и вторичной профилактики НБО. Внедрение просеивающих программ в практику требует существеннш: бюджетных ассигнований и является делом органов здравоохранения. Разработка же (методическая и организационная) просеиваищих программ нуждается в проведении определенных научных исследований и осуществляется в рамках научно-исследовательских учреждений. При этом должны решаться в первую очередь такие научные и практические задачи, как определение частоты и спектра НБО в популяциях, выяснение популяционно-ге-нетических закономерностей регионального распространения НБО, изучение генетической гетерогенности НБО в регионах, методическая адаптация просеивающих программ к материальным возможностям и организационной структуре службы здравоохранения. Иными словами, научно-исследовательские разработки должны дать органам здравоохранения ответ на вопросы, какие НБО, как и где нужно выявлять и доводить до клинического диагноза. Находясь у истоков создания отечественных программ массового и селективного просеивания, мы сосредоточили свои усилия на решении этих задач, разработав ряд программ селективного просеивания и подтверждающей диагностики и применив их к обследованию контингентов повышенного риска, т.е. контингентов с ожидаемым накоплением ИБО,и популяционных Еыборок.

Делъ и задачи исследования. Основном целью данной работы являлась разработка и реализация подходов к локусной и аллель-ной идентификации некоторых групп ИБО и изучение особенностей популяционного распространения последних в разных этнических группах Советского Союза. При этом решались следующие конкретные задачи:

1. Разработать программы селективного просеивания и подтверкдающ щей диагностики ЕБО для контингента детей с отставанием в ум- -ственном и физическом развитии и больных с несфероцитарными гемолитическими г немиями.

2. Определить спектр НБО в контингентах повышенного риска и порядок региональных частот некоторых ИБО путем обследования этих контингентов и выборок из популяций.

3. Изучить генетическую гетерогенность недостаточности эритро-цитарной глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФД) у гематологических больных и в выборках здоровых лиц из разных этнических групп СССР.

4. Изучить генетические закономерности распространения аллелей йсГ в разных этнических группах.

5. Изучить генетическую гетерогенность и особенности геногеог-рафии болезней накопления гликозаминогликанов (ГАГ) в СССР.

Научная новизна и практическая значимость. Основная часть конкретных результатов исследования получена впервые. Это касается характеристики частот, спектра и геногеографии НБО в стране. Для оценки этих параметров были применены практически все возможные виды селективного просеивания на НБО, что позволило сформулировать генетические закономерности их популяционного распространения.

Впервые в СССР были изучены особенности популяционного распространения некоторых НБО - фенилкетонурии (ФКУ), недостаточно-, сти эритроцитарной ГЗФД, болезней накопления ГАГ. Впервые был определен порядок частоты ФКУ в центральноевропейском регионе страны, показана целесообразность и созданы методические предпосылки массового просеивания на эту НБО. Справедливость Еывода о целесообразности массового просеивания на ФКУ впоследстврги была подтверждена при организации массового просеивания на ФКУ в БССР, Литве и Латвии /30 /. В ряде этнических групп страны определена частота недостаточности эритроцитарной Г6ФД и показана неравномерность этнического распространения аллелей вс(~ .

Впервые в СССР была разработана методическая база для ло-кусной и аллельной идентификации некоторых групп НБО и исследована их генетическая гетерогенность. Проведено аллельное типиро-вание по локусу &сС как среди гематологических больных, так и в выборках здоровых луц из разных этнических групп. Всего в ходе данного исследовании было изучено 69 аллелей по локусу , идентифицировано 27 разных аллелей, из них 20 ранее не описано в литературе. Все аллели из числа последней группы, включены в Международную классификацию аллелей С-Ы. /380,381/. Сопоставление частот и спектров аллелей в трех этнических группах наряду с анализом генетических факторов, влияющих на эти параметры, позволило сформулировать гипотезу о закономерностях распространения аллелей в разных популяциях. Разработанная программа исследования метаболизма ГАГ позволила выявить его нарушения при других формах врожденной патологии скелета (не относящихся к болезням накопления ГАГ) и показать их генетическую гетерогенность. Эти данные важны для прогресса биохимической генетики в исследовании наследственной патологии соединительной ткани.

Основное значение данной работы состоит в создании научных и методических предпосылок для внедрения программ массового и селективного просеивания в практику здравоохранения СССР. Нами было разработано и внедрено в практику медико-генетического консультирования страны в виде методических рекомендаций ("Методические рекомендации по выявлению наследственных болезней обмена", "Методические рекомендации по клинико-биохимической диагностике мукополисахаридозов") ряд программ селективного просеивания на НБО. Программы предназначены для двух контингентов повышенного риска - контингента детей с отставанием в умственном и физическом развитии и больных с несфероцитарными гемолитическими анемиями. Для каждой из этих программ были созданы, соответственно, программы подтверждения диагноза НБО. Все эти программы были апробированы при обследовании более 4000 больных с подозрением на НБО -интернированных в спецучреждения, обращавшихся в Центр по медико-генетическому консультированию Института медицинской генетики АМН СССР. Это позволило диагностировать 293 случая НБО, представленных 33 нозологическими формами, и на основании диагноза дать медико-генетическую консультацию отягощенным семьям. Поскольку к началу нашего исследования биохимическая диагностика НБО в стране только начиналась, многие нозологические единицы из класса НБО были диагностированы впервые в СССР.

Результаты данной работы использованы для разработки и решения некоторых задач, предусмотренных 4-мя темами научно-технической проблемы 0.69.07 на 1981-1985 гг. ГКНТ при СМ СССР, а именно: "Изучить закономерности реализации генетической информации при моногенных наследственных болезнях обмена веществ на уровне биохимических дефектов", "Разработать медико-генетические карты распространенности ряде наследственных болезней в СССР", "Изучить молекулярно-генетическую природу наследственных болезней", "Разработать и апробировать новые методы раннего выявления наследственных дефектов обмена веществ". Научно-методические разработки данного исследования использованы при планировании мер по улучшению биохимической диагностики НБО в стране в готовящемся приказе Минздрава СССР "О мерах по дальнейшему улучшению медико-генетической помощи населению'.' Один из разделов данного исследования, посвященный разработке и внедрению программ селективного просеивания и подтверждающей диагностики в практику медико-генетического консультирования, награжден серебряной медалью ВДНХ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Краснопольская, Ксения Дмитриевна

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Биохимическая генетика исследует генетический контроль сложнейшего метаболизма живых организмов, насчитывающего сотни различных, но взаимодействующих друг с другом метаболических путей. С 40-х гг. XX Еека - даты рождения биохимической генетики как науки - достигнуты огромные успехи в исследовании нормального метаболизма и его генетического контроля у человека, хотя количество "белых пятен" все еще очень велико. По сравнению с другими разделами генетики биохимическая генетика требует владения уникально большим количеством методов и организации уникально разнообразного производства по обеспечению реактивами и приборами этих исследований. Поскольку к настоящему времени большинство метаболических путей человека уже маркировано тем или иным числом НБО, то все трудности, стоящие перед биохимической генетикой, наследует и ее ветвь - медицинская биохимическая генетика. Однако, развитие последней связано с охраной здоровья населения и необходимо для нужд здравоохранения каждой страны. Путь преодоления этих трудностей и одновременно важнейшая задача отечественной медицинской биохимической генетики видится в: I) создании методической базы для анализа постепенно увеличивающегося числа метаболических путей и 2) применении этой базы для изучения природы патологических генных мутаций у человека и создания методов их диагностики.

Данное исследование является примером такого подхода к решению задач, стоящих перед отечественной медицинской биохимической генетикой. В нем сформулирован общий методологический принцип стратегии биохимической диагностики НБО от простых просеивающих методов до локусной и аллельной дифференциации. Для практической реализации этого подхода в соответствии с задачами исследования нами были использованы практически все методические разновидности селективного просеивания на ИБО, включая просеивание в контингентах повышенного риска и в популяциях.

Основная направленность и значение данного исследования - в проведении методических и научно-исследовательских разработок для планирования органами здравоохранения мер по диагностике, профилактике и лечению ИБО. Практическая значимость и перспективы использования данного исследования многоплановы. Оно создало базу для развертывания в стране выявления и диагностики широкого спектра ИБО. Было разработано, апробировано и внедрено в практику медико-генетического консультирования страны ряд программ селективного просеивания и подтверждающей диагностики ИБО. Эти программы адаптированы к возможностям службы здравоохранения страны и позволяют диагностировать аминоацидопатии, гликозурии, сфинго-лшшдозы, гликопротеидозы, мукополисахаридозы, эритровдтарные энзимопатии. Методы, использованные нами для локусной дифференциации ИБО, в большинстве случаев могут быть использованы для их дородовой диагностики - самого эффективного на сегодняшний день метода профилактики летальных и сублетальных форм ИБО. Таким образом, использованные наш программы селективного просеивания и подтверждения диагноза ИБО не только позволяют уточнить диагноз, дать семье грамотное медико-генетическое консультирование, но и обеспечивают возможность дородовой диагностики обширной группы ИБО.

Был определен спектр и порядок частот некоторых ИБО в ряде регионов страны и показана неоднородность их этнического распространения. Дальнейшее внедрение разработанных нами программ селективного просеивания на ИБО в практику медико-генетической службы страны должно способствовать уточнению региональных особенностей груза наследственной патологии и планированию научно обоснованных мероприятий по выявлению, лечению и профилактике НБО,

Была доказана целесообразность массового просеивания новорожденных на ФКУ в регионах страны с европеоидным населением и созданы методические и организационные предпосылки для его реализации. Полученные нами данные о частоте и геногеографии ФКУ и накопленный методический опыт ее выявления стимулировали внедрение программ массового просеивания новорожденных в Литве, Латвии, БССР, Москве, Ленинграде, Краснодаре, Орле. Они положены также в основу готовящегося по Минздраву СССР приказа о массовом обследовании новорожденных на ФКУ в рамках страны.

Была решена впервые в СССР задача локусной дифференциации болезней накопления ГАГ и заложены основы организации медико-генетической помощи семьям, отягощенным этими сублетальными формами НБО с высокой суммарной частотой, для которых не разработано доступных методов терапии.

Была решена впервые в СССР задача аллельной идентификации при недостаточности эритроцитарной Г6ФД. Это имеет практическое значение для регионов с высокой частотой дефекта, поскольку обеспечивает данные для оценки риска применения лекарственных препаратов, обладающих потенциальным гемолитическим действием. Особенно важно это для мальчиков-гемизигот, которым предстоит отбывать воинскую повинность в разных регионах страны, где медицинская служба могла не сталкиваться с этой наследственной патологией. Поэтому завершающим этапом всех наших экспедиционных обследований являлось чтение лекций для медперсонала данного региона и передача списков выявленных больных и отягощенных семей районной или областной службе здравоохранения с дачей соответствующих рекомендаций.

Наконец, семьи больных с НБО, диагностированных в ходе данного исследования» получили медико-генетическую консультацию.

Теоретическое значение данного исследования определяется в основном результатами изучения генетической гетерогенности эрит-роцитарной Г6ФД и болезней накопления ГАГ. Типирование аллелей G-сГ позволило получить интересные данные о генетической гетерогенности этого дефекта и проанализировать закономерности их распространения в разных этнических группах страны. В результате была сформулирована гипотеза о доминирующей роли отдельных генетических факторов в формировании частоты и спектра аллелей Gd~~ в разных популяциях. Согласно этой гипотезе у русских доминирующую роль играет мутационный процесс, у азербайджанцев - естественный < отбор и инбридинг, у евреев-ашкенази - генный дрейф. В ходе исследования генетической гетерогенности ГбФД-недостаточности наш было изучено 69 мутантных форм Г6ФД и открыто 20 новых аллелей Gd , включенных в международную классификацию. Наконец, ГбФД-недостаточность выполнила функции модели для исследования генетической гетерогенности наследственных энзимопатий. Удобство этой модели определялось монолокусным контролем реализации ферментного фенотипа и моноаллельным контролем его экспрессии у гемизигот. Освоение этой модели создало базу для решения задачи локусной и аллель-ной дифференциации других энзимопатий, требующей разработки более сложных методических подходов. Типирование аллелей G-d"в этнических группах в будущем может быть использовано в качестве модели .для изучения динамики генетического груза в популяциях /190/.

Изучение генетической гетерогенности болезней накопления ГАГ с помощью разработанной нами методической программы выявило нарушение метаболизма ГАГ и при других видах системной патологии скелета. Это привело к разработке принципов выявления наследственных нарушений метаболизма протеогликанов при врожденных пороках развития скелета и системной его патологии, развивающейся постнаталь-но. Исходя из этих принципов, была разработана методическая программа /56/, предназначенная для расшифровки первичного биохимического дефекта в группе моногенно наследующихся болезней, насчитывающей » 80 нозологических единиц. Расшифровка этиопатогенеза НБО, в свою очередь, всегда способствует обогащению знаний о нормальном метаболизме человека, демонстрируя неразрывность связи практических и научных аспектов изучения НБО.

Использование программ селективного просеивания и подтверждения диагноза НБО также имеет теоретический аспект, т.к. будучи интегрированными в структуру здравоохранения, они создают базу для изучения динамики генетического груза в популяциях и факторов, на нее влияющих.

Опыт по выявлению и диагностике НБО, накопленный наш при постоянном контакте с кабинетами по медико-генетическому консультированию, позволяет сделать и некоторые организационные выводы, имеющие отношение к будущему медико-генетической службы страны. Становится очевидным, что для такой большой страны как СССР с выраженной неравномерностью регионального распространения НБО необходимо создание региональных медико-генетических центров по принципу численности населения (100-150 тыс. новорожденных в год). Эти центры могут быть созданы на базе кабинетов по медико-генетическому консультированию соответствующего региона при областных, краевых и республиканских больницах. В их обязанности должно входить в плане НБО не только селективное просеивание, но также массовое просеивание на ФКУ (в будущем - на гипотиреоз и другие НБО), подтверждение диагноза и биохимический контроль за лечением. Необходимо также создание 2-3 референсных центров в стране, хорошо оснащенных реактивами и оборудованием, осуществляющих подтверждающую и пренатальную диагностику НБО и контроль за качеством диагностики в региональных центрах и кабинетах по медико-генетическому консультированию. Каждый из этих референсных центров должен специализироваться по определенным видам метаболизма.